ES2912995T3 - Obtención de cepas de levadura de alto rendimiento para la metabolización de la arabinosa - Google Patents

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Abstract

Un proceso para la obtención y selección de cepas de levadura capaces de fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada que comprende: - la integración cromosómica de los genes araA, araB y araD, ventajosamente araA de B. licheniformis, araB y araD de E. coli, en una cepa de levadura capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y que tiene al menos un gen GRE3 inactivado o eliminado; - poner las cepas transformadas en cultivo directo en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono para la selección de cepas capaces de metabolizar dicha arabinosa; - opcionalmente seleccionar las cepas transformadas que hayan metabolizado arabinosa por su actividad aldosa reductasa menor o igual a 0,002 U/g de proteína, o incluso menor o igual a 0,0005 U/g de proteína.

Description

DESCRIPCIÓN
Obtención de cepas de levadura de alto rendimiento para la metabolización de la arabinosa
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a cepas de levadura capaces de metabolizar arabinosa, en asociación con su capacidad de fermentar xilosa y glucosa, incluida la presencia de inhibidores de estas dos últimas fermentaciones, específicamente, ácido acético en forma no disociada.
Más precisamente, la presente solicitud propone un método que permite seleccionar cepas capaces de metabolizar arabinosa y cepas mejoradas, que tienen un alto rendimiento en su capacidad para metabolizar arabinosa pero también xilosa, encontrándose estos dos tipos de pentosas en hidrolizados lignocelulósicos.
Técnica anterior
La biomasa vegetal o lignocelulósica, procedente esencialmente de la actividad agrícola y agroindustrial, es un sustrato complejo, que consiste en tres fracciones principales que son la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. Se trata de un desecho reciclable, útil para la producción de etanol, cuya demanda, al considerar por ejemplo su uso como biocombustible, sigue en aumento.
El método para producir etanol a partir de biomasa lignocelulósica consiste en recuperar por hidrólisis el máximo de azúcares presentes en las fracciones de celulosa y hemicelulosa, para luego transformarlos en etanol por fermentación.
Con respecto a la fermentación de los azúcares presentes en esta biomasa, que comprende tanto azúcares C6 (hexosas) como azúcares C5 (pentosas), hoy en día se favorece especialmente la fermentación anaerobia mediante el uso de levaduras, particularmente por medio de Saccharomyces cerevisiae, cuya capacidad para fermentar glucosa en etanol es ampliamente aprovechada y explotada.
Sin embargo, se ha prestado toda la atención a la fermentación de las pentosas, particularmente de la xilosa, que puede representar hasta un 25 a un 40 % de los azúcares totales contenidos en la biomasa lignocelulósica. Por lo tanto, las cepas de levadura capaces de fermentar glucosa se han modificado para que también puedan metabolizar pentosas.
A manera de ejemplo, el documento WO 2010/000464 informa de la obtención de cepas de levadura capaces de fermentar pentosas gracias a un gen bacteriano que codifica una xilosa isomerasa (XI) que convierte la xilosa en xilulosa metabolizable por la levadura.
Se debe señalar que, alternativamente, una vía que comprende una xilosa reductasa (XR o XYL1) que genera xilitol y una xilitol deshidrogenasa (XDH o XYL2) también permiten la obtención de xilulosa.
Por lo tanto, el documento WO 2012/072793 describe cepas de levadura mejoradas, por asociación de genes exógenos que codifican una xilosa isomerasa y una xilitol deshidrogenasa que permiten eliminar el xilitol que ha demostrado ser un inhibidor de la xilosa isomerasa. Cepas de este tipo, en particular la cepa depositada en la CNCM el 5 de octubre de 2011 con el número I-4538, presentan rendimientos mejorados y por tanto una utilidad comprobada para la producción de etanol.
Otro problema crucial ha sido el de destacar, en los hidrolizados lignocelulósicos, de inhibidores de la fermentación entre los que aparecen los furaldehídos (furfural, HMF), compuestos fenólicos y ácidos orgánicos (ácido acético, ácido levulínico, ácido fórmico). En particular, la presencia de una fuerte concentración de ácido acético, mayor a 5 g/kg (en el medio inicial) y que puede alcanzar hasta 10 g/kg, está intrínsecamente ligada a la de grupos acetilo asociados covalentemente a moléculas de hemicelulosa.
Trabajos anteriores han abordado la mejora de la resistencia de las cepas a la presencia de ácido acético en la masa de fermentación. Por lo tanto, el documento WO 2011/080411 reporta la obtención de cepas de levaduras en las que se ha mejorado la resistencia al ácido acético sobre la glucosa.
Sin embargo, el ácido acético también es un inhibidor de la fermentación de xilosa. Esta inhibición se caracteriza por una reducción de la cinética de consumo de xilosa (Bellisimi y otros, FEMS Yeast Res., 2009, 9:358-364), mientras que en glucosa esta inhibición se traduce en un retraso en el inicio de la fermentación, pero permanece la cinética inalterada a partir de entonces. Se debe señalar que en presencia de glucosa y xilosa en el medio, las cepas de levadura fermentan primero la glucosa debido a la represión catabólica.
Por lo tanto, los documentos WO 2013/178915 y WO 2013/178918 describen métodos para obtener cepas de levadura capaces de metabolizar las pentosas, particularmente la xilosa, y resistentes a los inhibidores de la fermentación, en particular al ácido acético.
Otras cepas mejoradas, particularmente en su capacidad para fermentar glucosa y xilosa en presencia de ácido acético, se describen en los documentos WO 2015/121595 y FR 3035405.
Todo este trabajo se ha concentrado en la xilosa como la pentosa de interés. Aunque se considera generalmente que es la pentosa mayoritaria en la hemicelulosa, la xilosa no es la única. Por lo tanto, es posible encontrar también arabinosa en estas estructuras vegetales (Saddler, 1993, Wallingford, Oxon, UK: CAB International), en una proporción a veces mayor al 40 % (Schadel y otros, 2010, Physiologia Plantarum 139, 241-255). Además, la arabinosa se encuentra en el bagazo (Hanko y Rohrer, 2000, Anal. Biochem. 283, 192-199) o en fibras originarias del maíz denominadas “fibras de maíz” (Gulati y otros, 1996, Bioresource Technology 58, 253-264).
Además del valor económico evidente de la fermentación adicional de arabinosa, también debe señalarse que la arabinosa residual puede constituir un sustrato conveniente para el desarrollo de microorganismos contaminantes, posiblemente capaces de convertirla en ácidos orgánicos que, como se mencionó anteriormente, son inhibidores de la fermentación de glucosa y xilosa (Schell y otros, 2007, Bioresour. Technol. 98, 2942-2948).
Se han descrito numerosos microorganismos capaces de metabolizar la arabinosa, tanto entre los microorganismos fúngicos, en particular los hemiascomicetos tal como Scheffersomyces stipitis, los basidiomicetos y los hongos filamentosos, y entre las bacterias tales como Erwinia chrysanthemi, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Lactobacillus plantarum.
Sin embargo, entre las levaduras que pueden explotarse a nivel industrial, particularmente aquellas capaces de soportar títulos de etanol tan altos como los tolerados por la levadura Saccharomyces cerevisiae, no se ha informado que ninguna sea naturalmente capaz de fermentar arabinosa.
El documento WO 03/095627 ha informado de la posibilidad de obtener cepas de S. cerevisiae capaz de crecer en arabinosa mediante la transformación de una cepa de laboratorio mediante plásmidos multicopia que portan específicamente los genes araA (que codifica una L-arabinosa isomerasa) de B. subtilis, araB (que codifica una L-ribuloquinasa mutada ventajosamente) y araD (que codifica una L-ribulosa-5-P-4 epimerasa) de E. coli. Este documento plantea abiertamente la cuestión de la posibilidad de obtener una cepa capaz de cofermentar xilosa. El documento WO 2008/122354 describe cepas de S. cerevisiae transformada por medio de vectores autorreplicantes que portan los genes araA de B. licheniformis, araB (ventajosamente mutado) y araD de E. coli, ventajosamente optimizado por codones, capaz de crecer aeróbicamente o anaeróbicamente en medios que contienen arabinosa como única fuente de carbono. La selección de los transformantes se realiza mediante cultivo en un medio que contiene glucosa como fuente de carbono.
El documento Wang y otros (2013, Biomed Research International, 2013, 1-9) describe la selección de cepas de S. cerevisiae, que integran a nivel cromosómico los genes araA, araB y araD de L. plantarum, optimizado por codones y que sobreexpresan GAL2, por su capacidad para metabolizar la arabinosa.
El documento WO 2008/041840 describe secuencias específicas de araA, araB y araD que confieren a una levadura la capacidad de metabolizar la arabinosa, en este caso procedentes de L. plantarum. En la práctica, estos genes se introducen a través de plásmidos en una cepa de laboratorio de S. cerevisiae eliminada para el gen de la aldosa reductasa GRE3, y que sobreexpresa la vía de las pentosas fosfato (TAL1, TKL1, RPE1 y RKI1) y expresa la vía de fermentación de xilosa (XI o XylA y XKS1). De acuerdo con los autores, una cepa de este tipo no es capaz de crecer directamente en un medio que contiene arabinosa y se requiere un nuevo pase en un medio que contiene galactosa. Además, las cepas obtenidas al final de estos cultivos han perdido su capacidad de metabolizar xilosa.
El documento WO 2012/143513 informa de la integración cromosómica de al menos los genes araA, araB y araD y XylA en una cepa de levadura del tipo Saccharomyces que, tras cultivo de acuerdo con el método “Sequential Batch Repeat” tal como se describe en el documento WO 2009/112472 en medios que contienen 20 g/L de arabinosa y 20 g/L de xilosa, le confiere la capacidad de fermentar glucosa, xilosa y arabinosa. Mutaciones en los diferentes genes (SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80, PMR1) se han destacado.
El documento de Madhavan y otros (2012, Critical Reviews in Biotechnology, 32(1), 22-48) enumera las posibilidades de construir cepas de S. cerevisiae capaces de metabolizar las hexosas, pero también las pentosas presentes en la lignocelulosa.
El documento WO 2014/207087 describe microorganismos genéticamente modificados para producir productos de fermentación a partir de pentosas, en particular xilosa y arabinosa. Sin embargo, los ejemplos ilustran únicamente la metabolización de la xilosa.
Existe una necesidad evidente de obtener nuevas cepas de levadura capaces de metabolizar arabinosa, además de su capacidad de fermentar glucosa y xilosa, incluso con la presencia de inhibidores tales como el ácido acético. Descripción de la invención
La presente solicitud se enmarca dentro de la búsqueda de nuevas cepas de levadura capaces de metabolizar al menos arabinosa, apoyándose en la aportación de los inventores vinculada a diferentes aspectos:
- donde destaca el hecho de que la introducción de la vía metabólica de la arabinosa es necesaria pero no suficiente para garantizar el metabolismo eficaz de la arabinosa;
- donde destaca la posibilidad de seleccionar directamente transformantes que hayan integrado la vía de metabolización de la arabinosa en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono;
- donde destaca la necesidad de un control estricto de la producción de poliol para garantizar la fermentación eficaz de la arabinosa;
- donde destaca la posibilidad de que las vías de fermentación de la xilosa y la arabinosa coexistan de forma estable;
- donde destaca el desarrollo de un protocolo de selección de cepas de levadura que tengan una capacidad mejorada para fermentar simultáneamente arabinosa, xilosa y glucosa, inclusive en presencia de inhibidores de fermentación de estos últimos azúcares, específicamente, ácido acético.
De acuerdo con un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la obtención y selección de cepas de levadura capaces de fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada, que comprende:
- la integración cromosómica de los genes araA, araB y araD, incluso más ventajosamente de los genes araA de B. licheniformis, araB y araD de E. coli, en una cepa de levadura capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y que tenga al menos un gen GRE3 inactivado o eliminado;
- el cultivo directo de las cepas transformadas en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono para la selección de cepas capaces de metabolizar dicha arabinosa;
- opcionalmente la selección de cepas transformadas que hayan metabolizado arabinosa por su actividad aldosa reductasa menor a 0,002 U/g de proteína, o incluso menor o igual a 0,0005 U/g de proteína.
Dentro del alcance de la invención, se entiende por “cepa de levadura” una población de levaduras rigurosamente idéntica desde el punto de vista genético. Esto también incluye tanto las cepas denominadas cepas de laboratorio como las denominadas cepas industriales.
Ventajosamente, la cepa de levadura implementada en el alcance de este método se selecciona de entre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Yarrowia, Paffia, Kluyveromyces, Candida, Talaromyces, Brettanomyces, Pachysolen, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Debaryomyces, ventajosamente una cepa de Saccharomyces cerevisiae. Estas levaduras son conocidas por no ser capaces de metabolizar la arabinosa de forma natural, o a un nivel muy bajo que no se puede usar industrialmente. Además, se seleccionan ventajosamente por su capacidad para realizar una fermentación anaeróbica, incluso más ventajosamente una fermentación alcohólica anaeróbica.
De acuerdo con la invención, el método se implementa para una cepa capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada. Como se ha descrito ampliamente en el estado de la técnica, la capacidad de metabolizar la xilosa puede resultar de la introducción de un gen que codifica una xilosa isomerasa, que se origina, por ejemplo, a partir de Clostridium fitofermentans, y/o una xiluloquinasa.
Ventajosamente, intervienen las siguientes cepas:
- la cepa depositada en la CNCM el 5 de octubre de 2011 con el número I-4538,
- la cepa depositada en la CNCM el 16 de mayo de 2013 con el número I-4749;
- la cepa depositada en la CNCM el 12 de diciembre de 2013 con el número I-4829;
- la cepa depositada en la CNCM el 9 de abril de 2015 con el número I-4966;
incluso más ventajosamente la cepa depositada en la CNCM el 29 de enero de 2015 con el número I-4953.
Dentro del alcance de la invención, una cepa de levadura capaz de metabolizar arabinosa es una cepa capaz de consumir o utilizar arabinosa, ventajosamente L-arabinosa, presente en su medio de cultivo. Por lo tanto, y particularmente en dependencia de las condiciones de cultivo, una cepa de levadura puede usar arabinosa para la producción de su biomasa y/o la generación de productos de fermentación. Dentro del alcance de la presente solicitud, se entiende por fermentación de arabinosa el metabolismo de arabinosa que tiene lugar en condiciones hipóxicas y/o anaeróbicas, es decir, en condiciones de baja disponibilidad (típicamente menos del 20 %) o ausencia total de oxígeno.
Dentro del sentido de la invención, el término "metabolizar" puede aplicarse por tanto a la capacidad de la cepa de utilizar arabinosa para garantizar su crecimiento como a su capacidad de fermentar arabinosa en diferentes productos de fermentación tales como derivados hidroxilados, que incluyen etanol o isobutanol, y/o derivados carboxilados que incluyen ácidos orgánicos.
De acuerdo con una modalidad particular, se hace referencia a su capacidad para convertir la L-arabinosa en L-ribulosa y/o L-ribulosa-5-fosfato y/o en D-xilulosa-5-fosfato y/o en un producto de fermentación tal como etanol. De acuerdo con una modalidad ventajosa y como se describe en la Figura 1, la L-arabinosa se convierte en L-ribulosa bajo la influencia de una arabinosa isomerasa (araA; EC: 5.3.1.4). La propia L-ribulosa puede convertirse en L-ribulosa-5-fosfato bajo la influencia de una ribuloquinasa (araB; EC: 2.7.1.16). A continuación, la L-ribulosa-5-fosfato puede transformarse en D-xilulosa-5-fosfato bajo la influencia de una ribulosa 5 fosfato epimerasa (araD; EC: 5.1.3.4). Ventajosamente, la D-xilulosa-5-fosfato es absorbida entonces por la porción no oxidante de la vía de las pentosas fosfato y puede conducir a la producción de etanol.
En una primera etapa del método de acuerdo con la invención, el o los genes que permiten la metabolización de la arabinosa se introducen en la cepa de levadura, que entonces se denomina transformante.
En lo sucesivo en la descripción, los términos "gen" o "secuencia" se aplican a una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia codificante (que codifica en particular una enzima de la vía de interés), posiblemente flanqueada por secuencias reguladoras, en particular un promotor o un terminador. Una secuencia codificante puede optimizarse, es decir, modificarse para integrar los codones preferidos del hospedador, en este caso la levadura, en la que se va a expresar esta secuencia.
Los genes que codifican la vía de metabolización de la arabinosa son genes denominados exógenos o heterólogos, que pueden ser de naturaleza sintética u originarios de otros organismos (o fuentes). Ventajosamente, tienen su origen en microorganismos capaces de metabolizar la arabinosa, ventajosamente hemiascomicetos tales como Scheffersomyces estipitis, basidiomicetos, hongos filamentosos o bacterias tales como Erwinia chrysanthemi, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis o Lactobacillus plantarum. De acuerdo con una modalidad particular, estos genes se originan en la bacteria Bacilo licheniformis y/o Escherichia coli. De acuerdo con otra modalidad preferida, estos genes corresponden al gen araA de B. licheniformis, al gen araB de E. coli y al gen araD de E. coli, como se describió por Widemann y Boles (2008, Applied and Environmental Microbiology 74, 2043-2050; el documento WO 2008/122354). Las técnicas que permiten la introducción de ADN en un hospedador (o transformación) se conocen bien por un experto en la técnica y comprenden, en particular, la permeabilización de las membranas mediante la aplicación de un campo eléctrico (electroporación), mediante una vía térmica (aplicación del choque térmico), o por vía química, por ejemplo por medio de acetato de litio.
Los genes introducidos pueden integrarse en el genoma del hospedador, en particular por recombinación homóloga o integración cromosómica, ventajosamente por medio de casetes integradores, o expresados extracromosómicamente por medio de plásmidos o vectores. Los diferentes tipos de plásmidos, ventajosamente autorreplicantes, se conocen bien por un experto en la técnica, que se diferencian en particular con respecto a su origen de replicación, su promotor (inducible o constitutivo), su marcador (por ejemplo, resistencia a un antibiótico o la capacidad de crecer en un medio selectivo) y el número de copias por célula.
Los genes que codifican la vía de metabolización de la arabinosa están integrados a nivel cromosómico, ventajosamente en el locus HO de la cepa de levadura, incluso más ventajosamente en todos los loci HO de la cepa de levadura.
Ventajosamente, el casete que porta este o estos genes y que sirve para su incorporación o integración en la cepa de levadura está desprovisto de marcadores, particularmente de resistencia a un antibiótico.
De acuerdo con otra modalidad preferida, el casete que porta este o estos genes no lleva un gen que codifica un transportador de arabinosa, particularmente el gen araT.
La adecuada introducción del gen o genes puede verificarse fácilmente mediante técnicas conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo por medio del marcador posiblemente portado por el casete de expresión, o preferentemente por medio de la realización de una PCR por medio de cebadores dirigidos a los genes introducidos. Además, puede utilizarse la misma técnica de PCR para verificar la integración de los genes en el locus objetivo, particularmente mediante el uso de cebadores dirigidos a este locus.
En un etapa posterior del método de acuerdo con la invención, se selecciona una cepa de interés que haya incorporado y expresado eficazmente la vía de metabolización de la arabinosa por su capacidad para metabolizar la arabinosa presente, como única fuente de carbono, en el medio de cultivo.
De manera característica de acuerdo con la invención, la selección de los transformantes se realiza directamente sobre un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono. En otras palabras, la capacidad de una cepa de levadura para metabolizar arabinosa se prueba mediante el cultivo de dicha cepa en un medio que contiene, dicha arabinosa como única fuente de carbono. Esto excluye cualquier inducción previa, en particular un cultivo previo en presencia de galactosa o la adición de galactosa en este medio, o una preselección de transformantes en un medio que contiene otra fuente de carbono tal como la glucosa por ejemplo.
Dentro del alcance de la invención, un medio de cultivo o crecimiento designa un medio que comprende los ingredientes necesarios para la multiplicación de las levaduras que están presentes. Consiste ventajosamente en un medio completo, adaptado al crecimiento de la levadura y que puede contener ingredientes convencionales tales como sales, tampones, extracto de levadura o cualquier otra fuente de nitrógeno metabolizable por la levadura, vitaminas... Dentro del alcance de la invención, lo que se entiende por “medio sintético” es un medio cuya composición química es conocida.
De manera adecuada, las condiciones de cultivo implementadas son condiciones de cultivo favorables al crecimiento de la levadura, en particular:
- un medio de cultivo de pH ácido, ventajosamente comprendido entre 4 y 6, o 4,5 y 5,5, incluso más ventajosamente igual a 5 o 5,4;
- una temperatura comprendida entre 28 y 37 °C, o entre 30 y 35 °C, ventajosamente igual a 32 °C;
- un período de crecimiento que puede ir desde 24 horas hasta varios días, por ejemplo 72 horas.
Ventajosamente, este crecimiento se realiza en un medio sólido, lo que permite aislar las cepas realmente capaces de metabolizar la arabinosa. De acuerdo con otra modalidad ventajosa, la selección de las cepas de interés se realiza por medio de cultivos en placas de Petri. De forma conocida, los medios sólidos contienen agar, ventajosamente a un nivel de 15 a 20 g/L.
De acuerdo con una primera modalidad, se selecciona una cepa de levadura capaz de metabolizar la arabinosa mediante el crecimiento aeróbico de esta cepa en un medio de cultivo que contiene arabinosa como única fuente de carbono.
Un medio adecuado para este crecimiento aeróbico es el medio sintético Difco® YNB, cuya composición exacta se da en las modalidades ilustrativas, ventajosamente a un nivel de 10 g/L, tal como el medio denominado en lo sucesivo YNB-Ara.
Alternativamente, puede seleccionarse una capa de levadura capaz de metabolizar la arabinosa mediante crecimiento anaeróbico o hipóxico en un medio de crecimiento que contiene arabinosa como única fuente de carbono.
Un medio adecuado para este crecimiento anaeróbico o hipóxico es por ejemplo el medio sintético YF, cuya composición exacta se da en las modalidades ilustrativas, que comprende arabinosa como única fuente de carbono, ventajosamente a un nivel de 70 g/L, tal como el medio llamado en lo sucesivo YF-ara.
Ventajosamente, este medio está adaptado para permitir el crecimiento en un medio sólido, como por ejemplo mediante la adición de agar, que permite por lo tanto el aislamiento directo de las cepas de interés.
De acuerdo con una modalidad alternativa, las cepas de levadura en las que se ha introducido la vía de metabolización de la arabinosa se aíslan mediante cultivo en medio sólido, ventajosamente en medio selectivo tal como el medio YNB-Ara descrito anteriormente, luego se seleccionan en medio líquido, anaeróbicamente o hipóxicamente, en un medio adecuado tal como el medio YF-ara descrito anteriormente. Estos cultivos líquidos pueden realizarse en microplacas del tipo Deep Well o en viales, bajo agitación débil igual por ejemplo a 100 rpm, o sin agitación y en condiciones de suministro de oxígeno reducido (limitado O2 o anaeróbicamente).
En estas condiciones, la capacidad de las cepas de levadura para metabolizar arabinosa puede evaluarse mediante: - su crecimiento, en particular mediante el control de la densidad óptica (DO) del medio de cultivo, medida ventajosamente a 600 nm, y/o
- fermentación de arabinosa, particularmente mediante el control de la concentración de arabinosa presente en el medio de cultivo, por ejemplo mediante el uso de HPLC, o la evaluación de la pérdida de masa directamente relacionada con la producción de CO2, que es estequiométrica con la del etanol.
Se debe señalar que, según el conocimiento del solicitante, se informa por primera vez de la posibilidad de seleccionar fuentes de levadura capaces de metabolizar la arabinosa directamente por crecimiento en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono. Muy al contrario, se considera que un experto en la técnica se habría visto disuadido de implementar un enfoque de este tipo al considerar la enseñanza de Wisselink y otros (2007; Appl Environ Microbiol 73, 4881-4891; el documento WO 2008/041840) al haber informado que una selección directa de este tipo no funcionó.
Por lo tanto, de acuerdo con otro modo de modalidad ventajoso, la cepa de levadura obtenida también puede probarse, en paralelo o subsecuentemente, en las siguientes condiciones:
- en un medio de cultivo que contiene glucosa como única fuente de carbono, por ejemplo en un medio YF como se describió anteriormente, pero que contiene 150 g/L de glucosa, y en las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente. Esta etapa permite verificar la validez de las cepas seleccionadas, particularmente su capacidad para fermentar glucosa. Se debe señalar que pueden realizarse uno o más pases en un medio de glucosa antes de "volver a pasar" las cepas seleccionadas en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono (como se describió anteriormente) y esto para verificar que el fenotipo [ara+] es estable y conservado;
- un medio de crecimiento que contiene xilosa como única fuente de carbono, por ejemplo en un medio YF como se describió anteriormente pero que contiene 70 g/L de xilosa (medio YF-xilosa en las modalidades ilustrativas), y en las condiciones de cultivo mencionadas anteriormente. Esta etapa permite verificar que las cepas seleccionadas han conservado su capacidad de fermentar xilosa y son de interés cuando la cepa de levadura sobre la que se implementa el método de la invención tiene capacidad de fermentar xilosa.
Además y dentro del alcance de la invención, se ha destacado que un criterio importante para la selección de cepas de interés para la metabolización de arabinosa era su nivel de producción de poliol.
De manera conocida, los polioles como el xilitol tienen un efecto inhibidor sobre la actividad de la xilosa isomerasa (xylA) (Kovalevsky y otros, 2012, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 68, 1201-1206). Dentro del alcance de la presente invención, se ha destacado que los polioles también fueron capaces de inhibir la actividad de la arabinosa isomerasa (araA; Figura 1), y por lo tanto reducir el rendimiento, en términos de metabolización de la arabinosa, de una cepa seleccionada por medio del método de acuerdo con la invención.
El arabitol puede generarse a partir de arabinosa bajo la influencia de la aldosa reductasa(s), de la misma manera que el xilitol se genera a partir de xilosa. Se debe señalar que, de manera conocida, el gen GRE3 codifica la principal aldosa reductasa en S. cerevisiae pero que, incluso cuando se elimina o se inactiva, la actividad de la aldosa reductasa puede persistir. Además, la presencia de actividad de xilitol deshidrogenasa en las cepas de levadura permite potencialmente eliminar el xilitol.
Por lo tanto y de acuerdo con esta hipótesis, una cepa seleccionada de particular interés tiene:
- una fuerte actividad poliol deshidrogenasa mayor o igual a 0,001 U/g de proteína, incluso más ventajosamente mayor o igual a 0,002 U/g de proteína; y/o
- una actividad de aldosa reductasa débil.
En la práctica y dentro del alcance de la invención, se ha destacado que podría seleccionarse una cepa de interés basándose en su actividad de aldosa reductasa baja o nula. Ventajosamente, esta actividad es menor a 0,005 U/g de proteína, o incluso a 0,004, 0,003 o incluso a 0,002 U/g de proteína. De manera más preferida, es menor o igual a 0,0015 U/g de proteína, o incluso menor o igual a 0,001 U/g de proteína, incluso más ventajosamente menor o igual a 0,0005 U/g de proteína.
Un protocolo detallado para la medición de la actividad de la aldosa reductasa se describe en la parte titulada "Modalidades ilustrativas."
Además, la cepa de levadura implementada dentro del alcance del método de acuerdo con la invención tiene uno o más genes GRE3 eliminado o inactivado.
De acuerdo con otra modalidad preferida, una cepa de levadura implementada dentro del alcance de la presente invención tiene al menos una copia supernumeraria del gen HAA1 que codifica el regulador transcripciona1Haa1p. De forma conocida, es capaz de conferir a las cepas de levadura, en particular S. cerevisiae, una capacidad para resistir al ácido acético y por tanto permitir mejorar su crecimiento en un medio que contiene inhibidores de la fermentación del tipo de los ácidos orgánicos, tal como el ácido acético. Además, el solicitante ha destacado que la sobreexpresión de este gen conferiría una resistencia a otros inhibidores del tipo de los compuestos fenólicos, en particular a la vainillina.
Ventajosamente, la expresión del gen supernumerario que codifica Haa1p se pone bajo el control de un promotor heterólogo, por ejemplo el promotor pPGK1. Esta copia supernumeraria del gen HAA1 puede codificar la proteína nativa o una forma mutada de la misma, por ejemplo, la versión constitutivamente activa HAA1si35f descrito por Swinnen y otros (2017, Microbial Cell Factories 16:7).
De acuerdo con una modalidad preferida, la copia adicional del gen HAA1 se integra a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente por inserción en el gen GRE3. Los resultados son dos efectos ventajosos dentro del alcance de la invención, específicamente:
- la inactivación del gen GRE3 que codifica una actividad de aldosa reductasa;
- la sobreexpresión del gen HAA1 que confiere una mayor resistencia de las cepas de levadura al ácido acético, pero también a la vainillina.
La segunda etapa del método de acuerdo con la invención, que corresponde a la etapa de seleccionar las cepas de levadura de interés. De acuerdo con una modalidad particular, primero se evalúa la aptitud para metabolizar la arabinosa presente en el medio de cultivo, luego se prueba la actividad aldosa reductasa de las cepas seleccionadas.
Por lo tanto, la ventaja de las cepas seleccionadas, particularmente su capacidad para fermentar arabinosa, pero también glucosa y xilosa, puede confirmarse luego mediante la evaluación de su rendimiento en medios sintéticos que contienen los diferentes azúcares en una mezcla, específicamente, arabinosa, glucosa y xilosa. Con el fin de imitar las condiciones reales de fermentación, estos medios también contienen ácido acético, ventajosamente a un nivel de 1 a 10 g/L, conocido por ser un inhibidor de la fermentación de glucosa y xilosa.
Los medios de este tipo se denominan, por ejemplo, YFP o YFCF, cuya composición se indica más abajo:
Medio YFCF:
- 10 g/L de extracto de levadura;
- 10 g/L de bactopeptona;
- 63 g/L de glucosa;
- 28 g/L de xilosa;
- 28 g/L de arabinosa;
- 4 g/L de ácido acético (cantidad introducida en el medio de cultivo a pH 5).
Medio YFP:
- 10 g/L de extracto de levadura;
- 10 g/L de bactopeptona;
- 63 g/L de glucosa;
- 52 g/L de xilosa;
- 6,1 g/L de arabinosa;
- 4 g/L de ácido acético (cantidad introducida en el medio de cultivo a pH 5).
Además, las condiciones de cultivo estándar, favorables a la producción de etanol en levadura, son:
- un pH ácido estable, ventajosamente comprendido entre 4 y 6, por ejemplo igual a 5;
- una temperatura comprendida entre 28 y 37 °C, o incluso entre 30 y 35 °C, ventajosamente igual a 30 °C; - agitación débil, por ejemplo igual a 100 rpm;
- condiciones de suministro de oxígeno reducido (bajo O limitado2). En la práctica, el cultivo puede realizarse en un vial cerrado por medio de un tapón que reduce el aporte de O2 en el medio mientras que permite la eliminación del CO2 producido;
- inoculación con un inóculo de 0,25 g/kg eq MS de la cepa propagada a saturación en YPG a las 24 horas; - un periodo de crecimiento de al menos 24 horas, por ejemplo 72 horas.
Dentro del alcance de la invención, se han destacado las cepas seleccionadas por medio de este método que tienen:
- la capacidad de usar arabinosa como única fuente de carbono para garantizar la producción de su biomasa; - la capacidad de fermentar arabinosa;
- la capacidad de fermentar glucosa y xilosa, incluida la presencia de ácido acético en forma no disociada. - Bajo las condiciones descritas anteriormente, lo que se observó después de 72 horas de fermentación: - consumo del 95 % o incluso de toda la glucosa y la xilosa presentes en el medio de cultivo, convertidas en biomasa o en etanol y CO2;
- consumo de más del 50 %, o del 60 %, del 70 % o incluso del 80 % de la arabinosa presente en el medio de cultivo.
Por lo tanto, la presente solicitud informa de una cepa de levadura que puede obtenerse por medio del método descrito, capaz de fermentar al menos el 50 %, o el 60 %, el 70 % o incluso el 80 % de la arabinosa después de 72 horas de fermentación en un medio que comprende glucosa. (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 63 g/L), xilosa (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 28 o 52 g/L), arabinosa (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 6,1 o 28 g/L) y ácido acético (ventajosamente al nivel de 1 a 10 g/L, por ejemplo 4 g/L). Preferentemente, una cepa de levadura de este tipo es capaz de fermentar al mismo tiempo al menos el 90 % o el 95 % de la glucosa y la xilosa también presentes.
Una cepa de este tipo presenta también ventajosamente al menos una de las siguientes características, o todas estas características:
- al menos una copia del gen araA, preferentemente originario de B. licheniformis, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente en al menos un locus HO;
- al menos una copia de un gen araB, preferentemente originario de E. coli, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente en al menos un locus HO;
- al menos una copia de un gen araD, preferentemente originario de E. coli, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente en al menos un locus HO;
- al menos una copia de un gen exógeno que codifica una xilosa isomerasa, ventajosamente de Clostridium fitofermentans;
- al menos una copia supernumeraria del gen GAL2 que codifica un transportador de hexosas también capaz de garantizar la captura de xilosa. De acuerdo con otra modalidad, dicha cepa comprende al menos dos copias supernumerarias del gen GAL2. Este puede ponerse bajo el control de un promotor fuerte y constitutivo del tipo pADH1;
- la supresión de la actividad de la aldosa reductasa codificada por GRE3, ventajosamente por inserción del gen HAA1 en el locus GRE3;
- la sobreproducción de xiluloquinasa (XKS1), particularmente por modificación del promotor o la introducción de copias supernumerarias;
- la expresión o la sobreproducción de la vía de las pentosas fosfato (RPE1, RKI1, TKL1, TAL1, ...);
- la ausencia de actividad de xilosa reductasa (XR).
De acuerdo con una modalidad particular, una cepa de este tipo no está mutada en los siguientes genes: SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80 y/o PMR1. De acuerdo con otra modalidad particular, la cepa no presenta las siguientes mutaciones: G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154w, A1186G en el gen cEp 3, A436C en el gen GAL80, A113G en el gen PMR1.
Una cepa de acuerdo con la invención es la cepa depositada en la CNCM (Collection Nacionale de Cultures de Microorganismes [Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos], Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con fecha 19 de mayo de 2016, con el número I-5085.
De acuerdo con otro aspecto, la solicitud se refiere a un método para obtener y/o seleccionar cepas de levadura que tienen una capacidad mejorada para fermentar arabinosa, xilosa y glucosa, incluida la presencia de inhibidores de la fermentación, específicamente, ácido acético en forma no disociada, que se manifiesta en particular por un aumento en la producción de etanol y un mayor consumo de la arabinosa presente en el medio.
Por lo tanto, la invención también se refiere a un método para obtener y seleccionar una cepa de levadura que tiene una capacidad mejorada para fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada, en el que una cepa de levadura que tiene una capacidad para fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y obtenida por medio del método descrito anteriormente, ventajosamente la cepa I-5085 depositada, se cultiva sucesivamente en las siguientes condiciones:
- cultivo anaeróbico o hipóxico en un medio que contiene, como únicas fuentes de carbono, arabinosa y xilosa en concentraciones límite para la producción de biomasa, ventajosamente al nivel de 5 g/L y 4 g/L, respectivamente; entonces
- dos cultivos anaeróbicos o hipóxicos sucesivos y en presencia de ácido acético en forma no disociada, uno en un medio que contiene glucosa como única fuente de carbono y el otro en un medio que contiene xilosa como única fuente de carbono;
- posiblemente un cultivo aeróbico en un medio mínimo que contiene una fuente de carbono estrictamente respiratoria, ventajosamente glicerol, como única fuente de carbono.
Un método de este tipo consiste por tanto en realizar una evolución dirigida de las cepas de levadura implementadas. Sin querer vincularse a ninguna teoría en particular, la presión de selección ejercida por los cultivos sucesivos en los medios de cultivo definidos en lo sucesivo permite seleccionar una cepa que haya adquirido los rasgos fenotípicos necesarios para aumentar su capacidad de fermentar arabinosa y conservar su capacidad de fermentar xilosa y glucosa, incluida la presencia de ácido acético en forma no disociada.
Por lo tanto, el método de acuerdo con la invención permite, a partir de una cepa aislada o de una mezcla de cepas, seleccionar una cepa que tenga una ventaja selectiva en términos de crecimiento sobre un medio que contiene estos tres azúcares y ácido acético en forma no disociada.
Este método, que también es objeto de la presente solicitud, puede implementarse sobre una cepa aislada, en particular sobre la cepa depositada en el CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) de fecha 19 de mayo de 2016, bajo el número I-5085. De acuerdo con este método, la cepa de levadura o una posible mezcla de cepas se cultivan sucesivamente en al menos tres medios de crecimiento. Como ya se mencionó, las expresiones "medio de crecimiento" y "medio de cultivo" se usan indistintamente para designar un medio que comprende los ingredientes necesarios para la multiplicación de las levaduras presentes.
El primer medio de crecimiento, ventajosamente líquido, se caracteriza porque comprende, como únicas fuentes de carbono, las pentosas arabinosa y xilosa.
Se debe señalar que tradicionalmente se acepta que cuando una población de levadura tiene dos azúcares disponibles, generalmente usa solo uno de ellos para formar su biomasa. Una vez que se consume este primer azúcar, posiblemente pueda usar el segundo. Por lo tanto, existía un riesgo real con respecto a la estabilidad del fenotipo de las dos pentosas de interés, específicamente, la xilosa y la arabinosa.
Característicamente de acuerdo con la invención, este primer medio comprende una concentración de pentosas que permiten cubrir juntas el 100 %, ventajosamente el 50 % cada una, de las necesidades de carbono de las cepas de levadura. De acuerdo con otra modalidad particular, la arabinosa y la xilosa están presentes en concentraciones equivalentes, por ejemplo a una tasa de 5 g/L para la arabinosa y 4 g/L para la xilosa.
De acuerdo con otra característica preferida, se trata de un medio sintético cuya composición exacta está controlada, ventajosamente un medio cuya composición química está completamente determinada. Un medio de este tipo es, por ejemplo, el medio denominado “GO xilosa arabinosa”, cuya composición precisa se indica en las modalidades ilustrativas. Se debe señalar que en un medio de este tipo, no es la fuente de nitrógeno la que es limitante para la producción de biomasa (10 g/L de (NH^PO 4) sino las cantidades de las fuente de carbono, en este caso xilosa (4 g/L) y arabinosa (5 g/L). Por lo tanto, un medio de este tipo favorece el crecimiento y la multiplicación de cepas de levadura que usan los dos azúcares.
La etapa siguiente intenta anticipar un posible riesgo de pérdida de tolerancia con respecto a los inhibidores, en particular del ácido acético en forma no disociada, de las cepas seleccionadas.
Por lo tanto y en esta etapa se implementan dos cultivos anaerobios:
- uno en un medio de cultivo que contiene glucosa como única fuente de carbono; y
- el otro en un medio de cultivo que contiene xilosa como única fuente de carbono.
El orden de paso sobre estos dos medios de cultivo posiblemente puede invertirse (medio de xilosa, luego glucosa). Ventajosamente, la concentración de glucosa o de xilosa del medio de cultivo es la que se lleva a cabo actualmente cuando se usa como única fuente de carbono, específicamente, comprendida entre 5 y 200 g/L en el caso de un medio líquido (5 y 200 g/kg en el caso de un medio sólido), igual por ejemplo a 150 g/L para glucosa y 70 g/L para xilosa.
Dicho medio comprende además el ácido orgánico susceptible de inhibir la fermentación de estos dos azúcares, específicamente, el ácido acético en forma no disociada.
Se debe señalar que, de manera conocida, sólo la forma no disociada o no ionizada de los ácidos de este tipo tiene capacidad de inhibición. Dentro del alcance de la invención, lo que se entiende por “forma no ionizada o no disociada” de un ácido fénico es su forma protonada. En la práctica, la forma de los ácidos orgánicos de este tipo depende del pH del medio en el que se incorporan. A un pH mayor al pKa del ácido, la mayor parte se encuentra en forma disociada o iones COO-. Por el contrario ya un pH más bajo, la mayoría se encuentra en forma no disociada o no ionizada (COOH). En lo sucesivo en la descripción, se hace referencia al ácido acético introducido en el medio, que incluye formas disociadas y no disociadas en dependencia del pH de dicho medio.
Ventajosamente, la concentración de ácido acético en forma no disociada del medio de cultivo está comprendida entre 0,5 y 5 g/L en medio líquido (equivale a 0,5 y 5 g/kg en medio sólido), ventajosamente entre 1,3 y 2,6 g/L. En la práctica y a manera de ejemplo, el último intervalo corresponde a una concentración de ácido acético añadida a un medio de crecimiento y pH 5 comprendido entre 3 y 6 g/L, por ejemplo igual a 4 o 5 g/L.
Aparte de estos dos ingredientes, este medio de crecimiento es ventajosamente un medio completamente sintético, adecuado para el crecimiento de levaduras de forma anaerobia o hipóxica, como por ejemplo el medio YF, cuya composición exacta se indica en las modalidades ilustrativas.
Por lo tanto medios adecuados para la implementación de esta segunda etapa del método son por ejemplo los medios denominados YF-glucosa ácida y YF-xilosa ácida, cuya composición se detalla en las modalidades ilustrativas.
Además de la composición de estos medios de cultivo, el cultivo de la cepa de levadura o de la mezcla de cepas en esta primera y segunda etapa del método de acuerdo con la invención se lleva a cabo ventajosamente en condiciones estándar favorables al crecimiento anaeróbico o hipóxico de la levadura, en particular del tipo Saccharomyces y a su actividad de fermentación, específicamente:
- pH ácido, ventajosamente comprendido entre 4 y 6, o 4,5 y 5,5, incluso más ventajosamente igual a 5 o 5,4; - temperatura comprendida entre 28 y 37 °C, o entre 30 y 35 °C, ventajosamente igual a 32 °C;
- cultivo bajo agitación débil, igual por ejemplo a 100 rpm;
- en condiciones de suministro de oxígeno reducido (bajo limitado O2). En la práctica, el cultivo puede realizarse en un vial cerrado por medio de un tapón que reduce el suministro de O2 en el medio mientras que permite la eliminación del CO2 producido.
Generalmente, el cultivo se detiene cuando la fuente de carbono osídico se ha consumido totalmente. En la práctica y ventajosamente el cultivo se realiza durante al menos 24 horas, o varios días, ventajosamente hasta 7 días. De acuerdo con un modo de modalidad particular, el método de acuerdo con la invención comprende además el paso de la levadura sobre un cuarto medio de crecimiento, ventajosamente líquido, destinado a seleccionar las células capaces de respirar, específicamente, que tienen mitocondrias funcionales. En la práctica esta etapa, que puede implementarse en cada ciclo o al menos una vez en el método, permite prescindir de la aparición de “petites”, cuyo fenotipo respiratorio deficiente puede ser desventajoso dentro del alcance de los métodos industriales de producción de levadura.
Ventajosamente, este cuarto medio es un medio pobre o mínimo, que contiene como única fuente de carbono una fuente de carbono que sólo puede ser utilizada por células que han conservado mitocondrias funcionales. Esto se denomina fuente de carbono estrictamente respiratoria, es decir, una fuente de carbono que implica sistemáticamente la oxidación mitocondrial y no produce etanol. Esta puede ser ventajosamente el glicerol o eventualmente etanol. En otras palabras, un medio de este tipo carece de azúcar fermentable.
Ventajosamente, la concentración de glicerol en el medio de cultivo es la actualmente implementada cuando se usa como única fuente de carbono, específicamente comprendida entre 5 y 50 g/L, ventajosamente comprendida entre 10 y 50 g/L, por ejemplo igual a 10 g/L para obtener una biomasa suficiente para eventualmente inocular el primer medio de cultivo del siguiente ciclo.
Por definición, un medio mínimo contiene, además de una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una fuente de potasio, una fuente de fósforo, una fuente de azufre, una fuente de magnesio, una fuente de calcio, una fuente de hierro, una fuente de oligoelementos y agua.
Un medio que puede servir para preparar este medio puede comprender:
- una base, tal como la “base nitrogenada de levadura” DIFCO®, ventajosamente al nivel de 3,4 g/L;
- y eventualmente sulfato de amonio, ventajosamente al nivel de 5 g/L.
- Aparte de la composición específica de este medio de crecimiento, el cultivo de la cepa de levadura o de la mezcla de cepas se realiza ventajosamente en condiciones estándar favorables al crecimiento aeróbico de la levadura, específicamente:
- pH ácido, ventajosamente comprendido entre 4 y 6, o entre 4,5 y 5,5, por ejemplo igual a 5;
- temperatura comprendida entre 28 y 37 °C, o entre 30 y 35 °C, ventajosamente igual a 32 °C;
- bajo agitación media, por ejemplo igual a 150 rpm;
- aeróbicamente. En la práctica, el cultivo puede realizarse en un vial con deflectores cerrado por un tapón poroso que permite el suministro de O2 en el medio.
Allí también, el cultivo se detiene cuando la fuente de carbono, ventajosamente glicerol, se ha consumido totalmente. En la práctica y ventajosamente, el cultivo se realiza durante varias horas, ventajosamente 48 horas.
Esta sucesión de cultivos en estos tres o cuatro medios, en las condiciones antes descritas, constituye un ciclo. En la práctica, un ciclo de selección de acuerdo con la invención puede por tanto desarrollarse de la siguiente manera:
- un primer cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de xilosa y arabinosa;
- un segundo cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de glucosa y ácido acético;
- un tercer cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de xilosa y ácido acético;
- posiblemente un cuarto cultivo aeróbico en presencia de glicerol;
o
- un primer cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de xilosa y arabinosa;
- un segundo cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de xilosa y ácido acético;
- un tercer cultivo anaeróbico o hipóxico en presencia de glucosa y ácido acético;
- posiblemente un cuarto cultivo aeróbico en presencia de glicerol.
De acuerdo con la invención, estos diferentes cultivos se realizan de acuerdo con el método denominado “Single Batch Repeat”, es decir, sin renovación de los medios de cultivo presentes.
De acuerdo con una modalidad particular, un ciclo de este tipo se repite al menos 2 veces (“repetición de múltiples lotes”), 2 veces por ejemplo.
Este método ha permitido seleccionar cepas de levadura que, durante la fermentación en un medio aproximado al medio natural que comprende en particular arabinosa, glucosa, xilosa y ácido acético, ofrecen una mejor producción de etanol (un título alcohólico más alto) y un mejor consumo de la arabinosa presente en el medio.
De acuerdo con otro aspecto, la presente solicitud informa de una cepa de levadura que puede obtenerse por medio del método descrito. Por lo tanto, se han podido aislar cepas de levadura que, tras el proceso de selección, tienen una capacidad de consumo de la arabinosa presente en el medio incrementada al menos en un 10 %, o 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, o incluso 80 %. Este rendimiento se evalúa ventajosamente en condiciones de fermentación como se describió anteriormente en relación con el medio YFCF y después de 160 horas.
De hecho y en estas condiciones, se ha observado un consumo mayor al 90 %, incluso al 95 % o incluso al 97,5 % de la arabinosa presente en el medio de cultivo.
Por lo tanto, la presente solicitud informa de una cepa de levadura que puede obtenerse por medio del método descrito, capaz de fermentar al menos el 90 %, o el 95 %, o incluso el 97,5 % de la arabinosa después de 160 horas de fermentación en un medio que comprende glucosa (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 63 g/L), xilosa (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 28 g/L), arabinosa (ventajosamente al nivel de 1 a 100 g/L, por ejemplo 28 g/L) y ácido acético (ventajosamente al nivel de 1 a 10 g/L, por ejemplo 4 g/L). Preferentemente, una cepa de levadura de este tipo es capaz de fermentar simultáneamente al menos el 90 % o el 95 % o incluso el 100 % de la glucosa y de la xilosa también presentes.
Ventajosamente, una cepa de este tipo presenta al menos una de las siguientes características, o todas estas características:
- al menos una copia de un gen araA, preferentemente procedente de B. licheniformis, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente en todos los loci HO;
- al menos una copia de un gen araB, preferentemente procedente de E. coli, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente a nivel de todos los loci HO;
- al menos una copia de un gen araD, preferentemente procedente de E. coli, integrado ventajosamente a nivel cromosómico, incluso más ventajosamente a nivel de todos los loci HO;
- al menos una copia de un gen exógeno que codifica una xilosa isomerasa, ventajosamente de Clostridium fitofermentans;
- al menos una copia supernumeraria del gen GAL2 que codifica un transportador de hexosas también capaz de garantizar la captura de xilosa. En consecuencia con otra modalidad, dicha cepa comprende al menos dos copias supernumerarias del gen GAL2. Este puede ponerse bajo el control de un promotor fuerte y constitutivo del tipo pADH1;
- la supresión de la actividad de la aldosa reductasa codificada por GRE3, ventajosamente por inserción del gen HAA1 en el locus GRE3;
- la sobreproducción de xiluloquinasa (XKS1), particularmente por modificación del promotor o la introducción de copias supernumerarias;
- la expresión o la sobreproducción de la vía de las pentosas fosfato (RPE1, RKI1, TKL1, TAL1, ...);
- la ausencia de actividad de xilosa reductasa (XR).
De acuerdo con otra modalidad ventajosa, una cepa de este tipo presenta al menos una de las siguientes características, preferentemente ambas:
- fuerte actividad poliol deshidrogenasa, ventajosamente mayor o igual a 0,001 U/g de proteína, incluso más ventajosamente mayor o igual a 0,002 U/g de proteína;
- actividad aldosa reductasa menor a 0,005 U/g de proteína, o 0,004, 0,003 o incluso 0,002 U/g de proteína, preferentemente menor o igual a 0,0015 U/g de proteína, o menor o igual a 0,001 U/g de proteína, incluso más aún con mayor preferencia menor o igual a 0,0005 U/g de proteína.
De acuerdo con una modalidad particular, una cepa de este tipo no está mutada en los siguientes genes: SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80 y/o PMR1. De acuerdo con otra modalidad particular, la cepa no presenta las siguientes mutaciones: G1363T en el gen SSY1, A512T en el gen YJR154w, A1186G en el gen CEP3, A436C en el gen GAL80, A113G en el gen PMR1.
Una cepa de acuerdo con la invención es la cepa depositada en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con fecha 19 de mayo de 2016, con el número I-5086.
De acuerdo con una modalidad particular, una cepa de este tipo presenta al menos una copia supernumeraria del gen HAA1, ventajosamente insertado en el gen GRE3.
De acuerdo con otro aspecto, la invención se refiere al uso de cepas como las definidas anteriormente para la fermentación de un material que contiene ventajosamente arabinosa y/o xilosa y/o glucosa, y/o para la producción de etanol.
De acuerdo con una modalidad particular, el material es un material lignocelulósico. Un material de este tipo típicamente contiene:
- pentosas, en particular D-xilosa y L-arabinosa;
- hexosas, en particular D-manosa, D-galactosa, L-ramnosa y D-glucosa;
- ácidos urónicos.
De acuerdo con un aspecto particular, la invención se refiere a un método para producir productos de fermentación o etanol que comprende las siguientes etapas:
- incubar un material o medio que contiene arabinosa y/o xilosa y/o glucosa, ventajosamente arabinosa, xilosa, glucosa y ácido acético, con una cepa como la definida anteriormente;
- Fermentación en condiciones anaeróbicas o semianaeróbicas (hipóxicas);
- Recuperación del o de los productos de fermentación o del etanol.
De acuerdo con una modalidad particular, el material o medio es hemicelulosa o “fibras de maíz”.
La presente invención se ilustrará más abajo por medio de las siguientes modalidades ilustrativas, que apoyan las figuras adjuntas. Sin embargo, estos no tienen un alcance limitante.
Leyendas de las figuras:
La Figura 1 muestra las vías metabólicas de conversión de L-arabinosa y D-xilosa en D-xilulosa-5-fosfato. La Figura 2 muestra el plásmido pLI285-055 que permite la integración de los genes araA/araB/araD en el locus HO de Saccharomyces cerevisiae.
La Figura 3 muestra los productos de PCR obtenidos mediante el uso de los oligonucleótidos de la tabla 1 más abajo. La banda 1 corresponde al marcador de tamaño (escala de ADN de 1 kb), las bandas 2 a 9 corresponden a los productos de PCR obtenidos mediante el uso como matriz del ADN genómico de los 8 transformantes probados, la banda 10 al obtenido con la cepa no transformada. La banda 11 es el control negativo de la técnica (agua) y la banda 12 es el control positivo con el plásmido pLI285-055 como matriz. La Figura 4 ilustra el crecimiento de las colonias en un medio YPG blasticidina 60 mg/L (A) y en un medio YNBAra que contiene 10 g/L de arabinosa (B).
La Figura 5 ilustra el crecimiento de clones seleccionados, en un medio que contiene arabinosa (A) o xilosa (B) como única fuente de carbono.
La Figura 6 muestra la evolución de la concentración (expresada en g/kg) de diferentes constituyentes en función del tiempo de fermentación, en medio YFCF (63 g/kg de glucosa, 28 g/kg de xilosa, 28 g/kg de arabinosa y 4 g/kg de ácido acético pH = 5), de los clones 13 (A) y 126 (B) seleccionados por su capacidad de fermentar arabinosa. Los valores representan los valores promedios resultantes de 3 experimentos biológicamente independientes.
La Figura 7 muestra la actividad de la aldosa reductasa medida en los diferentes conjuntos de genes probados (I-4953; clon 13; clon 126). Los valores representan los valores promedios de 2 experimentos biológicamente independientes.
La Figura 8 muestra la pérdida de masa observada a las 48 horas de fermentación en el clon 126 y sus transformantes (transformados con pADH1-GRE3).
La Figura 9 muestra (A) la evolución de la concentración de etanol (g/kg) en función del tiempo de fermentación en medio YFCF de diferentes clones seleccionados tras evolución dirigida realizada a partir de la cepa EG31; (B) la concentración de arabinosa (g/kg) después de 160 horas de fermentación en medio YFCF de estos mismos clones y de la cepa EG31.
Modalidades ilustrativas
I/ Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae capaz de fermentar arabinosa:
1. Transformación por la vía de la arabinosa:
La vía de fermentación de la arabinosa se muestra en la Figura 1.
La cepa denominada I-4953, depositada en el Instituto Pasteur (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con el número CNCM I-4953 con fecha 29 de enero de 2015, se transformó por medio del plásmido pLI285-055 (Figura 2), un derivado del plásmido pHD22 que lleva un casete para expresar la vía de la arabinosa que permite la integración del araA gen de Bacilo licheniformis y araB/araD desde Escherichia coli en el locus HO de esta cepa de S. cerevisiae.
También se sabe que esta cepa es capaz de metabolizar la xilosa debido a la presencia de al menos una copia de un gen exógeno que codifica la xilosa isomerasa de Clostridium fitofermentans.
Además, esta cepa sobreexpresa los genes que codifican las enzimas de la porción no oxidativa de la vía de las pentosas fosfato, particularmente los genes TAL1 y TKL1.
2. Validación de la integración cromosómica de la vía de la arabinosa:
La correcta integración de los diferentes genes que codifican las enzimas que constituyen la vía de metabolización de la arabinosa, en particular de los genes ara A, B y D, ha sido verificada por PCR mediante el uso como matriz del ADN genómico de los transformantes y de los oligonucleótidos que permiten amplificar un fragmento de cada uno de los 3 ORF correspondientes. Estos oligonucleótidos, así como también su secuencia, se indican en la Tabla 1 más abajo:
Figure imgf000014_0001
Los productos de PCR obtenidos se analizaron en gel de agarosa al 0,8 % tras una migración de una hora a 50 voltios en TAE 0,5x.
Los resultados, presentados en la Figura 3, muestran que se ha amplificado realmente un producto de PCR para los 3 genes de la vía de la arabinosa en todos los transformantes probados (8). Esta observación sugiere que estos genes en realidad se han integrado en el genoma de la levadura.
Además, se ha llevado a cabo una secuenciación convencional para comprobar que los genes araA, B y D no están mutados (datos no mostrados).
3. Selección de las cepas realmente capaces de metabolizar arabinosa:
Para seguir el avance en las investigaciones, se ha decidido simplificar el sistema de expresión de la vía de la arabinosa. Para ello, se modificó el casete para que expresara los genes ara A, B y D mientras que carece de la secuencia de codificación de un transportador de arabinosa (araT).
Para medir la frecuencia de aparición de cepas capaces de metabolizar arabinosa, se transformó la cepa I-4953, depositada en la CNCM el 29 de enero de 2015, por medio de 1,3 mg de este casete portador araA, B y D.
El producto de transformación se repartió en 2 tipos de medios:
- un primer medio que corresponde a YPG (10 g/L de extracto de levadura; 10 g/L de peptona; 20 g/L de glucosa como única fuente de carbono) que contiene Blasticidina al nivel de 50 mg/L. El objetivo es determinar el número de células que han integrado el casete en su genoma;
- un segundo medio denominado YNB-Ara que corresponde a un medio mínimo (Difco® YNB) que contiene 10 g/L de arabinosa como única fuente de carbono. Este medio debe permitir determinar el número de células que han adquirido el fenotipo [ara+].
El medio Difco® YNB (“Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos y sulfato de amonio”), designado con el número 0335-15, contiene:
- Biotina 2 pg/L
- Pantotenato (calcio) 400 pg/L
- Ácido fólico 2 |jg/L
- Inositol 2000 jg/L
- Niacina 400 jg/L
- Ácido P-aminobenzoico 200 jg/L
- Piridoxina (clorhidrato) 400 jg/L
- Riboflavina 200 jg/L
- Tiamina (clorhidrato) 400 jg/L
- Ácido bórico 500 jg/L
- Sulfato de cobre 40 jg/L
- Yoduro de potasio 100 jg/L
- Cloruro de hierro 200 jg/L
- Sulfato de manganeso 400 jg/L
- Molibdato de sodio 200 jg/L
- Sulfato de zinc 400 jg/L
- Fosfato monobásico de potasio 1 g/L
- Sulfato de magnesio 500 mg/L
- Cloruro de sodio 100 mg/L
- Cloruro de calcio 100 mg/L
pH final= 5,4
Sulfato de amonio (5 g/L)
La Figura 4 ilustra el resultado obtenido en estos dos tipos de medios.
Después de 6 días de crecimiento en los dos medios, se contaron las colonias. Se observó que el número de colonias en medio YNB-Ara representa aproximadamente el 18 % del observado en YPG Blasticidina. En otras palabras, solo el 18 % de las colonias que han integrado los genes araA, B y D en su genoma parecen capaces de crecer mediante el uso de la arabinosa como única fuente de carbono.
Lo anterior revela que:
- el casete que codifica los genes araA, B y D es necesario pero no suficiente para obtener un fenotipo [ara+]; - es posible la selección directa de los transformantes en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono y, contrariamente a las enseñanzas de Wisselink y otros (2007; Appl Environ Microbiol 73, 4881­ 4891), no es necesaria una etapa previa de crecimiento en presencia de galactosa.
A continuación, el casete se ha simplificado incluso más y se ha privado de cualquier marcador de selección, particularmente de resistencia a los antibióticos.
Los 1156 transformantes que habían crecido en el medio YNB-Ara se probaron luego en el formato de pocillos profundos (= microplaca con 96 pocillos) para confirmar su capacidad de crecer anaeróbicamente en arabinosa, pero también para verificar la retención de su capacidad para fermentar xilosa y glucosa.
La composición de los medios implementados en este alcance se detalla más abajo:
Medio YF =
- extracto de levadura (EXL) 5 g/L;
- fosfato diamónico 4,7 g/L;
- ácido cítrico 11,4 g/L;
- citrato trisódico 13,5 g/L;
- ZnSO421,2 mg/L;
- MgSO47 H2O 1 g/L;
- tiamina 18,24 mg/L;
- piridoxina 5,28 mg/L;
- biotina 1,76 g/L;
- pantotenato 3,8 mg/L;
- ácido nicotínico 20 mg/L;
- meso-inositol 50 mg/L;
- riboflavina 1 mg/L;
- para-amino-benzoato 1,2 mg/L;
- Tween 801 g/L.
Medio YF-ara: Medio YF que contiene 70 g/L de arabinosa
Medio YF-xilosa: Medio YF que contiene 70 g/L de xilosa
El pH del medio se mantiene en 5. El cultivo se realiza a 32 °C.
La Figura 5 ilustra los resultados obtenidos con una serie de cepas cuyo crecimiento ha sido controlado en paralelo en un medio que contiene arabinosa (A) o xilosa (B) como única fuente de carbono, este último medio permite seleccionar las cepas que han conservado su capacidad para metabolizar la xilosa.
Los resultados presentados en la Figura 5 muestran que el modo de selección de la cepa [ara+] se ha mejorado aún más: La Figura 5A muestra que 15 clones de los 91 probados no parecen capaces de reanudar su multiplicación mientras se usa arabinosa. Esto sugiere que, a diferencia de la selección basada en la resistencia a un antibiótico, la selección sobre YNB-Ara permite obtener un 85 % de transformantes que han adquirido el fenotipo [ara+].
Otra faceta que surge de los resultados presentados en la Figura 5 se refiere a la coexistencia de las dos vías metabólicas, xilosa y arabinosa. Por lo tanto puede observarse que ciertas cepas han adquirido el fenotipo [ara+] en detrimento del fenotipo [xyl+]. Otras, por otra parte, no han conservado el fenotipo [ara+] después del subcultivo en glucosa (resultados no mostrados). Sin embargo, entre las 91 cepas probadas, 67 parecen haber adquirido y conservado el fenotipo doble [ara+; xyl+], o casi % de los transformantes.
4. Comparación de 2 cepas seleccionadas:
- Fermentación en medio YFCF:
Se ha comparado el rendimiento de 2 clones aislados (denominados clones 13 y 126, respectivamente), como se describió anteriormente, durante la fermentación en medio YFCF a pH 5 que comprende glucosa como fuente de carbono, pero también arabinosa y xilosa presentes en cantidades iguales, así como también ácido acético, acercándose por lo tanto a los medios naturales de fermentación.
Más precisamente, la composición del medio YFCF es la siguiente:
- 10 g/L de extracto de levadura;
- 10 g/L de bactopeptona;
- 63 g/L de glucosa;
- 28 g/L de xilosa;
- 28 g/L de arabinosa;
- 4 g/L de ácido acético (cantidad introducida en el medio de cultivo a pH 5).
Las condiciones de fermentación son las siguientes:
- pH: 5
- Temperatura: 32 °C
- -O2 condiciones: sin suministro de oxígeno
- Agitación: 100 rpm
- Duración del cultivo: hasta 72 horas
- Precultivo/Incubación: 0,25 g/kg eq MS de levadura previamente propagada a saturación en medio YPG durante 24 horas.
La producción de etanol se estima indirectamente mediante la medición de la pérdida de masa del vial de fermentación, al estar directamente correlacionada esta pérdida de masa con la producción de CO2 que es estequiométrica con la del alcohol. Se expresa en g por kg de medio.
Las concentraciones de glucosa, xilosa, arabinosa y glicerol en el medio se controlan por HPLC.
Las variaciones de biomasa se evalúan mediante medición de la materia seca residual después de 4 horas a 105 °C. Los resultados, presentados en la Figura 6, revelan:
- una reducción en la tasa de consumo de xilosa para el clon 13 en comparación con el clon 126, acompañada también de una tasa reducida de producción de etanol;
- en particular, una menor tasa de consumo de arabinosa en el clon 13 que en el clon 126. Por lo tanto, tras 32 horas de fermentación, el clon 13 consumió 12,1 /- 0,6 g/kg de arabinosa, mientras que el clon 126 consumió 15,3 /- 0,5 g/kg de la misma.
También hay que señalar que las pentosas se consumen mientras la concentración de glucosa extracelular no sea cero.
Se intentó entonces explicar la diferencia observada entre los clones 13 y 126, en particular en lo que se refiere a la tasa de fermentación de la arabinosa.
Análisis de las actividades de la vía:
Se probó la actividad enzimática intracelular implicada en las vías metabólicas de la arabinosa y de la xilosa.
En primer lugar, no se observaron diferencias notables en la actividad de la xilitol deshidrogenasa (resultados no mostrados).
Por otra parte, se observó una actividad diferente de arabinosa isomerasa (codificada por araA) entre los clones 13 y 126, con una mayor inhibición competitiva para el clon 13 (resultados no mostrados).
Como se ilustra en la Figura 7, esta diferencia se correlacionó con una diferencia en la reducción de aldosas, y más precisamente de la actividad de aldosa reductasa de estos dos clones. Se debe señalar que en la cepa I-4953 original, el gen GRE3 que codifica la principal aldosa reductasa en S. cerevisiae había sido eliminado, pero que quedaba una actividad residual (ver Figura 7).
Titulación de la actividad de la aldosa reductasa en un extracto celular:
Propagación de las cepas
Las cepas a probar se establecen para crecer en un medio rico (YPG). Son necesarias dos fases sucesivas de propagación de 24 horas a 30 °C, bajo agitación, para obtener suficiente biomasa. Una vez finalizadas las cosechas de biomasa, se realiza la medición de la materia seca sobre 1 mL de cada nata tras su paso por la estufa de secado a 105 °C durante 4 horas. Las fermentaciones se realizan en matraces redondos de 250 mL que contienen 100 g de medio de fermentación YF-xilosa. Cada matraz redondo se inocula a una tasa de 0,5 g/kg de materia seca equivalente. Las fermentaciones se realizan a 32 °C, bajo agitación a 110 rpm, y duran 3 días. En esta etapa se recogen 50 mL de producto de fermentación que luego sirven para la determinación de las diferentes actividades enzimáticas y de la concentración proteica de la muestra.
Preparación del extracto celular
Se recogen 50 mL del producto de fermentación mediante centrifugación (4700 rpm, 2 min, 4 °C) y luego se resuspenden en 3 mL de tampón de fosfato de potasio 0,1 M, pH 7. Después de la centrifugación, cada sedimento se vuelve a suspender en 1 mL de tampón de fosfato de potasio 0,1 M pH 7.
A continuación, se transfiere 1 mL del sedimento resuspendido en 1 tubo Fast Prep (previamente rellenado con 250 mL de bolas) y luego se tritura a 4 °C: 4 x 30 segundos (6 m/s), cada uno espaciado por 30 segundos. Luego se centrifuga la materia triturada durante 3 minutos a 10000 rpm (para precipitar tanto las bolas así como también los desechos celulares) y se transfiere la totalidad del sobrenadante en un tubo Eppendorf enfriado sobre hielo.
Titulación de las actividades enzimáticas
La titulación de la actividad enzimática se realiza mediante el control de la absorbancia a 340 nm. Las medidas se realizan en un ambiente termostatado a 32 °C.
Figure imgf000017_0001
El sustrato se agrega después de 1 minuto.
Los resultados presentados en la Figura 7 destacan una reducción muy fuerte en la actividad de la aldosa reductasa en los clones 13 y 126 en comparación con la cepa parental I-4953. Se debe señalar, sin embargo, que esta actividad es el doble en el clon 13 que en el clon 126. Esta observación parece poder explicar el bajo rendimiento del clon 13 en comparación con el clon 126. Para poder corroborar este resultado con el rendimiento en la fermentación de xilosa y/o arabinosa, se intentó aumentar la actividad aldosa reductasa en el clon 126.
Impacto de la reintroducción de un gen que codifica una aldosa reductasa sobre la capacidad de las células para metabolizar arabinosa:
Esto revela que dos de las principales diferencias entre los clones 126 y 13 residen en su capacidad de fermentar xilosa y arabinosa y en su capacidad de reducirlas a xilitol y arabitol, respectivamente. En la medida en que estos dos fenotipos parecen anticorrelacionados, se intentó reforzar esta actividad en las células del clon 126.
En este sentido, el gen GRE3 que codifica la principal aldosa reductasa en la levadura S. cerevisiae (Garay-Arroyo y Covarrubias, 1999, Yeast 15, 879-892; Traff y otros, 2001 Appl. Environ. Microbiol. 67, 5668-5674) se ha vuelto a introducir. En la práctica, una copia del gen ADH1 se ha integrado en el locus nativo de GRE3 en el genoma del clon 126.
Para validar la correcta integración del gen en el locus correcto, se han usado los siguientes cebadores en las reacciones de PCR:
- B6C2 (CCTATTGCTGTTTCCTCTTCAAAGTAC; SEQ ID NO: 7), que hibrida en el terminador del marcador de selección;
- B13B1 (TAGTTGTCAGTGCAATCCTTC; SEQ ID NO: 8), complementario con una región del terminador del gen GRE3.
Después de la verificación de la integración del casete en el genoma de los transformantes seleccionados (resultados no mostrados), se probó su capacidad para utilizar arabinosa anaeróbicamente como única fuente de carbono. En este sentido, tanto los transformantes así como también el clon 126 se inocularon al nivel de 2 g (eq MS)/kg en medio YF-Ara.
La pérdida de masa después de 48 horas de fermentación se muestra en la Figura 8. Estos resultados muestran que todos los clones que tienen integrado el gen GRE3 tienen una capacidad de fermentación de arabinosa que es reducida en comparación con la del clon 126. Por tanto, este resultado apoya la hipótesis de acuerdo con la cual una actividad de aldosa reductasa demasiado alta limita la capacidad de las células para fermentar arabinosa.
Conclusiones:
La integración de la vía de fermentación de la arabinosa, en este caso la aparición de los genes araA (B. licheniformis)/araB (E. coli)/araD (E.coli) en el locus HO de la cepa I-4953 de S. cerevisiae, seguido de un cribado en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono, ha permitido seleccionar cepas capaces de fermentar arabinosa. Además, se ha demostrado que entre estas cepas, las más favorables son aquellas que tienen una actividad de aldosa reductasa baja. Dentro de este alcance, se ha aislado una cepa particularmente interesante, específicamente, la cepa EG31 que fue depositada en el Instituto Pasteur ( Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) con el número CNCM I-5085 con fecha 19, de mayo 2016.
II/ Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae optimizado para la fermentación de arabinosa y xilosa: 1. Selección de una cepa capaz de fermentar arabinosa y xilosa por evolución dirigida:
Con el fin de seleccionar una cepa más optimizada para la fermentación de pentosas, y en particular de arabinosa, la cepa EG31 se ha sometido a una evolución dirigida por lotes.
Por lo tanto se ha perfeccionado un protocolo de evolución dirigida que permite obtener el fenotipo deseado. Para ello se ha definido e implementado un medio en el que estaría en desventaja la levadura que consumiría sólo uno de los dos azúcares. En la práctica, en este primer medio denominado “GO xilosa arabinosa” y definido más abajo, no es la fuente de nitrógeno la que es limitante sino las fuentes de carbono. En la práctica, este medio contiene 10 g/L de (NH4)2PO4 pero solo 4 g/L de xilosa y 5 g/L de arabinosa.
Medio 1: GO xilosa arabinosa (pH 5):
- Xilosa 4 g/L
- Arabinosa 5 g/L
- (NH4)2PO4 (DAP) 10 g/L
- Ácido cítrico 11,4 g/L
- Citrato trisódico 13,5 g/L
- ZnSO40,004 g/L
- MgSO40,5g/L
- KH2PO41 g/L
- NaCl 0,1 g/L
- CaCl20,1 g/L
- CuSO40,00006 g/L
- -H3BO30,0005 g/L
- KI 0,0001 g/L
- MnSO40,0004 g/L
- Na2MoO40,0002 g/L
- -FeCla 0,0002 g/L
- Piridoxina 0,002 g/L
- Biotina 0,0008 g/L
- Pantotenato 0,002 g/L
- Ácido nicotínico 0,001 g/L
- Meso-inositol 0,001 g/L
- Tween 801 g/L
El cultivo se realiza a 32 °C con agitación a 100 rpm en viales cerrados con tapón que permiten reducir el aporte de oxígeno en el medio y que permiten el escape del CO2 bajo la presión que se produce en todo este cultivo. El cultivo dura aproximadamente 7 días en estas condiciones.
2. Selección de una cepa que también ha conservado su capacidad para fermentar glucosa y/o xilosa en presencia de ácido acético
Para anticipar un posible riesgo de pérdida de tolerancia con respecto a los inhibidores, en particular al ácido acético en forma no disociada, se han introducido en el ciclo de evolución dirigida dos cultivos en lotes sucesivos en medios que contienen glucosa o xilosa como única fuente de carbono y en presencia, en ambos casos, de fuertes concentraciones de ácido acético.
Medio 2: YF-glucosa ácido:
El medio YF-glucosa ácido corresponde al medio YF descrito anteriormente, que contiene 150 g/L de glucosa y tiene una concentración de ácido acético (cantidad introducida en el medio de cultivo a pH 4,4) igual a 5 g/L.
Medio 3: YF-xilosa ácido:
El medio YF-xilosa ácido corresponde al medio YF-xilosa descrito anteriormente, con una concentración de ácido acético (cantidad introducida en el medio de cultivo a pH 5) igual a 4 g/L.
Condiciones de cultivo:
El cultivo se realiza a 32 °C con agitación a 100 rpm en viales cerrados con tapones que permiten reducir el aporte de oxígeno en el medio y que permiten el escape del CO2 bajo la presión que se produce en todo este cultivo. El cultivo dura aproximadamente 7 días en estas condiciones.
3. Eliminación de las “petites”:
Para evitar la selección de cepas carentes de mitocondrias, que no serían compatibles con los métodos de producción industrial, también se ha añadido una etapa de cultivo en un medio que contiene glicerol como única fuente de carbono. Esta etapa requiere la presencia de una cadena de transferencia de electrones funcional en las células para que puedan multiplicarse.
Medio 4: YNB glicerol:
- 3,4 g/L DIFCO® “yeast nitrogen base”;
- 5 g/L de sulfato de amonio;
- 10 g/L de glicerol como única fuente de carbono.
El cultivo se realiza a 30 °C con agitación a 150 rpm en viales con deflectores cerrados por tapones porosos que permiten el aporte de oxígeno al medio. El cultivo dura aproximadamente de 24 a 48 horas en estas condiciones. En la práctica, un ciclo de evolución dirigida se caracteriza por tanto por:
- un cultivo en medio GO xilosa arabinosa; después
- un cultivo en medio YF glucosa ácido; después
- un cultivo en medio YF xilosa ácido; después
- un cultivo en medio de glicerol YNB.
4. Evaluación de los clones obtenidos:
En la práctica, se llevaron a cabo dos ciclos de cultivo.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un proceso para la obtención y selección de cepas de levadura capaces de fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada que comprende:
- la integración cromosómica de los genes araA, araB y araD, ventajosamente araA de B. licheniformis, araB y araD de E. coli, en una cepa de levadura capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y que tiene al menos un gen GRE3 inactivado o eliminado;
- poner las cepas transformadas en cultivo directo en un medio que contiene arabinosa como única fuente de carbono para la selección de cepas capaces de metabolizar dicha arabinosa;
- opcionalmente seleccionar las cepas transformadas que hayan metabolizado arabinosa por su actividad aldosa reductasa menor o igual a 0,002 U/g de proteína, o incluso menor o igual a 0,0005 U/g de proteína.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa de levadura capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y que tiene al menos un gen GRE3 inactivado o eliminado se elige entre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Yarrowia, Paffia, Kluyveromyces, Candida, Talaromyces, Brettanomyces, Pachysolen, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces y Debaryomyces, ventajosamente una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
3. El proceso de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque la cepa de levadura capaz de fermentar xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y que tiene al menos un gen GRE3 inactivado o eliminado es la cepa registrada en la CNCM el 29 de enero de 2015 con el número 1-4953.
4. Una cepa de levadura obtenida mediante el uso del proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque presenta además una actividad aldosa reductasa menor o igual a 0,002 U/g de proteína, o incluso menor o igual a 0,0005 U/g de proteína y es la cepa 1-5085, registrada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) el 19 de mayo de 2016.
5. Un proceso para obtener y seleccionar una cepa de levadura con una capacidad mejorada para fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada, en donde una cepa de levadura capaz de fermentar arabinosa, glucosa y xilosa en presencia de ácido acético en forma no disociada y obtenida mediante el uso del proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, ventajosamente una cepa de acuerdo con la reivindicación 4, se cultiva sucesivamente en las siguientes condiciones:
- un cultivo anaeróbico o en hipoxia en un medio que contiene, como únicas fuentes de carbono, arabinosa y xilosa en concentraciones limitantes para la producción de biomasa, ventajosamente en una cantidad de 5 g/L y 4 g/L respectivamente; luego
- dos cultivos anaeróbicos o en hipoxia sucesivos en presencia de ácido acético en forma no disociada, uno en un medio que contiene glucosa como única fuente de carbono y el otro en un medio que contiene xilosa como única fuente de carbono;
- posiblemente un cultivo aeróbico en un medio mínimo que contiene, como única fuente de carbono, una fuente de carbono respiratorio estricto, ventajosamente glicerol.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque el cultivo sucesivo de la cepa en los distintos medios se repite al menos 2 veces.
7. Una cepa de levadura que puede obtenerse con el proceso de acuerdo con una de las reivindicaciones 5 a 6, caracterizada porque es la cepa 1-5086, registrada en la CNCM (Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) el 19 de mayo de 2016.
8. La cepa de levadura de acuerdo con una de la reivindicación 4 o 7, caracterizada porque tiene al menos una copia supernumeraria del gen HAA1, ventajosamente insertado a nivel del gen GRE3.
9. Uso de una cepa de acuerdo con una de las reivindicaciones 4, 7 y 8 para la fermentación de un material, que contiene ventajosamente arabinosa y/o xilosa y/o para la producción de etanol.
10. Un proceso para la producción de productos de fermentación o etanol que comprende las siguientes etapas: - Incubación de un material o medio que contiene arabinosa y/o xilosa con una cepa de acuerdo con una de las reivindicaciones 4, 7 y 8;
- Fermentación en condiciones anaeróbicas o semianaeróbicas;
- Recuperación de uno o más productos de fermentación o etanol.
11. El proceso para la producción de productos de fermentación o etanol de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el material o medio también contiene glucosa.
12. El proceso para la producción de productos de fermentación o etanol de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, caracterizado porque el material o medio es hemicelulosa o "fibras de maíz".
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