CN103403143B - 木糖发酵微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供经过长时间也能维持木糖的发酵能力的微生物。本发明提供使NAD激酶基因及/或FPS1基因的表达功能丧失的微生物、所述微生物的制造方法及使用所述微生物的乙醇的制造方法。

Description

木糖发酵微生物
技术领域
本发明涉及使NAD激酶基因的表达功能丧失的微生物。此外，本发明涉及通过使NAD激酶基因的功能丧失来制作木糖发酵能力增加的发酵微生物的方法。本发明进一步涉及包含使所述微生物与含有木糖的原料接触的工序的乙醇的制造方法。
背景技术
近年来，从化石燃料的枯竭、有必要削减CO2气体这样的观点出发，进行了如下研究，即将以往作为废弃物的玉米芯、稻草、柳枝稷、斑茅、废木材等这样的生物质作为燃料来生成乙醇。人类从几千年前开始就已具有从淀粉通过由酿酒酵母进行的发酵来制成乙醇的技术。淀粉是葡萄糖α-1,4键合而成的多糖，通过各种各样的生物所具有的水解酶可容易地分解。此外，葡萄糖是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)最为优选的C源，可通过发酵由1分子的葡萄糖生成2分子的乙醇。相对于此，生物质作为多糖包含纤维素或半纤维素。
其中，纤维素是葡萄糖β-1,4键合而成的多糖，具有结晶结构。其存在以下问题，即有必要进行用于损坏结晶结构的前处理、为了分解纤维素而必需的纤维二糖水解酶Ⅰ、纤维二糖水解酶Ⅱ、内切葡聚糖酶等的活性不充分等，但是由于分解后所产生的糖为葡萄糖，所以用酿酒酵母来发酵没有任何问题。
相对于此，半纤维素除了葡萄糖以外，还包含木糖、阿拉伯糖这样的五碳糖，以往酿酒酵母并不能发酵这些五碳糖。因此，为了发酵木糖，经常使用以下方法，即,使具有发酵木糖的能力的树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶基因在酿酒酵母中高表达(图1)。树干毕赤酵母的木糖还原酶为主要使用NADPH作为辅酶的酶，反应后生成一分子的NADP。另一方面，木糖醇脱氢酶为主要使用NAD作为辅酶的酶，反应后生成一分子的NADH。因此，如图1所示的那样，在发酵葡萄糖时，NADP/NADPH或NAD/NADH的平衡没有变化，但是发酵木糖时，偏向NADP或NADH增加的方向。可以认为这就是由木糖进行乙醇发酵时的收率低的原因。
迄今为止，进行了以下尝试，即,将辅酶特异性变换为NADH的突变型木糖还原酶的制作(非专利文献1)、将辅酶特异性变换为NADPH的突变型木糖醇脱氢酶的制作(非专利文献2)、糖酵解途径的甘油醛三磷酸脱氢酶的辅酶特异性为将作为NADPH的酶的基因从其它的生物种导入的实验(非专利文献3)、使大肠杆菌等的细菌所具有的转氢酶(在NADPH与NAD或NADP与NADH之间进行氢的交换)表达(非专利文献4)等，但是并没有得到充分的效果。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：PetschacherB,NidetzkyB.MicrobCellFact.2008Mar17;7:9.
非专利文献2：WatanabeS,SalehAA,PackSP,AnnaluruN,KodakiT,MakinoK.JBiotechnol.2007Jun30;130(3):316-9.Epub2007Apr29.
非专利文献3：VerhoR,LondesboroughJ,PenttileM,RichardP.ApplEnvironMicrobiol.2003Oct;69(10):5892-7.
非专利文献4：MikaelAnderlundet.al.ApplEnvironMicrobiol.1999June65(6):2333-2340
发明内容
在此种情况下，有必要开发出经过长时间也能维持木糖的发酵能力的微生物。
作为提高木糖发酵中的乙醇收率的方案，本发明人等认为重要的是增加细胞内的NAD或NADPH，从而着眼于NAD(H)激酶进行了深入研究，结果发现通过破坏NAD(H)激酶基因，可阻止
NAD+ATP→NADP+ADP
的反应中的NAD的减少。因此，制作破坏了NAD激酶基因的酵母株，并在该酵母株中进行了木糖的发酵，结果判断出与野生型的相同株相比乙醇收率提高。
本申请发明为基于上述见解的发明。
即，本发明涉及以下内容。
[1]一种微生物，其特征在于，其使NAD激酶基因的表达功能丧失。
[2]根据上述[1]中所述的微生物，其特征在于，所述NAD激酶基因是选自UTR1基因、YEF1基因中的至少一种的基因。
[3]根据上述[1]或[2]中所述的微生物，其特征在于，其进一步使FPS1基因的表达功能丧失。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的微生物，其特征在于，其是酵母。
[5]根据上述[1]～[3]中任一项所述的微生物，其特征在于，其是酿酒酵母。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的微生物，其特征在于，其导入了木糖代谢酶基因。
[7]根据上述[6]中所述的微生物，其特征在于，所述木糖代谢酶基因是选自由木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖磷酸化酶基因所组成的组中的至少1种的基因。
[8]一种制作木糖发酵能力增加的微生物的方法，其特征在于，其使NAD激酶基因的表达功能丧失。
[9]根据上述[8]中所述的方法，其特征在于，所述NAD激酶基因是选自UTR1基因、YEF1基因中的至少1种的基因。
[10]根据上述[8]或[9]中所述的方法，其特征在于，其包含进一步使FPS1基因的表达功能丧失的工序。
[11]根据上述[8]～[10]中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物是酵母。
[12]根据上述[8]～[10]中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物是酿酒酵母。
[13]根据上述[8]～[12]中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物是导入了木糖代谢酶基因的微生物。
[14]根据上述[13]中所述的方法，其特征在于，所述木糖代谢酶基因是选自由木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖磷酸化酶基因所组成的组中的至少1种的基因。
[15]一种乙醇的制造方法，其特征在于，其包含使所述[1]～[7]中任一项所述的微生物与含有木糖的原料接触的工序。
[16]一种微生物，其特征在于，其使FPS1基因的表达功能丧失。
[17]根据上述[16]中所述的微生物，其特征在于，其是酵母。
[18]根据上述[16]中所述的微生物，其特征在于，其是酿酒酵母。
[19]根据上述[16]～[18]中任一项所述的微生物，其特征在于，其导入了木糖代谢酶基因。
[20]根据上述[19]中所述的微生物，其特征在于，所述木糖代谢酶基因是选自木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖磷酸化酶基因中的至少1种的基因。
[21]一种制作木糖发酵能力增加的微生物的方法，其特征在于，其使FPS1基因的表达功能丧失。
[22]根据上述[21]中所述的方法，其特征在于，所述微生物是酵母。
[23]根据上述[21]中所述的方法，其特征在于，所述微生物是酿酒酵母。
[24]根据上述[21]～[23]中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物是导入了木糖代谢酶基因的微生物。
[25]根据上述[24]中所述的方法，其特征在于，所述木糖代谢酶基因是选自由木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖磷酸化酶基因所组成的组中的至少1种的基因。
[26]一种乙醇的制造方法，其特征在于，其包含使上述[16]～[20]中任一项所述的微生物与含有木糖的原料接触的工序。
根据本发明，提供具有优异的木糖发酵能力的微生物。此外，不管是小规模还是伴随搅拌的大规模，本发明的微生物均显示出高木糖发酵能力。此外，即使在用于连酿发酵（连续酿造发酵）等的长期发酵的情况下，本发明的微生物也可维持高水平的木糖发酵能力。此外，通过使用本发明的微生物的制作方法，也可以广范围的微生物作为宿主，制成具有相同的高木糖发酵能力的育种。通过使用本发明的微生物可高效率地从含有木糖的原料来制造乙醇。此外，使用本发明的微生物时，只要是包含木糖的原料，例如即使以氨基酸含量低的生物质作为原料的情况也可高效率地制造乙醇。
附图说明
图1是表示葡萄糖及木糖的代谢途径的图。
图2是实施例中所使用的质粒pENTUTR1的简图。
图3是实施例中所使用的质粒pENTYEF1的简图。
图4是实施例中所使用的质粒pYRGFLP的简图。
图5是实施例中所使用的质粒pYRNFLP的简图。
图6是实施例中所使用的质粒pENTUTR1G的简图。
图7是实施例中所使用的质粒pENTYEF1N的简图。
图8表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH473)。图中“Δ木糖”表示木糖减少量，“Δutr1”表示“UTR1基因破坏”。
图9表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH468)。图中“Δ木糖”表示木糖减少量，“Δutr1”表示“UTR1基因破坏”。
图10表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH473)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图11表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH473、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图12表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图13表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图14表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：CSLX、宿主：HH472)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图15表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：CSLX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图16表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：CSLX、宿主：HH472、45mL规模、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图17表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：CSLX、宿主：HH472、45mL规模、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图18表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(木糖醇生成量、培养基：CSLX、宿主：HH472、45mL规模、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图19表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(甘油生成量、培养基：CSLX、宿主：HH472、45mL规模、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图20表示使用本发明的微生物的木糖连续发酵试验的结果(培养基：CSLX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图21表示使用本发明的微生物的木糖连续发酵试验的结果(木糖同化量、培养基：CSLX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图22表示使用本发明的微生物的木糖连续发酵试验的结果(木糖醇生成量、培养基：CSLX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图23表示使用本发明的微生物的木糖连续发酵试验的结果(甘油生成量、培养基：CSLX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”表示“UTR1基因破坏”。
图24表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(2)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿utr1”及“⊿yef1”分别表示“UTR1基因破坏”及“YEF1基因破坏”。
图25表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(2)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿utr1”及“⊿yef1”分别表示“UTR1基因破坏”及“YEF1基因破坏”。
图26是实施例中所使用的质粒pCR4FPS1的简图。
图27是实施例中所使用的质粒pYR-AFLP的简图。
图28是实施例中所使用的质粒pCR4FPS1AUR的简图。
图29表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿XYL”表示木糖减少量，“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图30表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验的结果(培养基：YPX、宿主：HH472、48小时后)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图31表示使用本发明的微生物的发酵试验的结果(培养基：YPD、宿主：HH472、24小时后)。图中“⊿GLC”表示葡萄糖减少量，“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图32表示使用本发明的微生物的发酵试验的结果(培养基：YPD、宿主：HH472、24小时后)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图33表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(50ml规模)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图34表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(50ml规模)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图35表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(50ml规模)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图36表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(50ml规模)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
图37表示使用本发明的微生物的木糖发酵试验(50ml规模)的结果(培养基：YPX、宿主：HH472)。图中“⊿fps1”、“⊿utr1”、“⊿yef1”分别表示“FPS1基因破坏”、“UTR1基因破坏”、“YEF1基因破坏”。
具体实施方式
以下详细说明本发明。以下的实施方式，是为了说明本发明而进行的例示，并不是将本发明限定于这些实施方式。本发明只要不脱离其宗旨，可通过各种各样的方式来实施。
且，本说明书中所引用的所有的文献、公开公报、专利公报及其它的专利文献均作为参照并入本说明书中。此外，本说明书包含2011年2月25日提出申请而成为本申请优先权主张的基础的日本国专利申请(日本特愿2011-040651号公报)的说明书及附图所述的内容。
本发明者人等在使用抑制了NAD激酶基因的表达的微生物株时，发现与野生型同种株相比，由含有木糖的原料进行的乙醇生产效率提高，从而完成了本发明。进而，发现抑制甘油通道的基因表达时，由含有木糖的原料进行的乙醇生产效率更加提高。以下记载了本申请发明的各实施方式。
1.NAD激酶基因功能丧失的微生物
本发明提供在某实施方式中使NAD激酶基因的表达功能丧失的微生物。
在本发明中，“微生物”是指通过肉眼不能判别其存在、可通过显微镜等来观察的程度以下的大小的生物。作为微生物的例子，可列举细菌、蓝细菌、古细菌等的原核生物，以及丝状菌、酵母、粘菌、担子菌、单细胞性的藻类及原生动物等的真核生物。
优选微生物为对糖具有发酵能力的种类，更优选为酵母。酵母可为芽殖酵母或裂殖酵母中的任一种。在某实施方式中，酵母也可为酿酒酵母NBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954、X2180-1A(ATCC26786)、CB11(BerkleyStockCenter)、W303-1A(BY4848)等的芽殖酵母。在其它的实施方式中，酵母也可为日本裂殖酵母(Schizosaccharomycesjaponicus(Hasegawaeajaponicus))、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus(Octosporomycesoctosporus))及粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等的裂殖酵母。
在本发明中，“NAD激酶基因”是指编码NAD激酶蛋白质的基因，可为DNA或RNA中的任一种。NAD激酶是指具有在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)上附加磷酸而转换为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的活性(以下称为“NAD激酶活性”)的酶(MagniGetal.,(2006)Minireviewsinmedicinalchemistry6(7):739–46)。
在本说明书中使用时，“NAD激酶基因”不限定于编码来自酿酒酵母的NAD激酶蛋白质(序列号2或4)的基因(序列号1或3)，也可为编码显示NAD激酶活性且与NAD激酶属于相同家族的同源蛋白质的基因。与NAD激酶属于相同家族的蛋白质在很多的植物中被发现，在家族内整体均高度保守。由于NAD激酶为细胞代谢重要的酶，所以其基因在家族内整体均高度保守，关于多种微生物的NAD激酶或其同源蛋白质的基因，其碱基序列已被解析，其序列信息也已录入数据库(参照表1)。
表1
使用酿酒酵母来制作本发明的微生物时，NAD激酶基因优选UTR1基因(序列号1)及YEF1基因(序列号3)。
在某一实施方式中，NAD激酶基因也可为在编码具有NAD激酶活性的多肽的多核苷酸的碱基序列中，1或多个碱基发生缺失、插入、取代或附加的突变体。突变体可在编码或非编码区域或在其两者中发生突变。在编码区域中的突变可由保守或非保守的氨基酸的缺失、插入、取代及/或附加而生成。在本说明书中使用时，编码序列号2或序列号4的氨基酸序列的基因或编码在该氨基酸序列中1或多个(例如，1～40个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个等)或者1或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列的基因也包含在“NAD激酶基因”中。
在本发明中，“使NAD激酶基因的表达功能丧失”是指从NAD激酶基因使具有原本酶功能的NAD激酶不表达。作为此种状态的例子，可列举不仅有NAD激酶基因的表达产物完全没有生成的状态，还有表达了该基因的表达产物(例如，hnRNA、mRNA或蛋白质)，但是这些表达产物不具有原本的正常功能的状态。此种NAD激酶基因的功能丧失可通过使NAD激酶基因或其转录调节区或者包含启动子区域的表达调控区上1或多个核苷酸发生缺失、取代及/或插入等来产生。且进行所述缺失、取代及/或插入的位点、发生缺失、取代及/或插入的序列只要丧失了NAD激酶基因的正常功能就没有特别限定，优选编码NAD激酶的酶活性位点的基因序列的至少1个缺失。
本发明的微生物特别是真核生物时，有时所述NAD激酶的表达功能只要在染色体上的至少其中之一的等位基因(异型接合体)中丧失就具有效果，但是优选在两等位基因中均丧失(同型接合体)。
此外，本发明的微生物除NAD激酶基因以外，或者也可单独丧失FPS1基因的功能。
在本说明书中使用时，“FPS1基因”不限定于编码来自酿酒酵母的FPS1蛋白质(序列号24)的基因(酵母属基因组数据库注册号：YLL043W、基因库注册号：NM_001181863.1、序列号23)，也可为编码发挥作为甘油通道的功能的蛋白质的基因。
在某一实施方式中，编码序列号24的氨基酸序列的基因或编码该氨基酸序列中1或多个(例如，1～40个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个等)或1或几个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列的基因也包含在“FPS1基因”中。
在本发明中，“使FPS1基因的表达功能丧失”是指从FPS1基因使具有原本的酶功能的FPS1蛋白质不表达。作为此种状态的例子，可列举不仅有FPS1基因的表达产物完全没有生成的状态，还有虽该基因的表达产物得到表达(例如，hnRNA、mRNA或蛋白质)，但是这些表达产物不具有原本的作为甘油通道的功能的状态。此种FPS1基因的功能丧失可通过FPS1基因或其转录调节区或者包含启动子区域的表达调控区中1或多个核苷酸发生缺失、取代及/或插入等而产生。且，进行所述缺失、取代及/或插入的位点、发生缺失、取代及/或插入的序列只要可丧失FPS1基因的作为甘油通道的功能就没有特别限定，但是优选编码FPS1蛋白质的活性位点的基因序列的至少1个缺失。
本发明的微生物特别是真核生物时，有时所述FPS1的表达功能只要在染色体上的至少其中之一的等位基因(异型接合体)中丧失就具有效果，但是优选在两等位基因中均丧失(同型接合体)。
2.制作木糖发酵能力增加的发酵微生物的方法
本发明提供通过使宿主微生物的NAD激酶基因的表达功能丧失来制作木糖发酵能力增加的发酵微生物的方法。
此外，上述方法也可包含进一步使FPS1基因的表达功能丧失的工序。或者也可通过不使宿主微生物的NAD激酶基因的表达功能丧失而单独使FPS1基因的表达功能丧失来制作木糖发酵能力增加的发酵微生物。
作为使NAD激酶基因或FPS1基因的表达功能丧失的方法，可列举基因靶向或RNAi等的敲除或敲低技术。
(1)基因靶向
基因靶向是利用同源重组在染色体上的特定基因中导入突变的方法(Capeccchi,M.R.Science,244,1288-1292,1989)。
首先，构建用于使NAD激酶基因或FPS1基因的功能丧失的靶向载体。构建靶向载体时，制备对象动物的基因组DNA文库。为了不使由多型等引起的重组率降低，该基因组DNA文库优选使用由与成为基因靶向的对象的微生物种为同系统的微生物，优选来自同种的微生物的基因组DNA所制作的文库。作为此种文库也可使用市售的文库。或者，也可将NAD激酶或FPS1的cDNA或者其部分序列作为探针来进行筛选，从而克隆NAD激酶或FPS1的基因组基因的DNA序列，或者也可基于NAD激酶或FPS1的cDNA或者其部分序列制成引物，通过将基因组的NAD激酶基因或FPS1基因进行PCR扩增来制备。关于详细的基因组DNA文库的制备方法可参照以下内容。“Sambrook＆Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“Ausubel,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley＆Sons1987-1997”。
其次，将克隆的基因组DNA通过测序、萨瑟恩印迹法、限制酶酶切等进行解析来鉴定外显子(真核生物的情况)的位置及限制酶位点。根据通过此种解析所得到的序列信息为基础来确定诱变位点等。
在本发明中，导入到染色体上的突变(缺失、取代及/或插入)只要可损坏NAD激酶基因或FPS1基因的正常功能则没有特别限定，这些突变可存在于NAD激酶基因或FPS1基因的内含子区域、外显子区域或NAD激酶基因或FPS1基因的表达调控区。优选所述突变存在于NAD激酶基因或FPS1基因的外显子区域，进一步优选NAD激酶基因或FPS1基因中的至少1种的外显子缺失的突变，最优选所有的外显子缺失的突变。因为只要是此种突变就能确实地使NAD激酶基因或FPS1基因的功能缺损。
靶向载体包含诱变位点的3’及5’侧的相同区域(分别为3’端臂及5’端臂)，也可包含重组体的选择用的选择性标记。作为选择性标记的例子，可列举新霉素抗性基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、卡那霉素抗性基因等的正选择标记、LacZ、绿色荧光蛋白(GreenFluorescenceProtein)及荧光素酶基因等的破坏对象基因的表达报告基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)、白喉毒素A片段(DTA)等的负选择标记等。特别是由于本发明以微生物作为宿主，所以只要使用与营养缺陷型互补的基因例如URA3，即使在不包含尿嘧啶的琼脂培养基中也可进行选择，从而可根据宿主的营养缺陷型来使用。此外，只要使用对于放线菌酮有抗药性基因(YAP1)，即可在包含放线菌酮的培养基上进行选择。通过使用将这些选择标记插入3’端臂及5’端臂之间的序列也可破坏靶基因。载体也可包含在相同区域的外侧用于使载体直链化的适当的限制酶切割位点。
图6表示用于在实施例中使用的酿酒酵母的UTR1基因敲除的靶向载体的例子。其创建(contrust)为将编码UTR1蛋白质的N末端侧及C末端侧的各氨基酸序列的UTR1基因组基因序列分别作为5’端臂(“UTR1-N”)及3’端臂(“UTR1-C”)，从而在5’端臂与3’端臂之间插入作为正选择标记的遗传霉素抗性基因(“G418R”)。
该由UTR1-N-G418R-UTR1-C所组成的片段通过限制酶从载体切下、纯化后，转化到酵母中，通过同源重组取得获得了遗传霉素抗性的菌株，进一步通过PCR来确认UTR1基因被破坏。
此种靶向载体可以市售的质粒载体(例如，pENTR/D-TOPO(注册商标：Invitrogen)、pBluescriptⅡ(Stratagene)等)为基础来构建。
(2)RNA干扰
除上述以外，作为使NAD激酶基因或FPS1基因的表达功能缺损的方法，可列举使用siRNA(小干扰RNA：smallinterferingRNA)等的RNA干扰(RNA干扰：RNAinterference，RNAi)法。RNAi为经过多个阶段而进行的多步骤过程。最初，由RNAi表达载体所表达的双链RNA(双链RNA：DoubleStrandedRNA，dsRNA)或发夹状的shRNA(小发夹RNA：SmallHairpinRNA)通过切酶(Dicer)识别，分解成为21～23个核苷酸的siRNAs。其次，siRNAs被整合入称作RNA诱导沉默复合物(RNA诱导沉默复合物：RNA-InducedSilencingComplex，RISC)的RNAi目标复合物中，RISC和siRNAs的复合物与包含与siRNA序列互补的序列的目标mRNA结合,来分解mRNA。目标mRNA在与siRNA互补的区域的中央被切割，最终目标mRNA被快速分解而蛋白表达量降低。已知效力最高的siRNA双链为19bp的双链的各3’末端具有2个尿苷残基的突出部分的21个核苷酸长度的序列(ElbashirS.M.等,GenesandDev,15,188-200(2001))。
因此，为了得到NAD激酶基因或FPS1基因敲低的微生物，首先，将表1所示的那样的包含与NAD激酶基因或FPS1基因序列(例如，序列号23)(不限定于这些)的一部分互补的序列的核苷酸，以作为dsRNA或shRNA可表达的状态插入到适当的RNAi表达载体来制作RNAi载体。其次，通过将所述载体导入宿主细胞、选择转化体，可得到NAD激酶基因或FPS1基因敲低的微生物。
dsRNA或shRNA的设计及合成也可通过市售的DNA/RNA合成器，例如，应用生物系统394型（AppliedBiosystems394型）来进行或也可委托第三方机构(例如，TAKARABio公司)。
NAD激酶基因或FPS1基因的表达功能的丧失，可作为正常的NAD激酶基因或FPS1基因的表达量降低来确认。NAD激酶基因或FPS1基因的表达量可通过使用了本发明的微生物提取物的RT-PCR法及琼脂糖凝胶电泳、实时PCR法、诺森印迹法（Northern印迹法）、微阵列解析及质量分析法等来测定。用于这些测定方法的引物或探针，可基于该NAD激酶基因或FPS1基因的序列来设计及合成。NAD基因的表达产物是否正常可通过进行该表达产物的序列解析来确认。
本发明的微生物的特征在于NAD激酶基因或FPS1基因的表达功能丧失，进而，也可以木糖代谢酶基因可表达的状态导入。木糖代谢酶基因是编码在分解木糖而生成乙醇的一系列的化学反应中具有催化任一种反应的活性(以下称为“木糖代谢活性”)的蛋白质(以下称为“木糖代谢酶”)的基因。作为木糖代谢酶基因的例子，可列举木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因、木酮糖磷酸化酶基因。
此种木糖代谢酶基因，例如也可为来自树干毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、烟曲霉、金黄色葡萄球菌、巴斯德毕赤酵母、粟酒裂殖酵母等的基因。
优选在本发明的微生物中导入选自所述木糖代谢酶中的木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因或木酮糖磷酸化酶基因中的至少1种，也可导入这些基因中的2种以上或全部3种的基因。
作为木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因或木酮糖磷酸化酶基因的例子，可列举以下基因，但不限定于这些。
表2
木糖还原酶基因
表3
木糖醇脱氢酶基因
表4
木酮糖磷酸化酶基因
木糖还原酶是在木糖分解中催化以下反应的酶。
木糖＋NADPH→木糖醇＋NADP
木糖醇脱氢酶是在木糖分解中催化以下反应的酶。
木糖醇＋NAD→木酮糖＋NADH
木酮糖磷酸化酶是在木糖分解中催化以下反应的酶。
木酮糖＋ATP→木酮糖-5P＋ADP
在某一实施方式中，木糖代谢酶基因(例如，木糖还原酶、木糖醇脱氢酶或木酮糖磷酸化酶等)只要可编码具有木糖代谢活性的蛋白质，也可为上述木糖代谢酶基因的突变体。作为突变体的例子，也可为在编码上述木糖代谢酶蛋白质的多核苷酸的碱基序列中，1或多个碱基发生缺失、插入、取代或附加的突变体。突变体可在编码或者非编码区域或其两者中发生突变。在编码区域中的突变可生成保守或非保守的氨基酸的缺失、插入、取代及／或附加。在本说明书中使用的情况，编码序列号10、12或14的氨基酸序列的基因(例如，序列号9、11或13)或编码在该氨基酸序列中1或多个(例如，1～40个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、1个等)或1或者数个氨基酸发生缺失、取代或者附加的氨基酸序列的基因也包含在“木糖代谢酶基因”中。
在该领域中周知在多肽的氨基酸序列中的一些氨基酸可不对该多肽的结构或功能产生显著影响而容易地改变。进而，也周知不仅通过人为使其改变，在天然的蛋白质中也存在不使该蛋白质的结构或功能发生显著变化的突变体。
本领域技术人员可使用周知的技术而容易地使多肽的氨基酸序列中1或多个氨基酸发生改变。例如，可根据公知的点突变导入法使编码多肽的多核苷酸的任意的碱基改变。此外，也可设计对应于编码多肽的多核苷酸的任意位点的引物来制作缺失突变体或附加突变体。进而，只要使用本说明书中所述的方法，可容易地确定所制作的改造物是否具有所期望的活性。
优选的改造物具有保守性或者非保守性氨基酸取代、缺失或添加。优选沉默取代、添加及缺失，特别优选保守性取代。这些并不使本发明所涉及的多肽活性发生变化。
可看作代表性的保守性取代有：脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu及Ile中的1种的氨基酸取代为其它的氨基酸；羟基残基Ser及Thr的互换、酸性残基Asp及Glu的互换、酰胺残基Asn及Gln之间的取代、碱性残基Lys及Arg的互换及芳香族残基Phe、Tyr之间的取代。
如上述所详细表示，涉及何种氨基酸的变化可能为表现型的沉默(即相对于功能好像不具有显著的有害的效果)的进一步的指导可在Bowie,J.U.等的“DecipheringtheMessageinProteinSequences:TolerancetoAminoAcidSubstitutions”,Science247:1306-1310(1990)(在本说明书中作为参考来引用)中找到。
只要使用上述所列举的本发明所涉及的多核苷酸，在转化体或细胞中可合成具有木糖代谢酶活性的多肽。
优选木糖代谢酶基因以整合到可在宿主细胞中表达的表达载体中的状态导入。表达载体包含以下(i)～(iii)的要素。
(i)在宿主细胞内可转录的启动子；
(ii)键合到该启动子上的木糖代谢酶基因；及
(iii)由包含涉及RNA分子的转录终止及多聚腺苷化，且包含以在宿主细胞内发挥功能的信号作为构成要素的表达盒来构成。
作为此种载体，例如，可列举pYE22m(酵母用：Biosci.Biotech.Biochem.,59,1221-1228,1995)、YCp50(酵母用：X70276)、YIp1(酵母用：X70480)。
作为用于调节宿主细胞中的基因表达的启动子/终止子，只要在宿主细胞中发挥功能即可为任意的组合。例如，利用酵母时可使用TDH3、PYK1、PGK1、GAP、TPI1、GAL1、GAL10、ADH2、PHO5、CUP1、MFα1等的启动子，但不限定于此。作为构成性高表达启动子，可使用TDH3、TPI1、PGK1、PGI1、PYK1、ADH1等的启动子。
作为在转化时所使用的选择性标记可利用营养缺陷型标记(URA3、LEU2)、抗药性标记(潮霉素抗性、遗传霉素抗性)、铜抗性基因(CUP1)(Marinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81,3371984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m,PDR4)(分别参考猪腰淳嗣等,生物化学,64,660,1992；Hussainetal.,gene,101,149,1991)等。
作为宿主细胞的转化方法，可利用通常所使用的公知的方法。例如，为原核生物时可利用电穿孔法(MackenxieD.A.etal.Appl.Environ.Microbiol.,66,4655-4661,2000)、热休克法。此外，为酵母时可实施电穿孔法、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978))、醋酸锂法(J.Bacteriology,153,p163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methodsinyeastgenetics,2000版:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual等中所述的方法，但不限定于这些。
此外，关于通常的克隆技术，可参照“Sambrook&Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManualVol.3,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001”、“MethodsinYeastGenetics、Alaboratorymanual(ColdSpringHarborLaboratoryPress、ColdSpringHarbor,NY)”等。
3.乙醇的制造方法
如上所述制作的本发明的微生物与同种的野生型微生物相比，木糖发酵能力增加。在此，木糖发酵是指通过将木糖同化来生成乙醇。即木糖发酵是指由木糖进行的乙醇发酵。此外，乙醇发酵是指通过发酵过程而生成乙醇的反应。
因此，将本发明的微生物在含有木糖原料的存在下进行培养时，与在同一条件下培养同种的野生型微生物情况相比，作为副生成物的木糖醇和甘油的生成量减少，作为其结果就生成了更多的乙醇。
由此，本发明提供在其它的实施方式中包含使本发明的微生物和含有木糖的原料接触的工序的乙醇的制造方法。
使本发明的微生物与含有木糖的材料接触的工序可通过将本发明的微生物和含有木糖的材料混合来实现。优选使本发明的微生物在活性状态下与含有木糖的材料接触。
作为使本发明的微生物在活性状态下与含有木糖的材料接触的方法的例子，可列举在本发明的微生物可增殖的培养条件中，且在含有木糖的原料的存在下来培养本发明的微生物的方法。此种培养条件根据微生物种的不同而不同，例如，只要是酵母就可在添加了含有木糖的原料的YPD培养基(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)、SX培养基(木糖50g/l、6.7g/l无氨基酸酵母氮源、腺嘌呤20mg/l、组氨酸20mg/l、亮氨酸100mg/l、色氨酸20mg/l)等的适合的培养基中在30℃下进行培养。
或者，也可在本发明的微生物在含有木糖的原料的存在下进行培养之前，在本发明的微生物可增殖的培养条件下培养而使菌体增殖，其后，在含有木糖的原料的存在下使用本发明的微生物进行发酵。
但是，培养条件并不限定于上述内容。只要是本领域技术人员，即可选择适当的对应于微生物种的适合的培养条件来进行实际培养。
木糖的发酵能力可通过使本发明的微生物和含有木糖的原料接触，经过一定时间后测定系统的乙醇生成量来确认。
此外，木糖发酵能力也可作为相对于木糖同化量的乙醇收率来测定。相对于木糖同化量的乙醇收率也可按照以下所述来计算。
首先，由木糖(C5H10O5)进行的乙醇(C2H5OH)生成可用下述的反应式来表示。
6C5H10O5→10C2H5OH+10CO2+10ATP
由该反应式、木糖分子量(150)及乙醇分子量(46)，在木糖同化量与乙醇生成量之间，以下的式子所表示的关系成立。
乙醇生成量＝木糖同化量×｛(10×46)/(6×150)｝
因此，将生成了“木糖同化量×｛(10×46)/(6×150)｝＝木糖同化量×0.51”的量的乙醇的情况定为100%的乙醇收率。
木糖同化量及乙醇生成量可通过将包含本发明的微生物与含有木糖的原料的发酵系统的成分通过高效液相色谱法等公知的分析方法来分析从而容易地测定。
“含有木糖的原料”只要是包含木糖的原料则没有特别限定，优选来自包含木糖的生物的原料，即“含有木糖的生物质”。在日本国农林水产省发行的“生物质·日本综合战略”中，生物质被定义为“可再生且来自生物的有机资源中除化石资源以外的物质”。
因此，基于该定义“含有木糖的生物质”可定义为“可再生且来自生物的有机资源中除化石资源以外且包含木糖的物质”。
作为含有木糖的生物质的具体例，可列举甘蔗、玉米、甜菜、马铃薯、甘薯、麦、高粱(モロコシ)、蜀黍（ソルガム）等的不可食用部分、废木材、纸浆废液、甘蔗渣、谷壳、玉米芯、稻草、柳枝稷、斑茅、象草，但不限定于这些。
实施例
以下，使用实施例来详细地说明本发明，但本发明不限定于该实施例所述的方式。
试验方法：
本实施例中所使用的试验项目及试验方法如下所示。在没有特别声明的情况下，在本实施例中的试验方法以此为准。
＜UTR1及YEF1基因的取得＞
酿酒酵母的UTR1基因已被克隆，其碱基序列也已有报道(酵母属基因组数据库注册号：YJR049C)。此外，酿酒酵母的YEF1基因也已被克隆，其碱基序列已录入基因库(基因库注册号NM_001178856)。因此，UTR1基因(基因组序列：序列号1)及YEF1基因(基因组序列：序列号3)以其碱基序列信息为基础，将由具有各个基因的酿酒酵母所制备的染色体DNA用于PCR的模板，通过PCR来扩增、分离而得到。具体而言，在本实施例中，以酿酒酵母X2180-1A(ATCC26786)(MATaSUC2malmelgal2CUP1)的染色体DNA作为模板，使用引物UTR1F1和UTR1R1通过PCR来取得UTR1，使用引物YEF1F1和YEF1R1通过PCR来取得YEF1。所取得的DNA片段使用Invitrogen公司的pENTRTMDirectionalTOPO克隆试剂盒（产品名称），插入到载体、pENTRTM/得到质粒pENTUTR1(图2)或pENTYEF1(图3)。通过DNA测序来确认所插入的两基因的序列。为了取得两基因所使用的染色体DNA不仅限定于上述所表示的菌株，只要是属于酿酒酵母的酵母也可从任何酵母来制备。通过使用染色体DNA的PCR的目的基因的扩增及其后的分离，包含PCR引物的制备，可通过本领域技术人员所周知的方法来进行。
UTR1F1：
5’CACCGTTTAAACTCTAGAATGAAGGAGAATGACATGAATAAT3’(序列号5)
UTR1R1：
5’GTTTAAACGGATCCTTATACTGAAAACCTTGCTTGAGA3’(序列号6)
YEF1F1：
5’CACCGTTTAAACTCTAGAATGAAAACTGATAGATTACTGATTA3’(序列号7)
YEF1R1：
5’GTTTAAACGAGCTCTTAGATTGCAAAATGAGCCTGAC3’(序列号8)
＜用于PCR的模板DNA的制备方法＞
将酵母细胞悬浮于50μl的裂解缓冲液(0.125mg/ml酵母裂解酶100T、1M山梨糖醇、40mM磷酸钾缓冲液pH6.8、1mM二硫苏糖醇)中。在30℃孵育1小时后加入5μl蛋白酶E1mg/ml，进一步在55℃孵育20分钟、99℃孵育10分钟。以15,000rpm进行10分钟的离心，将上清作为模板DNA。
＜用于UTR1或YEF1基因破坏的单元的制作＞
为了破坏UTR1基因，使用BsaAI和FspI来切割pENTUTR1的UTR1基因，再在其中插入通过质粒pYRGFLP(图4)用PmeI切下的G418抗性标记基因(PGK1p::KanMX)，得到质粒pENTUTR1G(图6)。为了破坏YEF1基因，使用BstEⅡ和StuI来切割pENYEF1的YEF1基因，再在其中插入通过质粒pYRNFLP(图5)用PmeI切下的Nat抗性标记基因(TEF1p::Nat)，得到质粒pENTYEF1N(图7)。将该pENTUTR1G或pENTYEF1N用PmeI切割，并进行琼脂糖凝胶电泳，分别将约3.3kbp(具有UTR1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含G418抗性标记基因(PGK1p::KanMX))或约2.1kbp(具有YEF1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含Nat抗性标记基因(TEF1p::Nat))的DNA片段从琼脂糖凝胶中切下。通过凝胶纯化提取DNA片段。纯化提取使用illustraTMGFXTMPCRDNAandGelBandPurificationkit（illustraTMGFXTMPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒，商品名），根据操作指南来进行。
＜酵母株＞
在本发明中，使用酿酒酵母X2180-1A株来取得UTR1，使用HH467,468,472,473株来进行UTR1破坏株的育种。使用HH472株来进行YEF1破坏株的育种。在任一种株中，均在将树干毕赤酵母的木糖还原酶基因(XYL1:序列号9)、木糖醇脱氢酶基因(XYL2:序列号11)和酿酒酵母的木酮糖磷酸化酶基因(XKS1:序列号13)的表达单元表示为基因型的启动子控制下，使用整合入染色体的某区域的菌株，但不限定于此。
(1)酿酒酵母X2180-1A(ATCC26786)(MATaSUC2malmelgal2CUP1)
(2)酿酒酵母HH467(MATaleu2-3,112trp1-1his3-11,15ade2-1can1-100rad5-535ura3-1::URA3::TDH3p::XYL1::TDH3p::XYL2::TDH3p:
:XKS1)
(3)酿酒酵母HH468(MATaade1MAL61MAL62MAL63AGT1MAL12MAL31MAL32ura3::URA3::TDH3p::XYL1::TDH3p::XYL2::TDH3p::XKS1)
(4)酿酒酵母HH472(MATaSUC2malmelgal2CUP1GATI::TDH3p::XYL1::PYK1p::XYL2::TPI1p::XKS1)
(5)酿酒酵母HH473(MATaSUC2malmelgal2CUP1YCT1::TDH3p::XYL1::PYK1p::XYL2::TPI1p::XKS1)
(6)酿酒酵母CB11(BerkleyStockCenter)(MATaade1MAL61MAL62MAL63AGT1MAL12MAL31MAL32)
(7)酿酒酵母W303-1A(BY4848)(MATaura3-1leu2-3,112trp1-1his3-11,15ade2-1can1-100rad5-535)
在上述的菌株中，(6)为HH468的亲株，(7)为HH467的亲株，均已有市售((6)：工业技术院微生物工业技术研究所的微工研菌条第4198号(FERMBP-4198)、(7)：NBRPID号：BY4848)。此外，(1)为HH472及HH473的亲株，已有市售(ATCCID号：ATCC26786)。各菌株均同时记载了基因型。
＜UTR1或YEF1基因破坏株的育种＞
在所制备的约3.3kbp的DNA片段(具有UTR1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含遗传霉素抗性基因(PGK1p::KanMX))或约2.1kbp(具有YEF1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含Nat抗性标记基因(TEF1p::Nat))的DNA片段中，转化HH467、468、472、473，关于UTR1破坏株，涂布在包含300μg/ml遗传霉素的YPD(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖＊20g/L(过滤灭菌添加＊))培养基中，关于YEF1破坏株，涂布在包含50μg/mlclonNAT(链丝菌素硫酸盐：Nourseothricindihydrogensulfate)的YPD(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖＊20g/L(过滤灭菌添加＊))培养基中。从所生长发育的几个菌落中，关于UTR1破坏株，使用引物upUTR1_F1和pPGK657-r1或downUTR1_R和G418_F1进行PCR，通过使片段扩增来确认UTR1基因被破坏。关于YEF1破坏株，使用引物YEF1U_F和natMX-r2或YEF1D_R和natMX-f2进行PCR，通过使片段扩增来确认YEF1基因被破坏。进而，将转化体涂布在YPGly(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、甘油20g/L)培养基上确认生长发育，从而来确认不是呼吸缺陷株。在此，示出了将遗传霉素抗性或clonNAT抗性标记基因用于标记的例子，但是根据宿主的基因型也可使用其它的标记。只要使用与宿主的营养缺陷型互补的基因，例如URA3可在不包含尿嘧啶的琼脂培养基上进行选择。或者，只要使用对放线菌酮有抗药性的基因如YAP1，可在包含放线菌酮的YPD培养基上进行选择。
upUTR1_F1：5’CTACGCAAAGAGAACGGAG3’(序列号15)
pPGK657-r1：5’GCAATCAATAGGAAGACAGG3’(序列号16)
downUTR1_R：5’ATGTCACGCTTACATTCACG3’(序列号17)
G418_F1：5’TGGTTGTAACACTGGCAGAG3’(序列号18)
YEF1U_F：5’AGCGTTGTGAAAGGGAAATG3’(序列号19)
natMX-r2：5’GTGTCGTCAAGAGTGGTACC3’(序列号20)
YEF1D_R：5’TCTTCGACACTGCAAACGAC3’(序列号21)
natMX-f2：5’TCTACATGAGCATGCCCTGC3’(序列号22)
＜木糖发酵试验-小规模＞
在木糖的发酵试验中，作为发酵试验用培养基，使用YPX(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、木糖＊50g/L(分别在灭菌后添加＊))或CSLX(0.5%玉米浆、尿素＊＊5g/L、盐酸吡哆醛＊＊1mg/L、盐酸硫胺素＊＊1mg/L、生物素＊＊0.1mg/L、泛酸＊＊10mg/L、硫酸镁1mg/L、硫酸锌2mg/L、木糖＊50g/L、pH5.0(过滤灭菌后添加＊＊、分别在灭菌后添加＊))。供试于发酵实验的酵母如下进行培养。在10mlYPD中接种一接种环的供试酵母，在30℃的培养箱中振荡培养20小时。从其培养液中将酵母进行集菌，悬浮于新的20mlYPD中，在30℃下振荡培养3小时。将酵母细胞进行集菌，用在发酵试验中所使用的培养基进行2次洗净后，接种到2ml的培养基中使成为OD600=20或OD600=25，再加入到容量3ml的微型管中盖上盖，并在30℃孵育。适当取样，离心、过滤后，通过高效液相色谱法来进行成分分析。
＜木糖发酵试验-大规模＞
在使用了容量100ml的介质瓶的发酵试验中，在盖上穿入内径4mm的硅胶管。将管调整为浸渍不到培养基的长度。在管上安装止回阀，在内压增高时，可通过阀将气体排到外界从而调整为与外压相同的气压。供试于发酵试验的酵母如下进行培养。在10mlYPD中接种一接种环的供试酵母，在30℃的培养箱中振荡培养20小时。将其培养液总量接种到装入300ml三角烧瓶的100mlYPD中，在30℃的培养箱中振荡培养20小时后，离心、回收酵母总量，再悬浮于装入500ml三角烧瓶的200mlYPD中，在30℃振荡培养6小时。将酵母细胞进行集菌，用发酵试验用培养基进行2次洗净后，接种到45ml的培养基中使成为OD600=20。将介质瓶放置于温度保持在30℃的水浴中至培养基的加入量的深度为止，放入灭菌后的搅拌子，一边以60rpm的速度搅拌一边进行发酵。每次适当取样1ml的发酵液，离心、过滤后，通过高效液相色谱法进行成分分析。
＜木糖发酵试验-连酿发酵试验＞
将以45ml规模进行的发酵试验的酵母进行离心、回收，接种到10ml的CSLX培养基上使成为OD600＝100，再加入到50ml容量的带盖的灭菌塑料管中，在30℃进行发酵。48小时后取样1ml的发酵液，离心、过滤后，用高效液相色谱法进行成分分析。回收剩余酵母的总量用于下一阶段的发酵，再以相同的顺序进行发酵试验。
＜乙醇、木糖、甘油、木糖醇的测定＞
从发酵液中适当取样，离心、过滤后，将上清按照如下条件使用高效液相色谱法进行定量。分别从已知浓度的纯品样品的峰面积来计算试验样品的各浓度。
①分离色谱柱及条件
色谱柱：ShodexSUGARSH-G(6.0×50mm)＋SH1011(8.0×300mM)
洗脱液：5mMH2SO4
流速：0.6ml/min
柱温箱：60℃
检测器：二极管阵列检测器(DAD)280nm(糠醛类)
示差折光检测器(RI)(其他的糖类)
②装置构成
HPLC本体：日立L-2000系列
泵：L-2130
自动进样器：L-2200
DAD检测器：L-2450
RI检测器：L-2490
柱温箱：岛津CTO-10A
实施例1：通过YPX培养基的UTR1破坏株的木糖发酵试验1
作为宿主，使用HH467和HH468对UTR1破坏株进行育种。关于亲株(n=1)和3种的育种株(n=2)分别按照实验方法中所示的方法通过YPD进行培养后，接种到2mlYPX培养基中使成为OD600=20后加入到微型管中，在30℃静置进行发酵试验。24小时后离心、分离菌体，用高效液相色谱法对乙醇和木糖进行定量。乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。结果如图8及9所示。UTR1的破坏株在将HH467和HH468中的任一种作为宿主的情况下，与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率均增加。此外，木糖同化量与亲株几乎相同。可确认UTR1的破坏具有使由木糖进行的乙醇生成收率增加的效果。
实施例2：通过YPX培养基的UTR1破坏株的木糖发酵试验2
作为宿主使用HH473对UTR1破坏株进行育种。HH473株为由X2180-1A进行育种的菌株，其与HH467及HH468不同，为没有营养缺陷型的菌株。关于每一株分别用实验方法中所示的方法通过YPD进行培养后，接种到2mlYPX培养基中使成为OD600=25后加入到微型管中，在30℃静置进行发酵试验。在24小时或48小时后离心、分离菌体，用高效液相色谱法对乙醇和木糖进行定量。乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。结果如图10所示。UTR1的破坏株在没有氨基酸的营养缺陷型的HH473中，与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率增加。此外，一同示出了乙醇和作为48小时后的副产物的木糖醇和甘油的值(图11)。在UTR1破坏株中，木糖醇的生成量与亲株相比非常低。
其次，以HH472株作为宿主来取得UTR1破坏株。HH472株被插入到表达盒TDH3p::XYL1::PYK1p::XYL2::TPI1p::XKS1的区域与HH473株不同。
为了看到重现性，关于亲株以n=2进行与上述相同的发酵试验，关于UTR1破坏株以n=8进行与上述相同的发酵试验。其结果，UTR1破坏株的乙醇收率显著高(图12)、木糖醇生成量显著低(图13)。
实施例3：通过CSLX培养基的UTR1破坏株的木糖发酵试验
使用以在实施例2中育种的HH472作为亲株的UTR1破坏株(n=8)和亲株(n=2)在CSLX培养基上进行发酵试验。按照实验方法中所示的方法通过YPD进行培养后，接种到2mlCSLX培养基上使成为OD600=25后加入到微型管中，在30℃静置进行发酵试验。在24小时或48小时后离心、分离菌体，通过高效液相色谱法对乙醇、木糖、木糖醇、甘油进行定量。乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。乙醇生成量和收率如图14所示。在UTR1的破坏株中，与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率显著增加。此外，一同示出了乙醇和作为副产物的木糖醇和甘油的48小时后的值(图15)。任一种均比亲株低。鉴于在生物质的分解物中几乎不包含氨基酸，与YPX相比在仅包含约4分之1的量的氨基酸的CSLX培养基中也具有同样的效果，可以说是尤为重要的结果。从该结果判断本发明的微生物对以包含木糖的生物质作为原料的乙醇制造是有用的。
实施例4：45ml规模的通过CSLX培养基的UTR1破坏株的木糖发酵试验
以在实施例2中育种的HH472作为亲株的UTR1破坏株与亲株中，关于亲株(n=2)和UTR1破坏株(n=5)用实验方法中所示的方法通过YPD培养后，接种到100ml介质瓶中的45mlCSLX培养基中使成为OD600=20。在30℃下一边用磁力搅拌器搅拌(60rpm)一边进行发酵试验。在3、20、27、44、51小时后取样，离心、分离菌体，通过高效液相色谱法对乙醇、木糖、木糖醇、甘油进行定量。乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。各成分的过程如图16～19所示。UTR1的破坏株与亲株相比木糖醇和甘油的生成量降低，乙醇生成量·收率增加。此外，木糖同化速度与亲株相同。可知即使不通气而进行搅拌的发酵，通过破坏UTR1也可使作为乙醇发酵的副生成物的木糖醇和甘油的生成量减少，使乙醇生成量增加。
实施例5：10ml规模的通过CSLX培养基的UTR1破坏株的连续木糖发酵试验
将在实施例4中进行的45ml规模的发酵试验的亲株(n=2)和UTR1破坏株(n=5)进行离心、回收，并接种于10ml的CSLX培养基中使成为OD600=100，再加入到50ml容量的带盖的灭菌塑料管中，在30℃下静置进行发酵。48小时后取样，离心、过滤后，通过高效液相色谱法对乙醇、木糖、木糖醇、甘油进行定量。乙醇收率用百分率进行计算，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。将剩余的发酵液的酵母总量进行回收，以相同的顺序进行接下来的发酵，持续进行连续3次的发酵。图20表示乙醇生成量的收率，图21表示木糖同化量，图22表示木糖醇生成量，图23表示甘油生成量。即使连续进行持续发酵，UTR1破坏株与亲株相比乙醇生成量、乙醇收率也均高。特别是关于乙醇收率，亲株每经过一次发酵就有减少的趋势，与此相对，在UTR1破坏株中反而有增加的趋势。此外，作为副产物的木糖醇和甘油的生成量即使在进行连续发酵的情况下也低。木糖同化量每经过一次发酵就会减少一些，在亲株中也发现有该趋势。根据该结果，可知UTR1破坏株即使进行连续发酵也可得到同样的效果。由于由生物质来生产乙醇时，降低其生产成本非常重要，所以可连续发酵具有重大的意义。
实施例6：通过YPX培养基的UTR1破坏株、YEF1破坏株、UTR1YEF1破坏株的木糖发酵试验
对使用HH472作为宿主而制作的UTR1破坏株、YEF1破坏株、UTR1YEF1破坏株进行育种。HH472株为由X2180-1A所育种的菌株，其与HH467及HH468不同，为没有营养缺陷型的菌株。关于亲株(n=2)、UTR1破坏株(n=2)、YEF1破坏株(n=3)、UTR1YEF1破坏株(n=4)，分别用实验方法所示的方法通过YPD进行培养后，接种到2mlYPX培养基中使成为OD600=25后加入到微型管中，通过在30℃下静置进行发酵试验。在24小时或48小时后离心、分离菌体，用高效液相色谱法对乙醇和木糖进行定量。乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。结果如图24所示。UTR1破坏株与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率增加。YEF1破坏株与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率为稍有增加的程度，破坏了UTR1和YEF的两基因的UTR1YEF1破坏株与UTR1破坏株相比，乙醇收率进一步上升。此外，图25一同示出了乙醇和作为48小时后的副产物的木糖醇和甘油的值。UTR1YEF1破坏株与UTR1破坏株相比木糖醇和甘油的生成量少、乙醇的生成量多。判断通过破坏UTR1和YEF1两基因可进一步得到好的效果。
＜总结＞
如上所述，表明由木糖进行乙醇发酵时，NADH再氧化的反应为限速步骤，可知通过破坏作为NAD激酶的UTR1及/或YEF1基因可提高乙醇收率。不管在针对其合成需要NAD、NADPH的氨基酸的存在营养缺陷型的菌株中，还是在不存在营养缺陷型的菌株中，均可同样地制作本发明的微生物，将如此制作的微生物用于木糖发酵时可达到同样的效果。此外，使用本发明的微生物进行木糖发酵时，不管在营养丰富的如YPX那样的培养基中，还是在如玉米浆和尿素这样的在工业上使用的贫营养的培养基(CSLX)中，均发现了同样高的发酵效果。
实施例7：FPS1破坏株的制作
＜FPS1基因的取得＞
酿酒酵母的FPS1基因(序列号23)，其碱基序列已有报道(酵母属基因组数据库注册号：YLL043W)。此外，由同基因编码的FPS1蛋白质的氨基酸序列如序列号24所示。
以FPS1基因的碱基序列信息为基础，将由酿酒酵母制备的染色体DNA用作PCR的模板，通过PCR进行扩增、分离可得到FPS1基因。具体而言，在本实施例中，将酿酒酵母X2180-1A(ATCC26786)(MATaSUC2malmelgal2CUP1)的染色体DNA作为模板，使用下述的引物FPS1NFSCXB和FPS1CRB通过PCR来取得FPS1。将取得的DNA片段使用Invitrogen公司的TOPOTA测序用试剂盒（TOPOTAKitforsequencing，商品名）插入到载体、4-TOPO中，得到质粒pCR4FPS1(图26)。通过DNA测序来确认所插入的两基因的序列。用于取得两基因而使用的染色体DNA并不限定于上述所表示的菌株，只要是属于酿酒酵母的酵母，也可由任何的酵母来制备。通过使用了染色体DNA的PCR的目的基因的扩增及其后的分离，包含PCR引物的制备，可通过本领域技术人员所周知的方法进行。
FPS1NFSCXB：5’GAGCTCTAGAATGAGTAATCCTCAAAAAGCTC3’(序列号25)
FPS1CRB：5’GGATCCTCATGTTACCTTCTTAGCATTAC3’(序列号26)
＜用于FPS1基因破坏的单元的制作＞
制作用于破坏FPS1基因的单元为将pCR4FPS1的FPS1基因用StuI和HincⅡ切割并进行末端平滑化。将从质粒pYRAFLP(图27)用KpnI和FspI切下的AUR(金担子素)抗性标记基因(TDH3p::AUR1-C)插入其中，得到质粒pCR4FPS1AUR(图28)。将该pCR4FPS1AUR用PmeI和NotI切割，进行琼脂糖凝胶电泳，将约4.0kbp的DNA片段(具有FPS1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含金担子素抗性标记基因(TDH3p::AUR1-C))从琼脂糖凝胶切下。通过凝胶将DNA片段进行纯化提取。纯化提取使用illustraTMGFXTMPCRDNAandGelBandPurificationkit（illustraTMGFXTMPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒，商品名），根据操作指南来进行。
＜FPS1基因破坏株的育种＞
将所制备的约4.0kbp的DNA片段(具有FPS1的N末端和C末端的部分序列，在中央包含金担子素抗性基因(TDH3p::AUR1-C))转化到HH472、HH472的UTR1基因或YEF1基因或者其两者被破坏的菌株中，涂布到包含2μg/ml金担子素的YPD(酵母提取物10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖＊20g/L(过滤灭菌添加＊))培养基上。通过从生长发育了的数个菌落，使用下述的引物FPS1PF1和AUR1_R进行PCR，使1631bp的片段扩增来确认FPS1基因被破坏。进而，将转化体涂布在YPGly(酵母提取物10g/L,多聚蛋白胨20g/L,甘油20g/L)培养基上来确认生长发育，从而确认不是呼吸缺陷株。在此，显示了将金担子素抗性标记基因用作标记的例子，但是根据宿主的基因型也可使用其他的标记。只要使用与宿主的营养缺陷型互补的基因例如URA3，即可在不包含尿嘧啶的琼脂培养基上进行选择。或者，只要使用对放线菌酮有抗药性基因如YAP1，可在包含放线菌酮的YPD培养基上进行选择。
FPS1PF1：5’ATAACGCCTATTGTCCCAATAAG3’(序列号27)
AUR1_R：5’CATCTCGAAAAAGGGTTTGC3’(序列号28)
实施例8：通过YPD及YPX培养基的UTR1破坏株、YEF1破坏株、FPS1破坏株、UTR1,YEF1破坏株、UTR1,FPS1破坏株、UTR1,YEF1,FPS1破坏株的木糖发酵试验
将对于将HH472作为宿主所构建的UTR1破坏株、YEF1破坏株、FPS1破坏株、UTR1,YEF1破坏株、UTR1,FPS1破坏株、UTR1,YEF1,FPS1破坏株这6种的各破坏株和作为亲株的HH472株按照如实验方法所示的方法通过YPD进行培养后，接种到2mlYPX培养基或YPD培养基上使成为OD600=25后，加入到微型管中，在30℃下静置进行发酵试验(各n=3)。在24小时或48小时后进行离心、分离菌体(通过YPD进行的发酵仅在24小时后取样)，为木糖发酵的情况下，用高效液相色谱法对乙醇、木糖、木糖醇、甘油和醋酸进行定量，为葡萄糖发酵的情况下，用高效液相色谱法对乙醇和葡萄糖、甘油和醋酸进行定量。由木糖进行的乙醇收率用百分率来表示，将生成了木糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。结果如图29所示。FPS1的破坏株与UTR1破坏株、YEF1破坏株相同，与亲株相比由木糖进行的乙醇生成收率增加(图29)。一同示出了乙醇和作为48小时后的副产物的木糖醇、甘油和醋酸的值(图30)。在FPS1破坏株中，甘油和醋酸量与亲株相比增加了一些，木糖醇的生成量与亲株相比降低。由于UTR1,YEF1破坏株、UTR1,FPS1破坏株、UTR1,YEF1,FPS1破坏株中的任一个与各个基因的单独破坏株相比副产物生成量减少，因而由木糖进行的乙醇收率增加，即使将这些3种的基因任意地组合来破坏，也可有效地使由木糖进行的乙醇收率增加。
由葡萄糖进行的乙醇收率与木糖发酵的情况相同也用百分率来表示，以生成了葡萄糖同化量×0.51的乙醇的情况作为收率100%。结果如图31及图32所示。所有的破坏株与在葡萄糖发酵中大致相同或乙醇生成收率些许上升，即使碳源为葡萄糖，这些破坏株的乙醇生成量与亲株相比也不逊色。
实施例9：50ml规模的通过使用了YPX培养基的UTR1破坏株、YEF1破坏株、FPS1破坏株、UTR1,YEF1破坏株、UTR1,FPS1破坏株、UTR1,YEF1,FPS1破坏株的木糖发酵试验
对于以在实施例8中育种的HH472作为亲株的各破坏株和亲株，使用实验方法中所示的方法通过YPD进行培养后，接种到100ml介质瓶中的50mlYPX培养基中使成为50mg湿细胞/ml(wetcell/ml)。在30℃下一边用磁力搅拌器搅拌(60rpm)一边进行发酵试验。在2、8、22、29、46、51小时后取样，离心、分离菌体，用高效液相色谱法对木糖、乙醇、木糖醇、甘油和醋酸进行定量。各成分的过程如图33～37所示。在全部的破坏株中，与亲株相比木糖醇和醋酸的生成量降低。甘油生成量在作为FPS1破坏株的FPS1破坏株、UTR1,FPS1破坏株、UTR1,YEF1,FPS1破坏株中增加了，而乙醇生成量在全部的菌株中均超过了亲株。即使在不通气而进行搅拌的发酵中，对于UTR1、YEF1、FPS1的3种基因，不管是单独将各基因破坏，还是将这些基因任意地组合来破坏，均可有效地增加由木糖进行的乙醇收率。
工业实用性
以由生物质产生的5碳糖作为碳源来进行乙醇发酵时，可提高乙醇生成收率。特别是半纤维素含量多时有效。此外，该技术在酵母中生产在其生成中需要NAD的物质时，即使在由阿拉伯糖进行的乙醇生成等中，也可提高其收率。
序列表自由文本
序列号5：合成DNA
序列号6：合成DNA
序列号7：合成DNA
序列号8：合成DNA
序列号15：合成DNA
序列号16：合成DNA
序列号17：合成DNA
序列号18：合成DNA
序列号19：合成DNA
序列号20：合成DNA
序列号21：合成DNA
序列号22：合成DNA
序列号25：合成DNA
序列号26：合成DNA
序列号27：合成DNA
序列号28：合成DNA

Claims (2)

1.一种从木糖制造乙醇的方法，其特征在于，其使用酵母，该酵母中选自UTR1基因、YEF1基因和FPS1基因中的至少一种的基因的表达功能丧失，并且，该酵母中导入了木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖磷酸化酶基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母是酿酒酵母。
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