PT1282686E - Levedura recombinante para matérias-primas de lignocelulose - Google Patents
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Description
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DESCRIÇÃO "LEVEDURA RECOMBINANTE PARA MATÉRIAS-PRIMAS DE LIGNOCELULOSE"
ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um método para obter levedura para fermentação de matérias-primas de lignocelulose e a uma levedura recombinante para a fermentação de matérias-primas de lignocelulose.
CONTEXTO DA INVENÇÃO E DESCRIÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR A lignocelulose é o componente maioritário de resíduos de produtos florestais e desperdícios agrícolas. As matérias-primas lignocelulósicas são maioritariamente compostas por celulose, hemicelulose e lignina. A fracção de celulose é constituída por polímeros de glucose, ao passo que a fracção de hemicelulose é constituída por uma mistura de polímeros de glucose, galactose, manose, xilose e arabinose. A fracção de lignina é um polímero de compostos fenólicos. A xilose encontra-se em hemiceluloses de madeira dura e madeira branda, ao passo que a arabinose é um componente da hemicelulose em certas colheitas agrícolas, como milho.
As fracções de celulose e hemicelulose podem ser hidrolisadas em açúcares monoméricos, que podem ser fermentados em etanol. 0 etanol pode servir como combustível líquido ambientalmente aceitável para transporte, uma vez que o dióxido de carbono libertado nos processos de fermentação e combustão será absorvido por plantas em crescimento em florestas e campos. 2 0 custo do etanol derivado de lignocelulose foi estimado por Von Sivers, M., G. Zacchi, L. Olsson e B. Hahn-Hãgerdal, 1994, "Cost analysis of ethanol production from willow using recombinant Escherichia coli", Biotechnol. Prog. 10: 555-560. Os seus cálculos basearam-se na fermentação de todos os açúcares hexose (glucose, galactose e manose) em etanol, e estimaram que a fermentação de açúcares pentose (xilose e arabinose) em etanol poderia reduzir o custo do etanol em aproximadamente 25%. Em consequência, a conversão microbiana de hexoses e pentoses derivadas de lignocelulose seria não só ambientalmente aceitável mas também poderia ser economicamente vantajosa.
Além disso, a libertação de açúcares monoméricos de matérias-primas lignocelulósicas também liberta produtos secundários, como ácidos fracos, furanos e compostos fenólicos, que inibem o processo de fermentação. A levedura de Padeiro habitualmente utilizada, Saccharomyces cerevisiae, é o único microrganismo produtor de etanol que consegue fermentar eficientemente hidrolisados de lignocelulose cuja toxicidade não foi eliminada (Oisson e Hahn-Hãgerdal, "Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production", Enzyme Microbial Technol. 18_: 312-331, 1996). Em particular, estirpes de Saccharomyces cerevisiae que fermentam eficientemente foram isoladas da instalação de fermentação de uma fábrica de pasta celulósica e papel (Lindén et al., "Isolation and characterization of acetic acid-tolerant galactose-fermenting strains of Saccharomyces cerevisiae from a spent sulfite liquor fermentation plant", Appl. Environ. Microbiol. 58: 1661-1669, 1992). 3 A levedura Saccharomyces cerevisiae fermenta os açúcares hexose glucose, galactose e manose para dar origem a etanol, mas é incapaz de fermentar os açúcares pentose xilose e arabinose devido à ausência de um ou mais passos enzimáticos. A levedura Saccharomyces cerevisiae consegue fermentar xilulose, um produto da isomerização da xilose, em etanol (Wang et al., "Fermentation of a pentose by yeasts", Biochem. Biophys. Res. Commun. _94: 248-254, 1980; Chiang et al., "D-Xylulose fermentation to ethanol by Saccharomyces cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol. 42: 284-289, 1981; Senac e Hahn-Hágerdal, "Intermediary metabolite concentrations in xylulose- and glucose-fermenting Saccharomyces cerevisiae cells", Appl. Environ. Microbiol. 56: 120-126, 1990).
Em células eucarióticas, o metabolismo inicial da xilose é catalisado por uma xilose redutase (XR), que reduz xilose em xilitol, e uma xilitol desidrogenase (XDH), que oxida xilitol em xilulose. A xilulose é fosforilada em xilulose 5-fosfato por uma xilulose quinase (XK) e é suplementarmente metabolizada pela via de pentose fosfato e glicólise em etanol. A levedura Saccharomyces cerevisiae foi geneticamente manipulada para metabolizar e fermentar xilose. Os genes para XR e XDH da levedura que fermenta xilose Pichia stipitis foram expressos em Saccharomyces cerevisiae (Patente Europeia atribuída a C. Hollenberg, 1991; Hallborn et al., "Recombinant yeasts containing the DNA sequences coding for xylose reductase and xylitol dehydrogenase enzymes", WO 91/15588; Kõtter e Ciriacy, "Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae", Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783, 1993). Os transformantes 4 metabolizam xilose mas não fermentam o açúcar pentose em etanol. 0 gene para a xilulose quinase (XK) de Saccharomyces cerevisiae foi clonado e super-expresso em transformantes de Saccharomyces cerevisiae que expressam XR-XDH (Deng e Ho, "Xylulokinase activity in various yeasts including Saccharomyces cerevisiae containing the cloned xylulokinase gene", Appl. Biochem. Biotechnol. 24/25: 193-199, 1990/ Ho e Tsao, "Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose", WO 95/13362, 1995; Moniruzzarnan et al., "Fermentation of corn fibre sugars by an engineered xylose utilizing a Saccharomyces strain", World J. Microbiol. Biotechnol. 13: 341-346, 1997). Foi mostrado que estas estirpes produzem quantidades liquidas de etanol em fermentações de misturas de xilose e glucose. Utilizando o bem estabelecido protocolo de integração ribossómica, os genes foram cromossomicamente integrados para gerar estirpes que podem ser utilizadas em meios complexos sem pressão de selecção (Ho e Chen, "Stable recombinant yeasts for fermenting xylose to ethanol", WO 97/42307; Toon et al., "Enhanced cofermentation of glucose and xylose by recombinant Saccharomyces yeast strains in batch and continuous operating modes", Appl. Biochem. Biotechnol. 63/65: 243-255, 1997) .
Apesar de se terem feito grandes progressos, ainda são necessários na área um método e uma ferramenta para fermentar eficientemente hidrolisados de lignocelulose para produzir etanol.
RESUMO DA INVENÇÃO 5
De acordo com a invenção, um método para obter uma levedura recombinante, que fermenta matérias-primas de lignocelulose em etanol, inclui introduzir DNA numa levedura de modo que a levedura tenha genes introduzidos que codificam xilose redutase, xilitol desidrogenase e xiluloquinase.
Em particular, a invenção refere-se a um método para obter uma levedura mutada recombinante de Saccharomyces cerevisiae, que fermenta matérias-primas de lignocelulose em etanol, que inclui introduzir DNA numa levedura de modo que a levedura tenha genes introduzidos que codificam xilose redutase obtidos de Pichia stipitis, xilitol desidrogenase obtidos de Pichia stipitis e xiluloquinase obtidos de Saccharomyces cerevisiae, e efectuar uma mutação da estirpe obtida desta forma de modo a dar origem a uma estirpe mutante que cresce em nutriente mínimo contendo xilose como única fonte de carbono.
Numa especificação preferida, a estirpe de Saccharomyces cerevisiae é S. cerevisiae USM21.
Numa especificação preferida, a estirpe de S. cerevisiae USM21 foi depositada como CBS 102678.
Numa especificação preferida, o método inclui proporcionar mutante adequados por tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS).
Numa especificação preferida, o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado cuja toxicidade não foi eliminada.
Numa especificação preferida, o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado cuja toxicidade foi eliminada. 6
Numa especificação preferida, o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado derivado de madeira branda.
Numa especificação preferida, o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado derivado de madeira dura.
Outro aspecto da invenção refere-se a uma levedura mutada recombinante de Saccharomyces cerevisiae gue contém genes introduzidos que codificam xilose redutase obtidos de Pichia stipitis, xilitol desidrogenase obtidos de Pichia stipitis e xiluloquinase obtidos de Saccharomyces cerevisiae e que é capaz de crescer em nutriente mínimo contendo xilose como única fonte de carbono.
Numa especificação preferida, S. cerevisiae foi depositada com o número de depósito CBS 102678.
Numa especificação preferida, inclui mutantes produzidos por tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS).
Numa especificação preferida, o mutante exibe uma velocidade de crescimento relativamente à sua estirpe básica superior a 30%.
Numa especificação preferida, o mutante está depositado com o número de depósito CBS 102679.
Numa especificação preferida, o mutante está depositado com o número de depósito CBS 102680.
DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS A presente invenção será agora descrita por intermédio de exemplos com referência às figuras adjuntas, nas quais se mostra o seguinte. A FIGURA 1 é uma apresentação esquemática da presente invenção que indica o mapa físico do vector de expressão 7
Yip2B6 que contém os genes XYL1 e XYL2 de Pichia stipitis que codificam XR e XDH, e o gene XK de Saccharomyces cerevisiae que codifica XK. PGKp = promotor de PGK; PGKt = terminador de PGK. A FIGURA 2 é uma apresentação gráfica da presente invenção que indica o crescimento exibido por dois mutantes independentes que fermentam xilose (XYL125 , XYL145 X) e a estirpe de referência (XYLUSM21 λ) em SCX.
DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DAS FIGURAS
De acordo com a invenção, é proporcionado um método para originar um microrganismo com capacidade para fermentar eficientemente matérias-primas de lignocelulose com a finalidade de produzir etanol. 0 método inclui os passos seguintes: • transformar o microrganismo com uma sequência de nucleótidos que compreende genes que codificam certas enzimas que degradam xilose, e • um promotor para promover a transcrição destes genes no microrganismo transformado e produção destas enzimas.
Se for necessário para efectuar a síntese e secreção destas enzimas pelo microrganismo, as sequências de nucleótidos também podem incluir sequências líder adequadas para estes genes. O microrganismo é uma estirpe de levedura e o método dota a estirpe de levedura da capacidade de produzir pelo menos uma das seguintes enzimas que usam lignocelulose: 8 • xilose redutase (XR); • xilitol desidrogenase (XD), e • xiluloquinase (XK). A invenção também inclui um método para fermentar matérias-primas lignocelulósicas com um microrganismo que foi transformado num microrganismo que usa xilose, por introdução no microrganismo de: • DNA que compreende genes que codificam enzimas que usam xilose, e • um promotor para promover a transcrição destes genes no microrganismo e produção destas enzimas. 0 DNA recombinante para utilização na transformação de um microrganismo de modo a dotá-lo da capacidade para fermentar matérias-primas de lignocelulose, cujo DNA compreende: • genes que codificam enzimas que usam xilose, e • um promotor para promover a transcrição destes genes no microrganismo transformado e produção destas enzimas.
Os genes da xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XD) e xiluloquinase (XK) que codificam as enzimas que usam xilose podem ser obtidos dos seguintes microrganismos: • Pichia stipitis (para genes XR e XD) • Saccharomyces cerevisiae (para gene XK). 0 método para originar um microrganismo também abrange o isolamento de mutantes com base na sua capacidade para 9 crescer rapidamente em xilose e a caracterização de estirpes seleccionadas, cujo método compreende tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS).
Os mutantes são XYL125 e XYL145 e podem usar xilose eficazmente na ausência de outras fontes de carbono.
Será apreciado que é bem conhecido que as leveduras recombinantes, mutantes, moléculas de DNA e vectores compreendendo genes de xilose redutase (XR), xilitol desidrogenase (XD) e xiluloquinase (XK) que a presente invenção proporciona ocorrem numa grande variedade de microrganismos e que numerosos genes XR, XD e XK foram, de facto, identificados e isolados. A fonte particular destes genes não é critica para os aspectos latos desta invenção, desde que as enzimas tenham actividade de XR, XD e XK ocorrente. Além disso, estes genes podem ser obtidos como genes XR, XD e XK de ocorrência natural, ou podem ser modificados, ou ser sintetizados por quaisquer técnicas conhecidas na área actual. A presente invenção também proporciona um ou mais promotores e/ou sequências lider para promover a transcrição dos genes e produção das enzimas.
Um vector de expressão preferido compreende os genes xilose redutase e xilitol desidrogenase de Pichia stipitis e um gene xiluloquinase de Saccharomyces cerevisiae (juntamente com promotores adequados e, possivelmente, sequências lider), os quais, quando transformados em Saccharomyces cerevisiae, lhe permitirão usar xilose. 10
Fizeram-se depósitos legais, seguindo as regulamentações do Tratado de Budapeste, da estirpe transgénica de Saccharomyces cerevisiae (XYLUSM21), bem como dos dois mutantes (XYLUSM125, XYLUSM145), no
Centraalbureau voor Scimmelcultures (CBS) Baarn $ Delft, Paises Baixos. Os depósitos foram feitos em 1 de Maio, 2000, com os números de depósito CBS 102678 (XYLUSM21), CBS 102679 (XYLUSM125) e CBS 102680 (XYLUSM145), respectivamente.
Especificações preferidas do presente método inventivo serão agora ilustradas por intermédio dos seguintes exemplos não limitativos. EXEMPLO 1
Construção da estirpe transgénica de Saccharomyces cerevisiae (XYLUSM21)
Construiram-se transformantes de Saccharomyces cerevisiae (USM21) com os genes xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH) da levedura que usa xilose Pichia stipitis e o gene xiluloquinase (XK) de Saccharomyces cerevisiae. Os três genes foram colocados sob o controlo das sequências promotora-terminadora de PGK. Células competentes de USM21 foram transformadas com o fragmento Pstl linear de Ylp2B6, como mostrado substancialmente na Figura 1, de modo a integrar uma única cópia no locus HIS3 por cruzamento simples. As células transformadas foram plaqueadas em meio YPX.
Os transformantes que usam xilose apareceram em 4 dias a 28°C. Verificou-se a integração correcta por análise "Southern" e reteve-se um transformante (estirpe XYLUSM21). 11
Mutagénese
Procedeu-se ao tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS) de acordo com Ausubel et al. ("Current protocols in molecular biology", 2o Volume, Capítulo 13, Ia edição, John Wiley & Sons, Inc., 1998, Massachusetts).
Tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS) para obter dois mutantes (XYL125, XYL145) A estirpe transgénica de Saccharomyces cerevisiae (XYLUSM21) foi tratada com metanossulfonato de etilo (EMS) para se obter uma taxa de sobrevivência de 20%, 30%, 40% e 50%. As células tratadas foram lavadas uma vez com tiossulfato de sódio 5% e foram incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente; em seguida, as células foram novamente suspensas em água destilada esterilizada. Todas as células foram transferidas em conjunto no mesmo instante para 50 mL de meio YPD complementado com ampicilina (todas numa cultura líquida de 50 mL de meio YPD) e foram incubadas durante 24 horas a 22°C. A cultura (XYLUSM21) foi transferida 8 vezes para meio YPX fresco com ampicilina em intervalos de 24 horas e a fermentação de xilose pelas células foi monitorizada em tubos Durham de meio YPX em cada intervalo de 24 horas. As amostras de 2 mL que foram recolhidas da cultura de 24 em 24 horas foram plaqueadas em placas de YPX suplementadas com ampicilina e, em seguida, salvaram-se as colónias que exibiram uma maior velocidade de crescimento.
Dos resultados do primeiro passo de rastreio seleccionaram-se dois mutantes (XYLUSM125, XYLUSM145) com uma velocidade de crescimento maior do que a da estirpe de referência (XYLUSM21) em meio YPX suplementado com ampicilina e examinou-se o seu crescimento. Para culturas 12 em balões com agitação, os organismos cresceram previamente em balões com agitação de 50 mL, que continham 10 mL de meio YPD, e foram incubados num agitador rotativo a 150 rpm e 30°C durante 16 horas. Utilizaram-se estas culturas para inocular balões Erlenmeyer de 500 mL que continham 50 mL de meio SCX com ampicilina. As culturas foram incubadas num agitador rotativo a 150 rpm e 30°C.
Os mutantes XYLUSM125 e XYLUSM145 exibiram uma velocidade de crescimento 100% e 75% mais elevada, respectivamente, do que a da estirpe transgénica de Saccharomyces cerevisiae (XYLUSM21), como mostrado na Figura 2. Estes mutantes podem usar eficazmente xilose na ausência de outras fontes de carbono. EXEMPLO 2
Estirpe e Meio de cultura
Empregou-se a estirpe de Saccharomyces cerevisiae do vinho USM21 (Kil+ Gal+) (van der Westhuizen e Pretorius, "The value of electrophoretic fingerprinting and karyotyping in wine yeast breeding programmes", Antoine van Leeuwenhoek _61: 249-257, 1992; ZA 91/9818) como receptor para experiências de transformação. As estirpes de levedura cresceram em meio complexo que consistiu em extracto de levedura 1%, peptona 2%, glucose 2% (YPD) ou xilose 2% (YPX). Para desenhar as curvas de crescimento, as estirpes cresceram em meio completo sintético (SCX) que continha base de azoto de levedura Difco 0,67% sem aminoácidos suplementada com xilose 2% como única fonte de carbono. Todos os meios foram complementados com ampicilina a uma concentração de 100 μg/mL, para prevenir contaminação bacteriana. 13 EXEMPLO 3
Transformação
Saccharomyces cerevisiae foi efectuada de acordo com Gietz et ai. ("Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure", Yeast 11: 355-360, 1995) . EXEMPLO 4
Técnicas de DNA
Preparou-se DNA plasmidico de Escherichia coli utilizando o método CTAB (Del Sal et ai., "A one-tube plasmid DNA mini-preparation suitable for sequencing", Nucleic Acids Res. 1_6: 9878, 1988). As técnicas comuns de DNA recombinante foram realizadas essencialmente como descrito em Sambrook et ai. ("Molecular cloning: a laboratory manual", 2a edição, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, 1989, N.I.). EXEMPLO 5
Fermentação A fermentação foi realizada num hidrolisado de abeto que continha. Desse modo, XYLUSM125 cresceu em 20 g/L de xilose em meio mínimo [Verduyn, C., E. Postma, W. A. Scheffers e J. P. Van Dijken, 1992, "Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation", Yeast 8_: 501-507] e estabeleceu XYLUSM125 numa cultura contínua em 20 g/L de xilose utilizando uma taxa de diluição D = 0,1 hora’1 (nota, fermentação aeróbica, adição de oxigénio). A velocidade de crescimento 14 obtida em xilose como única fonte de carbono foi Umax = 0,14 - 0,15 hora-1 e a biomassa originou 0,4 g.g-1; assim, cerca de 8 g/L de biomassa em 20 g/L de xilose como fonte de carbono. Quando o nutriente foi alterado para 20 g/L de xilose mais 20 g/L de glucose, a biomassa aumentou para 18 g/L e o resultado surpreendente foi que apenas restaram 4 -5 g/L de xilose. Isto indica que XYLUSM125 usa simultaneamente 20 g/L de glucose mais 15 - 16 g/L de xilose numa fermentação continua a D = 0,1 hora-1.
Repetiu-se a experiência, mas agora introduziram-se primeiramente 20 g/L de glucose para estabelecer um estado estacionário em fermentação continua, toda a glucose foi utilizada com um rendimento de biomassa de cerca de 6 g/L. Quando o nutriente foi alterado para 20 g/L de glucose mais 20 g/L de xilose, o rendimento da biomassa aumentou para cerca de 14 g/L com toda a glucose utilizada e cerca de 10 - 12 g/L de xilose utilizada (assim, restaram cerca de 8 -10 g/L de xilose).
Lisboa, 22 de Outubro de 2007
Claims (12)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para obter uma levedura mutada recombinante de Saccharomyces cerevisiae, que fermenta matérias-primas de lignocelulose em etanol, que inclui introduzir DNA numa levedura de modo que a levedura tenha genes introduzidos que codificam xilose redutase obtidos de Pichia stipitis, xilitol desidrogenase obtidos de Pichia stipitis e xiluloquinase obtidos de Saccharomyces cerevisiae, e efectuar uma mutação da estirpe obtida desta forma de modo a dar origem a uma estirpe mutante que cresce em nutriente mínimo contendo xilose como única fonte de carbono.
2. Método como reivindicado na Reivindicação 1, em que a estirpe de S. cerevisiae foi depositada com o número de depósito CBS 102678.
3. Método como reivindicado na Reivindicação 1, que inclui proporcionar mutantes adequados por tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS).
4 . Método como reivindicado em uma ou mais das reivindicações precedentes, em que o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado cuja toxicidade não foi eliminada.
5. Método como reivindicado em uma ou mais das Reivindicações precedentes 1 - 3, em que o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado cuja toxicidade foi eliminada.
6. Método como reivindicado em uma ou mais das reivindicações precedentes, em que o hidrolisado 2 lignocelulósico é um hidrolisado derivado de madeira branda.
7. Método como reivindicado em uma ou mais das reivindicações precedentes, em que o hidrolisado lignocelulósico é um hidrolisado derivado de madeira dura.
8. Levedura mutada recombinante de Saccharomyces cerevisiae que contém genes introduzidos que codificam xilose redutase obtidos de Pichia stipitis, xilitol desidrogenase obtidos de Pichia stipitis e xiluloquinase obtidos de Saccharomyces cerevisiae, e que é capaz de crescer em nutriente mínimo contendo xilose como única fonte de carbono.
9. Levedura como reivindicada na Reivindicação 8, cuja S. cerevisiae foi depositada com o número de depósito CBS 102678.
10. Levedura como reivindicada na Reivindicação 8 que foi mutada por tratamento com metanossulfonato de etilo (EMS).
11. Levedura como reivindicada na Reivindicação 10, em que o mutante está depositado com o número de depósito CBS 102679.
12. Levedura como reivindicada na Reivindicação 10, em que o mutante está depositado com o número de depósito CBS 102680. Lisboa, 22 de Outubro de 2007
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