CN107636144A

CN107636144A - 消耗乙酸盐/酯的酵母细胞

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Publication number: CN107636144A
Application number: CN201680029057.1A
Authority: CN
Inventors: 保罗·克拉森; 约瑟夫·帕图斯·约翰内斯·施米茨; 保卢斯·佩特鲁斯·德·瓦尔; 阿尔杰·鲍马
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2015-05-22
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2018-01-26
Anticipated expiration: 2036-05-18
Also published as: CN107636144B; US11319543B2; EP3298133A1; US20210310013A1; US20180127763A1; BR112017023262A2; ES2755680T3; EP3298133B1; EP3604506A1; HRP20191774T1; CA2983776A1; WO2016188813A1; US12012604B2; DK3298133T3; MY186983A; PL3298133T3; HUE045909T2

Abstract

本发明涉及一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏；b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；c)一种或更多种编码同源或异源乙酰‑CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和d)导致对所述酵母而言天然的3‑磷酸甘油磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或3‑磷酸甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。

Description

消耗乙酸盐/酯的酵母细胞

发明领域

本发明涉及工程化微生物，例如酵母。具体而言，本发明涉及戊糖转化提高的转化乙酸、戊糖和葡萄糖的酵母细胞。本发明还涉及其中所述酵母细胞生成发酵产物如乙醇的方法。

发明背景

第二代生物乙醇由例如水解成游离单体糖(如己糖和戊糖)以发酵成乙醇的植物生物质的木质纤维素级分生产。除生物质预处理和水解期间的糖释放外，还形成一些有毒副产物。例如，糠醛和HMF就是这些产物中的两种。它们形成的量取决于几个预处理参数，如温度、压力和预处理时间。木质纤维素水解物也含有大量的乙酸，乙酸是微生物如酵母发酵能力的强抑制物。

甘油是糖发酵成乙醇期间的主要副产物，其主要由于再氧化反应消耗在厌氧条件下的乙醇产生期间形成的过量NADH而形成。因此，在工业发酵期间，酵母细胞消耗的约5％至10％的糖被转为甘油。降低这种多元醇的量被认为是增加乙醇产率的有前景的途径。这可以通过调节分批补料过程中的进料速率，或通过选择生成更少甘油的菌株而实现，但这两种方法的效果都相对有限。

已经报道几种不同的方法，它们可以帮助减少乙酸对水解物中的糖的发酵能力的抑制作用，以及(例如通过酵母的遗传工程)通过缺失甘油生成中涉及的基因来(部分)解决氧化还原平衡问题。

Sonderegger等(2004)公开了在发酵木糖的Saccharomyces cerevisiae菌株中磷酸转乙酰酶和乙醛脱氢酶的异源表达。结合天然磷酸酮酶，Sonderegger等由此生成了功能性磷酸酮酶途径，其能够净再氧化NADH，所述NADH由该特定菌株中用于木糖利用的木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的异源表达所产生。

Guadalupe等(2009)描述了一种Saccharomyces cerevisiae菌株，其中通过破坏内源性NAD依赖型3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1和GPD2)而消除副产物甘油的生成。编码乙酰化NAD依赖型乙醛脱氢酶的E.coli mhpF基因的表达通过为培养基补充乙酸恢复了gpd1gpd2双缺失菌株厌氧生长的能力。

Yu等(2010)构建了经代谢工程化以通过甘油脱氢酶(由GCY1编码)、二羟丙酮激酶(DAK1)和甘油摄取蛋白(GUP1)的同时过表达来提高由甘油生成乙醇的Saccharomycescerevisiae菌株。在同一团队的后来报告中(Yu等，2011)，描述到分别编码醇脱氢酶和丙酮酸脱羧酶的ADH1和PDC1的额外过表达引起在发酵条件下的生长速率和甘油消耗增加，导致最终乙醇产率略有增加。

Lee和Dasilva(2006)公开了经工程化以通过引入Escherichia coli mgs和gldA基因的表达等由甘油生成1,2-丙二醇的酵母Saccharomyces cerevisiae。

Guadelupe等(并且还在专利申请WO 2011/010923中)描述的技术提供了用于在生物质糖发酵和前述乙酸发酵成例如乙醇期间降低水解物的乙酸含量的方法。

通过引入额外的NADH生成途径，例如通过另外(过)表达甘油消耗途径，进一步增强转化乙酸的能力是有潜在可能性的。在表达厌氧乙酸转化途径的酵母菌株(例如Medina等，2009所描述)中引入前述GUP1-、GCY1-和DAK1-基因(Yu等，2010)后，乙酸转化应增加以维持氧化还原平衡，导致水解物的去毒进一步增加且乙醇产率更高。然而Yu等的解决方案不起作用，因为酵母甘油脱氢酶(由GCY1编码)使用NADP⁺作为辅因子，由于辅因子再生不足而导致辅因子不平衡。替代性甘油脱氢酶(来自于E.coli的gldA)结合乙酸还原途径一起被测试，并且的确提高了在厌氧生长(发酵)条件下乙酸的转化(专利申请WO2013/081456)。尽管如此，仍然需要改善乙酸盐/酯(acetate)、戊糖和/或己糖向发酵产物的转化。

发明概述

因此，本发明的一个目标是提供这样的酵母，其能够由乙酸或乙酸盐/酯产生乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力，以及其中这些菌株被用于产生乙醇和/或其他发酵产物的方法。

另一个目标是提供细胞，例如酵母细胞，其能够由甘油和/或甘油和乙酸产生乙醇，同时保留其发酵己糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)以及戊糖(如木糖)的能力。另一个目标是增加发酵产物的产生(产量、生产率或两者)。在一个其实施方式中，酵母产生较少甘油。

此外，本发明的一个目标是提供能够厌氧地共同发酵乙酸盐/酯、戊糖和葡萄糖的酵母菌株。

本发明的一个目标是提供通过发酵戊糖和/或乙酸盐/酯产生乙醇的成本有效的方法。

本发明的另一个目标是提供一种酵母细胞，其能够以比使用本领域目前已知的菌株能够实现的速率更高的速率发酵戊糖。

另一个目标是减少C5/C6发酵的发酵时间。

通过阅读说明书和权利要求，本发明的其它目标、特征和优点很明显。

根据本发明实现了这些目标中的一个或更多个，本发明提供了一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶的破坏；

b)一种或更多种编码异源NAD+依赖型乙酰化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.10)的核苷酸序列；

c)一种或更多种编码同源或异源乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)的核苷酸序列；和

d)修饰，其导致与不含所述修饰的酵母相比，3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或3-磷酸甘油脱氢酶活性降低。

在一个实施方式中，d)中对酵母而言为天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)是对酵母而言为天然的乙醛脱氢酶-6(ALD6)。

本发明还涉及制备发酵戊糖的酵母细胞的方法，其中使包含戊糖途径的一个或更多个外源基因的酵母细胞经受对所述酵母细胞而言为天然的基因ALD6的破坏。

本发明还涉及一种发酵方法，其中木质纤维素糖被破坏株(disruptant)酵母细胞转化为发酵产物。在一个其实施方式中，发酵产物是乙醇。

本发明还涉及有氧增殖乙酸盐/酯消耗酵母的方法。

附图简介

图1显示了数学模型图式(最小-模型方法)。数字表示以下过程：1.)葡萄糖摄取和代谢(上游-糖酵解)，2.)木糖摄取和代谢，3.)甘油摄取和代谢，4.)乙醇形成(下游糖酵解)，5.)乙酸盐/酯摄取和代谢，6.)生物质形成，7.)用于维持(maintenance)的ATP周转，8.)CO₂和乙醇产生。

图2显示了所述方法的示意概述图：使用zeoMX标记缺失ALD6。这些修饰被引入YD01247、YD01248中。

图3显示了减少维持ATP对葡萄糖和木糖向乙醇的转化率的影响的模型预测。

图4显示了涉及乙醛-乙酸盐/酯-乙酰-CoA的无效循环，从而引起维持ATP增加的代谢途径的示意图。虚线箭头表示无效循环。将乙酰化乙醛脱氢酶(adhE，acdH)引入菌株中以使乙酸盐/酯向乙醇转化。

图5显示了参照物(YD01248，YD01247；透明线)和ALD6缺失菌株(YD01248ΔALD6，YD01247ΔALD6；实线)之间的糖消耗和乙醇形成率的比较。

序列表简介

SEQ ID NO:1 pRN772(携带loxP-kanMX-loxP序列的质粒)

SEQ ID NO:2 引物12388(ald6 5'侧翼正向)

SEQ ID NO:3 引物12389(ald6 3'侧翼反向)

发明详述

在本说明书和所附权利要求的通篇，词语“包括”、“包含”和“含有”应被解释为包含性的。换言之，在语境允许的情况下，这些词语意图传达的意思是：可以包括其它没有明确列举的要素或整体。

本文中不使用数量词修饰时指的是一个/种或多于一个/种(即一个/种或至少一个/种)语法对象。例如，“要素”可意味着一个/种要素或多于一个/种要素。例如，细胞在本文中可以是一个细胞，但也可以指菌株或细胞群体。

“酵母”在本文中被定义为真核微生物，其包括主要以单细胞形式生长的真菌(Eumycotina)亚门的所有物种。酵母可以通过单细胞菌体出芽而生长，或者可以通过生物体裂殖而生长。用于本发明中的优选酵母细胞属于Saccharomyces、Kluyveromyces、Candida、Pichia、Schizosaccharomyces、Hansenula、Kloeckera、Schwanniomyces和Yarrowia属。在一个其实施方式中，酵母细胞属于选自S.cerevisiae、S.exiguus、S.bayanus、K.lactis、K.marxianus和Schizosaccharomyces pombe的物种。在一个实施方式中，酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae种的。优选地，酵母能够厌氧发酵，更优选厌氧醇性发酵。

“破坏”在本文中理解为意指对活性的任何破坏，包括但不限于缺失、突变、降低所破坏的基因的亲和力和与ALD6mRNA互补的反义RNA的表达。基因破坏株是具有相应基因的一个或更多个破坏的细胞。本文中的对酵母而言为天然的被理解为基因在破坏之前存在于酵母细胞中。其包括以下情形：对酵母而言天然的基因存在于野生型酵母细胞、实验室酵母细胞或工业酵母细胞中。酵母细胞在本文中也可以被称为酵母菌株或作为酵母菌株的部分。

本文描述的本发明的各种实施方式可以交叉组合。

本发明提供了一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

a)对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏；

d)修饰，其导致与不含所述修饰的破坏株酵母相比，3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或3-磷酸甘油脱氢酶活性降低。

在本发明的一个实施方式中，c)中的对酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)是乙醛脱氢酶-6(ALD6)。

具有一种或更多种醛脱氢酶破坏的细胞在本文中被称为破坏株酵母细胞。具有ALD6基因破坏的细胞在本文中也被称为破坏株酵母细胞。

在一个实施方式中，酵母细胞还包含：

e)一种或更多种编码异源木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)的核苷酸序列；

f)一种或更多种编码异源甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)的核苷酸序列；和

g)一种或更多种编码同源或异源二羟丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列。

破坏株酵母细胞可以是单倍体、二倍体或多倍体。在二倍体或多倍体菌株中，在一个实施方式中，特征a)至g)可以单独或以任何组合存在于二倍体或多倍体菌株的一个等位基因中。在另一个实施方式中，其可以在所有等位基因中。对于多倍体菌株，特征a)至g)可单独或以任何组合存在于大多数等位基因中或者少数等位基因中。

下面更详细地描述本发明的这些特征和另一些实施方式。

a)对酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)的破坏

根据本发明被破坏的酶是对酵母而言天然的醛脱氢酶醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)。

在一个实施方式中，对酵母而言天然的醛脱氢酶是乙醛脱氢酶-6(ALD6)。

在本文中，ALD6是催化乙醛脱氢为乙酸盐/酯以及相反过程的任何Mg2+激活的酶。

ALD6反应是：

乙醛<-----ALD6----->乙酸盐/酯 (1)

在不限制本发明的范围的情况下，可以给出以下回顾性解释。如实施例中所示，数学模型证实：降低维持ATP需求会增加糖向乙醇的转化率(参见实施例1)。维持ATP周转的可能来源是无效循环。为了使乙酸盐/酯转化为乙醇，在菌株中引入乙酰化乙醛脱氢酶(例如adhE或acdH)(参见WO2015028583和WO2015028582)。这也在菌株中引入了可能的无效循环，参见图4。

图1显示了参与乙醛-乙酸盐/酯-乙酰-CoA的无效循环，从而引起维持ATP增加的代谢途径的示意图。虚线箭头表示无效循环。将乙酰化乙醛脱氢酶(adhE，acdH)引入菌株中以使乙酸盐/酯向乙醇转化。

在实施例1中，破坏无效循环导致维持ATP减少，从而改善葡萄糖和木糖向乙醇的转化。破坏无效循环的靶标是催化细胞质中乙醛转化为乙酸盐/酯的酶(ALD6)。ACS或乙酰化乙醛脱氢酶不能成为破坏无效循环的靶标，因为这些酶是乙酸盐/酯向乙醇转化途径的部分。

在本发明的一个实施方式中，酵母细胞是这样的菌株，其中通过选自ALD6基因的破坏和与ALD6mRNA互补的反义RNA的表达的方法来降低酵母变体中的ALD6表达。

在本发明的一个实施方式中，酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae的ALD6破坏株。

在另一个实施方式中，酵母细胞是Saccharomyces cerevisiae YD01247ΔALD6或YD01248ΔALD6。表1中给出了另一些酵母中与Saccharomyces cerevisiae的ALD6核苷酸序列具有同一性的适用于破坏的ALD6核苷酸序列。

表1：不同类型酵母中存在的适用于破坏的ALD6核苷酸序列

b)乙醛脱氢酶(乙酰化)(EC 1.2.1.10)

本发明的细胞还包含编码具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酰CoA(和/或乙酸)转化为乙醇的能力。具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶在本文中被理解为催化以下反应的酶(ACDH；EC 1.2.1.10)：

因此，该酶催化乙酰CoA转化为乙醛(和反方向转化)，其也被称为(乙酰化NAD-依赖型)乙醛脱氢酶或乙酰-CoA还原酶。该酶可以是进一步催化乙醛转化为乙醇(和反方向转化；见下文)的双功能酶。为了方便起见，我们在本文中将至少具有将乙酰CoA还原成乙醛或乙醇的能力的酶称为“乙醛脱氢酶”。在本文中还应当理解：细胞具有内源性醇脱氢酶活性，所述活性允许被提供有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酰-CoA转化为乙醇。此外，细胞具有内源性或外源性乙酰-CoA合成酶，其允许被提供有乙醛脱氢酶活性的细胞完成乙酸(经由乙酰-CoA)转化为乙醇。

外源基因可以编码仅具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶(即，仅具有将乙酰CoA还原成乙醛的能力的酶)，例如，由E.coli mhpF基因编码的乙醛脱氢酶。表2中提供了包含具有乙醛脱氢酶活性的单功能酶的原核生物的合适实例。这些单功能酶的氨基酸序列可在公共数据库中获得，并且本领域技术人员可利用其设计编码相应单功能酶的密码子优化的核苷酸序列。

表2：具有乙醛脱氢酶活性且与E.coli mhpF具有同一性的合适酶

序列和生物体	氨基酸同一性(％)
		Escherichia coli K12菌株MG1655亚株	100％
Shigella sonnei	100％
		Escherichia coli IAI39	99％
Citrobacter youngae ATCC 29220	93％
		Citrobacter sp.30_2	92％
Klebsiella pneumoniae 342)	87％
		Klebsiella variicola	87％
Pseudomonas putida	81％
		Ralstonia eutropha JMP134	82％
Burkholderia sp.H160	81％
		Azotobacter vinelandii DJ	79％
Ralstonia metallidurans CH34	70％
		Xanthobacter autotrophicus Py2	67％
Burkholderia cenocepacia J2315	68％
		Frankia sp.EAN1pec	67％
Polaromonas sp.JS666	68％
		Burkholderia phytofirmans PsJN	70％
Rhodococcus opacus B4	64％

在一个实施方式中，细胞包含编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶的外源基因，该基因赋予细胞将乙酰CoA转化为乙醇的能力。使用具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶相较于使用独立的各具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的酶的优点在于：其允许在途径中催化连续反应的酶之间的中间体的直接传递(channeling)，使得有效、专一且受保护的代谢物递送方式成为可能。因此，底物传递减少了中间体的运输时间，防止中间体通过扩散而损失，保护不稳定的中间体免受溶剂，并预先阻止中间体进入竞争性代谢途径。因此，双功能酶相较于单独的乙醛脱氢酶和醇脱氢酶允许更有效地将乙酰CoA转化为乙醇。使用双功能酶的另一个优点是：它也可以在所用条件(厌氧条件和/或分解代谢物阻遏条件)下在具有很少或没有醇脱氢酶活性的细胞中使用。

具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶在本领域中在原核生物和原生动物中是已知的，包括例如由Escherichia coli adhE和Entamoeba histolytica ADH2基因编码的双功能酶(参见例如Bruchaus和Tannich,1994,J.Biochem.303:743-748；Burdette和Zeikus,1994,J.Biochem.302:163-170；Koo等人,2005,Biotechnol.Lett.27:505-510；Yong等人,1996,Proc Natl Acad Sci USA,93:6464-6469)。具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶是由约900个氨基酸组成的较大蛋白质，其是双功能的，因为展示出乙醛脱氢酶(ACDH；EC 1.2.1.10)和醇脱氢酶活性(ADH；EC1.1.1.1)二者。E.coli adhE和Entamoebahistolytica ADH2显示出45％的氨基酸同一性。

表3：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与E.coli adhE具有同一性的合适双功能酶

序列和生物体	氨基酸同一性(％)
		Escherichia coli O157:H7Sakai菌株	100％
Shigella sonnei	100％
		Shigella dysenteriae 1012	99％
Klebsiella pneumoniae 342	97％
		Enterobacter sp.638	94％
Yersinia pestis biovar Microtus 91001菌株	90％
		Serratia proteamaculans 568	90％
Pectobacterium carotovorum WPP14	90％
		Sodalis glossinidius'morsitans'菌株	87％
Erwinia tasmaniensis Et1/99	86％
		Aeromonas hydrophila ATCC 7966	81％
Vibrio vulnificus YJ016]	76％

表4：具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性且与Entamoeba histolytica ADH2具有同一性的合适双功能酶

为了表达编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列，将(待表达的)核苷酸序列置于表达构建体中，其中所述核苷酸序列可操作地连接至合适的表达调控区/序列以确保将表达构建体转化到本发明的细胞中之后，酶表达(参见上文)。用于编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列的合适启动子包括这样的启动子：其优选对分解代谢物(葡萄糖)阻遏不敏感，在厌氧条件下有活性和/或优选不需要木糖或阿拉伯糖进行诱导。上文给出了这样的启动子的例子。

优选地，编码具有乙醛脱氢酶和醇脱氢酶活性的双功能酶或具有乙醛脱氢酶活性的酶的核苷酸序列适合根据目的细胞的密码子使用优化其密码子使用(如上所述)。

c)乙酰-CoA合成酶(EC 6.2.1.1)；

本发明的细胞包含编码具有乙酰-CoA合成酶的特定活性的酶的基因。乙酰-CoA合成酶或乙酸酯-CoA连接酶是参与碳糖代谢的酶(EC6.2.1.1)。其属于酶的连接酶类别，这意味着其催化两个大分子之间新化学键形成。

通过乙酰-CoA合成酶连接的两个分子是乙酸盐/酯和辅酶A(CoA)。包括所有底物和产物的完整反应是：

乙酰-CoA合成酶的Acs1形式由基因ACS1编码，基因ACS1被乙酸盐/酯激活并被葡萄糖失活。乙酰-CoA合成酶的Acs2形式由基因ACS2编码，基因ACS2被乙酸盐/酯激活并被葡萄糖失活。

表5中提供了具有乙酰-CoA合成酶活性的酶的合适实例。

表5：与Saccharomyces cerevisiae的Acs2蛋白具有同一性的合适的ACS。

d)导致3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或3-磷酸甘油脱氢酶活性降低的修饰

破坏株酵母细胞还可以进一步包含这样的修饰，其导致与不含所述修饰的破坏株酵母相比，3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或3-磷酸甘油脱氢酶活性降低。

在该实施方式中，细胞可以包含编码3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或编码3-磷酸甘油脱氢酶基因的一种或更多种内源核苷酸序列的破坏。

在此类实施方式中，NADH-依赖型甘油合成所需的酶活性降低或缺失。可通过以下方法来实现这种酶活性的降低或缺失：修饰编码NAD依赖型3-磷酸甘油脱氢酶活性(GPD)的一个或更多个基因或编码甘油磷酸磷酸酶活性(GPP)的一个或更多个基因，以使得酶表达比在野生型中少得多，或者使得基因编码活性降低的多肽。

这种修饰可以使用公知的生物技术来进行，具体可以包括编码GPD和/或GPP的结构基因的启动子区或编码区的一个或更多个敲除突变或定点诱变。或者，可以通过随机诱变随后选择GPD和/或GPP活性降低或缺失的菌株来获得甘油产生缺陷的酵母菌株。S.cerevisiae GPD1、GPD2、GPP1和GPP2基因示于WO2011010923中，并且在本申请的SEQ IDNO：24-27中公开。

因此，在本发明的细胞中，可以减少特定的3-磷酸甘油磷酸水解酶和/或编码3-磷酸甘油脱氢酶的基因。在本发明的细胞中，在优选厌氧条件下，与除了导致特定活性降低的遗传修饰之外遗传上相同的菌株相比，特定的甘油磷酸脱氢酶活性优选降低为至少0.8、0.5、0.3、0.1、0.05或0.01倍。甘油磷酸脱氢酶活性可以如Overkamp等人(2002,Yeast 19:509-520)所述来测定。

编码甘油磷酸脱氢酶(其活性在本发明的细胞中应降低或失活)的优选基因是vanden Berg和Steensma所述的S.cerevisiae GPD1(1997,Yeast 13:551-559)，其编码氨基酸序列GPD1及其在其他物种中的直系同源物。

表6中提供了属于Saccharomyces、Naumovozyna、Candida Vanderwaltozyma和Zygosaccharomyces属的包含具有甘油磷酸脱氢酶活性的酶的生物体(宿主)的合适实例。

表6：具有甘油磷酸脱氢酶(GPD1)活性的酶

序列和生物体	氨基酸同一性(％)
		S.cerevisiae	100％
Naumovozyma dairenensis	79％
		Naumovozyma castellii	80％
Candida glabrata	77％
		Vanderwaltozyma polyspora	77％
Zygosaccharomyces rouxii	74％
		Saccharomycopsis fibuligera	61％

然而，在一些菌株(例如Saccharomyces、Candida和Zygosaccharomyces的菌株)中，编码甘油磷酸脱氢酶的第二基因(即GPD2)是有活性的，参见例如Overkamp等人(2002，同上)。因此，编码甘油磷酸脱氢酶(其活性在本发明的细胞中应降低或失活)的另一优选基因是Overkamp等人所述的S.cerevisiae GPD2(2002，同上)，其编码氨基酸序列GPD2及其在其他物种中的直系同源物。

表7中提供了属于(Zygo)Saccharomyces和Candida属的包含具有甘油磷酸脱氢酶活性的酶的生物体(宿主)的合适实例。

表7：具有甘油磷酸脱氢酶(GPD2)活性的酶

序列和生物体	氨基酸同一性(％)
		S.cerevisiae	100％
Candida glabrata	75％
		Zygosaccharomyces rouxii	73％
Spathaspora passalidarum	62％
		Scheffersomyces stipitis	61％

在一个实施方式中，细胞是酵母，其中酵母细胞的基因组包含选自GPD1、GPD2、GPP1和GPP2的组的至少一个基因的破坏。

e)木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)

在一个实施方式中，破坏株酵母细胞包含木糖异构酶((E.C.5.3.1.5)；xylA)。

“木糖异构酶”(E.C.5.3.1.5)在本文中被定义为催化D-木糖直接异构化为D-木酮糖和/或相反过程的酶。该酶也被称为D-木糖酮异构酶。本文的木糖异构酶还可以能够催化D-葡萄糖和D-果糖之间的转化(因此可以被称为葡萄糖异构酶)。通常，木糖异构酶需要二价阳离子(例如镁、锰或钴)作为辅因子。

f)甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)

甘油脱氢酶在本文中被理解为催化以下化学反应的酶(EC 1.1.1.6)：

其他常用名包括甘油脱氢酶、NAD⁺-连接的甘油脱氢酶和甘油:NAD+2-氧化还原酶。优选地，遗传修饰引起甘油脱氢酶的过表达，例如，通过编码甘油脱氢酶的核苷酸序列的过表达。编码甘油脱氢酶的核苷酸序列对于细胞来说可以是内源的，或者可以是对细胞而言是异源的甘油脱氢酶。在本发明的细胞中可被破坏的核苷酸序列是例如来自S.cerevisiae的甘油脱氢酶基因(GCY1)，如例如Oechsner等人(1988,FEBS Lett.238:123-128)或Voss等人(1997,Yeast 13:655-672)所述。

g)一种或更多种编码同源或异源二羟丙酮激酶(E.C.2.7.1.28或E.C.2.7.1.29)的核苷酸序列

二羟丙酮激酶在本文中被理解为催化以下化学反应之一的酶：

EC 2.7.1.28 ATP+D-甘油醛<＝>ADP+D-甘油醛3-磷酸酯

EC 2.7.1.29 ATP+甘油酮¹<＝>ADP+甘油酮磷酸酯

¹甘油酮＝二羟丙酮。

其他常用名包括甘油酮激酶、ATP:甘油酮磷酸转移酶和(磷酸化)丙酮醇激酶。应当理解：甘油酮和二羟丙酮是同一种分子。优选地，遗传修饰引起二羟丙酮激酶的过表达，例如，通过编码二羟丙酮激酶的核苷酸序列的过表达。编码二羟丙酮激酶的核苷酸序列对于细胞而言可以是内源的，或者可以是对细胞而言是异源的二羟丙酮激酶。可用于在本发明的细胞中过表达二羟丙酮激酶的核苷酸序列是例如来自S.cerevisiae的二羟丙酮激酶基因(DAK1)和(DAK2)，如例如Molin等人(2003,J.Biol.Chem.278:1415-1423)所述。

表8中提供了具有甘油脱氢酶活性的酶的合适实例。

表8：与Saccharomyces cerevisiae GCY1的Gcy1蛋白具有同一性的合适GCY

表9中提供了具有二羟丙酮激酶活性的酶的合适实例。

表9：与Saccharomyces cerevisiae的Dak1蛋白具有同一性的合适DAK

序列和生物体	同一性(％)	登录号
			Dak1p[Saccharomyces cerevisiae S288c]	100	NP_013641.1
二羟丙酮激酶[Saccharomyces cerevisiae YJM789]	99	EDN64325.1
			DAK1样蛋白[Saccharomyces kudriavzevii IFO 1802]	95	EJT44075.1
ZYBA0S11-03576g1_1[Zygosaccharomyces bailii CLIB 213]	77	CDF91470.1
			推定蛋白[Kluyveromyces lactis NRRL Y-1140]	70	XP_451751.1
推定蛋白[Candida glabrata CBS 138]	63	XP_449263.1
			Dak2p[Saccharomyces cerevisiae S288c]	44	NP_116602.1

现在更详细地描述本发明的一些实施方式。

在一个实施方式中，酵母细胞的总乙醇生产率比相应野生型酵母的总乙醇生产率高至少约20％、至少约50％或至少约100％。

本发明还涉及酵母中一个或更多个ALD6的破坏的用途，所述破坏导致酵母中的无效ATP消耗循环被消除。

本发明是一种酵母细胞，其以比相应野生型酵母更高的速率发酵还含有葡萄糖的糖混合物中的戊糖，所述酵母细胞的特征在于ALD6表达降低。

本发明还是一种从戊糖发酵生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：在合适的发酵条件下，在含戊糖的材料中培养酵母细胞持续足以使戊糖发酵成乙醇的一段时间，所述酵母变体相对于相应的野生型酵母能够以高速率发酵戊糖并且具有降低的ALD6表达。

在破坏株酵母的另一个替代性实施方式中，功能性ALD6的启动子区域被通过下调ALD6基因表达来响应减少的氧的启动子替换。

在破坏株酵母的一个替代性实施方式中，可通过使用反义构建体来下调ALD6的表达，其中在响应减少的氧的启动子的调控下表达编码用于ALD6的反义链的部分或全部。在这种实施方式中，ALD6的反义mRNA在氧受限条件下表达，从而使功能性ALD6失活。

本发明的酵母细胞是ALD6破坏株。ALD6破坏株意指这样的变体，其中天然基因的部分或全部被去除或被其表达不产生具有天然ALD6的任何功能的表达产物的DNA替换。

“野生型”酵母是指本发明的酵母细胞所源自的具有正常水平的功能性ALD6的发酵戊糖的酵母菌株。在某些情况下，本专利申请中定义的“野生型酵母”可以包括诱变的酵母。例如，Saccharomyces cerevisiae菌株YD01247和YD01248本身是突变的酵母菌株。然而，YD01247或YD01248也是本文定义的野生型酵母，因为其是用于开发本发明的酵母细胞的具有正常水平的功能性ALD6的发酵戊糖的酵母。

根据实施例，天然ALD6活性的破坏导致C5/C6发酵的发酵时间更短和/或导致酵母细胞共消耗戊糖和葡萄糖。

获得了生成的酵母细胞(在实施例中被命名为YD1247ΔALD6和YD1248ΔALD6)，并且如下文实施例中所详述进行表征。考虑到的是：特征在于功能性ALD6基因表达降低且总乙醇产率增加的S.cerevisiae酵母细胞可用除利用破坏盒通过一步法位点特异性整合来消除ALD6基因之外的手段来获得。例如，缺乏功能性ALD6的变体或以降低的水平表达ALD6的变体可通过本领域已知的几种方式中的任何一种获得，例如使酵母细胞暴露于DNA嵌合剂或用紫外线照射酵母细胞。基于菌落大小和其他形态模式(即，小菌落(petite)尺寸、具有起皱外观的黄色菌落)，可将ALD6缺陷细胞与野生型细胞区分开。基于这种独特的表型推测鉴定的ALD6缺陷菌落可以通过例如ALD6活性测定来确认。

破坏株酵母细胞通常含有非酵母天然的戊糖代谢途径的基因和/或允许酵母细胞转化戊糖的基因。在一个实施方式中，酵母细胞可以包含一个或或两个或更多个拷贝的一种或更多种木糖异构酶和/或一个或两个或更多个拷贝的一种或更多种木糖还原酶和木糖醇脱氢酶基因，从而允许酵母细胞转化木糖。在其一个实施方式中，这些基因可以整合到酵母细胞基因组中。在另一个实施方式中，酵母细胞包含基因araA、araB和araD。然后其能够发酵阿拉伯糖。在本发明的一个实施方式中，酵母细胞包含xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因，以允许酵母细胞发酵木糖；缺失醛糖还原酶(GRE3)基因；过表达PPP-基因、TAL1、TKL1、RPE1和RKI1以允许细胞中通过戊糖磷酸途径的通量增加，和/或过表达GAL2和/或缺失GAL80。因此，虽然包含上述基因，但是可以在对于(野生型)酵母细胞而言是非天然的酵母细胞中引入合适的戊糖或其它代谢途径。根据一个实施方式，下列基因可通过引入宿主细胞中而引入破坏株酵母细胞中：

1)由PPP-基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1组成的簇，任选地受强组成型启动子的控制；

2)受强组成型启动子控制的由xylA-基因组成的簇；

3)受强组成型启动子控制的包含XKS1-基因的簇；

4)受强组成型启动子控制的由基因araA、araB和araD组成的簇；

5)醛糖还原酶基因的缺失。

上述破坏株细胞可以使用已知的重组表达技术来构建。ALD6的破坏可以在任何1)-5)的修饰之前、同时或之后进行。

可以使根据本发明的酵母细胞经受进化工程以改善其性质。进化工程方法是已知的方法。进化工程是这样的一种方法，其中微生物(本文中是酵母)的工业相关表型可以通过合理地建立自然选择的过程而与比生长速率和/或对营养物的亲和性偶联。例如Kuijper,M等人,FEMS Yeast Research 5(2005)925-934、WO2008041840和WO2009112472中详细描述了进化工程。在进化工程之后分离产生的发酵戊糖的酵母细胞。分离可以以任何已知的方式执行，例如，通过从进化工程中使用的酵母细胞培养液中分离细胞，例如通过取细胞样品或通过过滤或离心。

在一个实施方式中，酵母细胞不含标记。在本文中使用时，术语“标记”是指编码允许选择或筛选含有标记的宿主细胞的性状或表型的基因。不含标记意味着标记基本上不存在于酵母细胞中。当抗生素标记已用于构建酵母细胞并且随后被去除时，不含标记是特别有利的。可以使用任何合适的现有技术(例如，分子内重组)去除标记。

在一个实施方式中，基于抑制剂耐受宿主细胞构建工业酵母细胞，其中构建如下文所述进行。抑制剂耐受宿主细胞可以通过筛选菌株在含有抑制剂的材料上的生长来选择，例如,Appl.Biochem.Biotechnol.(2007),第136-140卷,847-858中所示，其中选择了抑制剂耐受S.cerevisiae菌株ATCC 26602。

酵母细胞还可包含将丙酮酸转化为期望的发酵产物所需的那些酶活性，所述发酵产物例如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、富马酸、苹果酸、衣康酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、β-内酰胺抗生素或头孢菌素。

在一个实施方式中，酵母细胞来源于工业酵母。工业细胞和工业酵母细胞可以如下所定义。(酵母)细胞在工业方法中的生存环境与在实验室中的生存环境显著不同。工业酵母细胞必须能够在多种环境条件下表现良好，所述环境条件可以在方法期间变化。这种变化包括营养源、pH、乙醇浓度、温度、氧浓度等的变化，它们共同对Saccharomycescerevisiae的细胞生长和乙醇生产具有潜在的影响。在不利的工业条件下，环境耐受菌株应当允许稳健的生长和生产。对于使用工业酵母菌株的应用中(诸如烘焙工业、酿造工业、酿酒和乙醇工业中)可能出现的这些环境条件变化，工业酵母菌株通常更稳健。在一个实施方式中，基于工业宿主细胞构建工业酵母细胞，其中构建如下文所述进行。工业酵母(S.cerevisiae)的例子有Ethanol(Fermentis)(DSM)和(Lallemand)。

根据本发明的酵母细胞优选是抑制剂耐受的，即它们能经得起在使用常见预处理和水解条件时典型水平的常见抑制剂，使得酵母细胞能够具有广泛的应用，即其具有针对不同原料、不同预处理方法和不同水解条件的高应用性。在一种实施方式中，酵母细胞是抑制剂耐受的。抑制剂耐受是对抑制性化合物的抗性。木质纤维素中抑制性化合物的存在和水平可随着原料、预处理方法、水解过程的变化而广泛改变。抑制剂类别的例子是羧酸、呋喃和/或酚类化合物。羧酸的例子是乳酸、乙酸或甲酸。呋喃的例子是糠醛和羟基-甲基糠醛。酚类化合物的例子是香草醛(vannilin)、丁香酸、阿魏酸和香豆酸。抑制剂的典型用量对于羧酸而言是每升若干克到每升20克或更多，取决于原料、预处理和水解条件。对呋喃而言是每升数百毫克到每升数克，取决于原料、预处理和水解条件。对酚类而言是每升数十毫克到每升一克，取决于原料、预处理和水解条件。

在一个实施方式中，酵母细胞是天然能够进行醇性发酵、优选地能够进行厌氧醇性发酵的细胞。酵母细胞优选地具有对乙醇的高度耐受，对低pH(即能够在低于约5、约4、约3、或约2.5的pH下生长)和对有机酸的高度耐受，和/或对提高的温度的高度耐受。

酵母细胞的任何上述特征或活性可天然存在于细胞中，或可通过遗传修饰被引入或修饰。

重组表达

酵母细胞是重组细胞。也就是说，酵母细胞包含不天然地存在于所讨论的细胞中的核苷酸序列，或用所述核苷酸序列转化，或用所述核苷酸序列遗传修饰。

用于在细胞中重组表达酶以及用于对酵母细胞进行其他遗传修饰的技术是本领域技术人员公知的。通常，此类技术涉及用包含相关序列的核酸构建体转化细胞。此类方法例如从标准手册中获知，例如Sambrook和Russel(2001)"Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第3版),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press或者F.Ausubel等人编,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。转化和遗传修饰真菌宿主细胞的方法从例如EP-A-0635 574、WO 98/46772、WO 99/60102、WO 00/37671、WO90/14423、EP-A-0481008、EP-A-0635574和US 6,265,186中获知。

生物制品生产

许多年来，已经建议引入多种生物体用于从作物糖生产生物乙醇。然而在实践中，所有主要的生物乙醇生产方法继续使用Saccharomyces属的酵母作为乙醇生产者。这归因于Saccharomyces种对工业方法而言的许多有吸引力的特征，即高度的酸、乙醇和渗透耐性，厌氧生长的能力，以及当然其高的醇性发酵能力。作为宿主细胞的优选的酵母物种包括S.cerevisiae、S.bulderi、S.barnetti、S.exiguus、S.uvarum、S.diastaticus、K.lactis、K.marxianus或K.fragilis。

酵母细胞可以是适合生产乙醇的细胞。然而，酵母细胞可适用于生产除乙醇以外的发酵产物。

这类非乙醇发酵产物原则上包括可由真核微生物如酵母或丝状真菌生产的任何散装(bulk)或精细化学品。

用于生产非乙醇发酵产物的优选酵母细胞是下述宿主细胞，所述宿主细胞含有导致降低的醇脱氢酶活性的遗传修饰。

木质纤维素

可以被认为是潜在的可再生原料的木质纤维素通常包含多糖纤维素(葡聚糖)和半纤维素(木聚糖、杂木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纤维素可以作为葡甘露聚糖(glucomannans)存在于例如木材衍生的原料中。这些多糖成为可溶糖(包括单体和多聚体，例如葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解发生于共同作用的不同酶的作用下。

另外，果胶和其他果胶物质如阿拉伯聚糖(arabinans)可占来自非木本植物组织典型的细胞壁干物质的可观的比例(约四分之一到一半的干物质可以是果胶)。

预处理

在酶处理之前，可对木质纤维素材料进行预处理。预处理可包括将木质纤维素材料暴露于酸、碱、溶剂、热、过氧化物、臭氧、机械击打、粉碎、研磨或快速降压，或其中任何两种或更多种的组合。这种化学预处理通常与热预处理(例如150-220℃之间1到30分钟)组合。

酶促水解

通常使预处理的材料经受酶促水解以释放根据本发明可被发酵的糖。这可用常规方法进行，所述常规方法例如与纤维素酶，例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和任选地其他酶接触。可在环境温度或更高温度下，在释放足够量的糖的反应时间下，进行利用纤维素酶的转化。酶促水解的结果是在本文中被命名为糖组合物的包含C5/C6糖的水解产物。

糖组合物

根据本发明使用的糖组合物包含葡萄糖以及一种或更多种戊糖，例如阿拉伯糖和/或木糖。在本发明中可以使用满足这些标准的任何糖组合物。糖组合物中任选的糖是半乳糖和甘露糖。在一种优选的实施方式中，糖组合物是一种或更多种木质纤维素材料的水解物。此处木质纤维素包括半纤维素和生物质的半纤维素部分。木质纤维素还包括生物质的木质纤维素级分。合适的木质纤维素材料可存在于以下列表中：果园底料，树丛，磨坊废弃物，城市木材废弃物，市政废弃物，伐木废弃物，森林疏伐废弃物，短期轮种木本作物，工业废弃物，小麦秸，燕麦秸，水稻秸，大麦秸，黑麦秸，亚麻秸，大豆壳，稻壳，水稻秸，玉米谷蛋白饲料，燕麦壳，甘蔗，玉米秸秆，玉米杆，玉米芯，玉米壳，柳枝稷，芒草，高粱，芸苔茎，大豆茎，牧场草，磨擦禾，狐尾草；甜菜浆，柑橘果实浆，种子壳，纤维素动物粪便，草坪修剪废弃物，棉花，海草，树木，软木材，硬木材，白杨，松树，灌木丛，草，小麦，小麦秸，甘蔗渣，玉米，玉米壳，玉米棒，玉米粒，来自谷粒的纤维，来自谷物湿磨或干磨的产物和副产物，市政固体废弃物，废纸，庭院废弃物，草本材料，农业残余物，林业残余物，市政固体废弃物，废纸，纸浆，造纸厂残余物，树枝，灌木，甘蔗，玉米，玉米壳，能源作物，森林，水果，鲜花，谷物，草，草本作物，叶，树皮，针叶，原木，根，树苗，灌木丛，柳枝稷，树木，蔬菜，水果皮，藤蔓，甜菜浆，小麦麸皮，燕麦壳，硬木材或软木材，由农业加工产生的有机废弃物材料，林业木材废弃物，或其中任意两种或更多种的组合。

表10中给出了源自木质纤维素的一些合适的糖组合物及其水解物的糖组合物的概况。所列出的木质纤维素包括：玉米芯、玉米纤维、稻壳、瓜皮(melon shells)、甜菜浆、小麦秸、甘蔗渣、木材、草和橄榄压制物(olive pressings)。

表10：来自木质纤维素材料的糖组合物的概况。Gal＝半乳糖，Xyl＝木糖，Ara＝阿拉伯糖，Man＝甘露糖，Glu＝谷氨酸盐/酯，Rham＝鼠李糖。给出了半乳糖百分比(％Gal)。

表10表明：在这些木质纤维素中，高量的糖以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖的形式存在。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和半乳糖向发酵产物的转化因而具有巨大的经济重要性。甘露糖也在一些木质纤维素材料中存在，其通常比上述提到的糖以较低的量存在。因而甘露糖也被酵母细胞转化是有利的。

预期可进一步操作处理本发明的酵母细胞，以实现其他期望的特征或甚至更高的总乙醇产率。

通过在含有水解物的培养基上对酵母细胞传代选择改进的酵母细胞已导致具有增强的发酵率的改进的酵母。使用本发明的教导，人们可容易地得到此类改进的菌株。

含有戊糖的材料表示不管是液体还是固体的包含戊糖的任何基质。合适的含戊糖的材料包括木质纤维素生物质，比如玉米壳、木材、纸、农业副产物等等或多糖的水解物。

本文中使用的“水解物”表示已通过添加水被解聚而形成单糖和寡糖的多糖。通过含多糖的材料的酶促或酸水解，可产生水解物。

优选地，酵母细胞能在与工业戊糖来源中发现的那些条件类似的条件下生长。当含有戊糖的材料可用酵母变体接种而没有过多的操作时，本发明的方法是最经济的。例如，制浆工业产生大量的纤维素废物。通过酸水解对纤维素糖化产生可用在发酵反应中的己糖和戊糖。但是，水解物或亚硫酸盐液含有天然存在于木材中的高浓度的亚硫酸盐和酚类抑制剂，所述抑制剂抑制或防止大多数生物生长。下文的例子描述了通过本发明的酵母细胞的硬木材和软木材的酸水解物(亚硫酸盐废液)中的戊糖的发酵。可以合理地预期：能在亚硫酸盐废液中生长的酵母菌株预计在几乎任何其他生物质水解物中生长。

增殖

本发明还涉及有氧增殖乙酸盐/酯消耗酵母的方法，特别是有氧增殖破坏株酵母菌株的方法。

本文中的增殖是导致起始酵母菌群增加的任何酵母生长的方法。增殖的主要目的是利用酵母作为活的生物体的自然繁殖能力来增加酵母菌群。可存在其它的增殖原因，例如，如果使用干酵母，那么在使酵母生长之前，利用增殖来使酵母再水化和适应。新鲜酵母(活性干酵母或湿饼(wet cake))可被加入以直接启动增殖。

增殖条件对最佳的酵母生产和随后的发酵(例如将木质纤维素水解物发酵为乙醇)很关键。它们包括适当的碳源、通气、温度和营养添加。增殖罐的尺寸通常在(木质纤维素水解物向乙醇)发酵器尺寸的2％和5％之间。

在增殖过程中，酵母需要碳源。在本文中，碳源可以包含甘油和/或乙酸盐/酯和/或糖(C6和C5糖)。也可以使用其他碳源。细胞壁生物合成以及蛋白质和能量的生产需要碳源。

增殖是有氧过程，因此增殖罐必须适当通气以维持一定水平的溶氧。通常通过在进入增殖罐的管道上安装空气引导器来实现适当的通气，所述引导器在增殖罐填充时和循环期间将空气引入增殖混合物中。增殖混合物保持溶氧的能力是加入空气的量和混合物的稠度的函数，这就是为什么经常以50:50至90:10之间的糊状物与水的比率加入水。“粘稠的”增殖混合物(80:20的糊状物与水的比率以及更高)经常需要加入压缩空气以弥补降低的保持溶氧的能力。增殖混合物中溶氧的量还是气泡大小的函数，因此一些乙醇工厂通过喷洒器加入空气，所述喷洒器与空气引导器相比产生较小气泡。伴随较低的葡萄糖，适当通气对促进有氧呼吸很重要，这与发酵的相对地厌氧环境不同。通气不足或高葡萄糖浓度的一个标志是增殖罐中增加的乙醇产率。

通常在增殖期间，酵母需要舒适的温度来生长和代谢，例如增殖反应器中的温度在25-40℃之间。较低温度通常导致较慢的代谢和减少的增殖，而较高温度能够引起压力化合物(stress compounds)的产生和增殖减少。在一种实施方式中，增殖罐在室内并被保护不受盛夏或寒冬温度的伤害，因此维持在30-35℃范围内之间的最适温度通常不是难题。

可以在酵母增殖正常进行时进行进一步增殖。

发酵

根据本发明的酵母细胞是能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的发酵戊糖和葡萄糖的酵母细胞。此外，本发明涉及发酵根据本发明的酵母细胞的方法，其中相对于野生型酵母的相应发酵，基本上完全发酵乙酸盐/酯、戊糖和己糖的发酵时间减少。在一个实施方式中，发酵时间减少40％或更多。在一个优选的发酵方法中，戊糖和葡萄糖被共发酵。在该方法的一个实施方式中，总乙醇生产率比利用相应野生型酵母的方法的总乙醇生产率高至少约20％、至少约50％或约100％。在该方法的一个实施方式中，含戊糖的材料包含木质纤维素材料的水解物。水解物可以是木质纤维素材料的酶促水解物。

发酵方法可以是需氧或厌氧的发酵方法。厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时运行，或者其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，更优选地消耗0mmol/L/h(即氧消耗不可检出)，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种用途。在不存在氧时，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能够被氧化性磷酸化反应氧化。为了解决这一问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD⁺。

因此，在一种优选的厌氧发酵方法中，丙酮酸被用作电子(和氢受体)，并且被还原成发酵产物如乙醇、丁醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、苹果酸、延胡索酸、氨基酸和乙烯。

发酵方法优选地在对细胞而言最适的温度下进行。因此，对大部分酵母或真菌宿主细胞而言，发酵方法在低于约42℃、优选地低于约38℃的温度下进行。对酵母或丝状真菌宿主细胞而言，发酵方法优选地在低于约35、约33、约30或约28℃的温度且高于约20、约22或约25℃的温度下进行。

在所述方法中，基于木糖和/或葡萄糖的乙醇产率优选地为至少约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或约98％。乙醇产率在本文中被定义为理论最大产率的百分比。

本发明还涉及用于生产发酵产物的方法。

根据本发明的方法可以在需氧和厌氧条件下进行。在一种实施方式中，所述方法在微需气(micro-aerophilic)或氧受限的条件下进行。

厌氧发酵方法在本文中被定义为这样的发酵方法，其在不存在氧时进行，或其中基本不消耗氧，优选地消耗少于约5、约2.5或约1mmol/L/h，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。

氧受限的发酵方法是下述方法，其中氧消耗受到从气体到液体的氧转移的限制。氧受限的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧受限条件下的方法中，氧消耗速率为至少约5.5、更优选地至少约6、如至少7mmol/L/h。本发明的方法可包括发酵产物的回收。

在一个优选的方法中，细胞发酵木糖以及葡萄糖二者，优选地同时发酵，在这种情况下优选地使用下述细胞，所述细胞对葡萄糖阻遏不敏感从而防止二次生长(diauxicgrowth)。除了作为碳源的木糖(和葡萄糖)来源以外，发酵培养基还会包含细胞生长所需的适当成分。用于微生物(如酵母)生长的发酵培养基的组成是本领域公知的。

发酵方法可以以分批、补料分批或连续的方式进行。也可以使用分离水解和发酵(SHF)方法或同时糖化和发酵(SSF)方法。也可以使用这些发酵方法模式的组合用于最佳生产力。这些方法在下文更详细地描述。

SSF模式

对同时糖化和发酵(SSF)的模式而言，液化/水解或预糖化步骤的反应时间取决于实现期望产率(即纤维素向葡萄糖的转化产率)的时间。这类产率优选地尽可能高，优选地为60％或更多，65％或更多，70％或更多，75％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，95％或更多，96％或更多，97％或更多，98％或更多，99％或更多，甚至99.5％或更多或99.9％或更多。

根据本发明，在SHF模式下实现了非常高的糖浓度，在SSF模式下实现了非常高的产物浓度(例如乙醇)。在SHF操作中，葡萄糖浓度是25g/L或更高，30g/L或更高，35g/L或更高，40g/L或更高，45g/L或更高，50g/L或更高，55g/L或更高，60g/L或更高，65g/L或更高，70g/L或更高，75g/L或更高，80g/L或更高，85g/L或更高，90g/L或更高，95g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，或者可以例如是25g/L-250g/L，30gl/L-200g/L，40g/L-200g/L，50g/L-200g/L，60g/L-200g/L，70g/L-200g/L，80g/L-200g/L，90g/L-200g/L。

SSF模式中的产物浓度

在SSF操作中，产物浓度(g/L)取决于生产的葡萄糖量，但因为在SSF中糖被转化成产物，所以这是不可见的，并且产物浓度可以通过与理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)相乘而与潜在的葡萄糖浓度相关。

发酵产物的理论最大产率(以gr产物/克葡萄糖计的Yps最大)可源自生物化学教科书。对乙醇而言，1摩尔葡萄糖(180gr)根据酵母中正常的糖酵解发酵途径产生2摩尔乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理论最大产率为92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。

对丁醇(MW 74gr/摩尔)或异丁醇而言，理论最大产率是每摩尔葡萄糖1摩尔丁醇。因此，(异)丁醇的Yps最大＝74/180＝0.411gr(异)丁醇/gr葡萄糖。

对乳酸而言，纯乳酸发酵(homolactic fermentation)的发酵产率是每摩尔葡萄糖2摩尔乳酸(MW＝90gr/摩尔)。根据所述化学计量法，Yps最大＝1gr乳酸/gr葡萄糖。

对其他发酵产物而言，可以进行类似的计算。

SSF模式

在SSF操作中，产物浓度为25g*Yps g/L/L或更高，30*Yps g/L或更高，35g*Yps/L或更高，40*Yps g/L或更高，45*Yps g/L或更高，50*Yps g/L或更高，55*Yps g/L或更高，60*Yps g/L或更高，65*Yps g/L或更高，70*Yps g/L或更高，75*Yps g/L或更高，80*Yps g/L或更高，85*Yps g/L或更高，90*Yps g/L或更高，95*Yps g/L或更高，100*Yps g/L或更高，110*Yps g/L或更高，120g/L*Yps或更高，或者可以例如是25*Yps g/L-250*Yps g/L，30*Yps gl/L-200*Yps g/L，40*Yps g/L-200*Yps g/L，50*Yps g/L-200*Yps g/L，60*Yps g/L-200*Yps g/L，70*Yps g/L-200*Yps g/L，80*Yps g/L-200*Yps g/L，90*Yps g/L，80*Ypsg/L-200*Yps g/L。

因此，本发明提供了用于制备发酵产物的方法，所述方法包括：

a.使用本文所述的方法降解木质纤维素；和

b.发酵所得到的材料，

从而制备发酵产物。

发酵产物

本发明的发酵产物可以是任何有用的产物。在一种实施方式中，其为选自以下的产物：乙醇，正丁醇，异丁醇，乳酸，3-羟基-丙酸，丙烯酸，乙酸，琥珀酸，富马酸，苹果酸，衣康酸，马来酸，柠檬酸，己二酸，氨基酸例如赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苏氨酸和天冬氨酸，1,3-丙二醇，乙烯，甘油，β-内酰胺抗生素和头孢菌素，维生素，药物，动物饲料补充剂，特种化学品，化学原料，塑料，溶剂，燃料包括生物燃料和沼气或有机聚合物，和工业酶例如蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂合酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。

发酵产物的回收

对发酵产物的回收而言，使用现有的技术。对不同的发酵产物而言，适用不同的回收方法。现有的从水性混合物中回收乙醇的方法通常使用分级和吸附技术。例如，可以使用发酵醪蒸馏器(beer still)加工在水性混合物中含有乙醇的发酵产物，以生产富集的含有乙醇的混合物，所述富集的含有乙醇的混合物随后进行分级(例如分级分馏或其他类似的技术)。接着，含有最高浓度乙醇的级分可以经过吸附剂，从乙醇中去除大部分(如果不是所有的话)剩余的水。

以下非限制性实施例旨在仅仅是示例性的。

实施例

数学模型的描述

根据最小-模型方法建立了发酵木糖并转化乙酸甘油酯的酵母菌株的数学模型描述。图1示出了模型中包括的集中途径的图示。模拟了以下途径：1.)葡萄糖摄取和代谢(上游-糖酵解)，2.)木糖摄取和代谢，3.)甘油摄取和代谢，4.)乙醇形成(下游糖酵解)，5.)乙酸盐/酯摄取和代谢，6.)生物质形成，7.)用于维持的ATP周转，8.)CO2和乙醇产生。

用于模拟生物质比速率的数学公式为：

基于1:1的摩尔:摩尔比由乙醇形成速率计算CO2损失。

使用表11中列出的转换因子进行由g到Cmol的单位转换。生物质形成的ATP成本被设定为0.00675mol ATP/gDW。每生物质合成的NADH生成被设定为3e-3mol/gDW。

表11，g到Cmol的单位转换

代谢物	摩尔重量(g/mol)	Cmol/mol	Cmol/g
				葡萄糖	180	6	0.033
木糖	150	5	0.033
				甘油	92	3	0.033
乙酸盐/酯	60	2	0.033
				乙醇	46	2	0.043
生物质	--	--	0.037

通过最小化糖、乙醇、甘油和乙酸盐/酯浓度的时程数据和模型预测之间的误差来估计参数值。参数值和初始条件分别列在表12和表13中。

使用MATLAB版本R2012A(Mathworks)来实施该模型，使用数值ODE求解器：ODE15s求解常微分方程。

表12：数学模型中使用的参数值

表131：典型发酵培养液的初始条件

^#根据以下关系计算细胞内[ADP]：[ADP](mol/gDW)＝1e-6-ATP

^*根据以下关系计算细胞内[NAD]：[NAD](mol/gDW)＝1e-6-[NADH]

材料和方法

一般分子生物学技术

除非另有说明，否则所用的方法是标准的生物化学技术。合适的一般方法学课本的例子包括Sambrook等人[1]和Ausubel等人[2]。

培养基

使用液体YEPhD培养基(10g/l酵母提取物、20g/l植物蛋白胨和20g/l葡萄糖)进行转化体的选择和增殖。为了获得固体培养基，在灭菌之前向液体培养基中加入15g/l琼脂。添加腐草霉素至终浓度为60μg/ml以选择zeoMX标记。

在生长实验之前使用GAST培养基作为预培养基(组成如表9所示)。在厌氧生长实验期间，使用补充有组氨酸(200mg/L)、尿素(2.325g/L)、麦角甾醇(0.01g/L)和Tween80(0.42g/l)的如Verduyn等[3]所述的矿质培养基。根据所示加入糖、甘油和乙酸。

表14：GAST培养基的组成

完全培养基	g/kg	1	0.25
				MES水合物	20	20	5
K2HPO4	2	2	0.5
				NaH2PO4.1水	1	1	0.25
酵母提取物	1	1	0.25
				硫酸铵	7.5	7.5	1.875
痕量元素溶液TE-SF	2	2	0.5
				维生素Ca Mg储液100x FS	10	10	2.5
用4N KOH将pH调节至pH为6
				淀粉(Zulkowsky)	30	30	7.5
以kg准备		1

溶解除淀粉以外的所有组分，调节pH，加入淀粉并过滤灭菌

在就要开始实验之前加入葡糖淀粉酶(20-50μl/L)

葡糖淀粉酶储液(CGR的HAS GLA)含有5000GA/ml

使用预处理的玉米秸秆水解物作为发酵培养基(组成示于表10中)。通过在4520xg下离心30分钟来除去水解物中的悬浮固体，随后在发酵前过滤(106μm)上清液。使用氨将培养基的pH调节至5.5，氨在生长过程中也起氮源的作用。加入新霉素(50ug/mL)和青霉素-G(100ug/mL)以防止发酵过程中的细菌污染。加入组氨酸(200mg/mL)以补充酵母营养缺陷型，加入硅酮消泡剂以防止发酵瓶中起泡。

表15：pCS水解物的组成

菌株

表16提供了这些实验中使用的菌株的概况。RN1069是参照菌株。其是缺乏在厌氧条件下消耗甘油和乙酸的能力的葡萄糖、木糖转化菌株。如WO2015028583和WO2015028582中所述，通过在RN1069中引入甘油和乙酸途径基因来构建YD01247和YD01248。从这些专利申请中可以明显看出：两种菌株之间引入的基因是不同的。YD01247含有来自E.coli的双功能adhE基因和来自Y.lypolitica的DAK1基因，而YD01248含有来自L.plantarum的acdH基因和来自S.cerevisiae的DAK1的过表达。

表16.使用的菌株及其遗传背景

整合构建体与选择

基于图2所示构建体，利用同源重组实现了ALD6的缺失。图2显示了该方法的示示意图：使用zeoMX标记缺失ALD6。这些修饰被引入YD01247、YD01248中。

zeoMX标记被用于选择。

转化后，通过PCR核实正确的整合。挑选了几个独立的转化体。基于在厌氧生长实验中的性能来选择要在AFM中检测的转化体。

生长实验

在生长实验之前，使转化体和参照菌株在30℃下在YEPhD琼脂孔板上生长过夜。将参照菌株以5倍涂布在琼脂孔板上，但将独立的转化体以单倍涂布。

使用针式工具(pintool)从96孔MTP样式中的琼脂孔板接种液体GAST培养基预培养物。将预培养板在Infors培养箱中，在30℃、250rpm和80％湿度下，在需氧条件下孵育72小时。

使用机器人接种装置，将5μl预培养物接种在主培养板中。在主培养板中使用以下生长培养基，每个孔270μl：

-Verduyn+2％葡萄糖，2％木糖，2g/l HAc，pH 4.5

-Verduyn+2％葡萄糖，2％木糖，1％甘油，2g/l HAc，pH 4.5。

为每种培养基和每个样品点(24小时、48小时和72小时)准备一个板，从而产生共六个主培养板。

将主培养板在Infors振荡培养箱中在30℃、250rpm、80％湿度下孵育，用氮气冲洗培养箱以获得(并保持)厌氧条件。在24小时、48小时和72小时后离心沉降主培养板。将150μl上清液加入每孔含有400μl D₂O的96孔深孔板中。还向每个样品中加入100μl NMR标准品(20g/l马来酸)。利用NMR分析来测定每个样品的残余糖浓度、甘油浓度、乙酸浓度和乙醇浓度。

NMR分析

为了定量样品中的葡萄糖、木糖、甘油、乙酸和乙醇，将100μl样品精确转移到合适的小瓶中。随后加入100μL在D₂O中的内标溶液和450μL D₂O，所述内标溶液含有马来酸(20g/l)、EDTA(40g/l)和痕量DSS(4,4-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸)。

在27℃的温度下，使用具有水抑制的脉冲程序(功率对应于3Hz)，在配备有冷冻探针的Bruker Avance III 700MHz上记录1D ¹H NMR谱。

基于以下信号(δ相对于DSS)计算分析物浓度：

-在5.22ppm处的α-葡萄糖峰(d,0.38H,J＝4Hz)，

-在5.18ppm处的α-木糖峰(d,0.37H,J＝4Hz)，

-在3.55ppm处的甘油峰(dd,2H,J_1,2＝6Hz和J_1a,1b＝12Hz)

-在1.91ppm处的乙酸峰(s,3H)

-在1.17ppm处的乙醇峰(t,3H,J＝7Hz)

用于标准品的信号：

-在6.05ppm处的马来酸峰(s,2H)。

用于AFM实验的酵母培养

将菌株(参见表5)从相应的甘油储液中划线在YEPhD琼脂板上，并将板在30℃下孵育72小时。使用来自YEPhD琼脂板的细胞划线接种200mL矿物培养基。将这些预培养物在振荡培养箱中在32℃和200rpm下孵育过夜。通过离心收获细胞并用ddH₂O洗涤。然后使用约1/3的培养体体将细胞沉淀物悬浮在ddH₂O中。使用酵母悬浮物的OD700值以及之前确定的OD700与酵母生物量之间的线性相关来计算发酵的接种体体。

在AFM实验期间使用下列菌株：

1.YD01248(参照物)

2.YD01248(ald6::loxPzeoMXloxP)col.#7

3.YD01247(参照物)

4.YD01247(ald6::loxPzeoMXloxP)col.#2

AFM条件

向500mL发酵烧瓶中装入400mL水解物并以0.5g/L的酵母生物质浓度接种。将发酵培养基保持在32℃并以250rpm搅拌，在发酵期间不控制pH。除了在线记录通过AFM产生的CO₂(与乙醇(EtOH)和生物质形成相关联)之外，在发酵过程中以6小时的间隔频率取样以监测酵母生长、底物利用和产物形成。总发酵时间是72小时。

实施例1

减少维持ATP对葡萄糖和木糖转化率的建模影响

用数学模型进行模拟以鉴定改善甘油和乙酸盐/酯转化酵母菌株的葡萄糖和木糖转化率的机会。模拟表明：细胞的高维持ATP需求延迟了木糖和葡萄糖向乙醇的转化(参见图3)。图3显示了参照维持ATP需求(黑色线)、减少10％的维持ATP需求(灰色虚线)和减少50％的维持ATP需求(黑色虚线)的发酵性能预测。通过将模型参数k1(参见表2)分别设置为5.4e-3和3e-3(mol/gDW/小时)来实现维持ATP减少10％和50％。这些结果清楚地表明：降低维持ATP需求增加了糖向乙醇的转化率。维持ATP即使小幅减少(-10％)就已经具有显著效果。

实施例2

鉴定破坏无效循环作为降低的维持ATP需求的靶标

数学模型预测：降低维持ATP需求会增加糖向乙醇的转化率(参见实施例1)。维持ATP周转的可能来源是无效循环。为了使乙酸盐/酯转化为乙醇，将乙酰化乙醛脱氢酶(例如，adhE或acdH)引入菌株中(参见WO2015028583和WO2015028583)。这还在菌株中引入了可能的无效循环，参见图4。

图3显示了参与乙醛-乙酸盐/酯-乙酰-CoA的无效循环的代谢途径，从而引起维持ATP增加的示意图。虚线箭头表示无效循环。将乙酰化乙醛脱氢酶(adhE，acdH)引入菌株中以使乙酸盐/酯向乙醇转化。

预期破坏无效循环会减少维持ATP，从而改善葡萄糖和木糖向乙醇的转化(实施例1)。破坏无效循环的靶标是催化细胞质中乙醛转化为乙酸的酶(ALD6)。ACS或乙酰化乙醛脱氢酶不能成为破坏无效循环的靶标，因为这些酶是乙酸盐/酯向乙醇转化途径的部分。

实施例3

ALD6敲除菌株的AFM试验

为了通过实验核实ALD6缺失会提高糖向乙醇的转化率这一模型预测，在AFM中检测以下菌株：

1.YD01248(参照物)

2.YD01248(ald6::loxPzeoMXloxP)col.#7，本文中的“YD01248ΔALD6”

3.YD01247(参照物)

4.YD01247(ald6::loxPzeoMXloxP)col.#2，本文中的“YD01247ΔALD6”。

每6小时取样进行HPLC分析，以测定残糖浓度和乙醇形成。结果示于图5中。图5显示了参照物(YD01248，YD01247；透明线)和ALD6缺失菌株(YD01248ΔALD6，YD01247ΔALD6；实线)之间的糖消耗和乙醇形成速率的比较。

表12总结了在48小时和72小时时，参照物相对于ALD6缺失菌株基于总糖的乙醇产率。图5和表7表明：在两种参照菌株中，ALD6缺失导致糖向乙醇的转化率提高。这些结果证实了模型预测，并证明了甘油-乙酸盐/酯转化酵母菌株中ALD6缺失对糖向乙醇转化的体极作用。

表12：48和72小时时基于总糖的乙醇产率。总糖被定义为：时间为0小时时的葡萄糖+木糖+阿拉伯糖。

实施例4

缺乏厌氧甘油发酵途径(gldA，DAK1)的ALD6敲除菌株的AFM试验

为了通过实验核实ALD6缺失在不含厌氧甘油发酵途径(gldA，DAK1)的菌株中的益处，构建了以下菌株：

表：13

表13提供了这些实验中使用的菌株的概况。WO2015028583中描述了RN1069的构建。总之，RN1069是引入了木糖发酵途径且gpd1和gpd2缺失的组氨酸营养缺陷型(his3缺失)S.cerevisiae菌株。因此，由于氧化还原平衡因为甘油形成途径被消除而不能维持，所以RN1069不能在厌氧条件下形成生物质。用pRN595转化RN1069。US2015176032中描述了pRN595的构建。总之，pRN595是高拷贝酵母表达载体，其带有受S.cerevisiae PGK1启动子控制的E.coli adhE的密码子优化序列、HIS3标记和2微米复制起点。基于在琼脂培养基上的选择来选择正确的转化体，所述琼脂培养基补充有0.67g/L酵母氮碱无氨基酸(Sigma-Aldrich)和2％v/v葡萄糖，且不添加组氨酸。在RN1069中引入E.coli adhE使其能够在乙酸存在下厌氧生长。选择一个菌落并命名为RN1069+pRN595，其充当参照菌株。

类似于上述，利用同源重组实现ALD6的缺失。通过用kanMX标记取代ORF来完成ALD6的缺失。使用引物12388+12389(分别为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3)从质粒pRN772(SEQ ID NO：1)PCR扩增flox化的kanMX标记，引物12388+12389分别含有与ALD6编码序列上游的5'序列同源的50bp和与ALD6编码序列下游的3'序列同源的50bp。用得到的PCR片段转化RN1069+pRN595，并基于G418抗性选择转化体。转化后，通过PCR核实kanMX标记在ALD6基因座的正确整合。挑选两个独立的转化体并在AFM发酵实验中检测其发酵性能。

在模拟预处理的玉米秸秆水解物中的糖浓度和乙酸盐/酯水平的合成培养基上进行发酵。培养基基于标准的Verduyn培养基，以尿素为氮源，补充有60g/L葡萄糖和35g/L木糖和乙酸。乙酸以两种不同的初始浓度：即3g/L和4g/L补充。将所有培养基的起始pH设定为pH＝5.5。向500mL发酵烧瓶中装入400mL培养基并以0.5g/L的酵母生物质浓度接种。将发酵培养基保持在32℃并以250rpm搅拌，在发酵期间不控制pH。除了在线记录通过AFM产生的CO₂(与乙醇(EtOH)和生物质形成相关联)之外，在发酵过程中以6小时的间隔频率取样以监测酵母生长、底物利用和产物形成。总发酵时间是72小时。

每6小时取样进行HPLC分析，以测定残糖浓度和乙醇形成。结果示于图6和图7中。图6和图7显示了初始乙酸浓度分别为3g/L和4g/L的参照物和ald6缺失菌株之间的糖消耗和乙醇形成速率的比较。参照物用透明线表示，ALD6缺失菌株(Δald6)用实线表示。

表14总结了在48小时和72小时时，参照物相对于ALD6缺失菌株基于总糖的乙醇产率。图6、图7和表14表明：在两种参照菌株中，ald6缺失导致糖向乙醇的转化率提高。

表14：48和72小时时基于总糖的乙醇产率。总糖被定义为：时间为0小时时的葡萄糖+木糖+阿拉伯糖。

这些结果显示：ald6缺失在没有厌氧甘油发酵途径(gldA，DAK1)的菌株中也是有益的。

参考文献

1.Sambrook等(1989),“Molecular Cloning,a laboratory manual”

2.Ausubel等(1995),“Current protocols in Molecular Biology”

3.Verduyn等(1992)“Effect of benzoic acid on metabolic fluxes inyeasts:a continuous culture study on the regulation of respiration andalcoholic fermentation”Yeast 8:501-517

4.Meaden等(1997),“The ALD6gene of Saccharomyces cerevisiae encodes acytosolic,Mg(2+)-activated acetaldehyde dehydrogenase”,Yeast 13(14):1319-27

5.Saint-Prix等(2004),“Functional analysis of the ALD gene family ofSaccharomyces cerevisiae during anaerobic growth on glucose:the NADP+-dependent ALD6p and Ald5p isoforms play a major role in acetate formation”,Microbiology 150(Pt 7):2209-20

序列表

<110> 帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120> 消耗乙酸盐/酯的酵母细胞

<130> 31210-WO-PCT

<150> EP15168833.0

<151> 2015-05-22

<160> 3

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

<211> 5005

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..5005

<223> /organism="Artificial Sequence"

/note="pRN772 (plasmid bearing loxP-kanMX-loxP sequence)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 1

gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 60

ctatgaccat gattacgcca agctatttag gtgacactat agaatactca agctatgcat 120

caagcttggt accgagctcg gatccactag cataacttcg tataatgtat gctatacgaa 180

gttattctag taacggccgc cagtgtgctg gaattcgccc ttaagcttgc ctcgtccccg 240

ccgggtcacc cggccagcga catggaggcc cagaataccc tccttgacag tcttgacgtg 300

cgcagctcag gggcatgatg tgactgtcgc ccgtacattt agcccataca tccccatgta 360

taatcatttg catccataca ttttgatggc cgcacggcgc gaagcaaaaa ttacggctcc 420

tcgctgcaga cctgcgagca gggaaacgct cccctcacag acgcgttgaa ttgtccccac 480

gccgcgcccc tgtagagaaa tataaaaggt taggatttgc cactgaggtt cttctttcat 540

atacttcctt ttaaaatctt gctaggatac agttctcaca tcacatccga acataaacaa 600

ccatgggtaa ggaaaagact cacgtttcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg 660

atttatatgg gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc 720

gattgtatgg gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg 780

ccaatgatgt tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc 840

cgaccatcaa gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc 900

ccggcaaaac agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg 960

atgcgctggc agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta 1020

acagcgatcg cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg 1080

atgcgagtga ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa 1140

tgcataagct tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg 1200

ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa 1260

tcgcagaccg ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt 1320

cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc 1380

agtttcattt gatgctcgat gagtttttct aatcagtact gacaataaaa agattcttgt 1440

tttcaagaac ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa 1500

tgttagcgtg atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag 1560

tgcgcagaaa gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc 1620

gattcgatac taacgccgcc atccagtgtc gacgatatct agagcgcgca taacttcgta 1680

taatgtatgc tatacgaagt tataggatcc atcacactgg cggccgctcg agcatgcatc 1740

tagagggccc aattcgccct atagtgagtc gtattacaat tcactggccg tcgttttaca 1800

acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc 1860

tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg 1920

cagcctatac gtacggcagt ttaaggttta cacctataaa agagagagcc gttatcgtct 1980

gtttgtggat gtacagagtg atattattga cacgccgggg cgacggatgg tgatccccct 2040

ggccagtgca cgtctgctgt cagataaagt ctcccgtgaa ctttacccgg tggtgcatat 2100

cggggatgaa agctggcgca tgatgaccac cgatatggcc agtgtgccgg tctccgttat 2160

cggggaagaa gtggctgatc tcagccaccg cgaaaatgac atcaaaaacg ccattaacct 2220

gatgttctgg ggaatataaa tgtcaggcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 2280

ccttttcacg tagaaagcca gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga atgtcagcta 2340

ctgggctatc tggacaaggg aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag cttgcagtgg 2400

gcttacatgg cgatagctag actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac cggaattgcc 2460

agctggggcg ccctctggta aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga tggctttctc 2520

gccgccaagg atctgatggc gcaggggatc aagctctgat caagagacag gatgaggatc 2580

gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 2640

gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 2700

gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 2760

tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 2820

agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 2880

ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 2940

tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 3000

acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 3060

ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgagcat 3120

gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 3180

ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 3240

tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 3300

ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 3360

ccttcttgac gagttcttct gaattattaa cgcttacaat ttcctgatgc ggtattttct 3420

ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 3480

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 3540

caataaccct gataaatgct tcaataatag cacgtgagga gggccaccat ggccaagttg 3600

accagtgccg ttccggtgct caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc 3660

gaccggctcg ggttctcccg ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac 3720

gacgtgaccc tgttcatcag cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc 3780

tgggtgtggg tgcgcggcct ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg 3840

aacttccggg acgcctccgg gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg 3900

gagttcgccc tgcgcgaccc ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac 3960

tgacacgtgc taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 4020

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 4080

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 4140

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 4200

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 4260

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 4320

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 4380

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 4440

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 4500

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 4560

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 4620

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 4680

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tgggcttttg ctggcctttt 4740

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 4800

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc aagcgcccaa 4860

tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt 4920

ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt 4980

aggcacccca ggctttacac tttat 5005

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..70

<223> /organism="Artificial Sequence"

/note="Primer 12388 (ald6 5’flank forward)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 2

gcagaaaaga ggggcagtgg cctgtttttc gacataaatg aggggcatgg cgccaagcta 60

tttaggtgac 70

<210> 3

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> source

<222> 1..70

<223> /organism="Artificial Sequence"

/note="Primer 12389 (ald6 3’flank reverse)"

/mol_type="unassigned DNA"

<400> 3

tccacgttag ttttctttgg atatagcagt tgttgtacac tagcttaaga tcactatagg 60

gcgaattggg 70

Claims

1.一种经遗传修饰的酵母细胞，其包含：

d)导致对所述酵母而言天然的3-磷酸甘油磷酸水解酶(E.C.3.1.3.21)和/或3-磷酸甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.8或E.C.1.1.5.3)活性降低的修饰。

2.根据权利要求1所述的酵母细胞，其中a)中的对所述酵母而言天然的一种或更多种醛脱氢酶(E.C:1.2.1.4)是乙醛脱氢酶-6(ALD6)。

3.根据权利要求1或2所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含

e)一种或更多种编码异源木糖异构酶(E.C.5.3.1.5)的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞包含对所述酵母而言天然的基因gpp1、gpp2、gpd1和gpd2中的一个或更多个的破坏。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的酵母细胞，其中所述酵母细胞还包含：

6.根据权利要求1-5中任一项的酵母细胞，其中所述酵母细胞是能够同时厌氧消耗戊糖和葡萄糖的发酵戊糖和葡萄糖的酵母细胞。

7.一种发酵根据权利要求1-6中任一项所述的酵母细胞的方法，其中基本上完全发酵乙酸盐/酯、戊糖和己糖的发酵时间相对于相应地发酵野生型酵母减少。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述发酵时间减少40％或更多。

9.根据权利要求6或7中任一项所述的方法，其中共发酵戊糖和葡萄糖。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中总乙醇产生率比利用相应野生型酵母的方法的总乙醇产生率高至少约20％、至少约50％或约100％。

11.根据权利要求7-10中任一项所述的方法，其中木质纤维素材料的水解物被发酵。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述水解物是木质纤维素材料的酶促水解物。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述水解物包含乙酸盐/酯。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述包含乙酸盐/酯的水解物的乙酸盐/酯浓度为5％(w/w)或更高。