CN110199026A

CN110199026A - 获得用于代谢阿拉伯糖的高效酵母菌株

Info

Publication number: CN110199026A
Application number: CN201880006369.XA
Authority: CN
Inventors: 托马斯·德福热雷; 埃米莉·弗里奇; 乔治斯·皮尼德; 克里斯托夫·拉夫; 克莱尔·托雷尔
Original assignee: Lesaffre et Cie SA
Current assignee: Lesaffre et Cie SA
Priority date: 2017-01-24
Filing date: 2018-01-24
Publication date: 2019-09-03
Also published as: ES2912995T3; EP3574120B1; WO2018138135A1; HUE058951T2; AU2018213056A1; AU2018213056B2; US20190330645A1; AR110848A1; JP2020506678A; US10920232B2; HRP20220572T1; EP3574120A1; MY193450A; PT3574120T; CA3049415A1; DK3574120T3; BR112019014115A2; FR3062134B1; ZA201904267B; FR3062134A1

Abstract

本发明涉及用于获得适于代谢阿拉伯糖的酵母菌株的方法，以及包括在诸如乙酸的抑制剂存在下，在其发酵阿拉伯糖以及木糖和葡萄糖的能力方面具有良好性能的改良菌株。

Description

获得用于代谢阿拉伯糖的高效酵母菌株

技术领域

本发明涉及能够代谢阿拉伯糖，并且有利地结合在发酵木糖和葡萄糖的抑制剂如非离解形式的乙酸存在下发酵木糖和葡萄糖能力的酵母菌株。

更具体地，本发明提供了用于选择能够代谢阿拉伯糖的菌株的方法及其改良菌株，其以它们代谢阿拉伯糖和木糖的能力运行，两种类型的戊糖均在木质纤维素水解产物中回收。

背景技术

主要来自农业和农工业活动的木质纤维素或植物生物质是由纤维素、半纤维素和木质素这三种主要部分制成的复合基质。这涉及用于制造乙醇——对其的需求由于例如它作为生物燃料的用途而持续上升——的可回收废物。

由木质纤维素生物质生产乙醇的方法包括通过水解尽可能多地回收纤维素和半纤维素部分中存在的糖，然后通过发酵将它们转化为乙醇。

至于存在于该生物质中的糖(包括C6糖(己糖)和C5糖(戊糖))的发酵，优选酵母的厌氧发酵，特别是使用发酵葡萄糖的能力得到很好的控制和开发的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

然而，全面关注戊糖，特别是可占木质纤维素生物质中含有的总糖的高达25-40％的木糖的发酵。因此，修饰了能够发酵葡萄糖的酵母菌株使其也能够代谢戊糖。

例如，文献WO 2010/000464报道了酵母菌株的获得，所述酵母菌株由于编码将木糖转化为可以被酵母代谢的木酮糖(xylulose)的木糖异构酶(XI)的细菌基因而能够发酵戊糖。

应当注意，在替代方式中，包含产生木糖醇的木糖还原酶(XR或XYL1)和木糖醇脱氢酶(XDH或XYL2)的途径也可以产生木酮糖。

因此，文献WO 2012/072793描述了改进的酵母菌株，其组合了编码木糖异构酶的外源基因和编码能够消除木糖醇的木糖醇脱氢酶的外源基因，木糖醇被证明是木糖异构酶的抑制剂。这些菌株，特别是2011年10月5日保藏在CNCM(国家微生物培养物保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes)的菌株I-4538，具有改进的产量，并因此证明了用于生产乙醇的工业实用性。

另一个关键问题是在木质纤维素水解物中存在发酵抑制剂；其中有呋喃醛(糠醛和HMF)、酚类化合物和有机酸(乙酸、乙酰丙酸、甲酸等)。高于5g/kg(初始培养基)并且可达到10g/kg的高浓度乙酸的存在与与半纤维素分子共价键合的乙酰基的存在有内在联系。

先前的工作已经开始改进菌株对发酵霉菌中存在的乙酸的抗性。因此，文献WO2011/080411报道了获得对葡萄糖上的乙酸具有改善的抗性的酵母菌株。

然而，乙酸也是木糖发酵的抑制剂。这种抑制的特征在于木糖消耗动力学的减少(Bellisimi等人，FEMS Yeast Res.，2009,9：358-364)，而对于葡萄糖，这种抑制反映在发酵开始的延迟，动力学随后保持不变。应当注意，在培养基中葡萄糖和木糖都存在的情况下，酵母菌株由于分解代谢物抑制而首先发酵葡萄糖。

因此，文献WO2013/178915和WO2013/178918描述了用于获得能够代谢戊糖(特别是木糖)以及对发酵抑制剂(特别是乙酸)具有抗性的酵母菌株的方法。

文献WO 2015/121595和FR 3 035 405中描述了甚至更加改善的菌株，特别是在乙酸存在下其发酵葡萄糖和木糖的能力方面。

所有这些工作都集中于木糖作为目标戊糖。虽然它通常被认为是半纤维素中的主要戊糖，但木糖并不是唯一的。因此有可能在植物结构中还发现阿拉伯糖(Saddler，1993，Wallingford，Oxon，UK：CAB International)，其比例有时大于40％(等人，2010，Physiologia Plantarum 139,241-255)。此外，阿拉伯糖存在于甘蔗渣(Hanko和Rohrer，2000，Anal.Biochem.283,192-199)或称为“玉米纤维”的来自玉米的纤维中(Gulati等人，1996，Bioresource Technology 58,253-264)。

除了阿拉伯糖的额外发酵的明显经济价值之外，还值得注意的是，残留的阿拉伯糖可能形成致污微生物发育的选择基质，这些微生物可能将其转化为有机酸，所述有机酸是葡萄糖和木糖发酵的抑制剂，如前人所述(Schell等人,2007,Bioresour.Technol.98,2942-2948)。

已经描述了许多能够代谢阿拉伯糖的微生物以及真菌微生物，特别是半子囊菌如树干假丝酵母、担子菌和丝状真菌，作为细菌如菊花欧文氏菌、解糖热厌氧杆菌、大肠杆菌、运动发酵单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌。

然而，在可以在工业上使用的酵母菌株中，特别是那些能够支持与酿酒酵母耐受的乙醇滴度一样高的酵母菌株，没有一种被报道能够天然地发酵阿拉伯糖。

文献WO 03/095627报道了通过用特异性携带枯草芽孢杆菌araA(编码L-阿拉伯糖异构酶)、大肠杆菌araB(编码有利地突变的L-核酮糖激酶)和araD基因(编码L-核酮糖-5-P-4差向异构酶)的多拷贝质粒转化实验室菌株获得能够在阿拉伯糖上生长的酿酒酵母菌株的可能性。

文献WO 2008/122354描述了使用携带地衣芽孢杆菌araA、大肠杆菌araB(有利地突变的)和araD基因(有利地，其被密码子优化)的自我复制载体转化的、能够在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的好氧或厌氧培养基上生长的酿酒酵母菌株。通过在含有葡萄糖作为碳源的培养基中培养来选择转化子。

文献WO 2008/041840描述了赋予酵母代谢阿拉伯糖的能力的在该案中来自植物乳杆菌的araA、araB和araD的具体序列。在实践中，通过质粒将基因引入删除了醛糖还原酶基因GRE3的实验室酿酒酵母中、过量表达戊糖磷酸途径(TAL、TKL1、RPE1和RKI1)并表达木糖发酵途径(XI或XylA和XKS1)。根据作者，这样的菌株不能直接在含有阿拉伯糖的培养基上生长，而需要在含有半乳糖的培养基上进行预培养。此外，从所述培养获得的菌株丧失了其代谢木糖的能力。

文献WO 2012/143513报道了在酵母属酵母物种中染色体整合至少araA、araB和araD以及XylA基因，即：在用WO 2009/112472中描述的序贯批量重复方法在含有20g/L阿拉伯糖和20g/L木糖的培养基中培养后，使其具有发酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的能力。观察到了不同基因(SSY1、YJR154w、CEP3、GAL80、PMR1)的突变。

然而，还存在获得除了甚至在乙酸存在下也能够发酵葡萄糖和木糖之外，还能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株的需要。

发明内容

基于本发明人在以下多方面的贡献，本发明涉及确认适于代谢至少阿拉伯糖的新酵母菌株：

-强调引入阿拉伯糖代谢途径是必要的但不足以保证有效的阿拉伯糖代谢；

-强调在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上直接选择具有整合的阿拉伯糖代谢途径的转化子的可能性；

-强调需要严格控制多元醇的生产，以确保阿拉伯糖的有效发酵；

-强调木糖和阿拉伯糖的发酵可以在稳定的环境中共存；

-完善用于选择能够同时改善阿拉伯糖、木糖和葡萄糖发酵(包括在如乙酸的发酵抑制剂存在下后两种糖的发酵)的酵母菌株的方案。

根据第一方面，本发明涉及用于获得和/或选择能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株的方法，其包括以下步骤：

-将代谢阿拉伯糖的途径引入酵母菌株；

-基于以下标准中的至少一个选择能够表达所述途径的菌株：

a/它能够代谢存在于含有上述阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中的阿拉伯糖，和/或

b/醛糖还原酶活性低或甚至没有。

根据特定实施方案，所述方法包括：

-在酵母菌株中染色体整合araA、araB和araD基因，有利地地衣芽孢杆菌的araA、大肠杆菌的araB和araD；

-将转化的菌株的培养物直接置于含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中，以选择能够代谢所述阿拉伯糖的菌株。

有利地，该方法还包括基于其醛糖还原酶活性小于或等于0.002U/g蛋白质，甚至小于或等于0.0005U/g蛋白质，而选择具有代谢的阿拉伯糖的转化的菌株。

在本发明的上下文中，“酵母菌株”应理解为从遗传观点来看严格相同的酵母群体。这包括称为实验室菌株的菌株和称为工业菌株的菌株。

有利地，在所述方法中使用的酵母菌株选自酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、耶氏酵母属(Yarrowia)、红发夫酵母属(Paffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、篮状菌属(Talaromyces)、酒香酵母属(Brettanomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、汉逊酵母属(Hansenula)、克勒克酵母属(Kloeckera)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和德巴利酵母属(Debaryomyces)菌株，有利地，酿酒酵母菌株。这些酵母已知不能天然地代谢阿拉伯糖或以非常低的水平代谢阿拉伯糖，不是工业上适用的。此外，有利地，选择它们是由于其厌氧发酵能力，甚至更有利地由于它们的厌氧乙醇发酵。

根据一个具体实施方案，在适于发酵木糖，有利地，适于在非离解形式的有机酸(例如乙酸)的存在下发酵木糖的菌株上进行该方法(本申请的主题)。如现有技术中广泛公开的，代谢木糖的能力可以导致引入编码木糖异构酶(例如来自植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentans))和/或木酮糖激酶的基因。

有利地，这些是以下菌株：

-2011年10月5日在CNCM注册，编号为I-4538的菌株；

-2013年5月16日在CNCM注册，编号为I-4749的菌株；

-2013年12月12日在CNCM注册，编号为I-4829的菌株；

-2015年4月9日在CNCM注册，编号为I-4966的菌株；

更有利地，2015年1月29日在CNCM注册，编号为I-4953的菌株

出于本发明的目的，能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株是能够消耗或使用存在于其培养基中的阿拉伯糖，有利地，L-阿拉伯糖的菌株。因此并且特别基于培养条件，酵母菌株可以使用阿拉伯糖来生产其生物质和/或产生发酵产物。出于本申请的目的，阿拉伯糖的发酵应理解为在低氧和/或厌氧条件下，即在氧气可用性低(通常小于20％)或完全不存在氧气的条件下发生的阿拉伯糖的代谢。

因此，在本发明的含义内，术语“代谢”也可以指酵母菌株使用阿拉伯糖来确保其生长的能力以及其在多种发酵产物(例如羟基衍生物(包括乙醇或异丁醇)和/或羧酸盐(包括有机酸)的发酵产物)中发酵阿拉伯糖的能力。

根据一个具体实施方案，提及其将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或L-核酮糖-5-磷酸和/或转化为D-木酮糖-5-磷酸和/或转化为发酵产物(例如乙醇)的能力。根据一个有利的实施方案并且如图1所示，在阿拉伯糖异构酶(araA：EC：5.3.1.4)的作用下，L-阿拉伯糖被转化为L-核酮糖。L-核酮糖本身可以在核糖核酸酶(araB；EC：2.7.1.16)的作用下被转化为L-核酮糖-5-磷酸。因此，L-核酮糖-5-磷酸可以被核酮糖5磷酸差向异构酶(araD；EC：5.1.3.4)转化为D-木酮糖-5-磷酸。有利地，D-木酮糖-5-磷酸通过戊糖磷酸途径的非氧化部分进行，并可导致乙醇的产生。

在根据本发明的方法的最初步骤中，将允许阿拉伯糖代谢的基因引入酵母菌株，然后将其称为转化的菌株。

在下文中，术语“基因”或“序列”是指包含编码序列(编码例如来自目标途径的酶)的核酸序列，其可能侧接调节序列，特别是启动子或终止子。编码序列是可优化的，即可修饰以整合宿主的优选密码子，所述宿主在此处是其中表达该序列的酵母。

根据一个具体实施方案，编码阿拉伯糖代谢途径的基因是称为外源或异源元件的遗传元件，其可以是合成的或来自其他生物(或来源)。有利地，它们来自能够代谢阿拉伯糖的微生物，其有利地是半子囊菌如树干假丝酵母、担子菌和丝状真菌，或细菌如菊花欧文氏菌、解糖热厌氧杆菌、大肠杆菌、运动发酵单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或植物乳杆菌。根据一个具体实施方案，这些基因来自地衣芽孢杆菌和/或大肠杆菌。根据另一个优选的实施方案，这些基因对应于Widemann和Boles(2008,Applied and EnvironmentalMicrobiology 74,2043–2050；WO 2008/122354)描述的地衣芽孢杆菌araA基因、大肠杆菌araB基因和大肠杆菌araD基因。

用于将DNA引入宿主(或转化)的技术是本领域技术人员公知的，包括通过施加电场(电穿孔)、加热(施加热冲击)或例如使用醋酸锂的化学方法使膜透化。

引入的基因可以被整合到宿主的基因组中，特别是通过同源重组或染色体整合，有利地，使用整合盒，或使用质粒或载体在染色体外表达。不同类型的质粒，有利地，自我复制质粒是本领域技术人员公知的，这些质粒特别是通过复制起点、启动子(诱导型或组成型)、标记(对抗生素的抗性或在选择性培养基上生长的能力)和每细胞的拷贝数而有所不同。

根据一个实施方案，将编码阿拉伯糖代谢途径的基因，有利地在酵母菌株的HO基因座水平上，更有利地在酵母菌株的所有HO基因座水平上进行染色体整合。

有利地，携带该(这些)基因并用于将它们合并或整合到酵母菌株中的盒缺乏标记物，特别是抗生素抗性。

根据另一个优选的实施方案，携带该(这些)基因的盒不携带编码阿拉伯糖载体的基因，特别是araT基因。

通过本领域技术人员已知的技术，例如使用可能由表达盒携带的标记，或者优选地通过使用靶向引入的基因的引物进行PCR，可以很容易地验证基因的正确引入。另外，相同的PCR技术可用于验证基因在靶向基因座处的整合，特别是使用靶向所述基因座的引物。

在根据本发明的方法的后续步骤中，由于其代谢存在于培养基中的作为唯一碳源的阿拉伯糖的能力，选择掺入了并有效表达阿拉伯糖代谢途径的目标菌株。

在根据本发明的特征性方式中，转化子的选择直接在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上进行。换句话说，通过在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上培养酵母菌株来测试所述菌株代谢阿拉伯糖的能力。这不包括任何先前的诱导，特别是在半乳糖存在下或在培养基中添加半乳糖的先前培养，或在含有另一碳源如葡萄糖的培养基上预选转化子。

在本发明的范围内，培养或生长培养基是含有存在的菌株增殖所需成分的培养基。它有利地涉及适合酵母生长的完全培养基，其可含有常规成分，例如盐、缓冲液、酵母提取物或酵母可代谢的任意其他氮源、维生素等。在本发明的上下文中，“合成培养基”应理解为其化学组成已知的培养基。

以适当的方式，使用的培养条件是有利于酵母生长的条件，具体地：

-培养基具有酸性pH，有利地，在4和6之间，甚至在4.5和5.5之间，更有利地等于5或5.4；

-温度在28和37℃之间，甚至在30和35℃之间，有利地等于32℃；

-生长时间从24小时到几天不等，例如72小时。

有利地，这种生长在固体培养基中进行，使得可以分离实际上能够代谢阿拉伯糖的菌株。根据另一个有利的实施方案，通过在皮氏(Petri)培养皿中培养进行目标菌株的选择。在已知的方式中，固体培养基含有琼脂，有利地，浓度为15至20g/L。

根据第一个实施方案，通过使该菌株在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的生长培养基中需氧生长来选择能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株。

适合于这种需氧生长的一种培养基是合成培养基YNB其精确组成在实施例中给出，其含有阿拉伯糖作为唯一碳源，有利地，浓度为10g/L，例如下文称为YNB-Ara的培养基。

或者，可以通过在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的生长培养基中在厌氧条件或低氧条件下生长来选择能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株。

适合于这种厌氧生长或低氧生长的一种培养基是合成培养基YF，其精确组成在实施例中给出，其含有阿拉伯糖作为唯一碳源，有利地浓度为70g/L，例如下文称为YF-ara的培养基。

有利地，该培养基适于在例如添加琼脂的固体培养基中的生长，从而允许直接分离目标菌株。

根据一个替代实施方案，通过在固体培养基中培养，有利地在例如上述YNB-Ara培养基的选择性培养基中培养来分离其中引入了阿拉伯糖代谢途径的酵母菌株，然后在例如上述YF-ara培养基的合适的培养基中，在厌氧条件下或在低氧条件下在液体培养基中选择。所述液体培养可以在如深孔板(Deep Well)的微孔板中或在小瓶中，在例如100rpm的低搅拌下，或在没有搅拌的情况下以及在氧气供应减少的条件下(在有限的O₂或厌氧条件下)进行。

在这些条件下，酵母菌株代谢阿拉伯糖的能力可以通过以下评估：

-它们的生长，特别是通过监测培养基的光密度(OD)，有利地在600nm处测量；和/或

-阿拉伯糖的发酵，特别是通过监测培养基中存在的阿拉伯糖的浓度，例如通过HPLC，或通过评估与CO₂的产生直接相关的质量损失，其与乙醇的生成是化学计量相关的。

注意，据申请人所知，这是第一次报道直接通过在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上生长酵母菌株来选择能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株的可能性。相反，鉴于Wisselink等人(2007；Appl Environ Microbiol 73,4881-4891；WO 2008/041840)报告这种直接选择不起作用的信息，认为本领域技术人员将被劝阻使用这种方法。

根据另一个有利的实施方案，也可以同时或随后在以下条件下测试所获得的酵母菌株：

-在含有葡萄糖作为唯一碳源的生长培养基上，例如在如上所述的YF培养基上，但含有150g/L葡萄糖，并且在上面给出的培养条件下。该步骤使得可以验证所选菌株的有效性，特别是它们发酵葡萄糖的能力。注意，在将选择的菌株培养到含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上(如上所述)并验证表型[ara+]是稳定的并且保存之前，可以在葡萄糖培养基上进行一次或多次传代。

-在含有木糖作为唯一碳源的生长培养基上，例如在如上所述的YF培养基上，但含有70g/L的木糖(实施例中的YF-木糖培养基)，并且在上面给出的培养条件下。该步骤使得有可能验证所选菌株保持其发酵木糖的能力，并且当使用本发明方法的酵母菌株能够发酵木糖时，该步骤显示出优势。

另外并且在本发明的范围内，显示选择用于阿拉伯糖代谢的目标菌株的重要标准是它们的多元醇生产水平。

以已知的方式，多元醇如木糖醇对木糖异构酶(xylA)活性具有抑制作用(Kovalevsky等人,2012,Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.68,1201-1206)。在本发明的范围内，已经证明多元醇还可以抑制阿拉伯糖异构酶活性(araA；图1)，并从而减少通过本发明方法选择的菌株的阿拉伯糖代谢。

与从木糖产生木糖醇的方式相同，阿拉伯糖醇可能在醛糖还原酶的作用下由阿拉伯糖产生。应当注意，以已知的方式，GRE3基因编码酿酒酵母中的主要醛糖还原酶，但即使当其缺失或失活时，醛糖还原酶活性仍可存在。此外，酵母菌株中木糖醇脱氢酶活性的存在具有消除木糖醇的潜力。

因此，根据这个假设，为特定目的选择的菌株显示：

-强的多元醇脱氢酶活性，有利地大于或等于0.001U/g蛋白质，或甚至更有利地大于或等于0.002U/g蛋白质；和/或

-低醛糖还原酶活性。

在实践中和在本发明的范围内，已经强调可以基于其低的、甚至无效的醛糖还原酶活性来选择目标菌株。有利地，该活性低于0.005U/g蛋白质，甚至0.004、0.003或甚至0.002U/g蛋白质。更优选地，它小于或等于0.0015U/g蛋白质，甚至小于或等于0.001U/g蛋白质，更有利地小于或等于0.0005U/g蛋白质。

用于测量醛糖还原酶活性的详细方案描述于“实施例”中。

进一步且有利地，在根据本发明的方法中使用的酵母菌株显示一种或多种缺失或失活的GRE3基因。

根据另一个优选的实施方案，用于本发明的酵母菌株显示编码转录调节因子Haa1p的HAA1基因的至少一个额外拷贝。以已知的方式，前者能够赋予酵母菌株，特别是酿酒酵母，抵抗乙酸的能力，从而改善在含有有机酸类发酵抑制剂如乙酸的培养基中的生长。另外，申请人已经表明，该基因的过表达将使其对其他酚类化合物抑制剂，特别是香草醛具有抗性。

有利地，将编码Haa1p的额外基因的表达置于异源启动子例如pPGK1启动子的控制下。基因HAA1的这种额外拷贝可编码其天然蛋白质或突变形式，例如Swinnen等人(2017,Microbial Cell Factories 16:7)描述的组成型活性形式HAA1_S135F。

根据优选的实施方案，HAA1基因的额外拷贝在染色体水平上整合，甚至更有利地通过在GRE3基因水平插入整合。由此，在本发明的范围内有两个有利的结果，它们是：

-编码醛糖还原酶的GRE3基因的失活；

-HAA1基因的过表达使酵母菌株对乙酸和香草醛的抗性更强。

对应于目标酵母菌株的选择步骤的根据本发明的方法中的第二步可用于评估前述2个标准中的任一个，有利地，评估两者。根据一个具体实施方案，首先评估代谢培养基中存在的阿拉伯糖的能力，然后测试所选菌株的醛糖还原酶活性。

对这样选择的菌株的益处，特别是它们发酵阿拉伯糖以及葡萄糖和可能的木糖的能力，可以通过评估它们在合成培养基上的表现来证实，所述合成培养基含有混合物中的不同糖，即阿拉伯糖和葡萄糖，甚至对于本来能够发酵木糖的菌株，为阿拉伯糖、葡萄糖和木糖。为了模拟实际的发酵条件，这些培养基还含有已知其抑制葡萄糖和木糖的发酵的乙酸，其浓度有利地为1-10g/L。

这种培养基的示例是YPF或YFCF，其组成如下：

YFCF培养基

-10g/L的酵母提取物；

-10g/L的细菌蛋白胨；

-63g/L的葡萄糖；

-28g/L的木糖；

-28g/L的阿拉伯糖

-4g/L的乙酸(在pH5下加入培养基中的量)。

YFP培养基

-10g/L的酵母提取物；

-10g/L的细菌蛋白胨；

-63g/L的葡萄糖；

-52g/L的木糖；

-6.1g/L的阿拉伯糖；

-4g/L的乙酸(在pH5下加入培养基中的量)。

有利于酵母中乙醇生产的标准培养条件是：

-酸性且稳定的pH，有利地在4和6之间，例如等于5；

-温度在28和37℃之间，甚至在30和35℃之间，有利地等于30℃；

-低搅拌，例如100rpm；

-减少供氧条件(在有限的O₂下)。在实践中，可以在带盖子的烧瓶中进行培养，该盖子减少培养基中O₂的供应，同时允许排出产生的CO₂；

-用在YPG上饱和繁殖24小时的菌株的0.25g/kg eq MS接种物接种；

-生长时间至少为24小时，例如72小时。

在本发明的范围内，通过该程序选择的菌株表现出：

-使用阿拉伯糖作为唯一碳源来确保其生物质的生产的能力；

-发酵阿拉伯糖的能力；

-即使在非离解形式的有机酸，特别是乙酸存在下，发酵葡萄糖和可能的木糖的能力。

在上述条件下发酵72小时后观察到：

-消耗95％、甚至全部的培养基中存在的葡萄糖和木糖，转化为生物质，或乙醇和CO₂；

-消耗培养基中存在的阿拉伯糖的超过50％、甚至60％、70％或甚至80％。

因此，根据另一方面，本发明涉及使用所述方法可获得的酵母菌株，其能够在培养基中发酵72小时后发酵至少50％、甚至60％、70％或甚至80％的阿拉伯糖，所述培养基包含葡萄糖(有利地，浓度为1至100g/L，例如63g/L)、木糖(有利地，浓度为1至100g/L，例如28或52g/L)、阿拉伯糖(有利地，浓度为1至100g/L，例如6.1或28g/L)和乙酸(有利地，浓度为1至10g/L，例如4g/L)。优选地，这种酵母菌株能够同时发酵也存在的葡萄糖和木糖的至少90％、甚至95％。

这种菌株还有利地显示出以下特征中的至少一个，甚至所有特征：

-araA基因的至少一个拷贝，其优选来自地衣芽孢杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在至少一个HO基因座的水平上整合；

-araB基因的至少一个拷贝，其优选来自大肠杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在至少一个HO基因座的水平上整合；

-araD基因的至少一个拷贝，其优选来自大肠杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在至少一个HO基因座的水平上整合；

-编码木糖异构酶的外源基因的至少一个拷贝，其有利地来自发酵植物多糖梭菌；

-基因GAL2的至少一个额外拷贝，其编码也能确保捕获木糖的己糖转运蛋白。根据另一个实施方案，所述菌株包含GAL2基因的至少两个额外拷贝。这可以置于pADH1型强组成型启动子的控制之下；

-抑制由GRE3编码的醛糖还原酶活性，有利地通过在GRE3基因座水平插入HAA1基因；

-木酮糖激酶(XKS1)的过量产生，特别是通过修饰启动子或引入额外拷贝；

-磷酸戊糖途径(RPE1、RKL1、TKL1、TAL1等)的表达或过量产生；

-木糖还原酶(XR)活性的缺失。

根据一个具体实施方案，这种菌株在以下基因水平下不是沉默的：SSY1、YJR154w、CEP3、GAL80和/或PMR1。根据另一个具体实施方案，该菌株不携带以下突变：SSY1基因中的G1363T、YJR15w基因中的A512T、CEP3基因中的A1186G、GAL80基因中的A436C、PMR1基因中的A113G。

通过使用所要求保护的方法获得的特别关注的菌株是2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur，25ruedu Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)登记的编号为1-5085的菌株。

根据另一方面，本发明涉及用于获得和/或选择酵母菌株的方法，所述酵母菌株在有机酸发酵抑制剂，特别是乙酸的存在下具有改善的发酵阿拉伯糖、木糖和葡萄糖的能力，其显著表征为乙醇产量的增加和培养基中存在的阿拉伯糖的更多的消耗。

本发明还涉及用于获得和/或选择酵母菌株的方法，所述酵母菌株，有利地，在非离解形式的有机酸如乙酸存在下，具有改善的发酵葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的能力，其中将显示出这种能力的酵母菌株在下列条件下连续培养：

-在第一种培养基中的厌氧培养，所述第一种培养基含有作为唯一碳源的阿拉伯糖以及有限量的木糖以生产生物质；然后

-在非离解形式的有机酸，有利地是在乙酸的存在下的两次连续的厌氧培养，一次在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中，另一次在含有木糖作为唯一碳源的培养基中；

-任选地，在基础培养基中的需氧培养，所述基础培养基含有严格呼吸的碳源，有利地，甘油，作为唯一碳源。

因此，这种方法是为了实现所用酵母菌株的定向进化。不希望受任何一种理论的影响，由在下面定义的生长培养基中的连续培养所施加的选择压力允许菌株获得用于在非离解形式的有机酸，特别是乙酸的存在下增加其发酵阿拉伯糖的能力和保持其发酵木糖和葡萄糖的能力所必需的表型性状。

因此，根据本发明的方法允许从分离的菌株或菌株混合物中选择一种在含有这三种糖以及所述非离解形式的有机酸的培养基上生长的方面具有选择优势的菌株。

所述方法，也是本申请的主题，可用在分离的菌株，特别是2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，Institut Pasteur，25ruedu Docteur Roux，75724Paris Cedex 15)登记的编号为I-5085的菌株上。

根据所述方法，将酵母菌株或菌株混合物在至少三种生长培养基中连续培养。如前所述，表述“生长培养基”和“培养基”可互换使用，以指定包含存在的酵母的繁殖所必需的成分的培养基。

第一种生长培养基，有利地是液体，其特征在于它含有戊糖阿拉伯糖和木糖作为唯一的碳源。

应该注意的是，传统上认为，当酵母群体有两种糖时，它通常只用一种来制造生物质。一旦消耗了第一种糖，就可以使用第二种糖。因此，两种戊糖(木糖和阿拉伯糖)的发酵表型的稳定性存在真正的风险。

在根据本发明的特征性方式中，第一培养基含有一定浓度的戊糖，其可以覆盖每种酵母菌株需要的碳的100％，有利地50％。根据另一个实施方案，阿拉伯糖和木糖以相等的浓度存在，例如，以阿拉伯糖为5g/L而木糖为4g/L的比率。

根据另一个优选的特征，它是其精确组成受控的合成培养基，有利地，是其化合物完全确定的培养基。这种培养基命名为例如“GO木糖阿拉伯糖”，其组成在实施例中给出。注意在这样的培养基中，在木糖(4g/L)和阿拉伯糖(5g/L)存在的情况下，限制生物质生产的不是氮源(10g/L的(NH₄)₂PO₄)而是碳源的量。因此，这种培养基有利于使用两种糖的酵母菌株的生长和繁殖。

设计以下步骤以预期对所选菌株的抑制剂，特别是非离解形式的乙酸的耐受性丧失的可能风险。

因此，在这一步骤中，实施了两次连续的厌氧培养：

-一次在含有葡萄糖作为唯一碳源的生长培养基中；以及

-另一次在含有木糖作为唯一碳源的生长培养基中。

两种培养基上的传代顺序可任选地是相反的(木糖培养基，然后是葡萄糖培养基)。

有利地，生长培养基中葡萄糖或木糖的浓度是当其被用作唯一碳源时通常实施的，在液体培养基的情况下具体地在5和200g/L之间(在固体培养基的情况下在5和200g/kg之间)，例如葡萄糖等于150g/L并且木糖等于70g/L。

有利地，所述培养基还包括能够抑制两种糖发酵的有机酸。它有利地包括乙酸或甲酸，更优选乙酸。

应注意，已知只有这种酸的非离解或非离子形式具有抑制能力。在本发明的上下文中，羧酸的“非离子化或非离解形式”被理解为其质子化形式。在实践中，这种有机酸的形式取决于它们掺入的培养基的pH。在pH大于酸的pKa时，酸主要以离解形式或COO^-离子存在。相反，在较低pH下，主要形式是非离解或非离子形式(COOH)。在本说明书的其余部分中，提及加入培养基中的乙酸，其根据所述培养基的pH包括解离和非解离形式。

有利地，在生长培养基中非离解形式的有机酸，有利地为乙酸，的浓度在液体培养基中在0.5和5g/L之间(相当于在固体培养基中在0.5和5g/kg之间)，有利地在1.3和2.6g/L之间。在实践中并且作为实施例，该最终范围对应于添加至pH5的生长培养基中的乙酸浓度，其在3和6g/L之间，例如4或5g/L。

除了这两种成分外，所述生长培养基还有利地是一种完全合成的培养基，其适合于酵母厌氧或低氧生长，例如，YF培养基，其确切组成在实施例中给出。

适用于实施本发明方法第二步的培养基是例如称为YF-葡萄糖酸和YF-木糖酸的培养基，其组成在实施例中详述。

除了这些生长培养基的特定组成外，在本发明方法的第一和第二步骤中酵母菌株或菌株混合物的培养有利地在有利于酵母，特别是酵母属，在厌氧或低氧条件下生长以及它们的发酵活性的标准条件下进行，其具体为：

-酸性pH，其有利地在4和6之间，甚至在4.5和5.5之间，甚至更有利地等于5或5.4；

-温度，其在28至37℃之间，甚至在30至35℃之间，有利地等于32℃；

-在温和搅拌下，例如等于100rpm；

-在氧气供应减少的条件下(在有限的O₂下)。在实践中，培养可以在用盖子塞住的烧瓶中进行，该盖子减少培养基中O₂的供应，同时允许排出产生的CO₂。

通常，当可水解的葡萄糖碳源完全消耗时培养停止。在实践中，并且有利地，将培养放置至少24小时，甚至数天，有利地，长达7天。

根据一个具体实施方案，根据本发明的方法还包括将酵母传代到第四生长培养基中，有利地是液体，用于选择能够呼吸的，特别是具有功能性线粒体的细胞。在实践中，该步骤可以在该方法中每个循环中实施或者实施至少一次，用于克服“小菌落”(petites)的出现，“小菌落”的呼吸缺陷表型在工业酵母生产方法的背景下可能是不利的。

有利地，该第四培养基是含有碳作为唯一碳源的贫营养或基础培养基，所述碳仅可被保留功能性线粒体的细胞使用。在这种情况下，人们谈到严格呼吸碳的来源，这意味着系统地涉及线粒体氧化而不产生乙醇的碳源。它可以有利地是甘油或可能是乙醇。换句话说，这种培养基不含可发酵的糖。

有利地，生长培养基的甘油浓度是当其被用作唯一碳源时通常使用的甘油浓度，具体地在5和50g/L之间，有利地在10和50g/L之间，例如等于10g/L以便获得足够的生物质用于接种下一循环的第一培养基。

根据定义，基础培养基除碳源外还含有氮源、钾源、磷源、硫源、镁源、钙源、铁源、微量元素源和水源。

可用于制备该培养基的培养基可包括：

-基础，例如酵母氮基础，有利地浓度为3.4g/L；

-和任选的硫酸铵，有利地浓度为5g/L。

除了该生长培养基的特定组成外，酵母菌株或菌株混合物的培养有利地在有利于酵母需氧生长的标准条件下进行，其具体为：

-酸性pH值，其有利地在4和6之间，甚至在4.5和5.5之间，例如等于5；

-温度，其在28和37℃之间，甚至在30和35℃之间，有利地等于32℃；

-在中等搅拌下，例如等于150rpm；

-在需氧培养中。在实践中，培养可以在带有多孔盖的带挡板的烧瓶中进行，该多孔盖允许在培养基中供应O₂。

同样，当碳源，有利地是甘油，已经完全消耗时，培养停止。在实践中并且有利地，培养在数小时，有利地48小时内完成。

在这三种，甚至四种培养基中，并且在所描述的条件下，所述连续培养构成了一个循环。

在实践中，根据本发明的选择循环可以如下：

-在木糖和阿拉伯糖存在下的第一次厌氧或低氧培养；

-在葡萄糖和乙酸存在下的第二次厌氧或低氧培养；

-在木糖和乙酸存在下的第三次厌氧或低氧培养；

-在甘油存在下的可能的第四次厌氧培养；

或者

-在木糖和阿拉伯糖存在下的第一次厌氧或低氧培养；

-在木糖和乙酸存在下的第二次厌氧或低氧培养；

-在葡萄糖和乙酸存在下进行第三次厌氧或低氧培养；

-在甘油存在下的可能的第四次厌氧培养。

根据本发明，这些不同的培养根据“单批重复”方法进行，例如不需要更新当前的培养基。

根据一个具体实施方案，这种循环重复至少两次(“多批重复”)，例如2次。

该方法能够选择在接近含有阿拉伯糖、葡萄糖、木糖和乙酸的天然培养基的培养基上发酵期间，表现出改善的乙醇生产(更高的醇强度)和更好地消耗培养基中存在的阿拉伯糖的酵母菌株。

根据另一方面，本发明涉及使用上述方法获得的酵母菌株。由此可以分离在该选择过程结束时，消耗存在于培养基中的阿拉伯糖的能力增加至少10％、甚至20％、30％、40％、50％、60％、70％、甚至更多80％的酵母菌株。这些性能有利地在上文关于培养基YFCF描述的发酵条件下和160小时后评估。

事实上，在这些条件下，观察到培养基中存在的阿拉伯糖消耗超过90％、甚至95％或甚至97.5％。

因此，根据另一方面，本发明涉及使用所述方法可获得的酵母菌株，其能够在培养基中发酵160小时后发酵至少90％、甚至95％或甚至97.5％的阿拉伯糖，所述培养基包括葡萄糖(有利地，其量为1至100g/L，例如63g/L)、木糖(有利地，其量为1至100g/L，例如28g/L)、阿拉伯糖(有利地，其量为1至100g/L，例如28g/L)和乙酸(有利地，其量为1至10g/L，例如4g/L)。优选地，这种酵母菌株能够同时发酵至少90％、甚至95％，或甚至100％的葡萄糖和木糖。

-araA基因的至少一个拷贝，其优选地来自地衣芽孢杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在所有HO基因座的水平上整合；

-araB基因的至少一个拷贝，其优选地来自大肠杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在所有HO基因座的水平上整合；

-araD基因的至少一个拷贝，其优选地来自大肠杆菌，有利地在染色体水平上整合，更有利地在所有HO基因座的水平上整合；

-GAL2基因的至少一个额外拷贝，其编码也能确保捕获木糖的己糖转运蛋白。根据另一个实施方案，所述菌株包含GAL2基因的至少两个额外拷贝。这可以置于pADH1型强组成型启动子的控制之下；

-磷酸戊糖途径(RPE1、RKL1、TKL1、TAL1等)的表达或过量产生；

-木糖还原酶(XR)活性的缺失。

根据另一有利实施方案，这种菌株呈现以下特征中的至少一个，有利地呈现两者：

-强多元醇脱氢酶活性，有利地大于或等于0.001U/g蛋白质，更有利地大于或等于0.002U/g蛋白质；

-醛糖还原酶活性小于0.005U/g蛋白质，甚至0.004、0.003、甚至0.002U/g蛋白质，优选小于或等于0.0015U/g蛋白质，甚至小于或等于0.001U/g蛋白质，最优选小于或等于0.0005U/g蛋白质。

特别关注的菌株是2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Culturesde Microorganismes，Institut Pasteur，25rue du Doctor Roux，75724Paris Cedex 15)登记的编号为I-5086的菌株。

根据一个具体实施方案，这种菌株具有HAA1基因的至少一个额外拷贝，有利地在GRE3基因水平上插入。

根据另一方面，本发明还涉及通过培养如上定义的菌株获得的酵母。

在本发明的上下文中，“酵母”应理解为通过实施生产酵母菌株的方法获得的商业产品。因此，可以从单一菌株获得具有不同性质的酵母，其中这些差异与实施的生产方法相关。

根据另一方面，本发明涉及如上定义的菌株或酵母用于材料发酵，和/或用于生产乙醇的用途，所述材料有利地含有阿拉伯糖和/或木糖和/或葡萄糖。

根据一个具体实施方案，该材料是木质纤维素材料。这种材料通常包含：

-戊糖，特别是D-木糖和L-阿拉伯糖；

-己糖，特别是D-甘露糖、D-半乳糖、L-鼠李糖和D-葡萄糖；

-糖醛酸。

根据一个具体方面，本发明涉及发酵产物或乙醇的生产方法，其包括以下步骤：

-将含有阿拉伯糖和/或木糖和/或葡萄糖，有利地是阿拉伯糖、木糖和乙酸的材料或培养基，与如上定义的菌株或酵母一起培养；

-在厌氧或半厌氧(低氧)条件下发酵；

-回收一种或多种发酵产物或乙醇。

根据特定实施方案，材料或培养基是半纤维素或“玉米纤维”。

将使用附图支持的以下实施例更加进一步地说明本发明。但是，它们没有限制范围。

附图说明

图1示出了用于将L-阿拉伯糖和D-木糖转化为D-木酮糖-5-磷酸的代谢途径。

图2示出了质粒pL1285-055，其允许基因araA/araB/araD在酿酒酵母的HO基因座水平上整合。

图3示出了通过使用下表1中的寡核苷酸获得的PCR产物。泳道1对应于尺寸标记(1kb DNA梯形图)，泳道2至9对应于通过使用所测试的8个转化子的DNA基因组模板获得的PCR产物，泳道10是用未转化的菌株获得的。泳道11是该技术的阴性对照(水)，泳道12是质粒pL1285-055作为模板的阳性对照。

图4说明了菌落在YPG培养基+杀稻瘟素50mg/L(A)上以及在含有10g/L阿拉伯糖(B)的YNB-Ara培养基上的生长。

图5说明了所选克隆在含有阿拉伯糖(A)或木糖(B)作为唯一碳源的培养基上的生长。

图6表示，因其发酵阿拉伯糖的能力而选择的克隆13(A)和126(B)在YFCF培养基(63g/kg葡萄糖、28g/kg木糖、28g/kg阿拉伯糖和4g/kg乙酸，pH＝5)上各种成分的浓度(以g/kg表示)随发酵时间的变化。该值表示来自3个生物学独立实验的平均值。

图7表示在测试的不同基因库(I-4953；克隆13；克隆126)中测量的醛糖还原酶活性。该值表示来自2个生物学独立实验的平均值。

图8表示发酵48小时后在克隆126和转化子(用pADH1-GRE3转化)中观察到的质量损失。

图9示出了(A)在由EG31菌株定向进化后选择的不同克隆的YFCF培养基上，乙醇浓度(g/kg)随发酵时间的变化；(B)在这些相同克隆和菌株EG31的YFCF培养基上发酵160小时后阿拉伯糖的浓度(g/kg)。

实施例

I/获得能够发酵阿拉伯糖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株：

1.通过阿拉伯糖途径的转化：

发酵阿拉伯糖的途径如图1所示。

菌株I-4953，于2015年1月29日在CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)以编号CNCM I-4953注册，其被质粒pL1285-055(图2)转化，该质粒是带有阿拉伯糖途径表达盒的质粒pHD22的衍生物，其允许在该酿酒酵母菌株的HO基因座水平上整合地衣芽孢杆菌的araA基因和大肠杆菌的araB/araD。

由于存在编码来自发酵植物多糖梭菌的木糖异构酶的外源基因的至少一个拷贝，该菌株还因其代谢木糖的能力而闻名。

此外，该菌株过表达编码来自戊糖磷酸途径的非氧化部分的酶的基因，特别是TAL1和TKL1基因。

2.验证阿拉伯糖途径的染色体整合：

通过PCR使用转化子的基因组DNA作为模板以及寡核苷酸扩增相应的3个ORF中的每一个的一个片段来验证编码形成阿拉伯糖代谢途径的酶的各种基因，特别是基因ara A、B和D的正确整合。所述寡核苷酸及其序列如下表1所示：

在TAE 0.5x中以50伏特迁移1小时后，在0.8％的琼脂糖凝胶上分析获得的PCR产物。

图3中显示的结果显示，在所有测试的转化子(8个)中，PCR产物实际上已经扩增了阿拉伯糖途径的3个基因。这一发现表明这些基因已经有效地整合到酵母的基因组中。

另外，进行标准测序以检查基因araA、B和D未发生突变(数据未显示)。

3.选择实际上能够代谢阿拉伯糖的菌株：

为了进一步研究，选择简化阿拉伯糖途径的表达系统。为此，对盒进行修饰以表达基因ara A、B和D，同时使阿拉伯糖转运蛋白(araT)的编码序列丧失。

为了测量可以代谢阿拉伯糖的菌株出现的频率，使用1.3μg带有araA、B和D的所述盒转化2015年1月29日在CNCM注册的菌株I-4953。

将转化的产物涂布在两种类型的培养基上：

-第一种培养基，其对应于含有50mg/L的杀稻瘟素的YPG(10g/L酵母提取物；10g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖作为唯一碳源)。目的是确定已经将盒整合到了其基因组中的细胞数量；

-第二种培养基，称为YNB-Ara，其对应于含有10g/L阿拉伯糖作为唯一碳源的基本培养基(YNB)。该培养基必须能够确定已经获得了表型[ara+]的细胞数量。

(“不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮基础”)培养基，编号为0335-15，其包含：

-生物素2μg/L

-泛酸(钙)400μg/L

-叶酸2μg/L

-肌醇2000μg/L

-烟酸400μg/L

-对氨基苯甲酸200μg/L

-吡哆醇(盐酸盐)400μg/L

-核黄素200μg/L

-硫胺(盐酸盐)400μg/L

-硼酸500μg/L

-硫酸铜40μg/L

-碘化钾100μg/L

-氯化铁200μg/L

-硫酸镁400μg/L

-钼酸钠200μg/L

-硫酸锌400μg/L

-磷酸二氢钾1g/L

-硫酸镁500mg/L

-氯化钠100mg/L

-氯化钙100mg/L

最终pH＝5.4

硫酸铵(5g/L)

图4显示了在两种类型的培养基上获得的结果。

在两种培养基中生长6天后，对菌落计数。观察到YNB-Ara培养基中的菌落数约为YPG+杀稻瘟素培养基上观察到的菌落数的18％。换句话说，只有18％的在其基因组中整合了基因araA、B和D的菌落似乎能够通过使用阿拉伯糖作为唯一碳源来生长。

从上述内容可以清楚地看出：

-编码基因araA、B和D的盒是必要的，但不足以获得表型[ara+]；

-在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上直接选择转化子是可能的，并且与Wisselink等人(2007；Appl Environ Microbiol 73,4881-4891)的学说相反，这揭示了在半乳糖的存在下在先生长步骤不是必要的。

为了继续，盒已被进一步简化并且去掉了任何选择标记，特别是对抗生素的抗性。

然后以深孔形式(＝具有96孔的微孔板)测试在YNB-Ara培养基上生长的1156个转化子，以确认它们在阿拉伯糖上厌氧生长的能力，并验证它们发酵木糖和葡萄糖的能力的维持。

用于此效果的培养基的组成详述如下：

YF培养基＝

-酵母提取物(EXL)5g/L；

-磷酸二铵4.7g/L；

-柠檬酸11.4g/L；

-柠檬酸三钠13.5g/L；

-ZnSO₄ 21.2mg/L；

-MgSO₄ 7H₂O 1g/L；

-硫胺素18.24mg/L；

-吡哆醇5.28mg/L；

-生物素1.76g/L；

-泛酸3.8mg/L；

-烟酸20mg/L；

-肌醇50mg/L；

-核黄素1mg/L；

-对氨基苯甲酸盐1.2mg/L；

-吐温80，1g/L。

YF-ara培养基：含有70g/L阿拉伯糖的YF培养基

YF-木糖培养基：含有70g/L木糖的YF培养基

培养基的pH保持在5。培养在32℃下进行。

图5说明了由一系列菌株获得的结果，这些菌株在含有阿拉伯糖(A)或木糖(B)作为唯一碳源的培养基上同时生长，后一培养基可以选择保留了它们的代谢木糖能力的菌株。

图5中显示的结果显示选择菌株[ara+]的方法仍然得到改善：图5A显示所测试的91个克隆中的15个似乎不能使用阿拉伯糖再次开始繁殖。这表明，与基于对抗生素的抗性进行的选择相反，在YNB-Ara上的选择可以获得85％的获得表型[ara+]的转化子。

从图5中显示的结果中得出的另一个方面涉及木糖和阿拉伯糖两种代谢途径的共栖。因此，显然某些菌株已获得表型[ara+]而损害表型[xyl+]。另一方面，其他菌株在葡萄糖上继代培养后未保留表型[ara+](结果未示出)。然而，在所测试的91种菌株中有67种似乎已经获得并保留了双表型[ara+；xyl+]，这几乎是转化子的3/4。

4.两种选择的菌株的比较：

-在YFCF培养基上发酵：

在pH 5的YFCF培养基中发酵的过程中比较如上所述的2个分离的克隆(分别称为克隆13和126)的性能，所述培养基包含葡萄糖作为碳源，还有等量存在的(équi-représentés)阿拉伯糖和木糖，以及乙酸，从而接近天然培养基。

更具体地，YFCF培养基的组成如下：

-10g/L酵母提取物；

-10g/L的细菌蛋白胨；

-63g/L葡萄糖；

-28g/L木糖；

-28g/L阿拉伯糖；

-4g/L乙酸(在pH5的培养基中加入的量)。

发酵条件如下：

-pH：5

-温度：32℃

-O₂条件：无氧气供应

-搅拌：100rpm

-培养持续时间：最长72小时

-预培养/孵育：0.25g/kg eq DM酵母在YPG培养基中预先饱和繁殖24小时以上。

通过测量发酵烧瓶的质量损失来间接测量乙醇产量，所述质量损失与CO₂的产生直接相关，其与醇的产生是化学计量相关的。它以克/千克培养基表示。

通过HPLC跟进培养基中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘油的浓度。

通过在105℃下4小时后测量残留的干物质来评估生物质变化。

图6所示的结果揭示：

-与克隆126相比，克隆13的木糖消耗速度降低，这也与较低的乙醇产生速度相匹配；

-值得注意的是，克隆13中阿拉伯糖的消耗速度比克隆126慢。因此，在发酵32小时后，克隆13消耗12.1+/-0.6g/kg阿拉伯糖，而克隆126消耗15.3+/-0.5g/kg。

还值得注意的是，戊糖被消耗，而细胞外葡萄糖浓度不为零。

试图解释在克隆13和126之间观察到的差异，特别是阿拉伯糖发酵速率。

该途径活性的分析：

测试了参与阿拉伯糖和木糖的代谢途径的细胞内的酶的活性。

首先，在木糖醇脱氢酶活性水平上未观察到显著差异(结果未示出)。

另一方面，在克隆13和126之间观察到了不同的阿拉伯糖异构酶活性(由araA编码)谱，对克隆13具有更显著的竞争性抑制(结果未示出)。

如图7所示，这种差异可能与醛糖还原水平的差异，更确切地说是两种克隆的醛糖还原酶活性的差异相关。注意，在初始菌株I-4953中，编码酿酒酵母中主要醛糖还原酶的基因GRE3被删除，但仍然存在残留活性(参见图7)。

细胞提取物中醛糖还原酶活性的剂量：

菌株的繁殖

将待测菌株置于丰富培养基(YPG)中生长。需要在搅拌下在30℃下连续两个24小时的繁殖阶段以获得足够的生物质。收获生物质后，通过在105℃的烘箱中4小时，测量1ml的每种乳膏上的干物质。发酵在含有100g YF-木糖发酵培养基的250ml烧瓶中进行。以0.5g/kg当量干物质的速率接种每个烧瓶。发酵在32℃下在110rpm搅拌下进行3天。在该阶段，收集50ml发酵产物，然后用于确定样品的不同的酶活性和蛋白质浓度。

制备细胞提取物

通过离心(4700rpm，2min，4℃)收集50ml发酵产物，然后在3ml 0.1M，pH7的磷酸钾缓冲液中重悬。再次离心后，将每个沉淀在1ml 0.1M，pH7的磷酸钾缓冲液中重悬。

然后将1ml重悬的沉淀物转移到用于快速制备的1管(先用250μl球填充)中，然后在4℃下压碎：4×30秒(6m/s)，每次间隔30秒。接下来，将匀浆离心3分钟至10000rpm(以使球与细胞碎片一起翻滚)，并将全部上清液转移至在冰上冷却的Eppendorf管中。

酶活性的剂量

酶活性的剂量通过监测340nm处的吸光度来完成。测量在32℃的恒温控制环境中进行。

1分钟后加入底物。

图7中显示的结果显示与亲本菌株I-4953相比，克隆13和126中醛糖还原酶活性的急剧下降。然而，应注意，该活性在克隆13中比在克隆126中高两倍。该观察结果似乎能够解释克隆13与克隆126相比不佳的性能。为了证实该结果与木糖和/或阿拉伯糖的发酵性能，尝试增加克隆126中的醛糖还原酶活性。

重新引入编码醛糖还原酶的基因对细胞代谢阿拉伯糖的能力的影响：

克隆126和13之间在发酵木糖和阿拉伯糖的能力以及将它们分别还原成木糖醇和阿拉伯糖醇的能力方面存在两个主要差异。因为这两种表型看起来是反相关的，因此试图在克隆126的细胞中加强这种活性。

在这个意义上，重新引入了编码酿酒酵母上的主要醛糖还原酶的GRE3基因(Garay-Arroyo和Covarrubias，1999，Yeast 15,879-892；等人，2001Appl.Environ.Microbiol.67,5668-5674)。在实践中，在克隆126的基因组中的GRE3的天然基因座水平上整合了依赖ADH1基因的启动子的GRE3基因的拷贝。

为了验证基因在正确基因座的良好整合，将以下引物用于PRC反应：

-B6C2(CCTATTGCTGTTTCCTCTTCAAAGTAC；SEQ ID NO：7)，在选择标记的终止子中杂交；

-B13B1(T8)，AGTTGTCAGTGCAATCCTTC；(SEQ ID NO：8)，与GRE3基因终止子区域互补。

在验证所选转化子的基因组中的盒的整合(结果未示出)后，测试了它们在厌氧条件下使用阿拉伯糖作为唯一碳源的能力。在这个意义上，转化子和克隆126均以2g(eq MS)/kg的量接种在YF-Ara培养基中。

发酵48小时后的质量损失如图8所示。这些结果表明，所有整合了GRE3基因的克隆均具有比克隆126弱的发酵阿拉伯糖的能力。因此，该结果支持这样的假设：过强的醛糖还原酶活性限制了细胞发酵阿拉伯糖的能力。

结论：

将阿拉伯糖发酵途径，即基因araA(地衣芽孢杆菌)/araB(大肠杆菌)/araD(大肠杆菌)在酿酒酵母菌株I-4953的基因座HO水平上整合，随后在含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基上进行筛选，可以选择能够发酵阿拉伯糖的菌株。此外，已经表明，在这些菌株中，最有利的是那些表现出低醛糖还原酶活性的菌株。在这一背景下，分离出了一种特别受关注的菌株，即菌株EG31，并已于2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale deCultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724ParisCedex 15)以编号CNCM I-5085注册。

II/获得对阿拉伯糖和木糖的发酵优化的酿酒酵母菌株：

1.通过定向进化选择能够发酵阿拉伯糖和木糖的菌株：

为了选择仍然对戊糖特别是阿拉伯糖发酵优化的菌株，将菌株EG31分批进行定向进化。

因此，完善了定向进化的方案，使得获得所寻求的表型成为可能。为此，已经定义并实施了一种培养基，在该培养基种仅消耗两种糖中的一种的酵母将是不利的。在实践中，在名为“GO木糖阿拉伯糖”并且在下面定义的第一种培养基中，限制的不是氮源，而是碳源。在实践中，该培养基含有10g/L的(NH₄)₂PO₄，但仅含有4g/L的木糖和5g/L的阿拉伯糖。

培养基1：GO木糖阿拉伯糖(pH 5)：

-木糖4g/L

-阿拉伯糖5g/L

-(NH₄)₂HPO₄(DAP)10g/L

-柠檬酸11.4g/L

-柠檬酸三钠13.5g/L

-ZnSO₄(0.004g/L)

-MgSO₄ 0.5g/L

-KH₂PO₄ 1g/L

-NaCl 0.1g/L

-CaCl₂ 0.1g/L

-CuSO₄ 0.00006g/L

-H₃BO₃ 0.0005g/L

-KI 0.0001g/L

-MnSO₄ 0.0004g/L

-Na₂MoO₄ 0.0002g/L

-FeCl₃ 0.0002g/L

-吡哆醇0.002g/L

-生物素0.0008g/L

-泛酸(0.002g/L)

-烟酸0.001g/L

-肌醇0.001g/L

-吐温80，1g/L

培养在32℃100rpm搅拌下在用盖子塞住的烧瓶中进行，盖子用于减少培养基中的氧气供应并允许整个培养中产生的CO₂在过大压力下逸出。在这些条件下，培养持续约七天。

2.选择在乙酸存在下保留其发酵葡萄糖和/或木糖的能力的菌株

为了预测对抑制剂特别是对非解离形式的乙酸耐受性丧失的风险的可能性，将两个连续培养分批引入定向进化循环中，引入含有葡萄糖或木糖作为唯一碳源的培养基中，并且在两种情况下均有强浓度的乙酸存在。

培养基2：YF-葡萄糖酸：

YF-葡萄糖酸培养基对应于上述YF培养基，其含有150g/L葡萄糖并且乙酸浓度(引入到pH4.4的培养基中的量)等于5g/L的。

培养基3：YF-木糖酸：

YF-木糖酸培养基对应于上述YF-木糖培养基，其中乙酸浓度(引入到pH5的培养基中的量)等于4g/L。

培养条件：

3.消除“小菌落”：

为了避免选择与工业生产过程不相容的丧失线粒体的菌株，还添加了在含有甘油作为唯一碳源的培养基上培养的步骤。该步骤需要存在用于将功能性电子转移到细胞中的链，从而它们可以繁殖。

培养基4：YNB甘油：

-3.4g/L氮基础酵母；

-5g/L硫酸铵；

-10g/L的甘油作为唯一的碳源。

培养在30℃下以150rpm搅拌在带有多孔盖的带挡板的烧瓶中进行，所述多孔盖允许向培养基中供应氧气。在这些条件下，培养持续24至48小时。

在实践中，定向进化循环的特征在于：

-在GO木糖阿拉伯糖培养基上培养；然后

-在YF葡萄糖酸培养基上培养；然后

-在YF木糖酸培养基上培养；然后

-在YNB甘油培养基上培养。

4.对如此获得的克隆进行评估：

在实践中，进行了两个培养循环。

在该定向进化结束时，将克隆在完全培养基的培养皿上个体化，并且在YFCF培养基上评估所获得的克隆的性能，所述培养基的组成如上所述。图9A显示了获得的6个较好的克隆的乙醇产量随发酵时间的变化。

这些结果表明，6个克隆中有5个具有接近EG31菌株的动力学，但最终的酒精滴度大于EG31菌株的最终酒精滴度。注意到最后一个克隆C7在6碳糖代谢到5碳糖代谢的转变过程中似乎更快。随后，发酵动力学似乎与其他克隆的动力学相同。在发酵结束时，似乎该菌株的酒精强度比在其他克隆的实施期间更大。

为了证实这种改善实际上与更好的阿拉伯糖消耗有关，通过HPLC进行剂量以量化剩余的糖。图9B表示发酵160小时后发酵培养基中阿拉伯糖的浓度。结果证实，选自定向进化的所有克隆均比EG31菌株消耗更多的阿拉伯糖，注意到克隆C7似乎更有效。该克隆更名为菌株EG32，于2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Cultures deMicroorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex 15)以编号CNCM I-5086注册。

序列表

<110> 乐斯福公司

<120> 获得用于代谢阿拉伯糖的高效酵母菌株

<130> L220-B-49632 PCT

<150> FR1750550

<151> 2017-01-24

<160> 8

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araA-v-f-1 "

<220>

<223> araA-v-f-1

<400> 1

atgattcaag ctaagaccc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araA-v-r-1 "

<220>

<223> araA-v-r-1

<400> 2

atgtcaatct tgtcccatgg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araB-v-f-1 "

<220>

<223> araB-v-f-1

<400> 3

atggctattg ctattggttt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araB-v-r-2 "

<220>

<223> araB-v-r-2

<400> 4

ccacaaaacg aacatagcgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araD-v-f-1 "

<220>

<223> araD-v-f-1

<400> 5

atgttggaag acttgaagag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "araD-v-r-1 "

<220>

<223> araD-v-r-1

<400> 6

tagaagtagt cagcgtgggt 20

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "B6C2"

<220>

<223> B6C2

<400> 7

cctattgctg tttcctcttc aaagtac 27

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> "B13B1"

<220>

<223> B13B1

<400> 8

tagttgtcag tgcaatcctt c 21

PCT/RO/134表

Claims

1.一种用于获得和选择能够代谢阿拉伯糖的酵母菌株的方法，其包括：

-在酵母菌株中染色体整合araA、araB和araD基因，有利地，地衣芽孢杆菌的araA、大肠杆菌的araB和araD；

-将转化的菌株置于含有阿拉伯糖作为唯一碳源的培养基中直接培养，以选择能够代谢所述阿拉伯糖的菌株；

-任选地选择醛糖还原酶活性小于或等于0.002U/g蛋白质，或甚至小于或等于0.0005U/g蛋白质的已代谢阿拉伯糖的转化菌株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所用的酵母菌株选自酵母属、裂殖酵母属、毕赤酵母属、耶氏酵母属、红发夫酵母属、克鲁维酵母属、假丝酵母属、篮状菌属、酒香酵母属、管囊酵母属、汉逊酵母属、克勒克酵母属、许旺酵母属和德巴利酵母属菌株，有利地，酿酒酵母菌株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的酵母菌株，有利地，于2015年1月29日在CNCM以编号I-4953登记的菌株，能够在非离解形式的有机酸例如乙酸存在下发酵木糖，。

4.一种使用权利要求1至3之一所述的方法得到的酵母菌株，其特征在于，它进一步呈现小于或等于0.002U/g蛋白质，或甚至小于或等于0.0005U/g蛋白质的醛糖还原酶活性。

5.根据权利要求4所述的酵母菌株，其特征在于，它是菌株I-5085，于2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex15)注册。

6.一种用于获得和选择在非离解形式的有机酸如乙酸的存在下具有改进的发酵阿拉伯糖、葡萄糖和木糖的能力的酵母菌株的方法，其中在下列条件下连续培养呈现这种能力的酵母菌株，有利地，根据权利要求4和5之一所述的菌株：

-在含有有限浓度，有利地，其量分别为5g/L和4g/L，的阿拉伯糖和木糖作为唯一碳源以生产生物质的培养基中进行厌氧或低氧培养；然后-在非离解形式的有机酸，有利地，乙酸，的存在下进行两次连续的厌氧或低氧培养，一次在含有葡萄糖作为唯一碳源的培养基中，另一次在含有木糖作为唯一碳源的培养基中；

-在基础培养基中进行可能的需氧培养，所述基础培养基含有严格呼吸碳源，有利地，甘油，作为唯一碳源。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在多种培养基中的菌株的连续培养重复至少2次。

8.一种能够用根据权利要求6至7之一所述的方法获得的酵母菌株，其特征在于，其是2016年5月19日在CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15)注册的菌株I-5086。

9.根据权利要求4至5和8之一所述的酵母菌株，其特征在于，它具有HAA1基因的至少一个额外拷贝，有利地，该拷贝在GRE3基因的水平上插入。

10.一种通过根据权利要求4至5和8至9之一所述的菌株培养获得的酵母。

11.权利要求4至5和8至9之一所述的菌株或根据权利要求10所述的酵母用于材料发酵和/或用于乙醇生产的用途，有利地，所述材料含有阿拉伯糖和/或木糖。

12.一种用于生产发酵产物或乙醇的方法，其包括以下步骤：

-将含有阿拉伯糖和/或木糖的材料或培养基与根据权利要求4至5或8至9之一所述的菌株或根据权利要求10所述的酵母一起培养；

-在厌氧或半厌氧条件下发酵；

-回收一种或多种发酵产物，或乙醇。

13.根据权利要求12所述的用于生产发酵产物或乙醇的方法，其特征在于，所述材料或培养基还含有葡萄糖。

14.根据权利要求12或13所述的用于生产发酵产物或乙醇的方法，其特征在于，所述材料或培养基是半纤维素或“玉米纤维”。