JP2619865B2 - 改良された酵母菌株 - Google Patents

改良された酵母菌株

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は酵母、特に比較的高い二酸化炭素およびエタ
ノール産生速度を有するパン酵母およびビール酵母に関
する。たとえば二酸化炭素の発生速度が高いほどパン酵
母にとつてより速やかな発酵が得られ、あるいはエタノ
ール産生速度が高いほどビール酵母にとつて醸造時間が
短縮される。また本発明は制御下に転写ブロツクを取り
除くことにより遺伝子発現を制御するための新規な手段
に関する。
発明の背景 酵母は最も古い培養プラントの１つである。それらの
利用は紀元前約2000年にさかのぼる。種々の酵母属のう
ちではサツカロミセス属（Saccharomyces）が経済的に
も実用上も最も重要である。これはベーキング、醸造お
よびワイン製造工業に、ならびにバイオマス産生に広く
用いられているからである。たとえばジー・リード、
“酵母”、カーク・オスマー・エンサイクロペデイア・
オブ・ケミカル・テクノロジー、24:771-806（ジヨン・
ワイリー・アンド・サンズ、ニユーヨーク、1984年）を
参照されたい。
発酵における酵母の主要な（唯一ではない）機能は、
二酸化炭素およびエタノールを供給することである。目
的とする二酸化炭素およびエタノール産生速度を得るた
めに十分な酵母をドウ、ワート（麦芽汁）その他の発酵
可能な基質に添加しなければならない。活性の高い酵母
を用いるほどより少量の酵母を使用でき、これに応じて
原価が低くなる。
酵母の発酵力を改良するために現在も研究努力がなさ
れている。乾燥酵母および湿潤酵母いずれの形態もそれ
らの二酸化炭素産生能を高めて（１）発酵時間を短縮し
および／または（２）より少量の酵母を可能にするため
に改良することができる。これらはベーキングおよび醸
造において考慮すべき原価要因である。酵母の発酵力の
改良はまた、より安定な活性乾燥酵母（ADY）の形態の
調製をより魅力的なものにする。一般に新鮮な酵母培養
物からADYを調製する際に約40％の発酵能が失われる。
この問題を除き、または軽減する方法が絶えず求められ
ている。
乾燥酵母の活性を改良するための一方法は、乾燥法ま
たは酵母菌株の乾燥性に改質して、乾燥に際して起こる
活性損失を防止することによる。プロセス改良がなさ
れ、この問題に古典的な遺伝学的取組みが施されて、あ
る程度の成果が得られた。たとえば米国特許第3,993,78
3号明細書を参照されたい。
低活性の乾燥酵母という問題を解決するための他の取
組みについては米国特許第4,420,563号明細書に記載さ
れている。特に糖分の高い甘いドウにおいて改良された
発酵活性をもつ酵母が、増殖中の酵母培養物に増殖後期
に塩類を漸増添加することにより製造された。
本発明はあらゆる酵母菌株の二酸化炭素およびエタノ
ール産生活性を高める遺伝学的および化学的に誘発され
た改良法を目的とする。
発明の要約 ここには酵母により産生される二酸化炭素、エタノー
ルその他の発酵生成物（たとえばクエン酸）の産生率を
高める方法が開示される。一般にこれらの方法は酵母細
胞中のATP水準を低下させ、これにより解糖を刺激する
ことを伴う。本発明の一観点においては、酵母遺伝子型
において代謝酵素をコードする遺伝子の天然プロモータ
ーを、調節可能なプロモーターに置換し（たとえばシン
グルコピーもしくはマルチコピーベクターにより、また
は酵母ゲノム中への同時挿入（cointegration）によ
り）、こうしてこの酵素の調節発現を可能にし、これに
よりこの酵素が触媒する代謝反応をATPが消費される逆
反応と同時に進行させることによつて、ATP水準が低下
する。本発明の他の観点においては、修飾は酵母遺伝子
型に代謝酵素をコードする遺伝子を挿入することをも伴
う。ただしこの場合はこの遺伝子の構成性発現を可能に
するプロモーターの発現制御下に行われ、これによりこ
の酵素が触媒する代謝反応をATPが消費される逆反応と
同時に進行させることができる。本発明の他の修飾は、
代謝酵素をコードする遺伝子を修飾して、たとえば酵素
のアロステリツクその他の抑制または不活化を防止し、
または除くことによる。
一形態においては酵素はFDPアーゼである。FDPアーゼ
遺伝子の付加的な突然変異を誘発し、これによりこの酵
素のSer-12に対するコドンをセリン以外のアミノ酸に対
するコドンと置換するか、あるいはこれによりたとえば
AMPおよび／またはフルクトース−2,6−ジホスフエート
によるアロステリツク抑制を低下させ、または除去す
る。他の形態においては、遺伝学的修飾は細胞外APアー
ゼに関する遺伝子を、たとえばリーダー配列をコードす
る部分の遺伝子の除去により修飾することを伴う。これ
により、修飾された酵素は酵母の細胞質内に留まり、細
胞内ATPの加水分解を触媒する。
本発明により与えられる一利点は、遺伝学的修飾がパ
ン発酵（leavening）期間中（好ましくは初期）にのみ
“活動”し、酵母の生産水準における増殖中には活動し
ないことである。これはパン酵母においては重要な利点
である。あるいは遺伝学的修飾が構成性発現可能であ
り、これによりこの修飾を発酵生成物（たとえばエタノ
ール）の産生増加のための大規模生産（すなわち酵母の
商業的規模での増殖）に際して活動させることができ
る。
遺伝学的修飾の調節は温度感受性プロモーター、また
は特定の物質の存在によつて誘発されるプロモーターの
使用により達成され、これにより酵素はあらかじめ定め
られた温度において、またはその物質の存在によつての
み発現する。あるいは発現制御はここに詳述するFLP遺
伝子構造を酵母ゲノムに挿入することによつて与えられ
る。
これらの方法に有用なベクターには、セントロメア
（動原本）を含むシングルコピープラスミド、および酵
母２μ複製原点を含むマルチコピープラスミド、ならび
に酵母ゲノムへのこれらの同時挿入を可能にするベクタ
ーが含まれる。
本発明はさらに、ATP消費を直接的もしくは間接的に
誘発しうる化学物質と共に酵母を増殖させるか、または
酵母をこれと接触させることによつてATP水準を低下さ
せる方法をも包含する。この種の化学物質には比較的小
型の有機分子および蛋白質、たとえば酵母キラートキシ
ンが含まれる。
本発明はさらに、ここに開示される方法により製造さ
れた遺伝学的に修飾された酵母をも包含する。
最後に本発明は異種（heterologous）遺伝子を酵母、
細菌、ならびにより高等の真核細胞、たとえば植物細胞
および哺乳動物細胞において制御された発現を行うため
の方法ならびにベクター系をも包含する。
図面の簡単な説明 第１図はGal Iプロモーターからの発現FLP遺伝子を含
む挿入酵母プラスミドの構成を示す。
第２図は大腸菌（E.coli）からのβ−galコード部位
に融合したGalプロモーターを含む酵母プラスミドを示
す。
第３図はグルコース制限増殖下におけるGal Iプロモ
ーターからのβ−ガラクトシダーゼ活性の誘発を示す。
第４図は調節された部位特異性組換えによる異種遺伝
子の消失を示す。
第５図は酵母FDPアーゼ遺伝子を発現するGPDHプロモ
ーターからの転写ブロツクの消失を示す。
第６図はSal I/Bgl II制限部位が結合した発現ブロツ
クを含むプラスミドを示す。
第７図は複製原点ならびに酵母および大腸菌双方に対
する選択可能なマーカーを含む発現ベクターの構成を示
す。
第８図はクローン化された酵母FDPアーゼ遺伝子のヌ
クレオチド配列を示す。
第9AおよびＢ図はそれぞれクローン化FDPアーゼ酵素
の推定アミノ酸配列、およびブタFDPアーゼのアミノ酸
配列を示す。
第10図は異種プロモーターからの発現のためのFDPア
ーゼカセツトの構成を示す。
第11図はFDPアーゼがGPDHプロモーターから発現する
発現ベクターの合成を示す。
第12図はFDPアーゼのアミノ末端欠失の構成を示す。
第13図はプロテインキナーゼ認識部位のセリン残基を
アラニンと交換することにつき示す。
第14図は野生型FDPアーゼまたはアミノ末端欠失FDPア
ーゼを発現する酵母培養物の発酵に際しての二酸化炭素
の発生を示す。
第15図はサイクリツクAMP依存性プロテインキナーゼ
に対する認識部位が欠如したFDPアーゼ発現酵母培養物
の発酵に際しての二酸化炭素の発生を示す。
第16図はガス発生試験に用いた装置を示す。
第17図は非リン酸化FDPアーゼ酵素に関する遺伝子を
発現する酵母菌株のガス発生力の改良を示す。
第18図は酵母発現ベクター中への酵母酸性ホスフアタ
ーゼプロモーターの導入を示す。
第19図は酵母酸性ホスフアターゼプロモーターのDNA
配列および酸性ホスフアターゼ（PHO5）に関する構造遺
伝子の開始部位を示す。
第20図は酸性ホスフアターゼプロモーターの３′末端
におけるユニークBgl II部位の導入を示す。
第21図は成熟蛋白質発現に関する酸性ホスフアターゼ
遺伝子中への制限部位の導入を示す。
第22図は酸性ホスフアターゼプロモーターからの、成
熟酸性ホスフアターゼ遺伝子を発現する発現ベクターの
合成を示す。
第23図は修飾された酸性ホスフアターゼ遺伝子を含む
プラスミド中への酵母セントロメアの導入を示す。
詳細な説明 酵母の解糖経路については長年広く研究されてきた。
たとえばフレンケルの“炭水化物の代謝”、酵母サツカ
ロミセス属菌の分子生物学：代謝および遺伝子発現（コ
ールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、ニユ
ーヨーク）を参照されたい。糖類の解糖代謝はエネルギ
ーおよびバイオマス転化双方の見地からみてきわめて非
効率的な過程である。それにもかかわらず酵母は好気的
増殖の酸化的リン酸化によるよりも、エネルギーが基質
レベルのリン酸化に由来する嫌気的解糖による方がいつ
そう速やかに増殖する。
本発明に至る研究の過程で、本発明者らは解糖速度が
酵母の細胞レベルにおけるアデノシン三リン酸（ATP）
によつて調節されていることを見出した。ある種の酵素
工程においてはATPの調節的役割が認められているが、
本発明者らの知るところでは解糖についてこれまで広範
な研究がなされてきたにもかかわらず、解糖経路全体に
おけるATPの調節的役割はこれまで証明されておらず、
示唆すらされていないのであるから、この知見は全く意
外であつた。本発明は細胞形質ATPの細胞レベルを低下
させるための修飾を施し、こうして解糖を刺激し、これ
により酵母による二酸化炭素およびエタノールの発生速
度を高めることによつて、上記の知見を利用している。
前記のようにパン酵母はパン発酵中のその二酸化炭素
産生能を高めることができれば改良されるであろう。ビ
ール酵母も発酵（すなわちアルコール産生）速度を高
め、醸造過程に必要な時間を短縮することによつて改良
されるであろう。本発明により修飾させた酵母を用いて
発酵過程でのバイオマス産生を低下させることによりエ
タノール産生のための発酵過程も改良された。本発明
は、細胞内ATP水準の異常な低下によつて解糖速度を調
節することによりこれらの改良を行うための修飾を提供
する。“細胞内ATP水準の異常な低下”とは、単に本発
明方法により誘発された低下を意味する。
解糖に付随する酵素は普通は過剰であるので、解糖速
度は後記の研究に際して見出されたように、特定の解糖
酵素の細胞内代謝産物（細胞内アデノシン三リン酸（AT
P）水準を含む）によるアロステリツク抑制によつて制
限される可能性がある。従つて本発明に従つて細胞内AT
P水準を低下させると解糖が促進され、これによつて二
酸化炭素およびエタノールの放出速度が高まり、バイオ
マスの産生は低下する。
しかしパン酵母の場合、酵母のこの変化が正常な増殖
に際して作動するならば、酵母はバイオマス産生時には
きわめて非効率的であろう。従つて商業的に酵母を増殖
させることが生産費の増大のため実施できないであろ
う。従つて本発明の遺伝学的修飾がパン酵母の生産につ
いてはそれが発酵（leaveningまたはfermentation）過
程に際してのみ作用し、酵母自体の生産（増殖期）に際
しては作用しないように調節することが望ましい。本発
明の一つの重要な利点は、ドウ発酵期（dough-rising p
hase）の開始段階または最初の段階で生産増加が起こる
べく遺伝学的修飾およびこれに付随する二酸化炭素産生
の増大を作動させうることである。しかしこの制限はビ
ール酵母またはエタノール産生酵母については必要では
ない。これらの場合、生産は発酵に際して同時に得られ
る。
細胞質のATP水準を低下させるための幾つかの方法お
よびその詳細な例を以下に述べる。一般にこれらの方法
には（ｉ）ATPを消費する調節された無益（futile）代
謝サイクルを確立すること、（ii）調節された様式で細
胞質ATPアーゼ活性を導入または増大させること、およ
び（iii）原形質膜の機能に影響を与えることにより細
胞質ATP水準を低下させることが含まれる。以下の記述
から明らかになるように、上記の方法（ｉ）および（i
i）は組換えDNA法により変異した遺伝子または変異した
遺伝子機能を酵母菌株に導入することを伴う。上記の方
法についてさらに詳述する前に、まずこの種の遺伝学的
修飾を行うための道具、すなわちこれらの変化をパン酵
母またはビール酵母に導入するのに適したベクター、調
節されたベクターおよび方法について述べることは有用
であろう。
ベクター 無役サイクルの導入に関与する遺伝子または細胞質酸
性ホスフアターゼ遺伝子を、プロモーターの転写制御下
に２種の自己複製型発現ベクター、すなわちシングルコ
ピーセントロメア含有プラスミド、またはマルチコピー
プラスミド中へクローン化することができる。あるいは
DNAを酵母染色体中へ組換えにより導入することもでき
る。さらに当技術分野で周知のように、これらのベクタ
ーは選択遺伝子および３′非コード部位を含む。
ベクターを酵母の一菌株中へ形質転換し、酵母細胞を
当技術分野で周知の選択プロトコールによりそのベクタ
ーを含むものにつき選択する。そのベクターを含む選択
された酵母細胞（すなわち形質転換された細胞）を適切
な増殖培地中で増殖させると、プロモーターが誘発され
て細胞質ATPの消費が開始する。
適切な選択遺伝子は当技術分野で周知である。選択試
薬はその選択遺伝子の不在下で細胞の増殖を阻止するも
のであることが好ましい。大規模培養において、プラス
ミドを失つた細胞は選択遺伝子を含まず、発酵に際して
過剰増殖することがないであろう。しかし目的生成物の
商業的生産に際しては特定の細胞毒素の使用を避けるこ
とが望ましいであろう。これによつて生成物の精製工程
が単純になる。従つて望ましい選択遺伝子は、親株の増
殖に必要な栄養素の欠如した培地で形質転換体を増殖さ
せうるものである。本発明の実施に有用な選択遺伝子に
は、たとえばURA3、LEU2などが含まれる。
ここで有用なベクターは当業者に周知の方法で合成で
きる。ベクターの構成要素、たとえば選択遺伝子、プロ
モーターなどは天然源から得られるか、あるいは後記の
ように合成することができる。基本的には大量に入手で
きる構成要素（すなわち天然プラスミド、たとえば酵母
の２μプラスミド上に存在するもの、または容易に合成
できるもの）を、適宜制限酵素およびT4 DNA リガーゼ
を用いて組立てることができる。ある構成要素を大量に
入手できない場合、当技術分野で周知のようにこれを細
菌クローニングベクター、たとえばプラスミドまたはフ
アージ中への挿入によつて増幅することができる。その
際、適宜制限酵素を使用して、当技術分野で周知の方法
により、単にその細菌を培養し、適宜なエンドヌクレア
ーゼでそのDNAを消化し、DNA断片を分離し、目的とする
構成要素を含有するDNAを同定し、これを採取すること
により、大量のベクターが得られる。通常は形質転換ベ
クターを少量組込み、次いで大量の形質転換ベクターDN
Aを産生するために適切な自己複製合成ベクター、たと
えばプラスミドまたはフアージにリゲートする。たとえ
ば周知のpBR322プラスミドを大部分の場合採用できる。
合成ベクターを用いて常法により、たとえば受容され
る原核生物を形質転換し、合成ベクターを高コピー数に
まで複製し、合成ベクターを細胞溶解により回収し、細
胞破片から合成ベクターを分離することにより、リゲー
トした形質転換ベクターをクローン化する。得られた合
成ベクター収穫物をそのまま酵母細胞中に形質転換する
ことができる。種々の型の酵母ベクターが容易に入手で
き、適宜代替することができる（ペアレントら、イース
ト（Yeast）１:83（1985））。
形質転換ベクター、ならびに種々の構成要素たとえば
特定のプロモーター、FLP遺伝子およびFDPアーゼ遺伝子
を含有するベクターを含む特定のベクターが1986年11月
５日に大腸菌HB101中においてアメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（12301、パークローン・ドラ
イブ、ロツクビル、マリーランド20852（米国））に寄
託された。これには下記のものが含まれる。
調節されたプロモーター 酵母形質転換ベクターに使用できる多数のプロモータ
ーが当技術分野で知られており、これらの本発明の実施
に際し使用することができる。ここに詳述するように、
調節されたプロモーター（それらの多くは当技術分野で
知られている）が本発明の特定の形態に好ましい。調節
された酵母プロモーターの例はガラクトース、マルトー
ス、リン酸もしくは窒素代謝、イソチトクローム類およ
びアルコールデヒドロゲナーゼIIに由来するものであ
る。調節されたプロモーターの詳細な例は酵母酸性ホス
フアターゼ（PHO5）遺伝子に由来するものである。報告
によればこのプロモーターは培地中の無機ホスフエート
水準に応じて作用する。強力なプロモーター、たとえば
酸性ホスフアターゼ（APアーゼ）に由来するものが、本
発明の特定の形態（たとえば無益サイクル形成）につい
ては最適なものよりも高い発現水準を与える可能性があ
る。目的とする調節されたプロモーターは幾つかの方法
で調節することができる。たとえば酸性ホスフアターゼ
プロモーターのクローン化コピーをインビトロでシヨー
トルの方法により突然変異誘発することができる（シヨ
ートルら、プロシ・ナシヨナル・アカデ・サイ・ユーエ
スエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）、79:1588（198
2））。あるいはプロモーター内のわずかな欠失／置換
は既知の方法でリンカーを挿入することにより行うこと
ができる（マツクナイトおよびキングスバリー、サイエ
ンス217:316（1982）；ハフロンおよびマツカーシー、
プロシ・ナショナル・アカデ・サイ・ユーエスエー（Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA）75:6012（1978））。突然変異
された酸性ホスフアターゼプロモーターを含むDNA断片
のプールを酵母／大腸周シヤトルプラスミドに挿入し、
ここでプロモーターは検出可能なマーカー、たとえば大
腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼまたはβ−ラクタマー
ゼ遺伝子を発現する（ガレンテおよびプタシユン、プロ
シ・ナショナル・アカデ・サイ・ユーエスエー（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA）、78:2199（1981）；ローズら、プ
ロシ・ナショナル・アカデ・サイ・ユーエスエー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、78:2460（1981）；マーチネツ
およびカサダバン、モレ．セル．バイオロ．（Mol.Cel
l.Biol.）、3:580（1983）；ならびにシルバーマンら、
モレ．セル．バイオロ．（Mol.Cell.Biol.）、2:1212
（1982））。形質転換された酵母コロニーを次いで検出
可能なマーカーの産生について、たとえば５−ブロム−
４−クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
（X-gal）を含有する培地上でスクリーニングする。そ
の際、目的とする表現型は高ホスフエート培地上では白
色コロニー、低ホスフエート培地上では淡青色コロニー
を与える。従つて強いプロモーターおよび弱いプロモー
ターを共に同定することができる。適切な表現型を示す
酵母細胞からDNAを採取し、常法により大腸菌中へ形質
転換する。アンピシリン耐性コロニーは酵母プラスミド
を含むはずである。これらの大腸菌形質転換体からプラ
スミドDNAが調製され、このプラスミドからの酸性ホス
フアターゼプロモーターが発現に用いられる。
あるいは温度感受性の調節遺伝子を用いることもでき
る。たとえば酸性ホスフアターゼ経路のpho Rおよびpho
U調節遺伝子における多数の突然変異が、36℃では構成
性発現、23℃では普通の調節を与えることが認められる
（ウエダら、ジエイ．バクテ．（J.Bact.）,122:911（1
975））。PHO5を含む目的プラスミドがpho Rまたはpho
U温度感受性突然変異を含む酵母菌株中へ形質転換さ
れ、酸性ホスフアターゼプロモーターが高ホスフエート
含量培地中での培養温度を変化させることにより調節さ
れる。この様式の調節は弱（突然変異）酸性ホスフアタ
ーゼプロモーターと組合わせて用いることもできる。
本発明の修飾を調節する他の方法は、天然では酸性ホ
スフアターゼプロモーターよりもはるかに弱い他の調節
されたプロモーターを用いるものである。この種のプロ
モーターが数種確認されている。たとえば酵母HO遺伝子
由来のものである。このプロモーターの発現はSir座に
おける突然変異によつて間接的に制御されている（ライ
ン、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）におけ
る潜在交配型遺伝子の調節および転位、Ph.D学位論文、
ユージーン、オレゴン大学（1979年））。Mat aを交配
型座に、アルフアカセツトHMLおよびHO対立遺伝子をホ
モタリツク座にもつ普通の“野性型”細胞においてはHO
プロモーターが作動するであろう。しかしこの菌株がSi
r突然変異を保有する場合は、Mat aおよびMatアルフア
（HML由来）の双方が発現し、HOプロモーターは作動し
ないであろう。従つてHOプロモーターが低温では発現す
るが高温では抑制される場合に、温度感受性Sir突然変
異を保有する菌株を使用することができる。
調節されたプロモーターはパン酵母の増殖中は“作動
せず”、発酵終了時、すなわちパンのドウ中で、酵母の
培養条件を変えることによつて“作動する”。たとえば
APアーゼプロモーターを用いる場合、酵母は培養物が発
酵終了前にすべてのホスフエートを使い尽くすべく調節
された量のホスフエートの存在下で増殖する。この時点
で、ホスフエートが発酵槽から枯渇したことによりAPア
ーゼプロモーターが誘発される。温度感受性発現系を用
いる場合、プロモーターが増殖中には“作動せず”、発
酵終了時に“作動する”ように温度が設定される。
無役（futile）サイクル発現のための機構としての調節
部位特異性組換え ATP減少法の発現を最適なものにするための問題は、
酵母の増殖中に作動せず、発酵中に作動すべく調節でき
るプロモーターを同定することが艱難な点である。酵母
は調節されたプロモーターに影響を与える可能性のある
種々の取扱い条件のため酵母のコンシステンシー（cons
istency）を制御し得ない種々の型のベーキング用に用
いられるので、これは特に困難である。CO2の産生（す
なわち解糖）に普通に要求されるものと同じ増殖条件に
よつて制御されるプロモーターを用いるならば、酵母は
標準的パン酵母と同じコンシステンシーをもつはずであ
る。
残念ながら解糖遺伝子は転写によつて強く調節され
ず、またこれらはパン酵母の増殖中に絶えず抑制される
こともない。しかし増殖終了時に解糖プロモーターによ
りATP減少過程の発現を始動させることによつて、発酵
はこれらの難点を克服するであろう。
従つて酵母はATPを浪費することなく増殖するが、発
酵過程ではATP減少過程が解糖プロモーターから発現す
るのを可能にする新規な方法が提供された。これはプロ
モーター（たとえばGPDHプロモーター）内の転写ブロツ
クを除去する、調節された部位特異性組換え法を採用す
ることにより達成される。これについて以下に詳述す
る。この異例の発現法は多種多様の遺伝子の発現の調節
に採用できることを留意すべきである。これには無益サ
イクルに関する酵素または細胞質ホスフアターゼをコー
ドする遺伝子が含まれるが、これらに限定されるもので
はない。
２ミクロンの酵母プラスミドが２個の逆行反復鎖間の
部位特異性組換えを行うことが示された（ハートレイお
よびドネルソン（1980）ネイチヤー286:860-864）。こ
の組換えはその遺伝子が２ミクロンのプラスミド上に位
置する特異的リコンビナーゼ（FLP）によつて触媒され
る（ブローチおよびヒツクス（1980）セル21:501-50
8））。Gal Iプロモーターはグルコースにより抑制さ
れ、ガラクトースにより誘発される（ヨカムら（1984）
モレ．セル．バイオロ．（Mol.Cell.Biol.）4:1985-199
8）。従つて天然の２ミクロンプラスミドが失われた場
合にGal Iプロモーターを用いてパン酵母のFLPの発現を
調節するならば、FLP遺伝子はガラクトースが存在する
までは発現しないであろう。増殖用発酵槽は普通はクラ
ブツリー（Crabtree）効果およびエタノール生成を防止
するために、また細胞の生成を最大限にするために、グ
ルコース制限下に操作される。本発明者らはGal Iプロ
モーターが、これらの条件下ではグルコース抑制性でな
いことを見出した。次いで発酵槽にガラクトースを添加
することによつてGal Iプロモーターが誘発され、その
結果FLP遺伝子が発現する。酵母の２ミクロンプラスミ
ドのキユアリング（curing）はたとえばエルハルトおよ
びホレンバーグの方法により行うことができる（ジエ
イ．バクテ．（J.Bact.）156:625-635）。FLP遺伝子を
前記のように他の調節可能なプロモーターによつて発現
することもできる。
従つてFLP遺伝子のクローンを分離し、調節可能なGal
Iプロモーターから発現させた。このために酵母の２ミ
クロンプラスミドをXba Iで消化し、次いでHind IIIで
消化し、1,450bp Xba I/Hind III断片を調製用ゲル電気
泳動法により分離した。次いで分離された断片を、Gal
Iプロモーターを含む一般の酵母プラスミド中へ、Pvu I
I/Sph I部位において、FLP断片がGal Iプロモーターか
ら発現する状態で挿入し、プラスミドAR900を得た（第
１図）。これによりFLP遺伝子蛋白質がGal Iプロモータ
ーから発現するのが可能となつた。
グルコース制限下での連続増殖期間中のGal Iプロモー
ターの調節 さらにFLP遺伝子制御のための機構としてのGal Iプロ
モーターを試験するために、大腸菌由来のβ−ガラクト
シダーゼコード部位に融合したGal Iプロモーターを含
むプラスミド（pRY171、第２図）（ペアレントら、前
掲）を実験室酵母菌株（たとえばKY114）のゲノム中へ
挿入することにより形質転換した。この菌株をケモスタ
ツト中へ接種し、ここで酵母用最小培地中でグルコース
制限下に培養物を増殖させた。培養物は倍加時間3.5時
間で、48時間の増殖により安定化した。ガラクトースを
発酵槽に最終濃度２％において添加し、一定期間毎に試
料を採取した。常法によりβ−ガラクトシダーゼ活性お
よび蛋白質濃度を測定した（ミラー、1972、分子遺伝学
における実験、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニユーヨ
ーク；ローズら、1981、プロシ．ナショナル．アカデ．
サイ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）78:2460-2464）。第３
図に見られるように、Gal Iプロモーターはガラクトー
スが存在する場合にグルコース制限された増殖条件下で
β−ガラクトシダーゼ活性を誘発した。
このガラクトース誘発性FLP遺伝子を組換え調節に使
用することの実用性を調べるために、固有２ミクロンプ
ラスミドを欠如し、酵母の２ミクロンプラスミドからの
反復によりフランクされた異種遺伝子を含むプラスミド
の挿入によりあらかじめ形質転換された酵母菌株（ハー
トレイおよびドネルソン、1980ネイチヤー286:860-864;
セネコフら、1985、プロシ．ナショナル．アカデ．サ
イ．ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）82:7270-
7274;アンドリユースら（1985）セル40:795-803）をGal
/FLP融合遺伝子を含むプラスミドで形質転換した。Gal/
FLP融合が作動するならば、その菌株はグルコース（Gal
Iプロモーターを抑制する）上で増殖させた場合、異種
遺伝子を発現するはずである。しかしこの菌株をガラク
トース上で増殖させた場合、異種遺伝子は組換えにより
ゲノムから切除され、その結果この遺伝子は消失するは
ずである（第４図）。グルコース培地上では97％のコロ
ニーがこの異種遺伝子を発現し、一方ガラクトース培地
上では異種遺伝子活性を含むコロニーは０％であつたの
で、これは実際に起こることが認められた。次いで発現
ブロツク、たとえば転写ブロツクを含むDNA配列、たと
えばURA3 Hind III断片、またはサイレンサー（silence
r）領域もしくは転写ターミネーター（ブランドら、198
5セル21:501-508）をプロモーター（たとえばGPDHプロ
モーター）中の上流活性化配列と翻訳開始部位の間に挿
入する。この転写ブロツク要素は、FLP遺伝子産物によ
り部位特異性組換えの基質であることが認識されたDNA
配列（表１に示す合成オリゴヌクレオチドとして挿入）
によつてフランクされる（セネコフラ、前掲；アンドリ
ユースら、前掲）。こうしてガラクトースを増殖中の非
グルコース抑制酵母培養物に添加することにより調節が
作動する。ガラクトースはFLP蛋白質の合成を誘発し、
これが発現ブロツクをフランクするDNA配列間の組換え
を触媒する。この組換えによつて発現ブロツクが除去さ
れ、これにより異種遺伝子、たとえばGPDHプロモーター
由来のFDPアーゼに関する遺伝子の発現が可能となる
（第５図）。
第６図に示す組換え部位によつて囲まれたブロツクは
寄託されており、選ばれたプロモーター中に当業者によ
つて、まずBgl II/Sal Iリンカーをプロモーター配列中
の発現可能な部位に、報告されている部位指向性突然変
異により挿入し（ゾラーおよびスミス、NAR10:6487-650
0（1982）；メソツズ・エンザイモロ．（Methods Enzym
ol.）100:468-500（1983）、DNA 3:479-488（198
4））、次いでプラスミドAZ402からの転写ブロツクをBg
l II/Sal I断片として挿入することによつて挿入するこ
とができる。
表１ FLP触媒による部位特異性組換え部位に関する配列 TCGACGCTTTGAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTA GCGAAACTTCAAGGATAAGGCTTCAAGGAT TTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCAGAGCGCTTA AAGAGATCTTTCATATCCTTGAAGTCTCGCGAATCTAG このFLP発現系を用いて事実上種々の宿主細胞におけ
るいかなる遺伝子の発現も調節することができる。一般
に２種のベクター系を用いて、異種DNA配列の宿主細胞
における発現を調節することができる。第１ベクターは
調節可能なプロモーターに作動可能な状態で結合したFL
P蛋白質をコードするDNA配列（FLP DNA）を含む。この
種のベクターの一例は、Gal Iプロモーターに操作可能
な状態で結合したFLP遺伝子を含むAR900である。他のプ
ロモーターを含む同様なベクターを常法により、AR900
からGal IプロモーターをEco RIおよびSph Iと共に切除
し、これらの代わりに目的プロモーターを同様に常法に
より、必要な場合には適宜なリンカーを用いて挿入する
ことにより構成できる。第２ベクターは、FLP蛋白質に
より認識されるDNA配列（フランキングDNA）によりフラ
ンクされた発現ブロツクを挿入含有するプロモーターに
作動可能な状態で結合した、発現すべき異種DNA配列を
含む。これらのベクターは常法によりAZ402由来のSal I
-Bgl IIカセツトを、容易に入手できる、および／また
は合成された構成要素と共に用いて構成することができ
る。AZ402由来のSal I-Bgl IIカセツトはFLP認識した組
換え部によりフランクされたHind III断片としてURA3発
現ブロツクを含む。URA 3の代わりに他の発現ブロツク
を常法により、同様に必要な場合には一般のリンカーを
用いて挿入することができる。発現ブロツク、たとえば
AZ402由来のSal I-Bgl IIカセツトを次いで必要な場合
には一般のリンカーを用いて、プロモーターに作動可能
な状態で結合した異種DNA配列を含むベクターのプロモ
ーター領域中へ挿入し、これにより発現がブロツクされ
る。挿入が適切になされたことは経験的にそのベクター
により形質転換された細胞の表現型を観察することによ
つて、および／または培地を発現生成物の不在について
監視することによつて、容易に確認することができる。
宿主細胞を上記の第１および第２ベクターにより形質転
換すると、第１ベクター中のFLP-DNAの発現によつて生
成したFLP蛋白質が第２ベクターのフランキングDNA間の
組換えを触媒する発現系が得られ、これにより発現ブロ
ツクが除去され、異種DNA配列の発現が可能となる。も
ちろん、いずれかの特定の宿主細胞を用いた場合、各ベ
クターは当技術分野で周知のようにその宿主が要求する
いかなる遺伝子要素をも含んでいなければならない。
上記のベクターおよび調節されたプロモーターを用い
て本発明者らはより高いCO2産生速度を特色とする酵母
菌株を得た。この種の菌株は宿主菌株に（ｉ）ATP消費
性の無役サイクルを、また本発明の他の形態においては
（ii）高い細胞質ATPアーゼ活性を導入することによつ
て得られた。
パン酵母菌株およびビール酵母菌株の遺伝学的修飾 パン酵母およびビール酵母の菌株は実験室菌株よりも
難しい形質転換用基質を提示する。これらは当技術分野
で周知の選択処理に用いるものだからである。
しかし修飾または異種遺伝子／プロモーター構成、た
とえば後記のGPDHプロモーターに結合したFDPアーゼ遺
伝子を、優性薬剤耐性遺伝子、たとえば抗菌薬ゲンタマ
イシン（G418）（ジミネツおよびデイビース、ネイチヤ−28
7:869（1980））またはハイグロマイシンＢ（グリツツ
およびデイビース、ジーン25:179-188（1983））に関す
るものを用いてベーキング用酵母菌株に導入することが
できる。この方法の一例として、アミノサイクリトール
ホスフオトランスフエラーゼ（ACPT）をコードする耐性
遺伝子は、G418に対する耐性を与えるがそのプロモータ
ーが弱いため耐性付与に際して部分的に有効であるにす
ぎない細菌トランスポゾンTN601によつて導入される
（ジメネツおよびデイビース、前掲）。このプロモータ
ーを酵母プロモーター（たとえば酵母グリセロアルデヒ
ドホスフエートデヒドロゲナーゼプロモーター）と交換
する。次いで目的遺伝子／プロモーターをその天然染色
体フランキング領域および前記TN601 ACPTと共に含むプ
ラスミドを構成する。このプラスミドは酵母複製原点を
含まない。パン酵母菌株をこのプラスミドにより形質転
換し、形質転換体をG418プレート上で選択する。ACPTの
プラスミドコピーはこのプラスミドが天然の遺伝子座に
おいて酵母ゲノムに挿入された場合にのみ安定に維持さ
れる。その結果、プラスミドおよびACPT配列により分離
された遺伝子（たとえばFDPアーゼ）の反復が得られ
る。これらの形質転換体をG418の不在下で増殖させる
と、プラスミドが“ルーピングアウト”により失われ、
“野生型”の、または導入された配列が残される。これ
らのG418感受性クローンを、次いでオリゴヌクレオチド
プローブを用いるゲノムDNAのサザン（Southern）ハイ
ブリダイゼーシヨンによつて、異種構成の存在につき常
法によりスクリーニングする。
（ｉ）ATP消費−無益（futile）サイクル 細胞ATP水準を低下させるための遺伝学的修飾の一方
法は、正常代謝経路をATPが消費される異常な様式で利
用し、これにより解糖を刺激するものである。より好ま
しくは、選ばれた経路が循環性であり、従つてその異常
な利用によつて、必要な代謝中間体、基質または産物の
いずれかが有意の蓄積または枯渇を生じることはない。
酵母における代謝経路の多くは細胞の増殖条件または要
求条件によつて逆方向へ進行することができる。たとえ
ば細胞の要求に応じて、代謝産物“A"が代謝産物“B"
に、または“B"が“A"に転化しうる。この種の経路を同
時に両方向に進行させると、代謝産物の正味蓄積または
損失は起こらないが、経路の進行に必要なエネルギーは
消費され、この点で“無益（futile）”サイクルであ
る。もちろん付加工程を伴う他の無益サイクルも採用で
きる（たとえばＡ→Ｂ→Ｃ→Ａ）。転写、翻訳および翻
訳後制御を採用してこの種の無益サイクルを作動または
停止することができ、その際サイクルの循環毎に１分子
のATPが消費され、産物の蓄積または基質の損失を生じ
ることはない。パン酵母の場合、ATP水準を低下させ、
これにより解糖を刺激する代謝変化は好ましくはこれが
発酵に際してのみ作動すべく調節される。
ATPを消費するために好ましい無益サイクルは下記の
ものである。フルクトース−６−ホスフエート→フルク
トース−1,6−ジホスフエート→フルクトース−６−ホ
スフエート。この経路に関与する酵素ホスホフルクトキ
ナーゼおよびフルクトース−1,6−ジホスフアターゼ（F
DPアーゼまたはFBPアーゼ）については広範にその特性
が調べられている（ブロキサムおよびラルデイ、ジ・エ
ンザイムズ８巻、ボイヤー（ph.D）編、239-278（197
3）；ウエダ、アドバ．エンザイモロジー（Adv.Enzymol
ogy）、48、193-244、（1979）；フオイおよびバタチヤ
ージー（Bhattachargee）、アルヒ．ミクロビオロ．（A
rch.Microbiol.）、129、215-220（1981）；フナヤマら
（1979））。FDPアーゼに関する遺伝子をクローニング
し、そのプロモーターを制御されたプロモーターと交換
することによつて、その遺伝子は任意に発現する。本発
明者らは、この遺伝子をグルコース上での増殖に際して
発現させると、ATPのかなりの消費およびその結果とし
ての解糖速度の上昇を達成するのに十分であることを見
出した。FDPアーゼにより駆動される無益サイクルを至
適化するためには天然のFDPアーゼ調節を理解する必要
がある。明確にするためにFDPアーゼの調節について簡
単に論じる。
FDPアーゼの調節 FDPアーゼの調節については多数の研究者が研究して
きた。野生型酵母においてフルクトース−1,6−ジホス
フエートの合成と分解の間の無益サイクルが生じるのを
防ぐために、非発酵性炭素源上で増殖している細胞にグ
ルコースが添加される際、この酵素は速やかに不活化さ
れる。このFDPアーゼ不活化は３段階で起こると思われ
る。最初の酵素活性抑制はアロステリツク調節により行
われる（レンツおよびホルター、F.E.B.S.レタ．（F.E.
B.S.Lett.）、109、271-274（1980）；ウオルフおよび
ホルツエル、微生物によるアミノ酸、ペプチドおよび蛋
白質の輸送および利用、ジエイ．ダブリユー・ペイネ
編、ジヨン・ワイリー、チンチエスター、1980年；トル
トラら、バイオケミ．バイオフイジ．リサ．コミ（Bioc
hem.Biophys.Res.Comm.）・100 688-695（1981））。グ
ルコースを酵母細胞に添加すると、酵母細胞にグルコー
スを添加すると、フルクトース−2,6−ジホスフエート
の濃度は数秒以内に検出不可能な水準から数μＭ（FDP
アーゼを部分的に抑制するのに十分）の濃度にまで上昇
する。フルクトース−2,6−ジホスフエートの合成を調
節する機構は分かつていない（ガンセドら、ジエイ．バ
イオロ．ケミ．（J.Biol.Chem.）、258 5998-5999（198
3））。最初の速やかな阻害ののち、FDPアーゼのリン酸
化を伴う第２工程が数分間にわたつて起こる（ミユラー
およびホルツエル、バイオケミ．バイオフイジ．リサ．
コミ（Biochem.Biophys.Res.Comm.）、103 926-933（19
81）；トルトラら、前掲；プルマンら、バイオケミ．バ
イオフイジ．リサ．コミ（Biochem.Biophys.Res.Com
m.）、107 1482-1489（1982））。FDPアーゼのリン酸化
状態は特定のキナーゼおよび特定のホスフアターゼによ
り制御される。リン酸化は特定のセリン残基において起
こる（ミユラーおよびホルツエル、前掲；マゾンら、ジ
エイ．バイオ．ケミ．（J.Biol.Chem.）、257 1128-113
0（1982））。この修飾されたFDPアーゼは修飾されてい
ない酵素よりも活性が低い。最初に、このリン酸化され
た酵素は特定のプロテアーゼの基質となるらしく、これ
がFDPアーゼの不可逆的不活化を約１時間にわたつて触
媒する。
FDPアーゼ調節のための遺伝学的修飾 このFDPアーゼをブロツクするために採用できる遺伝
学的方法が幾つかある。フルクトース−2,6−ジホスフ
エートを合成しないか、またはこの抑制物質に結合しな
いFDPアーゼを含む突然変異体は段階的不活化を初期に
ブロツクする。セリンの部位特異性突然変異（そうでな
い場合はリン酸化される）により第２および第３工程に
対し抵抗性の酵素が得られる。若干の酸素活性はフルク
トース−2,6−ジホスフエートによる初期の部分的阻害
後にも残存する（レンツおよびホルツエル、前掲；ウオ
ルフおよびホルツエル、前掲；トルトラら、前掲）。こ
の酵素活性は有意の無益サイクルを生じるのに十分であ
る。
本発明者らは、クローン化FDPアーゼ遺伝子中に存在
する、cAMP依存性蛋白質キナーゼに関する唯一のコンセ
ンサス認識部位である、FDPアーゼ（Arg9.Arg10.Asp11.
Ser12）中のリン酸化部位（Ser12）を確認し、直ちにこ
れを一般的な部位特異性突然変異誘発により変化させた
（ゾラーおよびスミス、前掲）。本発明者らは、リン酸
化を阻止するためにセリンをアミノ酸置換することが、
有意水準の無益サイクル形成に十分な酵素活性を生じる
のに十分であることを見出した。しかしこの酵素は高濃
度のAMPによつても阻害される（タケタおよびポーゲ
ル、ジエイ．バイオロ．ケミ．J.Biol.Chem.，240 651-
662（1965））。いつそう至適化するために、この酵素
（すでにSer12における置換によつてAMP阻害に対し若干
は抵抗性になつている）をそのAMP結合部位においてさ
らに変化させることができる。この酵素上のAMP結合部
位は明らかにされている。無益サイクルに関する酵素活
性を高めるために、この部位をインビトロで突然変異さ
せ、酵母に再導入し、AMPによる阻害の消失を間接的に
アツセイすることができる。プレート上で、もはやAMP
により阻害されない突然変異体は、糖新生炭素源上では
酵母を正常に増殖させるが、グルコース上では増殖がき
わめて貧弱であり、従つてこの種の変異についての簡便
なアツセイ法が得られる。
この無益サイクルに関与する酵素はかなり主要な酵母
蛋白質であり、この経路は相当な量のATPを消費するの
に十分である。解糖の刺激は“微細に調整され”、変化
したフルクトースジホスフアターゼ遺伝子のコピー数、
プロモーターの強度、または前記のFDPアーゼもしくはF
DPアーゼ変異体発現ベクターに用いられるプロモーター
を変化させることによつて、目的とするいかなる水準の
二酸化炭素出力をも与える。
別形態の無益サイクル（futile cycle） ATPの消費に関与しうる別形態の無益サイクルが意外
にも多数ある。たとえばピルビン酸キナーゼによるホス
ホエノールピルビン酸からピルビン酸への転化は逆行さ
せることができる（ジエイ．カツツおよびアール．ログ
ンシユタツト、カレ.トヒ゜.セル.レシ゛.（Cur.Top.cell.Reg.）、1
0 237-289（1976）ならびにアル・イー・リーブス、ハ゛イオ
ケミ.シ゛エイ.（Biochem.J.）125 531（1971））。あるいは他
の多くの無益サイクルがATPを消費すると思われ、これ
にはアミノ酸の生合成および分解、ポリホスフエートの
合成および分解、脂肪酸の生合成ならびにピリミジンの
生合成において見出されるものが含まれる。すべてが転
写の段階で厳密に制御されるので、関与する酵素の調節
をそれらのプロモーターの変化により変化させることに
よつて、無益サイクルを誘発することができる。しかし
この種のサイクルは付加的な調節機構をもつ。一般にこ
の付加的調節は中間体またはエネルギー代謝産物によ
る、酵素機能のフイードバツク阻害またはアロステリツ
ク変異を伴う。所望によりこの種のアロステリツク結合
部位を修飾して、ここに具体的なFDPアーゼの例におい
て記述した方法と同様な様式でアロステリツク阻害を除
去または低下させることができる。他の一群の調節は、
基質の利用性を制御しうる細胞器官において酵素のうち
の１種を封鎖すること、あるいは酵素複合体において不
安定な中間体を捕捉し、これらを速やかに安定な中間体
に転化することによる。これらの経路はすべてポテンシ
ヤル誘発可能なATP加水分解プロセスであり、従つて適
宜な遺伝学的修飾によつてATPを消費するために利用で
きる。
所望により、修飾された細胞により消費されるATPの
量を、CO2およびエタノールの産生が最大となるべく調
節することができる。これはより強いもしくはより弱い
プロモーターを用いるか、またはその活性を調整するこ
とによつて、あるいは前記のようにその調節の程度が培
養の温度に依存する温度感受性調節遺伝子を用いること
によつて行うことができる。
（ii）高められた細胞質酸性ホスフアターゼ活性の導入 解糖速度を調節するための別形態の修飾は、細胞質酸
性ホスフアターゼを産生して、ATPを含む有機ホスフエ
ートを加水分解するものである。普通は細胞外のもので
あるビール酵母菌の酸性ホスフアターゼは周辺細胞質
（periplasm）内に位置する誘発可能な非特異的ホスフ
アターゼである。この酵素に関する遺伝子が最近クロー
ン化され、特性が明らかにされた（ロジヤーら、プロ
シ．ナシヨナル．アカデ．サイ．ユーエスエー（Proc.N
at'l.Acad.Sei.,U.S.A.）、79 2157-2161（1982）を参
照されたい）。ホスフアターゼが細胞の周辺細胞質中へ
分泌されるのを阻止すると（たとえばこの酵素の分泌リ
ーダーを除去する遺伝学的修飾により）、細胞質中で有
機ホスフエート（ATPを含む）が脱リン酸化されるであ
ろう。しかしこの非特異的ホスフアターゼは他の重要な
有機ホスフエートをも脱リン酸化し、細胞の代謝に重大
な損傷を与えるであろう。従つて“捕捉される”細胞質
ホスフアターゼの水準は厳密に制御されなければならな
い。たとえば酵母の酸性ホスフアターゼに対する天然の
プロモーター（PHO5）は解糖速度の増大を達成すべく十
分に誘発された場合、過度のATPアーゼ活性を発現す
る。細胞質酸性ホスフアターゼによる調節されたATP加
水分解法を得るためには、十分に誘発された際に目的の
効果を示すほど弱いプロモーターを使用することが好ま
しく、あるいは下記のように基礎的水準の誘発可能なプ
ロモーターを使用することもできる。これは数種の方法
で行うことができる。その例は先きに述べた。
iii 原形質膜機能の修飾 本発明の他の形態は原形質膜ATPアーゼを伴うもので
あり、これは細胞質中のイオンの濃度を調節するために
発酵により産生されたATPの３分の１以上を使う。これ
は細胞における主要なATP加水分解経路である。従つて
この経路の刺激を細胞のATP水準の低下に利用し、これ
により発酵（すなわちエタノールおよび二酸化炭素の産
生）を刺激することができる。
原形質膜プロトンポンプに影響を与えるある種の薬物
が発酵を刺激すべく細胞を誘発するという証明がある
（セラノ、ヨーロ．ジエイ．バイオケミ．（Eur.J.Bioc
hem.）、105:419（1980））。認められた刺激はきわめ
て低い。この知見の重要性は見落されていたようであ
り、実験誤差の範囲内のものとして無視され、それ以上
の研究を行われなかつた。同様に原形質膜プロトン濃度
勾配を混乱させる他の薬物（すなわちジシクロヘキシル
カルボジイミドおよびジエチルスチルベストロール）は
発酵を刺激しないので、この刺激の理由は完全には明ら
かでない。この研究により支持された一説明は、ジシク
ロヘキシルカルボジイミドおよびジエチルスチルベスト
ロールが原形質膜ATPアーゼを阻害し、従つて細胞ATP水
準を低下させないというものである。細胞の一般代謝に
対するかなりの損傷を、他のATP依存性膜機能の破壊に
よつて受ける可能性もある。ジニトロフエノールは原形
質膜のプロトン濃度勾配を直接に破壊することにより作
用すると思われる。これにより原形質膜ATPアーゼが刺
激され、これによつて細胞ATP水準が低下する可能性が
ある。
原形質膜ATPアーゼを刺激する別法は、小型蛋白質、
たとえばリボヌクレアーゼ（アルペルら（1967）ジエ
イ．バクテ．（J.Bact）93:759-765;イフアンチスら（1
967）ジエイ．バクテ．（J.Bact）94:1509-1515）また
は酵母キラートキシン（バツセイおよびシヤーマン（19
73）ビオヒミカ・エ・ビオフイジカ・アクタ298:868-87
5）の使用によるものであろう。
本発明を下記の例に関連してさらに説明する。これら
は純粋に例示であり、請求の範囲に示された本発明の範
囲を限定するものと解すべきではない。
実験例 材料 DNA制限酵素および代謝酵素はすべてニユー・イング
ランド・バイオラボズから購入された。これらの酵素は
ニユー・イングランド・バイオラボズにより指示された
条件および緩衝中で使用された。ただしマングビーン
（mung bean）エキソヌクレアーゼはPLバイオケミカル
ズから入手され、指示に従つて使用された。ATPおよび
デオキシヌクレオシド三リン酸（dNTP）、すなわちdAT
P、dGTP、dCTPおよびdTTPはPLバイオケミカルズから購
入され、▲〔32 P〕▼はニユー・イングランド・ニユー
クリアー・コーポレーシヨンから得られた。
リゲーシヨン反応はマニアチスら、分子クローニン
グ、実験の手続き、（コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニユーヨーク州（1982））の記載に従つて（その記
載をここに参考として引用する）、その246頁に記載さ
れた緩衝液を使用し、DNA濃度１〜100μg/mlを採用し
て、平滑末端（blunt ended）DNAについては23℃、“接
着末端（sticky ended）DNAについては16℃の温度で行
われた。電気泳動は90mMトリスボレート、10mM・EDTAを
含有する0.5〜1.5％アガロースゲル中で行われた。
DNA消化ののち制限酵素を65℃に10分間加熱すること
により不活化した。一連の反応を行う場合は、各工程の
のちDNAを70％エタノールで沈殿させた。制限部位を大
型のDNAポリメラーゼ断片（クレノー、Klenow）および
４種のdNTPとの反応により“フイル−イン”したのち、
反応混合物を10mM塩化マグネシウムとなし、等容量の5M
酢酸アンモニウムを添加した。DNAを−20℃で２倍容量
のエタノールにより沈殿させ、エツペンドルフ微量遠心
機で４℃において10分間遠心分離することによつてDNA
をペレツト化した。エタノールを注ぎ出し、ペレツトを
0.2M酢酸ナトリウム10μl/μｇ・DNAとなるように溶解
した。DNAを２倍容量のエタノールで再沈殿させ、前記
と同様に遠心分離した。DNAを真空下に乾燥させたの
ち、次の構成工程に進んだ。合成オリゴヌクレオチドを
マニアチスらの前掲文献の記載に従つてキナーゼ処理
し、65℃に加熱し、４℃にまで徐冷することによりアニ
ールしたのち使用した。
DNAの調製および形質転換 大腸菌からの“スーパーコイル”プラスミドDNAの精
製および大腸菌の形質転換はマニアチスら（1982）の前
掲文献の記載に従つた。酵母の形質転換はヒネンらのプ
ロシ．ナシヨナル．アカデ．サイ．ユーエスエー（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）、75、1929-33（1978）に従つ
た。ただし1.2Mソルビトールを1.0Mの代わりに用いた。
形質転換された細菌をスクリーニングするための小規模
プラスミド調製は本質的には報告に従つた（マニアチス
ら、1982、前掲；ホームズおよびクイツグレイ．アナ
リ．バイオケミ．（Anal.Biochem.）14 193（1981）。
ただしRNアーゼ消化は制限酵素消化後に、電気泳動直前
にRNアーゼ（ベーリンガー・マンハイム）の1mg/ml溶液
１μｌをアガロースゲルのウエルに添加することにより
行われた。
菌株および培地 大腸菌株HB101をすべての細菌形質転換に用いた。酵
母菌株DB745（ボツトシユタインら、ジーン ８、17-24
（1979））、KY114またはATCC26675を用いた。大腸菌は
前記（マニアチスら、1982、前掲）の記載に従つて、ア
ンピシリン（49μg/ml）を含むかまたは含まないLB培地
中で増殖させた。酵母は形質転換前に30℃で、酵母抽出
物（デイフコ）１％、バクト・ペプトン（デイフコ）１
％、およびグルコース２％を含有する培地において増殖
させた。酵母用最少培地は下記のものを含有していた。
硫酸アンモニウム5g、グルコース10g、アデニン40mg、
ロイシン60mg、ビオチン２μｇ、パントテン酸カルシウ
ム400μｇ、葉酸２μｇ、イノシトール２μｇ、ナイア
シン400μｇ、ｐ−アミノ安息香酸100μｇ、塩酸ピリド
キシン400μｇ、ホウ酸500μｇ、硫酸銅40μｇ、ヨウ化
カリウム100μｇ、モリブデンナトリウム200μｇ、硫酸
亜鉛400μｇ、硫酸マグネシウム500mg、塩化ナトリウム
100mg、塩化カルシウム100mg、およびリン酸カリウム
（一塩基性）1g（高ホスフエート培地）もしくは10mg
（低ホスフエート培地）（１当たり）。酸性ホスフア
ターゼプロモーターの誘発のために、細胞を30℃で高ホ
スフエート酵母用最少培地で予備増殖させ、ホスフエー
トを含まなくなるまで洗浄し、低ホスフエート酵母用最
少培地に移し、30℃で増殖を再開した。移したのち８〜
12時間で最大誘発が起こつた。
ジニトロフエノール実験については、この実験に用い
た酵母菌株はフライシユマンの活性乾燥酵母であつた。
酵母を酵母エキス（デイフコ）１％、バクトペプトン
（デイフコ）１％、リン酸二カリウム0.05Mを含有し、
クエン酸をpH5.6になるまで滴加したCO中で増殖させ
た。培地は15l容カルボイ中で10lずつのバツチに調製
し、121℃で２時間オートクレーブ滅菌した。冷却後に
無菌のグルコースを２％（w/v）になるまで添加した。
消泡剤を24時間毎に添加して、起泡を防止した。供給培
地をケモスタツトおよび培養器に接続する直前に15l容
カルボイの培地に直接にジニトロフエノールを添加し、
供給培地を同一濃度にした。ジニトロフエノールはエタ
ノール中の原液に調製した。細胞をケモスタツトに接種
する前にCO中で一夜増殖させた。ケモスタツト培養物は
ニユー・ブルンスビツク・サイエンテイフイツク、モデ
ルF-2000中で増殖させた。培養器はサイドアームの付加
により１の作動容積を得るべく、あらかじめ調整され
た。使用済み培地は液内オープンチユーブによつて流出
させ、培養物の表面に留まる傾向をもつ消泡剤の流失を
防止した。
発酵槽は30℃で、撹拌調整４において操作された。容
器に窒素を500cc/分の速度で連続的に吹込み、排出ガス
はドライ−ライト（Dry-Rite）の真空トラツプを通過さ
せ、二酸化炭素測定のためパーキン・エルマー・マス・
スペクトロメーターガス分析器へ送られた。
連続培養においては培地をフアルマシアモデルM3ポン
プにより250ml/時間の割合で供給した。二酸化炭素の測
定を行う場合は、すべての調整、容量および温度を監視
し、必要に応じ調節した。培地の供給量、温度および撹
拌はかなり安定であることが認められたが、窒素ガスの
供給量は４時間の期間にわたつて10％程度変動した。従
つてガス分析器からの出力をチヤートレコーダーに送
り、窒素の流量を２時間の期間にわたつて手動で調整し
た。培養物中の細胞密度の測定を行う前にこの期間にわ
たつて排出ガス中の窒素の流量および二酸化炭素の水準
の安定性につき調べた。従つて培養物は測定を行う前に
検出限界内において安定であることが証明された。これ
はデータの再現性によつて立証された。培養物の密度
は、培養物を水に10倍に希釈し、バウシユ・アンド・ロ
ム・モデル・スペクトロニク20により600nmで密度を読
取ることによつて測定された。
ベクターの構成 発現プラスミドの大きさを最小限に抑え、かつ制限部
位の数を少なくするために、選択遺伝子としてのウラシ
ル３遺伝子（URA3）および２μの複製原点を含むプラス
ミドを構成した。あるいは他の酵母プラスミド、たとえ
ばYEp24もしくはYEp13またはこれらの均等物（ペアレン
トら、前掲）も使用できる。本発明者らによるプラスミ
ドはYIp5（ボートシユタインら、前掲）に由来し、Hae
III/Hpa I断片を付加され、酵母の２μプラスミド由来
の複製原点を含んでいた。プラスミドYOpI（第７図）が
２μ原点をYIp5のEco RI部位に導入することにより構成
された。YEp24からのプラスミドDNA（ボートシユタイン
ら、前掲）を制限酵素Hae IIIおよびHpa Iで切断し、こ
のDNAを調製用1.0％アガロースゲル上で泳動させた。２
μ複製原点を含む1.4kbの断片を分子量マーカー断片の
泳動パターンとの比較により同定し、アガロース中に切
取られたウエル中に電気的に溶離した。ウエルから得た
緩衝液をDEAEセフアセルカラム上に導通することによ
り、このDNA断片を精製した。プラスミドYIp5をEco RI
で切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノー（Klenow）断
片および４種のdNTPすべてを用いて“接着性末端（stic
ky ends）”を“フイル−インした”。YEp24からのHae
III/Hpa I断片をこの“フイル−インした"YIp5のEco RI
部位にリゲートした（第７図）。リゲーシヨン混合物を
HB101中へ形質転換し、得られたアンピシリン耐性コロ
ニーを２μ原点断片の存在につきスクリーニングした。
Hae III部位にリゲートした“フイル−インされた"Eco
RI部位はEco RI部位を再生するので、断片の配列は得ら
れたEco RI部位をプラスミド上の制限部位にマツピング
することによつて決定された。アンピシリン耐性遺伝子
内のPst I部位の近位にEco RI部位をもつプラスミド（Y
Op I）を後続の構成に用いた。
実施例1. 無益サイクルによるATPの消費 フルクトース−1,6−ジホスフアターゼに関する遺伝子
の分離 大腸菌（菌株 DF567、CGSC番号6695）においてFDPア
ーゼの欠失突然変異体の相補によりFDPアーゼに関する
遺伝子を分離した。pBR322プラスミドベクターにおける
“野生型”酵母ゲノムDNAのプラスミドライブラリーを
抗生物質耐性に関する選択によつてDF657中へ形質転換
し、酵母FDPアーゼ遺伝子を保有するプラスミドを、こ
れが細菌を糖新生炭素源上で増殖させる能力によつて同
定した。サンガーら、プロシ．ナシヨナル．アカデ．サ
イ．ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）74:5463-
5467、1977のジデオキシヌクレオチド配列決定法により
酵母FDPアーゼクローンの配列を決定した（第８図）。D
NA配列から誘導された酵母FDPアーゼのアミノ酸配列を
比較したところ、精製ブタFDPアーゼのアミノ酸配列
（マーカスら（1982）、プロシ．ナシヨナル．アカデ．
サイ．ユーエスエー（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）79:716
1-7165）（第９図）と50％以上の相同性を示し、酵母ク
ローンの同定が正しかつたことが確認された。
ATPの早期浪費を防止するために無益サイクルを慎重
に制御しなければならないので、天然FDPアーゼ遺伝子
の第１適応はそのプロモーターを発酵に際して調節でき
る配列のものと交換することであつた。酵母FDPアーゼ
のDNA配列の制限部位分析によつて、コード部位の開始
領域のきわめて近くにNde I部位が確認された（第10
図）。インビトロ突然変異誘発法によつて、Nde I部位
をSph I部位に変えることによりこのクローンの５′末
端を異種酵母プロモーターからの発現に適応させた。FD
Pアーゼ遺伝子をまずpBR322中へサブクローン化してプ
ラスミドAR705を形成した（第10図）。プラスミドAR705
をNde Iで消化し、マングビーンエキソヌクレアーゼで
処理した。Sph I部位の６塩基対のうち４対を含むアダ
プターを一端に、Xho Iオーバーハングを他端に含むア
ダプターをプラスミドにリゲートし、Xho Iで消化し、T
4 DNAリガーゼを用いてプラスミドを閉環して、プラス
ミドAT823を得た（第10図）。リゲーシヨン混合物を細
菌中へ形質転換し、アンピシリン耐性コロニーをSph I
およびXho I部位の存在についてスクリーニングした。
プラスミドAT823中のFDPアーゼ遺伝子を下記によりグ
リセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（GAP491）に
関する遺伝子からのプロモーターにリゲートした〔ホラ
ンドおよびホランド（1980）、ジエイ．バイオロ．ケ
ミ．（J.Biol.Chem.）255:2596-2605〕。プラスミドM90
3から誘導されたプラスミドO605（第13図）をKpn Iで消
化し、DNA Pol Iのクレナウ断片で処理し、Hind IIIで
切断した。プラスミドAT823をSph Iで切断し、DNA Pol
Iのクレノー断片で処理し、Hind IIIで切断し、3.8kbの
Sph I/Hind III断片を分離し、Hind III/Kpn I消化した
O605にリゲートして、プラスミドAU125を得た。プラス
ミドAU125中のFDPアーゼの発現はGPDHプロモーターによ
り調節される。
FDPアーゼ突然変異誘発 FDPアーゼを異種プロモーターと共に含有するプラス
ミドを酵母中へ形質転換し、形質転換体をFDPアーゼク
ローンの発現について調べた。FDPアーゼ活性は糖新生
または解糖炭素源上で誘発条件下に増殖させた場合、検
出可能であつた。発酵法により増殖させた場合、アロス
テリツク阻害剤および酵素の不活化によつて酵素活性が
低下すると期待されるであろう。
不活化はセリン残基のリン酸化によつて媒介されるの
で、本発明が意図する構造遺伝子の変化はこのリン酸化
部位を除去することである。リン酸化されるセリン残基
は残基12であると確認されている（この配列において唯
一のcAMP依存性蛋白質キナーゼ認識部位、精製リン酸化
酵素のペプチドマツピングおよびリン酸化ペプチドのア
ミノ酸配列決定から；リツテンハウスら（1986）、ジエ
イ．バイオロ．ケミ（J.Biol.Chem.）261:3939-394
3）。
肝FDPアーゼについて緩和なトリプシン消化を行うこ
とによつて活性を保有するアミノ末端欠失が得られるこ
とは先きに認められている（チヤタージエーら、198
5）。哺乳動物および酵母のFDPアーゼはきわめて高い水
準の保守（conservation）を示す。酵母酵素のアミノ末
端欠失を調製し、活性につき試験した。
フルクトース−1,6−ジホスフアターゼ（FDPアーゼ）
を遺伝子のアミノ末端内のDNA配列中に存在するEco RV
制限部位から、酵母GPDHプロモーターへ連結した（第12
図、AX4）。これによつてアミノ末端欠失（残基19とな
る）が得られ、これは蛋白質キナーゼ認識部位を欠如し
ていた。
さらに部位指向性突然変異誘発によりセリン（残基1
2）をアラニンに変えた（ゾラーおよびスミス、前
掲）。これは保守性変化であり、これは非リン酸化蛋白
質の活性に影響を与えないと予想され、ただし酵素のリ
ン酸化は阻止されるであろう。セリンは部位指向性突然
変異誘発によりスレオニン、バリンまたはシステインそ
の他のアミノ酸に変えることもできる（第13図）。これ
はこの残基の周りの部分の配列を一本鎖DNAウイルスM13
中へクローン化することにより達成された。この領域の
DNAにハイブリダイズし、ただしセリン残基において不
整合（mismatch）であり、従つてこの配列が代替コドン
を置換する合成オリゴヌクレオチドが作成された。次い
でこのハイブリツドからDNAポリメラーゼPol Iのクレノ
ー断片を用いて二重鎖分子を作成した。この反応は４種
すべてのデオキシヌクレオチド三リン酸およびDNAリガ
ーゼの存在下で行われた。次いでこのハイブリツド二重
鎖DNAを細菌中へクローン化し、複製し、再分離し、細
菌中へ再形質転換し、２本の鎖をほどいた。子孫の半数
はセリンに関する配列を含み、半数はアラニンその他の
選ばれたコドンに関する置換された配列を含む。これら
は置換配列に対し相補的な短鎖オリゴヌクレオチド（17
bp）へのハイブリダイゼーシヨンにより区別された。次
いでこの置換された遺伝子を前記のマルチコピーGPDH発
現ベクター中へ戻し、酵母の実験室菌株たとえばKY114
中へ形質転換した。
解糖速度を測定するために、グリセルアルデヒドリン
酸デヒドロゲナーゼ（GPDH）プロモーターからのFDPア
ーゼのクローンを発現する酵母の培養物を小型の１容
発酵槽中で試験した。培養物をバツチ式で増殖させ、窒
素を110ml/分で培養物に吹込んだ。二酸化炭素および細
胞密度を定期的に測定した。
最初に、野生型酵素（プラスミドAU 125）およびアミ
ノ末端欠失（プラスミドAX4）を発現した酵母培養物
を、非発現FDPアーゼを含む対照プラスミド（プラスミ
ドAU 110）と比較した（第14図）。これらの培養物が産
生する二酸化炭素の水準は増殖サイクルの開始時点では
きわめて類似する。しかし増殖サイクル終了時には実質
的にはより高い水準のCO2が生成した。アミノ末端FDPア
ーゼ欠失を保有する菌株の二酸化炭素出力の上昇は、野
生型酵素を発現しているものよりも低い。しかしこの酵
母菌株ではFDPアーゼは不活化していないと思われ、ア
ミノ末端欠失体は“野生型”酵素よりもかなり低い比活
性を示す。従つて野生型酵素は欠失を含む酵素よりも高
い解糖刺激を与えると予想されたであろうが、二酸化炭
素出力が増殖サイクルの終了時にのみ上昇するのはきわ
めて興味深い。これはFDPアーゼが指数増殖期にはアロ
ステリツクに調節されていることを示唆するであろう。
この調節に対して最も可能性があると思われるのはフル
クトース−2,6−ジホスフエートまたはAMPである。
FDPアーゼのリン酸化部位における特定の地点におけ
る突然変異体を作成し、発酵実験を繰返した。これらの
実験においては、GPDHプロモーター由来のセリンからア
ラニンへの突然変異を含むFDPアーゼを発現する菌株ATC
C 26675（プラスミドBA601）またはFDPアーゼを発現し
ない対照プラスミド（プラスミドBA802）を試験した。
菌株ATCC 26675は多数の被験酵母菌株のうちで最高水準
の不活化を与えることが認められた。このようにこれら
の培養は可能なガス発生力に対する保守的推定を与え
る。
前記のように発酵を行い、二酸化炭素および細胞密度
を測定した。二酸化炭素出力はこの場合もFDPアーゼを
発現する菌株では増殖サイクルの終了に伴つて増大した
（第16図）。発酵実験を反復し、良好な再現性を与え
た。培養物を増殖サイクルの終了時に採取し、遠心分離
し、下記のガス発生試験により調べた。
ガス発生試験は第16図に示した装置内で行われた。フ
ラスコは細胞1g、グルコース1gおよび培地（酵母用窒素
ベース、デイフコ）10mlを含み、最終OD600nmは12であ
つた。溶液はすべて32℃であつた。水浴も32℃であつ
た。フラスコを水浴に入れたのち、管Ａを最初の10分間
開いた。CO2発生の測定は、管Ａを閉じ、ビユレツトＹ
内の液面をビユレツトＸ内の液面に合わせてビユレツト
Ｘ内のガスを大気圧にしたのちビユレツトＸ内に発生し
たCO2の量を測定することによつて、定期的に行われ
た。100mlのCO2が産生されるまで測定を行つた。前記プ
ラスミドを含む菌株におけるCO2産生速度を第17図に示
す。この試験では突然変異体FDPアーゼを発現する菌株
は25％のガス発生力増大を示した。
前記の変異のほかに本発明はさらにフルクトース−2,
6−ジホスフエートまたはAMPによるFDPアーゼのアロス
テリツク調節の変化をも意図する。
フルクトース−2,6−ホスフエートはフルクトース−
６−ホスフエートから酵素フルクトース−６−ホスフエ
ート−２−キナーゼによる酵素経路によつて合成される
（クリフトンおよびフレンケル、ジエイ．バイオロ．ケ
ミ．（J.Biol.Chem.）、258:9245（1983）およびピルキ
スら、ジエイ．バイオロ．ケミ．（J.Biol.Chem.）、25
9:949（1949））。
酵素活性を抑制するための一方法は、FDPアーゼのク
ローン化コピーをインビトロで突然変異させ（たとえば
シヨートレら、プロシ．ナシヨナル．アカデ．サイ．
（Proc.Natl.Acad.Sci.）、79:1588（1982）を参照され
たい）、これを細胞内の自己複製選択性酵母プラスミド
に逆導入し、次いでフルクトース−2,6−ジホスフエー
トおよびAMPの阻害効力損失をアツセイするものであ
る。主として、アロステリツク阻害物質が結合する部位
は酵素構造内のかなり保守的変化である場合が多い。結
合部位のわずかな変異ですらフルクトース−2,6−ジホ
スフエートに対するその親和性を大幅に変化させると予
想されるからである。この方法は変化した酵素について
の優れたアツセイ法を必要とする。FDPアーゼは誘発可
能なプロモーターの制御下にあるので、無益サイクルが
有効に作動している場合、誘発性条件下では発酵可能な
炭素源上で増殖している突然変異コロニーはきわめて小
さいが、非誘発性条件下ではコロニーは普通の大きさで
ある。突然変異が推測されるコロニー糖新生炭素源上に
も接種した。ここではこれは誘発性条件下に普通に増殖
する。従つてこの種のコロニースクリーニング法を採取
して、変化した酵素についてアツセイすることができ
る。
最後に、変化したFDPアーゼをベーキングに用いる酵
母菌株中に前記の方法で導入する。変化したFDPアーゼ
を含むパン酵母は実質的に増大した発酵能をもつことが
認められた。
実施例2. 細胞質酸性ホスフアターゼの発現 APアーゼのプロモーター断片の調製 酸性ホスフアターゼ酵素の大型サブユニツトP60（PHO
5）の全長コピーを含むプラスミドYIpAP 11（ロージヤ
ーら、1982、前掲）を各種の制限酵素でマツピングし
た。Hpa IIは700bp制限断片を与え、これはその断片上
のCla I部位を参照することによりその位置が知られて
いる、構造遺伝子に関する開始コドン（チルら、モレキ
ユラー・セル・バイオロジー ３ 570-9（1983））から
600bpの上流DNA配列を含むことが認められた。プラスミ
ドYIpAP IIをHpa IIで切断し、DNAを調製用1.5％アガロ
ースゲル上で泳動させた。プロモーターを含む700bpの
バンドを前記のようにゲル中に切取られたウエル中へ電
気的に溶離し、DEAEセフアセルカラムで精製した。この
断片をCla Iで切断したYOp Iと混合し、DNAをT4 DNAリ
ガーゼでリゲートした。Hpa IIおよびCla Iは自己相補
性の“粘着末端”をもつので、これらのDNAは互いにリ
ゲートするであろう。このリゲーシヨン混合物をHB 101
中へ形質転換し、アンピシリンコロニーをプロモーター
断片の存在に関してスクリーニングした。この種のプラ
スミドの１種920（第18図参照）をその後の構成に用い
た。
酸性ホスフアターゼ（PHO 5）遺伝子の断片のDNA配列
から（第３図）（チルら、1983、前掲；アリマら、N.A.
R.11 1657-72（1983）、Bgl II制限エンドヌクレアーゼ
認識部位の６塩基のうち４塩基を含む領域が開始ATGか
ら5bp上流に確認された。この領域を用いて、自己相補
性配列CTAGCATGCTAGの合成オリゴヌクレオチドリンカー
により、APアーゼプロモーター配列内のこの地点にBgl
II部位を形成した。
プラスミド920をKpn Iで切断し（第20図参照）、DNA
を二重鎖エキソヌクレアーゼBal 31で処理した（レゲル
スキーら、N.A.Ｒ．５ 1145-1463（1978））。設定され
た時間毎にエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）を0.05
Mに添加することにより反応を停止した（レゲルスキー
ら、（1978）、前掲）。各時点で得たプラスミドの一部
をCla Iで消化し、12％ポリアクリルアミドゲル上で泳
動させた。300bp Cla I/Kpn I断片が消化されて約270bp
となつた時点を記録した。この時点で得た残りのBal 31
処理プラスミドをDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片お
よび４種のdNTPで処理した。自己相補性配列CTAGCATGCT
AGのリンカーをキナーゼ処理し、アニールし、このプラ
スミドDNAにリゲートした。次いでこのDNAをT4 DNAリガ
ーゼで閉環し、HB 101中へ形質転換した。約2000個のア
ンピシリン耐性コロニーをプレートから洗い出し、これ
らの大腸菌細胞からスーパーコイルプラスミドDNAを形
成させた（マニアチスら、1982、前掲）。このプールし
たプラスミドDNAを制限酵素Bgl IIで切断し、DNAを調製
用アガロースゲル上で泳動させた。切断された直線バン
ドとして泳動するDNAをアガロース中に切取られたウエ
ル中へ溶離し、DEAEセフアセルカラム上で精製した。こ
の精製DNAをT4 DNAリガーゼで再閉環し、HB 101中へ形
質転換した。アンピシリン耐性コロニーをBgl II部位の
存在につきスクリーニングした。プラスミドがBgl II部
位を獲得する唯一の方法は、この部位がBal 31消化DNA
とリンカーの結合部に形成されることであつた。これが
Kpn I部位の数百bp上流で起こる唯一の可能な配列は、A
TG開始コドンの前方5bである。Bgl II部位を含むこの種
のプラスミドの１種D718（第20図）をサンガーのジデオ
キシヌクレオチド配列決定法により調べたところ、予想
どおりであることが示された（サンガーら、プロシ．ナ
シヨナル．アカデ．サイ．（Proc.Natl.Acad.Sci.）74
5463-67（1977））。
プラスミドYIpAP 11は大腸菌において下記のとおりア
メリカン．タイプ．カルチヤー．コレクシヨンに寄託さ
れている。
大腸菌HB 101（YIpAP 11）‐ATCC No.39570リーダー／
天然蛋白質結合部における制限部位の形成 酸性ホスフアターゼ遺伝子の配列から認められるよう
に（第１図）、成熟配列の開始部付近にKpn I部位があ
る。これによつて、配列 を用いてリーダー配列と成熟蛋白質配列の結合部に制限
部位を導入することが可能となつた。
酸性ホスフアターゼ遺伝子には幾つかのKpn I部位が
あるので、断片を遺伝子の５′末端からサブクローン化
しなければならない。プラスミドYIpAP 11をBamHIおよ
びSal Iで切断し、このプロモーターを含む断片をYOp I
のBamHI/Sal I部位にサブクローン化した（第21図）。
形質転換された細菌をスクリーニングし、プラスミド80
1が正しい配列を含むことが認められた。成熟配列の
５′末端に制限部位を導入するために、プラスミド801
をKpn Iで切断し、上記のアダプターをKpn I部位にリゲ
ートした（第21図）。次いでプラスミドをBamHIで切断
し、この部位にDNAポリメラーゼＩのクレナウ断片を
“フイル−インし”、プラスミドを再閉環した。形質転
換した細菌コロニーをアダプターの存在に関してスクリ
ーニングした。この種のプラスミドの１種（J401）を後
続の構成に用いた。第21図から分かるように、アダプタ
ーはリーダーと成熟酸性ホスフアターゼの結合部にXho
I部位を形成する。従つてプラスミドをXho Iで切断し、
オーバーハングをマングビーンエキソヌクレアーゼで消
化すると、成熟コード部位の開始部の配列内の適正な位
置に平滑（blunt）部位が形成される。
酸性ホスフアターゼの“リーダー欠如（leader les
s）”クローンの合成 まず酸性ホスフアターゼの全長コピーをプラスミドJ4
01から構成した。プラスミドYIpAP 11をBamHIで切断
し、５′−オーバーハングにDNAポリメラーゼＩのクレ
ナウ断片を“充填し”、次いでSal Iで切断し、APアー
ゼ遺伝子を含むBamHI/Sal I断片を調製用ゲル電気泳動
により精製した。次いでこの断片をプラスミドJ401のSa
l I/Nru I部位にリゲートした（第22図）。Nru I部位に
リゲートした”フイル−イン"BamHI部位はBamHI部位を
再生する。次いで酸性ホスフアターゼプロモーターを構
造遺伝子に再結合させた。プラスミドD718をBgl IIで切
断し、開始メチオニンコドンに対する酸性ホスフアター
ゼプロモーター配列を再生する配列 のアダプターをBgl II部位にリゲートした。次いでこの
プラスミドをEco RIで切断し、このEco RI-Bgl IIアダ
プター断片（第22図）をあらかじめXho Iで切断したプ
ラスミドK 219中へクローン化し、マングビーンエキソ
ヌクレアーゼで処理してDNA末端をフラツシし、次いでE
co RIで切断した。形質転換体をスクリーニングし、ジ
デオキシヌクレオチド配列決定法により適正な制限断片
を含むプラスミドの配列を決定し、プラスミドM138がプ
ロモーターと成熟遺伝子の結合部に適正な配列をもつこ
とが認められた。
プラスミドへの酵母セントロメアの付加 酸性ホスフアターゼプロモーターは約1,000倍に誘発
しうる。酵母プラスミドのコピー数は種々の複製原点ま
たは酵母セントロメアを用いることにより変更できる
（クラークおよびカルボン、1980;チヤンパーおよびカ
ルボン、1983）。酵母セントロメアは２μ原点プラスミ
ドのコピー数を細胞当たり約１コピーに低下させる。
プラスミドM138をEco RIで切断し、各末端をDNAポリ
メラーゼＩのクレノー断片でプラント処理した。次いで
酵母の染色体４からのセントロメアを含むプラスミドYC
P19（第23図）（ペアレントら、前掲）をHind IIIで切
断し、各末端をDNAポリメラーゼＩのクレノー断片で平
滑化した。次いでセントロメアを含む断片をM138のEco
RI部位にリゲートして、プラスミドN305を得た（第22
図）。
細胞質酸性ホスフアターゼの発現 プラスミドM138およびN305を対照プラスミドM721と共
に酵母中へ形質転換した。ウラシルプロトトローフ（原
栄養体）を選択し、過剰のグルコース（４％）を含有す
る高ホスフエートMO培地中で、１容ニユー・ブルンス
ビツク・サイエンテイフイツク・モデルF-200発酵槽内
において増殖させた。増殖中にバウシユ・アント・ロム
・モデル・スペクトロニク20により600nmで細胞密度を
測定した。結果を下記の表１および２に示す。発酵槽は
30℃で撹拌調整４において操作された。容器に窒素を43
0cc/分の割合で連続的に吹込み、排出ガスをドライ−ラ
イト真空トラツプに導通し、パーキン・エルマー・マス
・スペクトロメーターガス分析器に導入してCO2を測定
した。
３種のプラスミドを保有する各菌株が高ホスフエート
培地上で増殖する際に産生する二酸化炭素の水準は異な
ることが認められた（表１）。その際高ホスフエート培
地中のプロモーター活性の基礎水準は解糖速度に影響を
与えるのに十分なものであつた。データをコンパイル
し、増殖サイクルの同一段階について正規化した場合、
高ホスフエート培地で増殖している培養物が産生する二
酸化炭素の水準はプラスミドのコピー数と共に高まるこ
とが認められた。マルチコピープラスミドを保有する菌
株は対照よりも２倍多い二酸化炭素を産生し、単一コピ
ープラスミドを保有する菌株は中間水準の産生を示し
た。このように本発明に従つて酸性ホスフアターゼを制
御し、これによつて細胞質ATPの水準を制御し、二酸化
炭素の産生を増加させることができる。
実施例3. 原形質膜アンカツプラーが解糖に与える影響 漸増する量の2,4−ジニトロフエノールをフライシユ
マンパン酵母の安定なケモスタツト培養物に添加したと
ころ、かなりの二酸化炭素産生刺激が認められた。
ケモスタツトにより定められた増殖条件下での細胞当
たりの二酸化炭素の基礎水準を測定するために、かつ培
養物の安定性を調べるために、予備実験を行つた。一夜
培養物をケモスタツトに接種し、バツチ培養物として24
時間増殖させた。培地の供給を開始し、培養物をさらに
24時間放置して安定化したのち測定を行つた。二酸化炭
素の産生および細胞数を48時間にわたつて監視した。こ
れらの結果を表３に示す。培地の添加開始後の期間を時
間で示す。二酸化炭素をガス流中の％として示す。
培養物は比較的安定であることが認められた。
ジニトロフエノールを供給培地に５μＭで添加した。
実験法に示したようにジニトロフエノールは培養器にも
５μＭで添加した。
培養物を48時間放置して安定化した。表４から認めら
れるように、５μＭのジニトロフエノールは二酸化炭素
の産生にほとんど影響を与えなかつた。
培養物のジニトロフエノールの濃度を徐々に段階的に
200μＭにまで高めた。ジニトロフエノール添加の各工
程後に培養物を36〜48時間放置し、安定化したのち、細
胞密度および二酸化炭素濃度を測定した。上記の表４に
示されるように、ジニトロフエノール濃度の増大に伴つ
て細胞当たり産生される二酸化炭素水準は上昇した。
ジニトロフエノールが細胞の代謝に与える影響が原形
質膜ATPアーゼのアンカツプリングであるとすれば、二
酸化炭素排出量の増加およびこれに対応する細胞密度の
低下が予測されたであろう。原形質膜イオン濃度勾配の
散逸がこのイオン濃度勾配に依存する他の細胞プロセ
ス、すなわち輸送にも影響を与えることを重い起こすべ
きである。従つて細胞の代謝効率がこの処理によつて低
下したことが認められたとしても意外ではないと思われ
る。従つてこの解糖刺激の水準は最小であると予想され
たであろう。
上記の実験は二酸化炭素の産生をジニトロフエノール
によつて用量依存性の様式で刺激することを証明したの
である。刺激の水準は再現性が高く、用いた最高濃度に
おいては２倍以上の二酸化炭素を産生することが認めら
れた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕ ｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ，Ｖｏｌ．７，Ｐ．389−396，1976 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏ ｌ．105，Ｐ．419−424，1980 Ａ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ“Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉ ｔｉｏｎ”1975，Ｗｏｒｔｈｐｕｂｌｉ ｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒ ｋ），Ｐ．631−632 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕ ｓｔｒｉａｌ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏ ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１, Ｐ．157−163，1983 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．186, Ｐ．307−319，1985

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】サッカロミセス属の酵母の二酸化炭素およ
    びエタノール産生速度を高める方法であって、 （ａ）酵母由来酵素のフルクトースー1,6−ジホスファ
    ターゼ（FDPアーゼ）をコードするDNAにより上記酵母を
    形質転換し、該DNAは調節可能なサッカロミセス属酵母
    のプロモーターの制御下にあり、該プロモーターはガラ
    クトース、マルトース、ホスフェート又は窒素代謝、イ
    ソチトクローム及びアルコール脱水素酵素IIプロモータ
    ーの遺伝子から選択されるものであり、そして （ｂ）グルコースの存在下での増殖中に、該調節可能プ
    ロモーターを活性化することにより前記DNAの発現を誘
    導する、 ことから成る方法。
  2. 【請求項２】フルクトース1,6−ジホスファターゼをコ
    ードするDNAを、突然変異を誘発して、そのDNAのコドン
    12がアラニン、トレオニン、バリン又はシステインをコ
    ードするものとする、特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】調節可能プロモーターが、フルクトースー
    1,6−ジホスファターゼを所定の温度でのみ発現するよ
    うな温度感受性プロモーターである、特許請求の範囲第
    １項記載の方法。
  4. 【請求項４】前記調節可能プロモーターが、前記DNAの
    構成的発現を可能にするものである特許請求の範囲第１
    項記載の方法。
  5. 【請求項５】サッカロミセス属の酵母の二酸化炭素およ
    びエタノール産生速度を高める方法であって、 （ａ）細胞外酸性ホスファターゼをコードする酵母DNA
    を遺伝学的に修飾し、該遺伝学的修飾により、酸性ホス
    ファターゼを酵母サイトプラズム中に保持せしめ、かつ
    細胞内ATPの制御された加水分解を触媒させるように
    し、 （ｂ）遺伝学的に修飾されたDNAを酵母細胞内に挿入
    し、 （ｃ）この酵母を適切な培養条件下で増殖する、 ことから成る方法。
  6. 【請求項６】サッカロミセス属の酵母の二酸化炭素およ
    びエタノール産生速度を高める方法であって、 （ａ）細胞外酸性ホスファターゼをコードする酵母DNA
    を遺伝学的に修飾し、該遺伝学的修飾により、酸性ホス
    ファターゼを酵母サイトプラズム中に保持せしめ、かつ
    細胞内ATPの制御された加水分解を触媒させるように
    し、 （ｂ）遺伝学的に修飾されたDNAを酵母細胞内に挿入
    し、 （ｃ）この酵母を適切な培養条件下で増殖させる、 ことから成り、該遺伝学的修飾が、前記DNAから機能的
    分泌リーダー配列を欠失するものであることを特徴とす
    る方法。
  7. 【請求項７】前記DNAがベクター内に含有されており、
    該ベクターが自己複製単一コピー、セントロメア含有プ
    ラスミドから成る特許請求の範囲第６項記載の方法。
  8. 【請求項８】前記DNAがベクター内に含有されており、
    該ベクターが酵母２μ複製起点を含有するマルチコピー
    プラスミドでから成る特許請求の範囲第６項記載の方
    法。
  9. 【請求項９】前記DNAが酵母の染色体に挿入される特許
    請求の範囲第６項記載の方法。
  10. 【請求項１０】酵母フルクトースー1,6−ジホスファタ
    ーゼをコードするDNAを含有するサッカロミセス属の酵
    母細胞であって、該DNAが調節可能サッカロミセスプロ
    モーターの制御下にあり、該酵母細胞が二酸化及びエタ
    ノールの高い生産速度をもつことを特徴とする酵母細
    胞。
  11. 【請求項１１】前記調節可能プロモーターにより、前記
    DNAの構成的発現が可能である特許請求の範囲第10項記
    載の酵母細胞。
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