BR112019014115A2 - Processo para obtenção e seleção de cepas de levedura, cepa de levedura, levedura obtida por cultura de uma cepa, uso de uma cepa ou de uma levedura, e, processo para produção de produtos de fermentação ou de etanol. - Google Patents
Processo para obtenção e seleção de cepas de levedura, cepa de levedura, levedura obtida por cultura de uma cepa, uso de uma cepa ou de uma levedura, e, processo para produção de produtos de fermentação ou de etanol. Download PDFInfo
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Abstract
a presente invenção refere-se a métodos para obtenção de cepas de levedura adequadas para metabolizar arabinose e a cepas melhoradas com bom desempenho quanto à sua capacidade de fermentar arabinose bem como xilose e glicose, inclusive na presença de inibidores como o ácido acético.
Description
PROCESSO PARA OBTENÇÃO E SELEÇÃO DE CEPAS DE LEVEDURA, CEPA DE LEVEDURA, LEVEDURA OBTIDA POR CULTURA DE UMA CEPA, USO DE UMA CEPA OU DE UMA LEVEDURA, E, PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE PRODUTOS DE FERMENTAÇÃO OU DE ETANOL
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a cepas de levedura capazes de metabolizar a arabinose, vantajosamente em combinação com a sua capacidade para fermentar xilose e glicose na presença de inibidores destas duas últimas fermentações, tais como ácido acético na forma não dissociada.
[002] Mais especificamente, a presente invenção provê um processo para a seleção de cepas capazes de metabolizar a arabinose e as suas cepas melhoradas, operando na sua capacidade para metabolizar arabinose e também xilose, ambos os tipos de pentoses recuperadas em hidrolisados lignocelulósicos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [003] A biomassa de lignocelulose ou vegetal, oriunda principalmente da atividade agropecuária e agroindustrial, é um substrato complexo constituído por três frações principais que são a celulose, a hemicelulose e a lignina. Trata-se de resíduos recicláveis usados na fabricação de etanol, cuja demanda continua aumentando devido, por exemplo, ao seu uso como biocombustível.
[004] O processo para produzir etanol a partir de biomassa de lignocelulose consiste em recuperar o máximo de açúcares presentes nas frações de celulose e hemicelulose quanto possível por hidrólise e depois transformá-los em etanol por fermentação.
[005] Quanto à fermentação dos açúcares presentes nesta biomassa, incluindo açúcares C6 (hexoses) e açúcares C5 (pentoses), hoje é preferida a fermentação anaeróbica por leveduras, em particular usando Saccharomyces
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2/45 cerevisiae, cuja capacidade de fermentar a glicose em etanol é bem controlada e desenvolvida.
[006] No entanto, toda a atenção é dada à fermentação de pentoses, em particular a xilose, que pode representar até 25 a 40% do total de açúcares contidos na biomassa de lignocelulose. Assim, cepas de levedura capazes de fermentar glicose foram modificadas para também serem capazes de metabolizar pentoses.
[007] Como exemplo, o documento WO 2010/000464 relata a obtenção de cepas de levedura capazes de fermentar pentoses por causa de um gene bacteriano codificador de uma xilose isomerase (XI) que converte a xilose em xilulose que pode ser metabolizada pela levedura.
[008] Deve ser notado que, de um modo alternativo, uma via compreendendo uma xilose redutase (XR ou XYL1) gerando xilitol e uma xilitol desidrogenase (XDH ou XYL2) pode também produzir xilulose.
[009] Assim, o documento WO 2012/072793 descreve cepas de levedura melhoradas que combinam genes exógenos que codificam uma xilose isomerase e uma xilitol desidrogenase capaz de eliminar o xilitol, que prova ser um inibidor da xilose isomerase. Essas cepas, em particular a deposição depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos) em 5 de outubro de 2011 sob o número 1-4538, melhoraram os rendimentos e, portanto, provaram uso industrial para a produção de etanol. [0010] Outro problema crucial foi mostrar, nos hidrolisados de lignocelulose, a presença de inibidores de fermentação entre eles estão os furaldeídos (furfural e HMF), compostos fenólicos e ácidos orgânicos (ácido acético, ácido levulínico, ácido fórmico, etc.). Em particular, a presença de altas concentrações de ácido acético, acima de 5 g/kg (meio inicial) e que pode chegar a 10 g/kg, está intrinsecamente ligada à presença de grupos acetila ligados covalentemente a moléculas de hemicelulose.
[0011] O trabalho anterior assumiu a melhoria da resistência das
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3/45 cepas à presença de ácido acético nos mostos de fermentação. Assim, o documento WO 2011/080411 relatou a obtenção de cepas de levedura com resistência melhorada ao ácido acético na glicose.
[0012] No entanto, o ácido acético é também um inibidor da fermentação da xilose. Esta inibição é caracterizada por uma redução da cinética do consumo da xilose (Bellisimi et al., FEMS Yeast Res., 2009, 9: 358-364), enquanto que na glicose, esta inibição é refletida por um atraso na iniciação da fermentação, a cinética subsequentemente permanecendo inalterada. Deve ser notado que, na presença de glicose e xilose no meio, as cepas de levedura fermentam a glicose primeiro devido à repressão catabólica.
[0013] Assim, os documentos WO 2013/178915 e WO 2013/178918 descrevem processos para obtenção de cepas de levedura capazes de metabolizar pentoses, em particular xilose, e resistentes à inibidores de fermentação, em particular ácido acético.
[0014] As cepas ainda mais melhoradas, particularmente na sua capacidade para fermentar a glicose e a xilose na presença de ácido acético, são descritas nos documentos WO 2015/121595 e FR 3 035 405.
[0015] Todo esse trabalho está concentrado na xilose como a pentose de interesse. Mesmo se for geralmente considerada a maioria das pentoses na hemicelulose, a xilose não é a única. Assim, é possível também encontrar a arabinose em estruturas vegetais (Saddler, 1993, Wallingford, Oxon, Reino Unido: CAB International), em uma proporção às vezes maior que 40% (Schãdel et al., 2010, Physiologia Plantarum 139, 241-255). Além disso, a arabinose é encontrada no bagaço (Hanko e Rohrer, 2000, Anal. Biochem. 283, 192-199) ou em fibras de milho chamadas “fibras de milho” (Gulati et al., 1996, Bioresource Technology 58, 253- 264).
[0016] Além do valor econômico óbvio da fermentação adicional de arabinose, também é digno de nota que arabinose residual pode formar um
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4/45 substrato de escolha para o desenvolvimento de microrganismos contaminantes, eventualmente capazes de convertê-lo em ácidos orgânicos que são inibidores da fermentação de glicose e xilose, como anteriormente afirmado (Schell et al., 2007, Bioresour. Technol. 98, 2942-2948.
[0017] Numerosos microrganismos têm sido descritos como capazes de metabolizar a arabinose, bem como em microrganismos fúngicos, em particular hemi-ascomicetos como Scheffersomyces stipitis, basidiomicetos e fungos filamentosos, como em bactérias tais como Erwinia chrysanthemi, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis e Lactobacillus plantarum.
[0018] No entanto, entre as cepas de levedura que podem ser usadas industrialmente, notadamente aquelas que podem suportar os títulos de etanol tão altos quanto aqueles tolerados pela levedura Saccharomyces cerevisiae, nenhum é relatado como naturalmente capaz de fermentar a arabinose.
[0019] O documento WO 03/095627 relatou a possibilidade de obter cepas de S. cerevisiae capazes de crescer em arabinose transformando uma cepa laboratorial por plasmídeos multicópia contendo especificamente genes araA (codificando uma L-arabinose isomerase) de B. subtilis, araB (codificando uma L-ribulocinase de forma vantajosa mutada) e araD (codificando uma epimerase de L-ribulose-5-P-4) de E. coli. Este documento levanta a questão abertamente da possibilidade de obter uma cepa capaz de cofermentar a xilose.
[0020] O documento WO 2008/122354 descreve cepas de S. cerevisiae transformadas usando vetores autorreplicantes contendo os genes araA de B. licheniformis, araB (vantajosamente mutados) e araD de E. coli, vantajosamente com códons otimizados, capazes de crescer em uma aerobiose ou meio de anaerobiose contendo arabinose como única fonte de carbono. Os transformantes são selecionados por cultura em meio contendo glicose como fonte de carbono.
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5/45 [0021] O documento WO 2008/041840 descreve sequências específicas de araA, araB e araD que conferem a uma levedura a capacidade de metabolizar arabinose, neste caso de L. plantarum. Na prática, os genes são introduzidos através de plasmídeos em uma cepa de laboratório de S. cerevisiae suprimidos para o gene GRE3 da aldose redutase, superexpressando a via dos fosfatos das pentoses (TALI, TKL1, RPE1 e RKI1) e expressando a via de fermentação da xilose (XI ou XylA e XKS1). Segundo os autores, uma cepa como esta não pode crescer diretamente em meio contendo arabinose, e a pré-cultura em meio contendo galactose é necessária. Adicionalmente, as cepas obtidas das referidas culturas perderam a sua capacidade para metabolizar a xilose.
[0022] O documento WO 2012/143513 relata a integração cromossômica de pelo menos os genes araA, araB e araD e XylA em uma cepa de levedura do tipo Saccharomyces que, após cultura com o método “Sequential Batch Repeat” descrito no documento WO 2009/112472, em um meio contendo 20 g/1 de arabinose e 20 g/1 de xilose, dar-lhe a capacidade de fermentar glicose, xilose e arabinose. Mutações de diferentes genes (SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80, PMR1) foram observadas.
[0023] No entanto, surgiu a necessidade de obter novas cepas de levedura capazes de metabolizar a arabinose, além de sua capacidade de fermentar glicose e xilose mesmo na presença de inibidores tais como ácido acético.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0024] A presente invenção refere-se a identificação de novas cepas de levedura adequadas para metabolizar pelo menos arabinose, com base nas contribuições dos inventores em relação a vários aspectos:
- destacar o fato de que a introdução da via metabólica da arabinose é necessária, mas insuficiente para garantir o metabolismo efetivo da arabinose;
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6/45
- salientar a possibilidade de selecionar diretamente os transformantes que integraram a via de metabolização da arabinose em um meio contendo a arabinose como única fonte de carbono;
- salientar a necessidade de um controle rigoroso da produção de poliol para assegurar a fermentação eficiente da arabinose;
- destacar que a fermentação de xilose e arabinose pode coexistir em um ambiente estável;
- aperfeiçoar um protocolo para a seleção de cepas de levedura capazes de melhorar a fermentação de arabinose, xilose e glicose ao mesmo tempo, compreendendo a fermentação dos dois últimos açúcares na presença de inibidores de fermentação como o ácido acético.
[0025] De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um processo para obtenção e/ou seleção de uma cepa de levedura capaz de metabolizar arabinose, compreendendo as seguintes etapas:
- introdução da via de metabolização da arabinose em uma cepa de levedura;
- seleção de uma cepa capaz de expressar a referida via com base em pelo menos um dos seguintes critérios:
a/ sua capacidade de metabolizar a arabinose presente em um meio de cultura contendo a arabinose acima mencionada como única fonte de carbono e/ou b/ baixa ou nula atividade de aldose redutase.
[0026] De acordo com uma forma de realização particular, o referido processo compreende:
- integração cromossômica dos genes araA, araB e araD, vantajosamente araA de B. licheniformis, araB e araD de E. Coli, em uma cepa de levedura;
- colocação direta em cultura das cepas transformadas em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono para a seleção de cepas
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7/45 capazes de metabolizar a referida arabinose.
[0027] Vantajosamente, o processo compreende adicionalmente a seleção de cepas transformadas possuindo arabinose metabolizada com base na sua atividade de aldose redutase inferior ou igual a 0,002 U/g de proteína, mesmo inferior ou igual a 0,0005 U/g de proteína.
[0028] No contexto da invenção, entende-se por “cepa de levedura” uma população de leveduras rigorosamente idêntica do ponto de vista genético. Isto engloba ambas as cepas referidas como cepas referidas de laboratoriais e as referidas como cepas industriais.
[0029] Vantajosamente, a cepa de levedura usada no referido processo é escolhida entre cepas de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Yarrowia, Paffia, Kluyveromyces, Candida, Talaromyces, Brettanomyces, Pachysolen, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces e Debaryomyces, vantajosamente uma cepa de Saccharomyces cerevisiae. Estas leveduras são conhecidas pela sua incapacidade de metabolizar arabinose naturalmente ou a um nível muito baixo, não aplicável industrialmente. Além disso, são vantajosamente escolhidas pela sua capacidade de fermentação anaeróbica, ainda mais vantajosamente pela sua fermentação alcoólica anaeróbica.
[0030] De acordo com uma forma de realização particular, o processo, objeto do presente pedido, é levado a cabo numa estirpe adequada para fermentar xilose, vantajosamente para fermentar xilose na presença de um ácido orgânico na forma não dissociada, tal como ácido acético. Como amplamente divulgado na técnica anterior, a capacidade para metabolizar xilose pode resultar na introdução de um gene que codifica uma xiloseisomerase, por exemplo, de Clostridium phytofermentans e/ou uma xiluloquinase.
[0031] Vantajosamente, estas são as seguintes cepas:
- a cepa depositada na CNCM em 5 de outubro de 2011 sob o número 1-4538;
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- a cepa depositada na CNCM em 16 de maio de 2013 sob o número 1-4749;
- a cepa depositada na CNCM em 12 de dezembro de 2013 sob o número 1-4829;
- a cepa depositada na CNCM em 9 de abril de 2015 sob o número 1-4966;
mais vantajosamente, a cepa depositada na CNCM em 29 de janeiro de 2015 sob o número 1-4953.
[0032] Para os fins da invenção, uma cepa de levedura capaz de metabolizar arabinose é uma cepa capaz de consumir ou usar arabinose, vantajosamente a L-arabinose, presente no seu meio de cultura. Assim e baseado notavelmente nas condições de cultura, uma cepa de levedura pode usar arabinose para produção de sua biomassa e/ou geração de produtos de fermentação. Para os propósitos do presente pedido, a fermentação de arabinose é entendida como sendo a metabolização da arabinose que ocorre em hipóxia e/ou anaerobiose, isto é, sob condições de baixa disponibilidade (tipicamente menos de 20%) ou completamente ausência de oxigênio.
[0033] No sentido da invenção, o termo “metabolizar” pode, portanto, ter como alvo a capacidade da cepa de levedura em usar a arabinose para garantir seu crescimento e sua capacidade de fermentar a arabinose em vários produtos de fermentação, como os derivados hidroxilados, incluindo etanol ou isobutanol e/ou carboxilatos, incluindo ácidos orgânicos.
[0034] De acordo com uma forma de realização particular, é feita referência à sua capacidade de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou Lribulose-5-fosfato e/ou em D-xilulose-5-fosfato e/ou em um produto de fermentação tal como etanol. De acordo com uma forma de realização vantajosa e como visto na Figura 1, a L-arabinose é convertida em L-ribulose sob a ação de uma arabinose isomerase (araA: EC: 5.3.1.4). A L-ribulose pode ser convertida em L-ribulose-5-fosfato sob a ação de uma ribuloquinase
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9/45 (araB; EC: 2.7.1.16). A L-ribulose-5-fosfato pode assim ser transformada em D-xilulose-5-fosfato sob ação de uma ribulose 5 fosfato epimerase (araD; EC: 5.1.3.4). Vantajosamente, o D-xilulose-5-fosfato é realizado pela parte não oxidativa da via das pentoses fosfatos e pode resultar na produção de etanol.
[0035] Em uma primeira etapa do processo de acordo com a invenção, o(s) gene(s) que permite a metabolização da arabinose é/são introduzido(s) na cepa de levedura, que é então designada por cepa transformante.
[0036] A seguir, os termos “gene” ou “sequência” significam uma sequência de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação (codificando, por exemplo, uma enzima da via de interesse) potencialmente flanqueada por sequências reguladoras, particularmente um promotor ou um terminador. Uma sequência de codificação é otimizável, isto é, modificável para integrar os códons preferidos do hospedeiro, aqui uma levedura, em que esta sequência é expressa.
[0037] De acordo com uma forma de realização particular, os genes que codificam a via metabólica da arabinose são elementos genéticos denominados elementos exógenos ou heterólogos, que podem ser sintéticos ou provir de outros organismos (ou fontes). Vantajosamente, são provenientes de microrganismos capazes de metabolizar a arabinose, vantajosamente hemiascomicetos tais como Scheffersomyces stipitis, basidiomicetos e fungos filamentosos, ou bactérias tais como Erwinia chrysanthemi, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Escherichia coli, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis ou Lactobacillus plantarum. De acordo com uma forma de realização particular, estes genes provêm da bactéria Bacillus licheniformis e/ou Escherichia coli. De acordo com outra forma de realização preferida, estes genes correspondem ao gene araA de B. licheniformis, ao gene araB de E. coli e ao gene araD de E. coli como descrito por Widemann e Boles (2008, Applied and Environmental Microbiology 74, 2043-2050; WO 2008/122354).
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10/45 [0038] As técnicas utilizadas para introduzir DNA em um hospedeiro (ou transformação) são bem conhecidas do especialista na técnica e compreendem a permeabilização das membranas aplicando um campo elétrico (eletroporação), com calor (aplicação de um choque térmico) ou quimicamente, por exemplo, usando acetato de lítio.
[0039] Os genes introduzidos podem ser integrados no genoma do hospedeiro, nomeadamente por recombinação homóloga ou integração cromossômica, vantajosamente com o uso de cassetes integrativas, ou expressos de maneira extracromossômica usando plasmídeos ou vetores. Diferentes tipos de plasmídeos, vantajosamente autoreplicantes, são bem conhecidos pelo especialista na técnica, diferindo notavelmente pela origem de replicação, o promotor (indutível ou constitutivo), o marcador (por exemplo, uma resistência a um antibiótico ou capacidade para crescer em um meio seletivo) e o número de cópias por célula.
[0040] De acordo com uma forma de realização, os genes que codificam a via de metabolização da arabinose são integrados cromossomicamente, vantajosamente ao nível do locus HO da cepa de levedura, mais vantajosamente ao nível de todos os loci HO da cepa de levedura.
[0041] Vantajosamente, a cassete que transporta este(s) gene(s) e que serve para incorporar ou integrá-los na cepa de levedura não possui um marcador, nomeadamente de resistência a antibióticos.
[0042] De acordo com outra forma de realização preferida, a cassete que transporta este(s) gene(s) não possui nenhum gene que codifique um transportador de arabinose, nomeadamente o gene araT.
[0043] A introdução adequada do(s) gene(s) pode ser facilmente verificada por técnicas conhecidas pelo especialista na técnica, usando um marcador possivelmente abrigado por uma cassete de expressão, por exemplo, ou preferivelmente realizando uma PCR usando iniciadores direcionando o(s)
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11/45 gene(s) introduzido(s). Além disso, a mesma técnica de PCR pode ser usada para verificar a integração do(s) gene(s) no locus alvo, notadamente usando primers direcionados ao locus.
[0044] Em uma etapa posterior do processo de acordo com a invenção, uma cepa de interesse tendo incorporado e expressando eficazmente a via de metabolização da arabinose é selecionada pela sua capacidade para metabolizar a arabinose presente no meio de cultura, como a única fonte de carbono.
[0045] De um modo característico de acordo com a invenção, a seleção dos transformantes é feita diretamente em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono. Em outras palavras, a capacidade de uma cepa de levedura para metabolizar a arabinose é testada cultivando a referida cepa em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono. Isto exclui qualquer indução anterior, em particular uma cultura anterior na presença de galactose ou adição de galactose ao meio, ou uma pré-seleção de transformantes em um meio contendo outra fonte de carbono tal como glicose.
[0046] No âmbito da invenção, um meio de cultura ou crescimento é um meio contendo os ingredientes necessários para a multiplicação das leveduras presentes. Vantajosamente refere-se a um meio completo adequado ao crescimento de levedura que pode conter ingredientes convencionais tais como sais, tampões, extrato de levedura ou qualquer outra fonte de nitrogênio que a levedura possa metabolizar, vitaminas, etc. No contexto da invenção, “meio sintético” é entendido como um meio cuja composição química é conhecida.
[0047] De maneira adequada, as condições de cultura usadas são condições favoráveis ao crescimento da levedura, particularmente:
- um meio de cultura com pH ácido, vantajosamente entre 4 e 6, mesmo 4,5 e 5,5, mais vantajosamente igual a 5 ou 5,4;
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- uma temperatura entre 28 e 37°C, mesmo entre 30 e 35°C, vantajosamente igual a 32° C;
- um tempo de crescimento variando de 24 horas a vários dias, por exemplo, 72 horas.
[0048] Vantajosamente, este crescimento ocorre em um meio sólido, tomando possível isolar as cepas que são realmente capazes de metabolizar a arabinose. De acordo com outra forma de realização vantajosa, a seleção de cepas de interesse é feita usando culturas em uma placa de Petri. De um modo conhecido, os meios sólidos contêm ágar, vantajosamente a uma concentração de 15 a 20 g /1.
[0049] De acordo com uma primeira forma de realização, uma cepa de levedura capaz de metabolizar arabinose é selecionada por crescimento aeróbico desta cepa em meio de crescimento contendo arabinose como única fonte de carbono.
[0050] Um meio adequado para este crescimento aeróbico é o meio sintético YNB Difco®, cuja composição exata é dada nos exemplos de realização, contendo arabinose como única fonte de carbono, vantajosamente a uma concentração de 10 g/1, tal como o meio referido daqui em diante como YNB-Ara.
[0051] Altemativamente, uma cepa de levedura capaz de metabolizar a arabinose pode ser selecionada por crescimento em condições anaeróbicas ou em hipóxia em um meio de crescimento contendo arabinose como única fonte de carbono.
[0052] Um meio adequado para este crescimento anaeróbico ou crescimento em hipóxia é o meio sintético YF, cuja composição exata é dada nos exemplos, compreendendo a arabinose como única fonte de carbono, vantajosamente a uma concentração de 70 g/1, como o meio referido para daqui em diante como YF-ara.
[0053] Vantajosamente, este meio é adequado para crescimento em
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13/45 um meio sólido, adicionando agar por exemplo, permitindo assim o isolamento direto das cepas de interesse.
[0054] De acordo com uma forma de realização alternativa, as cepas de levedura nas quais a via de metabolização da arabinose foi introduzida são isoladas por cultura em um meio sólido, vantajosamente em um meio seletivo tal como o meio YNB-Ara descrito acima, depois selecionado em um meio líquido sob condições anaeróbicas ou em hipóxia, em um meio adequado tal como o meio YF-ara descrito acima. As referidas culturas líquidas podem ser realizadas em microplacas como Deep Weel ou em frascos, sob agitação baixa, por exemplo, 100 rpm, ou sem agitação e sob condições de fornecimento de oxigênio reduzido (sob O2 limitado ou anaerobiose).
[0055] Nestas condições, a capacidade das cepas de leveduras para metabolizar a arabinose pode ser avaliada por:
- seu crescimento, nomeadamente monitorando a densidade óptica (OD) do meio de cultura, vantajosamente medida a 600 nm; e/ou
- a fermentação da arabinose, nomeadamente através da monitoração da concentração de arabinose presente no meio de cultura, por HPLC, por exemplo, ou avaliando a perda de massa correlacionada diretamente com a produção de CO2, que é estequiométrica com a do etanol. [0056] Deve ser notado que, do conhecimento do Requerente, esta é a primeira vez que a possibilidade de selecionar as cepas de levedura capazes de metabolizar diretamente a arabinose, cultivando-as em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono, foi relatada. Pelo contrário, considerou-se que o perito na técnica teria sido dissuadido de usar tal abordagem, dado que a informação em Wisselink et al. (2007; Appl Environ Microbiol 73, 4881-4891; WO 2008/041840) que relataram que tal seleção direta não funcionava.
[0057] De acordo com outra forma de realização vantajosa, as cepas de levedura obtidas podem também ser testadas ao mesmo tempo ou
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14/45 subsequentemente nas seguintes condições:
- em um meio de crescimento contendo glicose como única fonte de carbono, por exemplo, em um meio YF como descrito acima, mas contendo 150 g/1 de glicose e sob as condições de cultura dadas acima. Esta etapa permite verificar a validade das cepas selecionadas, principalmente a capacidade de fermentar glicose. Note que uma ou mais passagens no meio de glicose podem ser feitas antes de cultivar as cepas selecionadas em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono (descrita acima) e verificar se o fenótipo [ara +] é estável e preservado;
- um meio de crescimento contendo xilose como única fonte de carbono, por exemplo, em um meio YF como descrito acima, mas contendo 70 g/1 de xilose (meio YF-xilose nos exemplos de realização) e sob as condições de cultura dadas acima. Esta etapa permite verificar que as cepas selecionadas mantêm a sua capacidade de fermentar xilose e mostram interesse quando a cepa de levedura na qual o processo da invenção é usado é capaz de fermentar xilose.
[0058] Adicionalmente e no âmbito da invenção, mostrou-se que um critério importante na seleção de cepas de interesse para a metabolização da arabinose era o seu nível de produção de poliol.
[0059] De um modo conhecido, os polióis, tais como o xilitol, possuem um efeito inibidor da atividade da xilose isomerase (xilA) (Kovalevsky et al., 2012, Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 68, 12011206). No âmbito da presente invenção, foi evidenciado que os polióis também podem inibir a atividade da arabinose isomerase (araA; Figura 1) e, desse modo, diminuir os desempenhos da metabolização da arabinose de uma cepa selecionada pelo processo de acordo com a invenção.
[0060] E provável que o arabitol seja gerado a partir da arabinose sob a ação da (s) aldose redutase(s), da mesma forma que o xilitol é gerado a partir da xilose. Deve ser notado que de uma maneira conhecida, o gene
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GRE3 codifica a principal aldose redutase em S. cerevisiae mas que, mesmo quando esta é deletada ou desativada, uma atividade de aldose redutase pode persistir. Além disso, a presença de uma atividade de xilitol desidrogenase em cepas de levedura tem o potencial de eliminar o xilitol.
[0061] Assim, e de acordo com essa suposição, uma cepa selecionada para interesse particular mostra:
- uma forte atividade de poliol desidrogenase, vantajosamente superior ou igual a 0,001 U/g de proteína, ou ainda mais vantajosamente superior ou igual a 0,002 U/g de proteína; e/ou
- uma baixa atividade aldose redutase.
[0062] Na prática e no âmbito da invenção, foi salientado que uma cepa de interesse podería ser selecionada com base na sua baixa, mesmo nula, atividade de aldose redutase. Vantajosamente, esta atividade é inferior a 0,005 U/g de proteína, mesmo a 0,004, 0,003 ou mesmo 0,002 U/g de proteína. Mais preferivelmente, é menor ou igual a 0,0015 U/g de proteína, mesmo menor ou igual a 0,001 U/g de proteína, mais vantajosamente menor ou igual a 0,0005 U/g de proteína.
[0063] Um protocolo detalhado para medir a atividade da aldose redutase é descrito nos “Exemplos”.
[0064] Além disso e vantajosamente, a cepa de levedura usada no processo de acordo com a invenção mostra um ou mais genes GRE3 inativos ou deletados.
[0065] De acordo com outra forma de realização preferida, uma cepa de levedura usada na presente invenção apresenta pelo menos uma cópia supranumerária do gene HAA1 que codifica o regulador transcricional Haalp. De um modo conhecido, o primeiro é capaz de dar às cepas de levedura, especificamente S. cerevisiae, a capacidade de resistir ao ácido acético, melhorando assim o crescimento em um meio contendo inibidores de fermentação do tipo ácido orgânico, tal como ácido acético. Adicionalmente,
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16/45 o Requerente demonstrou que a sobrexpressão deste gene o tomaria resistente a outros inibidores de compostos fenólicos, em particular a vanilina.
[0066] Vantajosamente, a expressão do gene supranumerário que codifica Haalp é colocada sob o controlo de um promotor heterólogo, por exemplo, o promotor pPGKl. Esta cópia supranumerária do gene HAA1 pode codificar a proteína nativa ou uma forma mutada desta, por exemplo, a versão HAAlsi35F constitutivamente ativa, descrita por Swinnen et al. (2017, Cell Cell Factories 16: 7).
[0067] De acordo com uma forma de realização preferida, a cópia adicional do gene HAA1 é integrada ao nível dos cromossomas, ainda mais vantajosamente por inserção ao nível do gene GRE3. A partir daí, existem dois resultados vantajosos no quadro da invenção, que são:
- inativação do gene GRE3 codificando uma aldose redutase;
- a superexpressão do gene HAA1 torna as cepas de levedura mais resistentes ao ácido acético, mas também à vanilina.
[0068] A segunda etapa no processo de acordo com a invenção correspondendo a etapa de seleção das cepas de levedura de interesse pode ser usada para avaliar qualquer um dos dois critérios acima mencionados, vantajosamente ambos. De acordo com uma forma de realização particular, a capacidade para metabolizar a arabinose presente no meio de cultura é avaliada primeiro, depois as cepas selecionadas são testadas quanto à sua atividade de aldose redutase.
[0069] O interesse nas cepas assim selecionadas, notavelmente sua capacidade de fermentar arabinose, mas também glicose e eventualmente xilose, pode ser confirmado avaliando seu desempenho em meios sintéticos contendo os diferentes açúcares em mistura, isto é, arabinose e glicose, até arabinose, glicose e xilose no caso de cepas de origem capazes de fermentar xilose. De modo a imitar as condições reais de fermentação, estes meios também contêm ácido acético, vantajosamente em uma concentração de 1 a
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17/45 g/1, conhecido por inibir a fermentação de glicose e xilose.
[0070] Exemplos de tais meios são YPF ou YFCF, cuja composição é dada abaixo:
Meio YFCF:
[0071] - 10 g/1 de extrato de levedura;
- 10 g/1 de bacto-peptona;
- 63 g/1 de glicose;
- 28 g/1 de xilose;
- 28 g/1 de arabinose;
- 4 g/1 de ácido acético (quantidade adicionada ao meio de cultura a pH 5).
Meio YFP:
[0072] - 10 g/1 de extrato de levedura;
- 10 g/1 de bacto-peptona;
- 63 g/1 de glicose;
- 52 g/1 de xilose;
6,1 g/1 de arabinose;
- 4 g/1 de ácido acético (quantidade adicionada ao meio de cultura a pH 5).
[0073] Condições de cultura padrão favoráveis para a produção de etanol na levedura são:
- um pH acido e estável, com vantagem entre 4 e 6, por exemplo igual a 5;
- uma temperatura entre 28 e 37°C, mesmo entre 30 e 35°C, vantajosamente igual a 30°C;
- baixa agitação, 100 rpm por exemplo;
- condições reduzidas de fornecimento de oxigênio (sob O2 limitado). Na prática, a cultura pode ser feita em um frasco rolhado usando uma tampa que reduz o fornecimento de O2 no meio, permitindo a evacuação
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18/45 do CO2 produzido;
- sementeira com um inóculo de 0,25 g/kg eq MS da cepa propagada sob saturação em YPG por 24 horas;
- um tempo de crescimento de pelo menos 24 horas, por exemplo, 72 horas.
[0074] No âmbito da invenção, as cepas selecionadas através deste procedimento revelam:
- a capacidade de usar a arabinose como única fonte de carbono para garantir a produção da sua biomassa;
- a capacidade de fermentar arabinose;
- a capacidade de fermentar glicose e possivelmente xilose, mesmo na presença de um ácido orgânico de forma não dissociada, em especial o ácido acético.
[0075] Foi observado após 72 horas de fermentação nas condições descritas acima:
- consumo de 95%, mesmo todos, da glicose e xilose presentes no meio de cultura, convertidos em biomassa, ou etanol e CO2;
- consumo de mais de 50%, até 60%, 70%, ou mesmo 80% da arabinose presente no meio de cultura.
[0076] Assim e de acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma cepa de levedura susceptível de ser obtida usando o processo descrito, capaz de fermentar pelo menos 50%, mesmo 60%, 70% ou mesmo 80% da arabinose após 72 horas de fermentação em um meio compreendendo glicose (vantajosamente em uma concentração de 1 a 100 g/1, por exemplo, 63 g/1), xilose (vantajosamente em uma concentração de 1 a 100 g/1, por exemplo, 28 ou 52 g/1), arabinose (vantajosamente em uma concentração de 1 a 100 g/1, por exemplo, 6,1 ou 28 g/1) e ácido acético (vantajosamente em uma concentração de 1 a 10 g/1, por exemplo, 4 g/1). De preferência, uma tal cepa de levedura é capaz de fermentar ao mesmo tempo
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19/45 pelo menos 90%, mesmo 95%, da glicose e xilose também presentes.
[0077] Uma tal cepa também mostra vantajosamente pelo menos uma das seguintes características, mesmo todas as características:
- pelo menos uma cópia de um gene araA, de preferência de B. licheniformis, vantajosamente integrada ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de pelo menos um locus HO;
- pelo menos uma cópia do gene araB, de preferência de E. coli, vantajosamente integrada ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de pelo menos um locus HO;
- pelo menos uma cópia do gene araD, de preferência de E. coli, vantajosamente integrada ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de pelo menos um locus HO;
- pelo menos uma cópia de um gene exógeno que codifica uma xilose isomerase, vantajosamente a partir de Clostridium phytofermentans',
- pelo menos uma cópia supranumerária do gene GAL2, codificando um transportador de hexoses também capaz de assegurar a captura da xilose. De acordo com outra forma de realização, a referida cepa compreende pelo menos duas cópias supranumerárias do gene GAL2. Isto pode ser colocado sob o controle de um promotor forte e constitutivo do tipo pADHl;
- supressão da atividade de aldose redutase codificada por GRE3, vantajosamente por inserção do gene HAA1 ao nível do locus GRE3\
- superprodução de xiluloquinase (XKS1), em particular por modificação do promotor ou introdução de cópias supranumerárias;
- a expressão ou superprodução da via das pentoses fosfato (RPE1, RKL1, TKL1, TALI, etc.);
- ausência de atividade da xilose redutase (XR).
[0078] De acordo com uma forma de realização particular, tal cepa não é silenciada no seguinte nível de genes: SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80
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20/45 e/ou PMR1. De acordo com outra forma de realização particular, a cepa não possui as seguintes mutações: G1363T no gene SSY1, A512T no gene YJR15w, A1186G no gene CEP3, A436C no gene GAL80, A113G no gene PMR1.
[0079] Uma cepa de interesse particular, obtida pelo uso do processo reivindicado, é a cepa registrada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 19 de maio de 2016 sob o número 1-5085.
[0080] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para obtenção e/ou seleção de cepas de levedura com uma capacidade melhorada de fermentar arabinose, xilose e glicose na presença de inibidores de fermentação de ácidos orgânicos, particularmente ácido acético, caracterizado por um aumento na produção de etanol e por um maior consumo da arabinose presente no meio.
[0081] A invenção também se refere a um processo de obtenção e/ou seleção de uma cepa de levedura com uma capacidade melhorada para fermentar glicose, xilose e arabinose, vantajosamente na presença de um ácido orgânico em forma não dissociada tal como ácido acético em que uma cepa de levedura apresentando tal uma capacidade é cultivada sucessivamente nas seguintes condições:
- uma cultura anaeróbica em um primeiro meio contendo, como únicas fontes de carbono, arabinose e xilose em quantidades limitadas para a produção da biomassa; em seguida
- duas culturas anaeróbias sucessivas, uma em um meio contendo glicose como única fonte de carbono e a outra em um meio contendo xilose como única fonte de carbono na presença de ácido orgânico em forma não dissociada, vantajosamente ácido acético;
- opcionalmente, uma cultura aeróbica em um meio mínimo contendo, como a única fonte de carbono, uma fonte de carbono respiratório
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21/45 estrito, vantajosamente glicerol.
[0082] Tal processo é, portanto, para alcançar uma evolução dirigida das cepas de levedura usadas. Sem querer se apegar a nenhuma teoria, a pressão de seleção exercida pelas culturas consecutivas nos meios de crescimento definidos abaixo permite que a cepa adquira as características fenotípicas necessárias para aumentar sua capacidade de fermentar arabinose e reter sua capacidade de fermentar xilose e glicose e na presença de ácido orgânico em forma não dissociada, em particular o ácido acético.
[0083] Assim, o processo de acordo com a invenção permite selecionar, a partir de uma cepa isolada ou de uma mistura de cepas, uma cepa com uma vantagem seletiva em termos de crescimento num meio contendo estes três açúcares e o referido ácido orgânico na forma não dissociada.
[0084] O referido processo, também objeto do presente pedido, pode ser usado em uma cepa isolada, particularmente na cepa registrada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 19 de maio de 2016, sob o número 1-5085.
[0085] De acordo com o referido processo, a cepa de levedura ou mistura de cepas é cultivada consecutivamente em pelo menos três meios de crescimento. Como afirmado anteriormente, as expressões “meio de crescimento” e “meio de cultura” são usadas de forma intercambiável para designar um meio que compreende os ingredientes necessários para a multiplicação das leveduras que estão presentes.
[0086] O primeiro meio de crescimento, vantajosamente líquido, é caracterizado por conter as pentoses arabinose e xilose como as únicas fontes de carbono.
[0087] Deve ser notado que é tradicionalmente acordado que, quando uma população de leveduras tem dois açúcares, geralmente usa apenas um para produzir a biomassa. Uma vez que este primeiro açúcar seja consumido,
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22/45 o segundo pode ser usado. Assim, houve um risco real na estabilidade do fenótipo de fermentação das duas pentoses de interesse, a saber, xilose e arabinose.
[0088] De um modo característico de acordo com a invenção, o primeiro meio contém uma concentração de pentoses que torna possível cobrir 100%, vantajosamente 50% cada, das necessidades de carbono da cepa de levedura. De acordo com outra forma de realização, arabinose e xilose estão presentes em concentrações equivalentes, por exemplo, a uma razão de 5 g/1 para a arabinose e 4 g/1 para a xilose.
[0089] De acordo com outra característica preferida, um meio sintético cuja composição exata é controlada, vantajosamente um meio cuja composição química é inteiramente determinada. Tal meio é denominado por exemplo “GO xilose arabinose”, cuja composição é dada nos exemplos. Deve ser notado que em tal meio, não é a fonte de nitrogênio que limita a produção de biomassa (10 g/1 de (NFUhPCU), mas a quantidade de fontes de carbono, no caso da xilose (4 g/1) e arabinose (5 g/1). Assim, tal meio favorece o crescimento e a multiplicação de cepas de levedura que usam ambos os açúcares.
[0090] A etapa seguinte é concebida para antecipar um possível risco de perda de tolerância aos inibidores das cepas selecionadas, particularmente ácido acético na forma não dissociada.
[0091] Assim, nesta etapa, duas culturas anaeróbias sucessivas são implementadas:
- uma em meio de crescimento contendo glicose como única fonte de carbono; e
- a outra em um meio de crescimento contendo xilose como única fonte de carbono.
[0092] A ordem de passagem nos dois meios de cultura pode ser opcionalmente inversa (meio de xilose, depois meio de glicose).
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23/45 [0093] Vantajosamente, a concentração de glicose ou xilose no meio de crescimento é aquela comumente implementada quando é usada como a única fonte de carbono, especificamente compreendida entre 5 e 200 g/1 no caso de um meio líquido (5 e 200 g/kg no caso de um meio sólido), por exemplo igual a 150 g/1 para glicose e 70 g/1 para xilose.
[0094] Vantajosamente, o referido meio também inclui o ácido orgânico capaz de inibir a fermentação de ambos os açúcares. Vantajosamente envolve ácido acético ou ácido fórmico, ainda mais vantajosamente ácido acético.
[0095] Deve ser notado que é sabido que apenas a forma não dissociada ou não ionizada de tais ácidos tem capacidade de inibição. No contexto da invenção, “forma não ionizada ou não dissociada” de um ácido carboxílico é entendida como a sua forma protonada. Na prática, a forma de tais ácidos orgânicos depende do pH do meio no qual eles são incorporados. Em um pH maior que o pKa do ácido, o ácido será encontrado principalmente em forma dissociada ou COO'. Em contraste e com um pH mais baixo, a forma majoritária é a forma não dissociada ou não ionizada (COOH). No resto da descrição, é feita referência ao ácido acético adicionado ao meio, englobando formas dissociadas e não dissociadas de acordo com o pH do referido meio.
[0096] Vantajosamente, a concentração do ácido orgânico sob a forma não dissociada, vantajosamente como ácido acético, no meio de crescimento está compreendida entre 0,5 e 5 g/1 em meio líquido (equivalente a 0,5 e 5 g/kg em meio sólido), vantajosamente entre 1,3 e 2,6 g/1. Na prática e como exemplo, este intervalo final corresponde a uma concentração de ácido acético adicionada a um meio de crescimento a pH 5 compreendido entre 3 e 6 g/1, por exemplo, 4 ou 5 g/1.
[0097] Além destes dois meios, o referido meio de crescimento é vantajosamente um meio sintético completo adaptado ao crescimento de
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24/45 leveduras anaerobicamente ou em hipóxia, como por exemplo, o meio chamado ácido YF em que a composição exata é detalhada nos exemplos. [0098] Os meios adequados para a implementação da segunda etapa do processo de acordo com a invenção são, por exemplo, os meios chamados YF-glicose ácido e YF-xilose ácido, cuja composição é detalhada nos exemplos.
[0099] Além da composição específica destes meios de crescimento, a cultura da cepa de levedura ou mistura de cepas nestas primeira e segunda etapas do processo de acordo com a invenção é vantajosamente feita sob condições padrão favoráveis ao crescimento de leveduras, em particular tipo Saccharomyces, sob anaerobiose ou hipóxia, e sua atividade de fermentação, a saber:
- um pH ácido compreendido vantajosamente entre 4 e 6, mesmo 4,5 e 5,5, ainda mais vantajosamente igual a 5 ou 5,4;
- uma temperatura entre 28 e 37°C, mesmo entre 30 e 35°C, vantajosamente igual a 32°C;
- sob agitação suave, por exemplo, igual a 100 rpm;
- sob condições reduzidas de suprimento de oxigênio (sob O2 limitado). Na prática, a cultura pode ser feita em um frasco com tampa, reduzindo o fornecimento de O2 no meio, permitindo a evacuação do CO2 produzido.
[00100] Geralmente, a cultura é interrompida quando a fonte de dióxido de carbono foi completamente consumida. Na prática, e vantajosamente, a cultura é deixada durante pelo menos 24 horas, mesmo vários dias, vantajosamente durante até 7 dias.
[00101] De acordo com uma forma de realização específica, o método de acordo com a invenção compreende ainda a passagem da levedura para um quarto meio de crescimento, vantajosamente líquido, destinado a selecionar as células capazes de respirar, especificamente possuindo mitocôndrias
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25/45 funcionais. Na prática, esta etapa, que pode ser implementada com cada ciclo ou pelo menos uma vez no método, serve para superar o aparecimento de “petites” cujo fenótipo deficiente respiratório pode ser desvantajoso no contexto dos métodos de produção de levedura industrial.
[00102] Vantajosamente, este quarto meio é um meio pobre ou mínimo contendo como única fonte de carbono um carbono que só pode ser usado por células que retiveram mitocôndrias funcionais. Neste caso, está-se falando de uma fonte de carbono respiratório estrito, significando uma fonte de carbono que envolve sistematicamente a oxidação mitocondrial e não produz etanol. Pode ser vantajosamente glicerol ou possivelmente etanol. Em outras palavras, esse meio é livre de açúcar fermentável.
[00103] Vantajosamente, a concentração de glicerol do meio de crescimento é aquela habitualmente usada quando é usada como única fonte de carbono, especificamente compreendida entre 5 e 50 g/1, compreendida vantajosamente entre 10 e 50 g/1, por exemplo igual a 10 g/1 de modo a obter biomassa suficiente para inocular o primeiro meio de cultura do ciclo seguinte.
[00104] Por definição, um meio mínimo contém, além de uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de potássio, uma fonte de fósforo, uma fonte de enxofre, uma fonte de magnésio, uma fonte de cálcio, uma fonte de ferro, uma fonte de oligoelementos e de água.
[00105] Um meio que pode ser usado para a preparação deste meio de cultura pode incluir:
- uma base, tal como “base de nitrogênio de levedura” DIFCO®, vantajosamente a uma concentração de 3,4 g/1;
- e, opcionalmente, sulfato de amônio, vantajosamente a uma concentração de 5 g/1.
[00106] Além da composição específica deste meio de crescimento, a cultura da cepa de levedura ou mistura de cepas é vantajosamente feita sob
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26/45 condições padrão favoráveis ao crescimento de leveduras em aerobiose, a saber:
- um pH ácido vantajosamente compreende entre 4 e 6, mesmo 4,5 e 5,5, por exemplo igual a 5;
- uma temperatura entre 28 e 37°C, mesmo entre 30 e 35°C, vantajosamente igual a 32°C;
- sob agitação média, por exemplo, igual a 150 rpm;
- em aerobiose. Na prática, a cultura pode ser feita em um frasco com tampa, bloqueado por uma tampa porosa que permite o fornecimento de O2 no meio.
[00107] Novamente, a cultura é interrompida quando a fonte de carbono, vantajosamente glicerol, foi completamente consumida. Na prática e vantajosamente, a cultura é feita ao longo de várias horas, vantajosamente 48 horas.
[00108] A dita sucessão de cultura nestes três, até quatro meios, e sob as condições descritas, constitui um ciclo.
[00109] Na prática, um ciclo de seleção de acordo com a invenção pode ser o seguinte:
- uma primeira cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de xilose e arabinose;
- uma segunda cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de glicose e ácido acético;
- uma terceira cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de xilose e ácido acético;
- eventualmente uma quarta cultura aerobicamente na presença de glicerol;
ou
- uma primeira cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de xilose e arabinose;
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- uma segunda cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de xilose e ácido acético;
- uma terceira cultura em anaerobiose ou hipóxia na presença de glicose e ácido acético;
- eventualmente uma quarta cultura aerobicamente na presença de glicerol.
[00110] De acordo com a invenção, estas culturas diferentes são feitas de acordo com o método de “Repetição em lote simples”, por exemplo, sem renovação do meio de cultura presente.
[00111] De acordo com uma forma de realização particular, esse ciclo é repetido pelo menos duas vezes (“Repetição de vários lotes”), por exemplo, 2 vezes.
[00112] Esse processo possibilitou a seleção de cepas de leveduras que, durante a fermentação em meio próximo aos meios naturais contendo arabinose, glicose, xilose e ácido acético, apresentam melhor produção de etanol (maior teor alcoólico) e melhor consumo de arabinose presente no meio.
[00113] De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma cepa de levedura obtida usando o processo descrito acima. Dessa forma, foi possível isolar cepas de leveduras que, ao final deste processo de seleção, possuem capacidade para o consumo de arabimose presente no meio aumentar em pelo menos 10%, mesmo 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou até mais 80%. Estes desempenhos são vantajosamente avaliados sob condições de fermentação acima descritas em relação ao meio YFCF e após 160 horas.
[00114] De fato, nestas condições, foi observado um consumo superior a 90%, mesmo 95% ou mesmo 97,5% de arabinose presente no meio de cultura.
[00115] Assim e de acordo com um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a uma cepa de levedura susceptível de ser obtida usando o
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28/45 processo descrito, que capaz de fermentar pelo menos 90%, mesmo 95% ou mesmo 97,5% de arabinose após 160 horas de fermentação em um meio compreendendo glicose (vantajosamente em uma quantidade de 1 a 100 g/1, por exemplo, 63 g/1), xilose (vantajosamente em uma quantidade de 1 a 100 g/1, por exemplo, 28 g/1), arabinose (vantajosamente em uma quantidade de 1 a 100 g/1, por exemplo, 28 g/1) e ácido acético (vantajosamente em uma quantidade de 1 a 10 g/1, por exemplo, 4 g/1). De preferência, uma tal cepa de levedura é capaz de fermentar ao mesmo tempo pelo menos 90%, até 95%, ou mesmo 100% da glicose e xilose presentes.
[00116] Uma tal cepa também mostra vantajosamente pelo menos uma das seguintes características, mesmo todas as características:
- pelo menos uma cópia de um gene araA, de preferência de B. licheniformes, integrada com vantagem ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de todos os loci de HO;
- pelo menos uma cópia de um gene araB, de preferência de E. coli, vantajosamente integrada ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de todos os loci de HO;
- pelo menos uma cópia do gene araD, de preferência de E. coli, vantajosamente integrada ao nível cromossômico, mais vantajosamente ao nível de todos os loci de HO;
- pelo menos uma cópia de um gene exógeno que codifica uma xilose isomerase, vantajosamente a partir de Clostridium phytofermentans',
- pelo menos uma cópia supranumerária do gene GAL2, codificando um transportador de hexoses também capaz de assegurar a captura da xilose. De acordo com outra forma de realização, a referida cepa inclui pelo menos duas cópias supranumerárias do gene GAL2. Isto pode ser colocado sob o controle de um promotor forte e constitutivo do tipo pADHl;
- supressão da atividade de aldose redutase codificada por GRE3, vantajosamente por inserção do gene HAA1 no locus GRE3\
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- superprodução de xiluloquinase (XKS1), nomeadamente através da modificação do promotor ou da introdução de cópias supranumerárias;
- a expressão ou superprodução da via das pentoses fosfato (RPE1, RKI1, TKL1, TALI, etc.);
- ausência de atividade da xilose redutase (XR).
[00117] De acordo com outra forma de realização vantajosa, tal cepa apresenta pelo menos uma das seguintes características, vantajosamente ambas:
- atividade forte de poliol desidrogenase, vantajosamente superior ou igual a 0,001 U/g de proteína, ainda mais vantajosamente superior ou igual a 0,002 U/g de proteína;
- atividade de aldose redutase inferior a 0,005 U/g de proteína, mesmo 0,004, 0,003, ou mesmo 0,002 U/g de proteína, de preferência menor ou igual a 0,0015 U/g de proteína, até menor ou igual a 0,001 U/g de proteína, mais preferencialmente inferior ou igual a 0,0005 U/g de proteína.
[00118] De acordo com uma forma de realização particular, tal cepa não é mutada ao nível dos seguintes genes: SSY1, YJR154w, CEP3, GAL80 e/ou PMR1. De acordo com outra forma de realização particular, a cepa não possui as seguintes mutações: G1363T no gene SSY1, A512T no gene YJR154w, A1186G no gene CEP3, A436C no gene GAL80, A113G no gene PMRL [00119] Uma cepa de interesse particular é a cepa depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Doctor Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 19 de maio de 2016, sob o número 1-5086.
[00120] De acordo com uma forma de realização particular, tal cepa tem pelo menos uma cópia supranumerária do gene HAA1, vantajosamente inserida ao nível do gene GRE3.
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30/45 [00121] De acordo com outro aspecto, a presente invenção também tem como alvo uma levedura obtida por cultura das cepas como definidas acima.
[00122] No contexto da invenção, entende-se por “levedura” um produto comercial obtido através da implementação de um processo para a produção de uma cepa de levedura. Assim, leveduras com propriedades diferentes podem ser obtidas a partir de uma única linhagem, onde essas diferenças estão relacionadas com o processo de produção implementado.
[00123] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de cepas ou leveduras como definido acima para a fermentação de um material, contendo vantajosamente arabinose e/ou xilose e/ou glicose, e/ou para a produção de etanol.
[00124] De acordo com uma forma de realização específica, o material é um material lignocelulósico. Esse material geralmente contém:
- pentoses, em particular D-xilose e L-arabinose;
- hexoses, em particular D-manose, D-galactose, L-ramnose e D-glicose;
- ácidos urônicos.
[00125] De acordo com um aspecto particular, a invenção refere-se a um processo de produção de produtos de fermentação ou de etanol compreendendo as seguintes etapas:
- incubação de um material ou meio contendo arabinose e/ou xilose e/ou glicose, vantajosamente arabinose, xilose e ácido acético, com uma cepa ou levedura como acima definido;
- fermentação sob condições anaeróbicas ou semianaeróbicas (hipóxia);
- recuperação de um ou mais produtos de fermentação, ou etanol.
[00126] De acordo com uma forma de realização particular, o material
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31/45 ou meio é hemicelulose, ou “fibras de milho”.
[00127] A presente invenção será ilustrada mais adiante usando os seguintes exemplos, suportados pelas figuras anexas. No entanto, eles não têm um escopo limitante.
LEGENDAS PARA AS FIGURAS:
[00128] A Figura 1 mostra as vias metabólicas para conversão de Larabinose e D-xilose em D-xilulose-5-fosfato.
[00129] A Figura 2 mostra o plasmídeo pL1285-055 permitindo a integração dos genes araAlaraBlaraD ao nível do locus HO de Saccharomyces cerevisiae.
[00130] A Figura 3 mostra os produtos de PCR obtidos usando os oligonucleotídeos na Tabela 1 abaixo. A pista 1 corresponde a um marcador de tamanho (1 kb da escada de DNA), as pistas 2 a 9 correspondem aos produtos de PCR obtidos usando a matriz genômica de DNA dos 8 transformadores testados, a pista 10 é obtida com a cepa não transformada. A pista 11 é o controle negativo da técnica (água) e a pista 12 é o controlo positivo com o plasmídeo pL1285-055 como matriz.
[00131] A Figura 4 ilustra o crescimento das colônias em um meio YPG + blasticidina 50 mg/1 (A) e em um meio YNB-Ara contendo 10 g/1 de arabinose (B).
[00132] A Figura 5 ilustra o crescimento dos clones selecionados, em um meio contendo arabinose (A) ou xilose (B) como única fonte de carbono.
[00133] A Figura 6 representa a evolução da concentração (expressa em g/kg) dos vários constituintes com base no tempo de fermentação, em um meio YFCF (63 g/kg de glicose, 28 g/kg de xilose, 28 g/kg de arabinose e 4 g/kg de ácido acético (pH = 5), pelos clones 13 (A) e 126 (B) selecionados por sua capacidade de fermentar arabinose. Os valores representam os valores médios de 3 experiências biologicamente independentes.
[00134] A Figura 7 representa a atividade de aldose redutase medida
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32/45 em diferentes conjuntos de genes testados (1-4953; clone 13; clone 126). Os valores representam os valores médios de 2 experiências biologicamente independentes.
[00135] A Figura 8 representa a perda de massa observada após 48 horas de fermentação no clone 126 e transformadores (transformados com pADHl-GRE3).
[00136] A Figura 9 mostra (A) a alteração na concentração de etanol (g/kg) como uma função do tempo de fermentação em um meio YFCF de diferentes clones selecionados após uma evolução dirigida feita a partir da cepa EG31; (B) a concentração de arabinose (g/kg) após 160 horas de fermentação em meio YFCF destes mesmos clones e cepa EG31.
EXEMPLOS
1/ Obtenção de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae capaz de fermentar arabinose:
1. Transformação pela via arabinosa:
[00137] A via de fermentação da arabinose é representada na Figura 1.
[00138] A cepa anotada 1-4953, depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sob o número CNCM 1-4953 em 29 de janeiro de 2015, foi transformada com auxílio do plasmídeo pL1285- 055 (Figura 2), um derivado do plasmídeo pHD22 contendo uma cassete de expressão da via da arabinose permitindo a integração dos genes araA de Bacillus lichenformis e araB/araD de Escherichia coli ao nível do locus HO desta cepa de S. cerevisiae.
[00139] Esta cepa é também conhecida pela sua capacidade para metabolizar xilose devido à presença de pelo menos uma cópia de um gene exógeno que codifica a xilose isomerase de Clostridium phytofermentans.
[00140] Além disso, esta cepa superexpressa os genes que codificam enzimas da parte não oxidativa da via das pentoses fosfatos, notadamente os
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33/45 genes TALI e TKL1.
2. Validação da integração cromossômica da via arabinosa:
[00141] A correta integração dos vários genes que codificam as enzimas que formam a via de metabolização da arabinose, particularmente os genes ara A, B e D, foi verificada por PCR usando DNA genômico dos transformantes como matriz e oligonucleotídeos amplificando um fragmento de cada um dos correspondentes 3 ORF Os referidos oligonucleotídeos e a sua sequência, são mostrados na Tabela 1 abaixo:
| Nome | Sequência | Tamanho esperado |
| araA-v-f-1 (SEQ ID NO: 1) | ATGATTCAAGCTAAGACCC | 350 pb |
| araA-v-r-1 (SEQ ID NO: 2) | ATGTCAATCTTGTCCCATGG | |
| araB-v-f-1 (SEQ ID NO: 3) | ATGGCTATTGCTATTGGTTT | 357 pb |
| araB-v-r-2 (SEQ ID NO: 4) | CCACAAAACGAACATAGCGT | |
| araD-v-f-1 (SEQ ID NO: 5) | ATGTTGGAAGACTTGAAGAG | 363 pb |
| araD-v-r-1 (SEQ ID NO: 6) | TAGAAGTAGTCAGCGTGGGT |
[00142] Os produtos de PCR obtidos foram analisados em gel de agarose a 0,8% após uma hora de migração a 50 Volts em TAE 0,5x.
[00143] Os resultados mostrados na Figura 3 mostram que um produto de PCR foi realmente amplificado para os 3 genes da via da arabinose em todos os transformantes testados (8). Esse achado sugere que esses genes foram efetivamente integrados ao genoma da levedura.
[00144] Além disso, um sequenciamento padrão foi realizado para verificar se os genes araA, B e D não estão mutados (dados não mostrados).
3. Seleção de cepas realmente capazes de metabolizar arabinose:
[00145] Para prosseguir com as investigações, optou-se por simplificar o sistema de expressão da via arabinose. Para esse efeito, a cassete foi modificada para expressar os genes ara A, B e D sendo ao mesmo tempo privada da sequência de codificação para um transportador de arabinose (araT).
[00146] Para medir a frequência do aparecimento de cepas que podem metabolizar arabinose, a cepa 1-4953, depositada na CNCM em 29 de janeiro de 2015, foi transformada usando 1,3 pg da referida cassete contendo araA, B
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34/45 eD.
[00147] O produto da transformação foi distribuído em dois tipos de meio:
- um primeiro meio correspondente a YPG (10 g/1 de extrato de levedura; 10 g/1 de peptona; 20 g/1 de glicose como única fonte de carbono) contendo Blasticidina em uma quantidade de 50 mg/1. O objetivo é determinar o número de células que integraram a cassete em seu genoma;
- um segundo meio chamado YNB-Ara correspondendo a um meio mínimo (YNB Difco®) contendo 10 g/1 de arabinose como única fonte de carbono. Este meio deve permitir determinar o número de células que adquiriram o fenótipo [ara +].
[00148] O meio YNB Difco® (“Base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos e sulfato de amônio”), referenciado sob o número 0335-15, contém:
- Biotina 2 pg / L
- Pantotenato (cálcio) 400 pg/l
- Ácido fólico 2 pg/l
- Inositol 2000 pg/l
- Niacina 400 pg/l
- Ácido p-aminobenzóico 200 pg/l
- Piridoxina (cloridrato) 400 pg/l
- Riboflavina 200 pg/l
- Tiamina (cloridrato) 400 pg/l
- Ácido bórico 500 pg/l
- Sulfato de cobre 40 pg/l
- lodeto de potássio 100 pg/l
- Cloreto férrico 200 pg/l
- Sulfato de manganês 400 pg/l
- Molibdato de sódio 200 pg/l
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35/45
- Sulfato de zinco 400 pg/l
- Fosfato de potássio monobásico 1 g/1
- Sulfato de magnésio 500 mg/1
- Cloreto de sódio 100 mg/1
- Cloreto de cálcio 100 mg/1 pH final = 5,4
Sulfato de amônio (5 g/1) [00149] A Figura 4 ilustra o resultado obtido em ambos os tipos de meio.
[00150] Após 6 dias de crescimento nos dois meios, as colônias foram contadas. Foi observado que o número de colônias no meio YNB-Ara foi aproximadamente 18% do observado no meio YPG + Blasticidina. Em outras palavras, apenas 18% das colônias que integraram os genes araA, B e D em seu genoma parecem capazes de crescer usando a arabinose como única fonte de carbono.
[00151] E claro do exposto que:
- os genes codificadores de cassete araA, B e D são necessários, mas não suficientes para obter um fenótipo [ara+];
- a seleção direta de transformantes em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono é possível e em oposição aos ensinamentos de Wisselink et al. (2007; Appl Environ Microbiol 73, 48814891), revelando que uma etapa anterior de crescimento na presença de galactose não é necessária.
[00152] Para continuar, a cassete foi ainda mais simplificada e privada de qualquer marcador de seleção, notadamente a resistência aos antibióticos.
[00153] 1156 transformantes que cresceram no meio YNB-Ara foram então testados em formato Deep Well (= microplaca com 96 poços) para confirmar sua capacidade de crescer anaerobicamente em arabinose e também para verificar a manutenção de sua capacidade de fermentar xilose e glicose.
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36/45 [00154] A composição dos meios usados para este efeito é detalhada abaixo:
Meio YF = [00155] - extrato de levedura (EXL) 5 g/1;
- fosfato de di-amônio 4,7 g/1
- ácido cítrico 11,4 g/1;
- citrato trissódico 13,5 g/1;
- ZnSCL 21,2 mg/1;
- MgSO4 7H2O 1 g/1;
- tiamina 18,24 mg/1;
- piridoxina 5,28 mg/1;
- biotina 1,76 g/1;
- pantotenato 3,8 mg/1;
- ácido nicotínico 20 mg/1;
- meso-inositol 50 mg/1;
- riboflavina 1 mg/1;
- para-aminobenzoato 1,2 mg/1;
- Tween 80, 1 g/1.
[00156] Meio YF-ara: meio YF contendo 70 g/1 de arabinose
Meio YF-xilose: meio YF contendo 70 g/1 de xilose [00157] O pH do meio é mantido em 5. A cultura é realizada a 32°C.
[00158] A Figura 5 ilustra os resultados obtidos com uma série de cepas cujo crescimento foi seguido simultaneamente em um meio contendo arabinose (A) ou xilose (B) como única fonte de carbono, sendo este último meio possível para selecionar as cepas que retiveram sua capacidade, para metabolizar xilose.
[00159] Os resultados mostrados na Figura 5 mostram que o método de seleção de cepas [ara+] ainda foi melhorado: a Figura 5A mostra que 15 dos 91 clones testados não parecem capazes de começar a multiplicar novamente
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37/45 usando arabinose. Isto sugere que, ao contrário da seleção baseada na resistência a um antibiótico, a seleção em YNB-Ara toma possível obter 85% dos transformantes que adquiriram o fenótipo [ara+].
[00160] Outro aspecto que emergiu dos resultados mostrados na Figura 5 refere-se à coabitação de duas vias metabólicas xilose e arabinose. E assim evidente que certas cepas adquiriram o fenótipo [ara+] em detrimento do fenótipo [xyl+]. Outros, por outro lado, não retiveram o fenótipo [ara+] após a subcultura sobre glicose (resultados não mostrados). No entanto, das 91 cepas testadas, 67 parecem ter adquirido e retido o fenótipo duplo [ara+; xyl+], que é quase 3/4 dos transformantes.
4. Comparação entre duas cepas selecionadas'.
- Fermentação no meio YFCF:
[00161] O desempenho de 2 clones isolados (chamados clones 13 e 126, respectivamente) foi comparado durante a fermentação em meio YFCF a pH 5 contendo glicose como fonte de carbono, mas também arabinose e xilose equilibrada representada, bem como ácido acético, aproximando-se, assim, dos meios naturais de fermentação.
[00162] Mais especificamente, a composição do meio YFCF é a seguinte:
- 10 g/1 de extrato de levedura;
- 10 g/1 de bacto-peptona;
- 63 g/1 de glicose;
- 28 g/1 de xilose;
- 28 g/1 de arabinose;
- 4 g/1 de ácido acético (quantidade adicionada ao meio de cultura a pH 5).
[00163] As condições de fermentação são as seguintes:
-pH: 5
- Temperatura: 32°C
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38/45
- Condições de O2: sem fornecimento de oxigênio
- Agitação: 100 rpm
- Duração da cultura: até 72 horas
- Pré-Cultura/Incubação: 0,25 g/kg eq de MS de levedura previamente propagada na saturação em meio YPG durante 24 horas.
[00164] A produção de etanol é medida indiretamente medindo a perda de massa do frasco de fermentação, a perda de massa correlacionada diretamente com a produção de CO2, que é estequiométrica com a do álcool. E expresso em gramas por quilograma de meio.
[00165] As concentrações de glicose, xilose, arabinose e glicerol no meio são seguidas por HPLC.
[00166] As variações de biomassa são avaliadas medindo o material seco residual após 4 horas a 105°C.
[00167] Os resultados mostrados na Figura 6 revelam:
- uma redução na velocidade de consumo de xilose para o clone 13 em comparação com o clone 126, também correspondido por uma menor velocidade de produção de etanol;
- é notável que uma taxa de consumo de arabinose seja mais lenta no clone 13 do que no clone 126. Assim, após 32 horas de fermentação, o clone 13 consumiu 12,1 +/- 0,6 g/kg de arabinose, enquanto o clone 126 consumiu 15,3 +/- 0,5 g/kg.
[00168] E também digno de nota que as pentoses foram consumidas enquanto a concentração de glicose extracelular não era nula.
[00169] Foi feita uma tentativa para explicar a diferença observada entre os clones 13 e 126, em particular a taxa de fermentação de arabinose.
Análise de atividades da via:
[00170] A atividade enzimática intracelular envolvida nas vias metabólicas da arabinose e xilose foi testada.
[00171] Primeiro, nenhuma diferença notável foi observada no nível de
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39/45 atividade da xilitol desidrogenase (resultados não mostrados).
[00172] Por outro lado, foi observado um perfil de atividade da arabinose isomerase (codificada por araA) diferente entre os clones 13 e 126, com uma inibição competitiva mais significativa para o clone 13 (resultados não mostrados).
[00173] Como mostrado na Figura 7, esta diferença pode ser correlacionada com uma diferença no nível de redução das aldoses, mais precisamente a atividade aldose redutase de ambos os clones. Deve ser notado que na cepa inicial 1-4953, o gene GRE3 que codifica a principal aldose redutase em S. cerevisiae foi eliminado, mas permaneceu a atividade residual (ver Figura 7).
Dosagem da atividade aldose redutase em um extrato celular:
Propagação das cepas [00174] As cepas a serem testadas foram colocadas em meio rico (YPG) para crescer. Duas fases de propagação sucessivas de 24 h a 30°C, sob agitação, foram necessárias para obter biomassa suficiente. Uma vez colhida a biomassa, a matéria seca foi medida em 1 ml de cada creme após passar pelo forno a 105°C durante 4 horas. As fermentações foram realizadas em frascos de 250 ml contendo 100 g de meio de fermentação YF-xilose. Cada frasco foi semeado a uma taxa de 0,5 g/kg de matéria seca equivalente. A fermentação prosseguiu a 32°C sob agitação a 110 rpm durante 3 dias. Nessa fase, 50 ml de produto de fermentação são coletados e depois servem para determinar as diferentes atividades enzimáticas e a concentração de proteínas da amostra. Preparação do extrato celular [00175] 50 ml de produto de fermentação são coletados por centrifugação (4700 rpm, 2 min, 4°C) e depois ressuspensos em 3 ml de tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7. Após outra centrifugação, cada sedimento é então ressuspenso em 1 ml de tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7.
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40/45 [00176] 1 ml de sedimento ressuspenso é então transferido para 1 tubo para Fast Prep (preenchido anteriormente com 250 pl de esferas) e depois triturado a 4°C: 4 x 30 segundos (6 m/s), espaçados de 30 segundos cada. Em seguida, o homogeneizado é centrifugado 3 minutos a 10.000 rpm (para fazer as esferas caírem junto com os restos celulares) e a totalidade do sobrenadante é transferida para um tubo Eppendorf resfriado em gelo.
Dosagem de atividades enzimáticas [00177] A dosagem da atividade enzimática é feita monitorando a absorbância a 340 nm. As medições são feitas em um ambiente controlado termostaticamente a 32°C.
| branco (pl) | amostra (pl) | |
| Tampão de fosfato | 750 | 750 |
| (KH2PO4/K2HPO4 0,1 M pH=7) | ||
| pH = 7) | ||
| NAD (0,04 M) | 100 | |
| Extrato celular | 20 | |
| água | 750 | 430 (qs 1300) |
| xilitol 2 M | 200 |
[00178] O substrato é adicionado após 1 minuto.
[00179] Os resultados mostrados na Figura 7 mostram um declínio muito acentuado na atividade de aldose redutase nos clones 13 e 126 em comparação com a cepa parental 1-4953. No entanto deve ser observado, que esta atividade é duas vezes maior no clone 13 que no clone 126. Essa observação parece capaz de explicar o fraco desempenho do clone 13 comparado ao clone 126. Para corroborar este resultado com os desempenhos de fermentação de xilose e/ou da arabinose, foi feita uma tentativa para aumentar a atividade da aldose redutase no clone 126.
Impacto da reintrodução de um gene que codifica a aldose redutase na capacidade das células de metabolizar arabinose:
[00180] Existem duas diferenças primárias entre os clones 126 e 13 na sua capacidade de fermentar xilose e arabinose e a sua capacidade para as reduzir em xilitol e arabitol, respectivamente. Na medida em que esses dois fenótipos parecem anti-correlacionados, tentou-se reforçar essa atividade nas
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41/45 células do clone 126.
[00181] Nesse sentido, o gene GRE3 que codifica a principal ladose redutase na levedura S. cerevisiae (Garay-Arroyo e Covarrubias, 1999, Yeast 15, 879-892; Trãff et al., 2001 Appl. Environ. Microbiol. 67, 5668 -5674) foi reintroduzida. Na prática, uma cópia do gene GRE3 colocado sob a dependência do promotor do gene ADH1 foi integrada ao nível do locus nativo de GRE3 no genoma do clone 126.
[00182] A fim de validar a boa integração do gene no locus direito, os seguintes primers foram usados nas reações de PRC:
- B6C2 (CCTATTGCTGTTTCCTCTTCAAAGTAC; SEQ ID NO: 7), hibridizando no terminador do marcador de seleção;
- B13B1, AGTTGTCAGTGCAATCCTTC; (SEQ ID NO: 8), complementar a uma região do terminador do gene GRE3.
[00183] Após verificação da integração da cassete no genoma dos transformantes selecionados (resultados não mostrados), a sua capacidade de usar arabinose como única fonte de carbono sob condições anaeróbicas foi testada. Neste sentido, ambos os transformantes e clone 126 foram inoculados em uma quantidade de 2 g (eq MS)/kg em meio YF-Ara.
[00184] A perda de massa após 48 horas de fermentação é mostrada na Figura 8. Estes resultados mostram que todos os clones que integraram o gene GRE3 têm a capacidade de fermentar a arabinose que é diminuída em comparação com o clone 126. Este resultado suporta assim a hipótese de que atividade muito forte da aldose redutase limita a capacidade das células de fermentar a arabinose.
CONCLUSÕES:
[00185] Integração da via de fermentação da arabinose, ou seja, dos genes araA (B. licheniformis)/araB (E. coli)/araD (E. coli) ao nível do locus HO da cepa 1-4953 de S. cerevisiae, seguida de um rastreio em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono, tornou possível selecionar
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42/45 cepas capazes de fermentar arabinose. Além disso, foi demonstrado que entre essas cepas, as mais favoráveis foram aquelas que apresentaram baixa atividade de aldose redutase. Neste contexto, uma cepa particularmente interessante foi isolada, ou seja, a cepa EG31, e foi depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sob o número CNCM 1-5085 em 19 de maio de 2016.
II/ Obtenção de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae otimizada para a fermentação de arabinose e xilose:
1. Seleção de uma cepa capaz de fermentar arabinose e xilose por evolução dirigida:
[00186] Com o objetivo de selecionar uma cepa ainda otimizada para a fermentação de pentoses, em particular arabinose, a cepa EG31 foi submetida a uma evolução dirigida em batelada.
[00187] Assim, foi aperfeiçoado um protocolo para evolução dirigida, possibilitando a obtenção do fenótipo procurado. Para isso, um meio foi definido e implementado em que a levedura que consumiría apenas um dos dois açúcares estaria em desvantagem. Na prática, no primeiro meio chamado “GO xilose arabinose” e definido abaixo, não é a fonte de nitrogênio que é limitante, mas as fontes de carbono. Na prática, este meio contém 10 g/1 de (NH4)2PO4 mas apenas 4 g/1 de xilose e 5 g/1 de arabinose.
Meio 1: GO xilose arabinose (pH 5):
[00188] -Xilose 4 g/1
- Arabinose 5 g/1
- (NH4)2HPO4 (DAP) 10 g/1
- Ácido cítrico 11,4 g/1
- Citrato trissódico 13,5 g/1
- ZnSO4 (0,004 g/1)
- MgSO4 0,5 g/1
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43/45
- KH2PO4 1 g/1
- NaCl 0,1 g/1
- CaCl2 0,1 g/1
- CuSO4 0,00006 g/1
- H3BO3 0,0005 g/1
- KI 0,0001 g/1
- MnSO4 0,0004 g/1
- Na2MoO4 0,0002 g/1
- FeCl3 0,0002 g/1
- Piridoxina 0,002 g/1
- Biotina 0,0008 g/1
- Pantotenato (0,002 g/1)
- Acido nicotinico 0,001 g/1
- Meso-inositol 0,001 g/1
- Tween 80, 1 g/1 [00189] A cultura é feita a 32°C com agitação a 100 rpm em frascos fechados por tampas que servem para reduzir o fornecimento de oxigênio no meio e permitir que o C02 que é produzido através desta cultura em excesso de pressão escape. Sob essas condições, a cultura dura cerca de 7 dias.
2. Seleção de uma cepa que reteve sua capacidade de fermentar glicose e/ou xilose na presença de ácido acético [00190] Para antecipar um possível risco de perda de tolerância aos inibidores, particularmente ácido acético na forma não dissociada, duas culturas sucessivas foram introduzidas no ciclo de evolução dirigida em batelada em meio contendo glicose ou xilose como a única fonte de carbono, e em ambos os casos na presença de concentrações fortes de ácido acético. Meio 2: YF-glicose ácido:
[00191] O meio YF-glicose ácido corresponde ao meio YF descrito acima, contendo 150 g/1 de glicose e apresentando uma concentração de ácido
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44/45 acético (quantidade introduzida no meio de cultura a pH 4,4) igual a 5 g/1. Meio 3: YF-xilose ácido:
[00192] O meio ácido YF-xilose corresponde ao meio YF-xilose acima descrito, com uma concentração de ácido acético (quantidade introduzida no meio de cultura a pH 5) igual a 4 g/1.
Condições de cultura:
[00193] A cultura é realizada a 32°C com agitação a 100 rpm em frascos fechados por tampas que servem para reduzir o fornecimento de oxigênio no meio e permitir que o CO2 em excesso de pressão que é produzido através desta cultura escape. Sob essas condições, a cultura dura cerca de sete dias.
3. Eliminação de “petites”'.
[00194] Para evitar a seleção de cepas privadas de mitocôndrias, que não seriam compatíveis com os processos de produção industrial, foi também adicionado uma etapa para a cultura em um meio contendo glicerol como a única fonte de carbono. Esta etapa requer a presença de uma cadeia para a transferência de elétrons funcionais para as células, de modo que elas possam se multiplicar.
Meio 4: YNB glicerol:
[00195] - 3,4 g/1 de levedura à base de nitrogênio DIFCO®;
- 5 g/1 de sulfato de amônio;
- 10 g/1 de glicerol como única fonte de carbono.
[00196] A cultura é feita a 30°C com agitação a 150 rpm em frascos com defletor rolhados por tampas porosas que permitem o fornecimento de oxigênio ao meio. Nestas condições, a cultura dura de 24 a 48 horas.
[00197] Na prática, um ciclo de evolução dirigida é caracterizado por:
- uma cultura em meio de GO de xilose arabinose; em seguida
- uma cultura em meio de YF glicose ácido; em seguida
- uma cultura em meio YF xilose ácido; em seguida
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45/45
- uma cultura em meio de YNB glicerol.
4. Avaliação de clones obtidos:
[00198] Na prática, dois ciclos de cultura foram realizados.
[00199] No final desta evolução dirigida, os clones foram individualizados em placas de meio completo, e os desempenhos dos clones obtidos foram avaliados em um meio YFCF cuja composição é dada acima. A Figura 9A mostra a evolução da produção de etanol em função do tempo de fermentação para 6 dos melhores clones obtidos.
[00200] Estes resultados revelam que 5 dos 6 clones têm uma cinética próxima a da cepa EG31, no entanto com um título alcoólico final superior ao da cepa EG31. O último clone observou que o C7 parece mais rápido durante a transição entre o metabolismo dos açúcares com 6 carbonos e o dos açúcares com 5 carbonos. Subsequentemente, a cinética da fermentação parece ser a mesma dos outros clones. No final da fermentação, parece que o teor alcoólico é maior com essa cepa do que durante a implementação dos outros clones.
[00201] Para validar que esta melhora está de fato relacionada a um melhor consumo de arabinose, uma dosagem por HPLC foi realizada para quantificar os demais açúcares. A Figura 9B representa as concentrações de arabinose no meio de fermentação após 160 horas de fermentação. Os resultados confirmam que todos os clones selecionados da evolução dirigida consumiram mais arabinose do que a cepa EG31, o clone observou que o C7 parece ser o mais eficiente. Este clone foi renomeado para a cepa EG32, que foi depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) sob o número CNCM 1-5086 em 19 de maio de 2016.
Claims (14)
1. Processo para obtenção e seleção de cepas de levedura capazes de metabolizar a arabinose, caracterizado pelo fato de que compreende:
- integração cromossômica dos genes araA, araB e araD, vantajosamente os genes araA de B. licheniformis, araB e araD de E. Coli, em uma cepa de levedura;
- colocar as cepas transformadas em uma cultura direta em um meio contendo arabinose como única fonte de carbono para a seleção de cepas capazes de metabolizar a referida arabinose;
- selecionar opcionalmente cepas transformadas possuindo arabinose metabolizada pela sua atividade de aldose redutase inferior ou igual a 0,002 U/g de proteína, ou mesmo inferior ou igual a 0,0005 U/g de proteína.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura usada é escolhida entre Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Yarrowia, Paffia, Kluyveromyces, Candida, Talaromyces, Brettanomyces, Pachysolen, Hansenula, Kloeckera, Schwanniomyces e Debaryomyces, vantajosamente uma cepa de Saccharomyces cerevisiae.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cepa de levedura usada é capaz de fermentar xilose, inclusive na presença de um ácido orgânico sob a forma não dissociada, tal como o ácido acético, vantajosamente a cepa depositada na CNCM em 29 de janeiro de 2015 sob o número 1-4953.
4. Cepa de levedura obtida usando o processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que apresenta ainda uma atividade de aldose redutase menor ou igual a 0,002 U/g de proteína, ou mesmo menor ou igual a 0,0005 U/g de proteína.
5. Cepa de levedura de acordo com a reivindicação 4,
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2/3 caracterizada pelo fato de que é a cepa 1-5085, depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Instituto Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 19 de maio de 2016.
6. Processo de obtenção e de seleção de uma cepa de levedura, caracterizado pelo fato de que apresenta uma capacidade melhorada para fermentar arabinose, glicose e xilose na presença de um ácido orgânico em forma não dissociada, tal como ácido acético, em que uma cepa de levedura apresentando tal capacidade, vantajosamente uma cepa como definida na reivindicação 4 ou 5, é cultivada sucessivamente nas seguintes condições:
- uma cultura em anarobiose ou em hipóxia em um meio contendo, como únicas fontes de carbono, arabinose e xilose em concentrações limitantes para a produção de biomassa, vantajosamente em uma quantidade de 5 g/1 e 4 g/1, respectivamente; em seguida
- duas culturas sucessivas em anarobiose ou em hipóxia na presença de um ácido orgânico em forma não dissociada, vantajosamente ácido acético, uma em meio contendo glicose como única fonte de carbono e a outra em um meio contendo xilose como única fonte de carbono;
- eventualmente uma cultura em anarobiose em um meio mínimo contendo, como a única fonte de carbono, uma fonte de carbono respiratório estrito, vantajosamente glicerol.
7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a cultura sucessiva da cepa nos vários meios é repetida pelo menos 2 vezes.
8. Cepa de levedura capaz de ser obtida com o processo como definido na reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que é a cepa I5086, depositada na CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microrganismos, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15) em 19 de maio de 2016.
9. Cepa de levedura de acordo com qualquer uma das
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3/3 reivindicações 4, 5 ou 8, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos uma cópia supranumerária do gene HAA1, vantajosamente inserida no nível do gene GRE3.
10. Levedura obtida por cultura de uma cepa, caracterizada pelo fato de ser como definida em qualquer uma das reivindicações 4, 5, 8 ou 9.
11. Uso de uma cepa como definida em qualquer uma das reivindicações 4, 5, 8 ou 9 ou de uma levedura como definida na reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que é para fermentação de um material contendo vantajosamente arabinose e/ou xilose e/ou para a produção de etanol.
12. Processo para a produção de produtos de fermentação ou de etanol, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- incubação de um material ou meio contendo arabinose e/ou xilose com uma cepa como definida em qualquer uma das reivindicações 4, 5, 8 ou 9 ou com uma levedura como definida na reivindicação 10;
- fermentação sob condições anaeróbias ou semianaeróbicas;
- recuperação de um ou mais produtos de fermentação ou de etanol.
13. Processo de produção de produtos de fermentação ou etanol de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o material ou meio contém também glicose.
14. Processo para produção de produtos de fermentação ou etanol de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o material ou meio é a hemicelulose ou a “fibra de milho”.
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| CN102869766B (zh) * | 2010-04-21 | 2015-11-25 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 适于发酵混合的糖组合物的细胞 |
| KR101246780B1 (ko) * | 2010-10-06 | 2013-03-26 | 한국과학기술원 | 아라비노스 대사경로가 도입된 자일리톨 생산균주 및 이를 이용한 자일리톨 생산방법 |
| FR2968313B1 (fr) | 2010-12-03 | 2014-10-10 | Lesaffre & Cie | Procede de preparation d'une levure industrielle, levure industrielle et application a la production d'ethanol a partir d'au moins un pentose |
| MX2013012269A (es) * | 2011-04-22 | 2013-11-22 | Dsm Ip Assets Bv | Celula de levadura capaz de convertir azucares que incluyen arabinosa y xilosa. |
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