JPH02276589A - 酵母よりヒト血清アルブミンおよびその他の異種蛋白質を微生物学的に生産する方法 - Google Patents
酵母よりヒト血清アルブミンおよびその他の異種蛋白質を微生物学的に生産する方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
、特にクルベロミセス (Kluyveromycas)属を培養することによ
るヒト血清アルブミン(HSA)の微生物学的製造方法
に関する。
子量66キロドルトン(kd)を有する585アミノ酸
のタンパク質である。
17ジスルフイド結合によって維持される(ブラウン、
J、R,アルブミンストラクチュア、ファンクションア
ンドユーセズロゼノア、V、M等(編集)、バーガモン
プレス、オックスフォード(1977年)。
に多形であることが知られており。
下で電気泳動解析によって検出されている(ウェイトカ
ンプ、L、R,等、Ann。
〜226頁)、H8A遺伝子は、14イントロン配列に
よって15工キソン配列に分断され推定上の“キャップ
″部位から最初のポリ(A)付加部位まで16.9キロ
ベース(kb)以上を包含している。
流に分泌される。これは血中で最も多いタンパク質で約
40g/in血清の濃度を有し、従っていかなる時にも
ヒト体内中に約160gのアルブミンが循環している。
ることである。また種々の物質に対して例外的結合能を
有し、更に疎水性分子(例えばステロイド及び胆汁塩)
並びに治療物質の細胞内輸送の役目を果たし、従ってこ
れらを各作用部位に運搬することができる。更にその上
H8Aは最近プロスタグランジンの異化作用に関係して
いる。
ISAを生じ、これは分泌経路に新生ポリペプチドを導
く18アミノ酸のシグナル配列を含む、このシグナル配
列は、タンパク質が小胞体から放出される前に恐ら(は
同時翻訳処理によって切断される。この最初のタンパク
質分解切断は前駆体プローH8Aを生じこれは循環H8
Aの成熟形態では通常存在しないN−末端へキサペプチ
ド(Arg−Gly−Val−Phe−Arg−Arg
)を含んでいる。
AのN末端アスパラギン酸に結合したヘキサペプチドを
切断することによる第2のタンパク質分解段階でプロペ
プチドを除去する(ジュダ、J、D、及びキン、P。
5頁、バサースト、1.C,等サイエンス第235巻(
1987年)、348〜350頁)、シかしながら、処
理されないヒトアルブミンはプロペプチド配列の遺伝性
成熟を持つまれなヘテロ接合体で血流に存在する半分と
非常にまれなホモ接合体でアルブミンの全部を示すこと
ができる(タカハシ。
USA第84巻(1987年)、7403〜7407
頁)。
ーチを表わし、配列Arg−Gly−Val−Phs−
Arg−Gln−’−Asp+1で始まり、置換基Ar
g−1・・・>Glnはプロペプチドの切断を妨げて成
熟する(ブレナン、S、O,及びカレル、R1W、ネイ
チュア、第274巻(1978年)908〜909頁)
。プロアルブミンLi1la(アブド、Y0等、FEB
Sレターズ第131巻(1981年)286〜288頁
)及びタケフ(ナカダ等、臨床病理第30巻(1982
年)791〜796頁)として既知の他の変異体は、次
のN末端配列各々Arg−Gly−Val−Phe−A
rg−His−Asp及びArg−Gly−Val−P
he−Arg−Pro−Aspを有する。こ扛らの各々
の場合に於て観察される突然変異は、成熟ヒトアルブミ
ンのアミノ酸配列を通常先行させ、アルギニンコドンの
唯一の塩基変化を生じる塩基性アミノilArg−Ar
g対に影響を及ぼす(タカハシ。
USA第84巻(1987年)7403〜7407頁
)。
プチド及びH8A以外の血漿タンパク質を包含する他の
タンパク質の突然変異の実質的特徴である(ダグラス、
00等、Annu、 Rev、 Biochem、第5
3巻(1984年)665頁)、最近、肝臓中でプロア
ルブミンをアルブミンに切断するコンバーターゼが酵母
のプロテアーゼyscF に極めて密接に関係している
であ−ろうことか開示された(バサースト、1.C,等
、サイエンス第235巻(1987年)348〜350
頁)、このカルシウム依存チオールプロテアーゼはサッ
カロミセスセレビシェ(Saccharomycas
carevisiae)のKEX2遺伝子によってエン
コードされ、ゴルジ装置の膜に恐らくは結合される。、
S。
Arg対で各プロタンパク質を切断することができない
ため、α因子と呼ばれるフェロモンの突然変異及びキラ
ー毒素のそれに含まれることが知られている(ジュリウ
ス、D。
その上、KEX2遺伝子によってエンコードされる酵母
酵素は試験管内でアルブミンの正常なプロ配列(Arg
−Arg)を正しく認識して切断するが、プロアルブミ
ン、キリストチャーチの変異プロ配列(Arg−Gin
)を切断しないことは証明することができるパスルスト
、1.C,等、サイエンス第235巻(1987年)3
48〜350頁)、yscFプロテアーゼに類似したコ
ンバーターゼは、最近に、ラクチスのKEXI遺伝子に
よってエンコードされるとして記載されている(ヴエソ
ロスキーロウベル9M0等、イースト第4巻(1988
年)71〜81頁)、この知見を考慮してこれらの酵母
の正しい組換え体ヒトアルブミン変異能及び後者の培地
への分泌能を試験した。
めている。この中で商業上の興味はこの生成物が例えば
手術、事故、出血中の血液損失に埋め合わせるいわゆる
血液容積増量剤で1日当り及び数g範囲の1個当りの服
用量で広く使用される事実から生じている。
分画の常法によって生産され(コーン、E、J、等4
J、 Am、 Chew、 Soc、第68巻(194
6年)459頁)、血漿の世界的年間消費量は、9.5
X10’ffの範囲にある。またJ、リアウタウド等(
Bth Intern。
ピュアリフィケーションオブプロテインズ、デベロップ
メントオブパイオロジカルスタンダード′°、カーゲル
(編集)、ペイル第27巻(1973年)、107頁)
に記載される手法に従ってヒト胎盤から抽出することも
できる。
ス性汚染(例えばB型肝炎及びエイズ)がなく低コスト
で高純度且つ良好な安定性を有する改良された生産物を
得る可能性を開発した。しかしながら今のところH3A
の工業的規模に十分経済的関心があるほど有効な遺伝子
工学に基づく操作は知られていない。
生理化学特性を有する正しく突然変異した分泌アルブミ
ンを高レベル産生させる有効な宿主/ベクター系がない
ためである。
選択に思われるとしても、かかる操作の価格は医薬目的
に使用されるアルブミンの現在の販売価格を十分超えて
しまう(クラウスナー、A、バイオテクノロジー第3巻
(1985年)119〜125頁)、この生産物は一般
に数g量で低単位価格で処方されるため、HSAのバイ
オテクノロジー生産は微生物発酵系でのみ可能であると
思われる。
的に重要な異種タンパク質の微生物生産に対する宿主生
物として大腸菌(Escherichia coli)
を使用している。たとえこのタイプの操作が多くの異種
タンパク質に適当であるように思われたとしても、この
微生物を用いて経済的に許容できる条件下でH3Aを生
産する試み全ては一部しか成功してない。
がほとんどの場合、異種タンパク質を培地に排泄するこ
とができず更にこれらのタンパク質が細胞区画の1つに
蓄積するという事実にある。所望のタンパク質は従って
細胞物質から分離されねばならず、複雑な費用のかかる
操作のもとである。更にその上、大腸菌は内毒素と病原
体を生じ生産されたタンパク質を汚染し得る。このため
最終生産物、特に後者を医薬産物として用いる場合、残
留内毒素を除去する精製に十分な注意を払わねばならな
い。
蓄積される場合には正しく折りたたまれる特性を失う、
一般に分泌はH3Aに存在するようなジスルフィド結合
を生成させることができるために必要とされる。従って
大腸菌で産生されるH8Aは分泌されないという事実は
それを不溶形態で細胞内に沈降させる(ラック、Mo等
、バイオテクノロジ−第5巻(1987年)1309〜
1314頁)、従って細菌細胞から抽出した後タンパク
質は変性し、次いで試験管内で再生させなければならな
い。
異的な転写後及び翻訳後、修飾を行なうことを可能にす
る細胞機構がない。
Aを十分なレベルで発現させるために大腸菌を誘発する
ことは困難であるように思われる。その上、H8A構造
遺伝子が細菌pac又はompA遺伝子から誘導される
シグナルを分泌するために融合されている人工アルブミ
ンは一般に不完全に処理される(同書)、更にその上プ
レプロ配列のない、即ちMat−HSA形のH3A表現
はN末端メチオニン残基が大腸菌メチオニンアミノペプ
チダーゼ(MAP)によって切り出されないことを示し
ている(同書、欧州特許第198745号、公告日19
86年10月22日)。従って大腸菌由来H8Aは生体
内の成熟形態から得ることができず、ファージ由来リー
ダー配列を切り出し、次に変生し試験管内で再生するた
めにトリプシン切断によって試験管内で修飾させねばな
らない(欧州特許第236210号、公告日1987年
9月9日)。
btilis)についての研究が最近発表されている(
サウンダース、C,W、等J、 Bactan’ol。
の研究は原核微生物例えば枯草菌が1分子量ヒトタンパ
ク質例えばHSAを分泌する可能性を有するが、増殖培
地に於ける分泌が枯草菌原形質体即ち正常な細胞壁が酵
素処理によって消化されている細菌細胞を用いたときに
のみ得ることができることもわかっている。更にその上
、修飾H8Aのパーセントは生産されるタンパク質のレ
ベルに逆比例し、高発現レベルでは組換え体H3Aのほ
とんどは成熟されない形で残る(同書)、その上、枯草
菌からの組換え体HSAの物理化学的特性に関するデー
タは報告されていない。
レベルは免疫学的方法を用いて培養上清で検出されるH
8A量を考慮すれば嘆めて低い(欧州特許第02297
12A2号、公告日1987年7月22日)。
使用は微生物真核系、例えば酵母又は真菌の使用である
。事実これらの微生物は、更に複雑な真菌生物1例えば
哺乳類細胞に見られる構造及び細胞組織化の全てを有す
る。特に酵母は多くのタンパク質の活性に重要な転写後
及び翻訳後修飾を行なうことができる。更に酵母は工業
的規模の生産に非常に一般的であり、高細胞密度に生育
させることができ、病原性がなく、内毒素を生産せず古
代から食品工業に使用されている。結局哺乳類細胞と対
照的に酵母を用いた遺伝子操作は実施が容易であり、古
典的分子遺伝学は大量のデータを提供している。
はパン酵母を示すために用いられ、二基は最も一般的で
既知の最良種の1つである。以下酵母という言葉は他属
にも用いS、セレビシェ種に限定されないことは理解さ
れる。
現はS、セレビシェに於て全タンパク質の約1%の最大
レベルで証明されている(エチェバリー、T0等、バイ
オテクノロジー第4巻(1986年)726〜730頁
)、シかしながら、この研究に記載される抗H3A抗体
によって認識される物質は細胞に結合したままであり、
従って培養上清には全く運搬されない、更に組換え体タ
ンパク質の詳細な特徴は報告されていない。
於けるHSAの生産が報告されている(欧州特許第02
01239号、公告日1986年11月12日)、これ
もまた得られた生成物に関する量的又は質的データは記
載されていない、更にその上、この工程はMet−H8
Aの発現即ち成熟アルブミンの配列からすぐ上流のアミ
ノ酸メチオニンで開始するH8Aの対立遺伝子を生ずる
。シグナル配列の欠如は、組換え体HSAの分泌及び成
熟を排除し、三次構造が確認されていない細胞内アルブ
ミンの蓄積を生じる。更に最終産物に於けるN末端メチ
オニンの欠如は証明されていない。
培地に生コンホーメーションのHSAを有効に生産及び
排出することができる。
含み、天然に、マルキシアヌス変異株ドロソフィラルム
(drosophilarum)プラスミドpKD1由
来のベクターを使用する。
ある種のpKD1配列の価値と重要性をこれらを組込む
発現プラスミドの効能、特に安定性に於て明らかにした
。
組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)、メタロプ
ロテアーゼインヒビター(TIMP)及びインターロイ
キン例えばインターロイキン−1β(IQ−1β)の発
現にpKD1のこれらの実質的な要素を使用することに
関するが、これらのタンパク質は、pKD1プラスミド
誘導体が“一般的″即ち発現及び/又は分泌が所望され
るタンパク質の種類についてたとえあるとしてもほとん
ど依存しないことを示すために実施例としてだけ考慮さ
れる。
チス及びマルキシアヌスを含み、以後各々に、ラクチス
及びに、フラギリス(fragilis)と呼称する)
の酵母は重要な微生物であり、バイオテクノロジー工業
に於てかなり商業上の関心を有する。に、ラクチス及び
に、フラギリスは例えば酵素ラクターゼ(β−ガラクト
シダーゼ)の商業生産に用いられる。これらの酵母は、
酪農工業の乳漿主な副産物で生育させることができる。
を果たす゛単細胞タンパク質′。
イベロミセス属の微生物は、いわゆるGRASリスト(
Genarally Recognized As5a
fe)に言及されており、これは医薬グレード産物の生
産に重要な要素を表わすものである。
りである。3種のクローニングベクターがこの微生物に
対して記載されている。
クターを組込み、細胞に導入した後生物内組換えによっ
てクルベロミセス染色体に組込まれる。極めてまれな場
合は有効な選択マーカーの存在を必要とする組込みは二
基らのベクターが細胞内に自律複製できる配列を含まな
い場合に得られる。この系の利点は形質転換菌株の安定
性、即ち組込まれた配列の保持に選択圧を必要としない
通常の栄養支持体で生育することができるという事実で
ある。しかしながら欠点は組込まれた遺伝子が細胞当り
1個又は良くて少数のコピーに存在するだけであること
である。この低遺伝子量はしばしば異種タンパク質の低
レベルの生産となる。
自律的複製配列(AR8)を含むベクターを複製する(
ダス、S、及びホレンバーグ、c、p、カレントジェネ
ティクス第6巻(1982年)123〜128頁、国際
特許出願WO83104050,公告日1983年11
月24日、国際特許出願Wo 83104051、公告
日1983年11月24日)、かかるベクターは有糸分
裂細胞分裂の分離が極めて非相同であり、後者が選択圧
下で生育されるときでさえ高頻度で細胞から損失する結
果となるため中程度の関心があるにすぎない。
ミドpGK1−1 (Kl)(デロウベンコート、L0
等、J 、 Bactarial、第154巻(198
2年)737〜742頁、欧州特許第0095986号
、公告日1983年12月7日)からあるいはに、マル
キシアヌス変異株ドロソフィラルム(drosophi
larum)から分離される環状プラスミドpKD1(
欧州特許第0241435A2号、公告日1987年1
0月14日)から天然酵母プラスミド由来のベクターを
複製する。線状キラープラスミドから誘導される複製配
列を含むベクターは、それらの保持に特別の栄養培地を
必要とし、選択圧下でさえもわずか15個発生後−定集
団中40〜99%の細胞が失われるため、異種タンパク
質の大量生産に実際的な有用性はない(欧州特許第00
95986号、公告日1983年12月7日)、現在ま
で記載されているクルベロミセス属の形質転換に最も有
効なベクター系は細胞内プラスミドPKD1から誘導さ
れ、pKDlの全配列を含む構築は、高頻度で移入する
ことができ、70〜100コピーで細胞中に存在し、最
も重要なことには非選択条件下で比較的高安定性を有す
る。しかし、工業的規模の発酵は少なくとも40個の発
生にプラスミドの安定性を必要とするため欧州特許第0
241435号に記載されるベクターの有用性は応用を
探索することを制限している。欧州特許第024143
5号に記載される最も有効なベクター(P3)でさえも
非選択培地中わずか6個発生後一定集団中細胞の約70
%が失われる(欧州特許第0241435号、公告日1
987年10月14日)、大規模な発酵で選択圧を維持
することは技術上可能であっても選択培地の使用はしば
しばかなり低細胞密度を生じ、十分規定された菌株の使
用を必要とし、この方法を魅力のない、より高価なもの
にする。更にその上、欧州特許第0241435号は商
業的興味を有する異種タンパク質の発現の単独実施例を
含まない。事実pKD1由来ベクターから発現されるこ
とを示した゛1異種1′遺伝子は酵母S、セレビシェの
URA3遺伝子のみである。従って非酵母遺伝子例えば
哺乳類由来の遺伝子をpKDl及びそのクルベロミセス
の多発現に導入するとプラスミド不安定性の増大を生じ
ないことが明らかにされているにとどまっている。
ることができる新規な発現ベクターの生産及び欧州特許
第0241435号に記載されるものより著しく優れた
プロセッシング安定性特性である。本発明で記載される
新しい構築は非選択培地中50個発生の増殖後85〜9
0%の細胞の高コピー数で保持される。従って最適生育
特性のため且つ高細胞密度で長年使用されていたクルベ
ロミセス属の工業用菌株を用いて安定な多コピーベクタ
ーから異種タンパク質を生産することができる。
安定性の逆方向反復(IR)pKDlの安定性遺伝子座 pKDlの複製起点及び該酵母中で発現させることがで
きる配列制御下で該タンパク質に対して構造遺伝子をエ
ンコードするDNAを含む発現カセット 形質転換酵母に対して選択可能なマーカ及び任意に複製
起点及び大腸菌に対して選択可能なマーカー を包含している発現プラスミドで形質転換されたクルベ
ロミセス属の酵母を増殖培地で培養する。
KD1の特徴を十分利用することによって達成された。
ド保持に関与する特殊複製系を含む他の既知のクルベロ
ミセスベクターの全てと異なる。複製起点のほかにこの
系は、2個の逆方向反復、各々の長さ346ヌクレオチ
ド及びプラスミドの必須部分である3個の読み取り枠(
遺伝子A。
、 Ac1ds Res、第14巻(1986年)44
71〜4481頁)。これらの複製及び安定性要素、遺
伝子A、B、C及び逆方向反復(IR)の保持は極めて
高い分裂安定性を示すベクターを生じる。最も広範囲に
研究された系、S、セレビシェの構造上関係のある2μ
プラスミドとの類推によってこれらの遺伝子の2つ(B
及びC)によってエンコードされたタンパク質は、恐ら
く分裂細胞分裂中に分割するプラスミドに含まれ位置特
異性レコンビナーゼをエンコードする遺伝子Aの負の調
節の一部をつとめている(FLP、フッチャー、A、B
、イースト第4巻(1988年)27〜40頁)。2μ
DNAの逆方向反復間のFLP介在組換えは複製の規則
的機構(Mi胞分裂当り2μプラスミドの二部体の1つ
)から複製のローリングサークル型機構(l細胞当り約
50コピーに増幅するコピー数同書)までプラスミドを
スイッチすることを示している。この複製の正常な機構
の変化はプラスミドコピー数がFLPリコンビナーゼを
エンコードする遺伝子Aのリプレッサーとして作用する
遺伝子B及びC産物の十分量を生産させるほど低くなる
とすぐに誘発される。
例えばPKDIであることは確か)のコピー数は自己調
節方法で高レベルに保持され、選択マーカーの存在に依
存しない。
ーはpKDl (A15)の一部だけを含むかあるいは
中断された遺伝子A(PstIクローニング位置が遺伝
子Aのコーディング配列内にある(欧州特許第0241
435A2号、公告臼1987年10月14日)を含み
、従って定住プラスミドpKDlの特徴の1つである自
己調節複製系を破壊する。対照的に本発明に記載される
pKDlから誘導されるプラスミド構築は、pKDlの
重要なオープン読み取り枠の全ての機能的保持に関係す
る。従って以下に記載されるプラスミドの安定性は、プ
ラスミドP1及びP3に関してかなり高められ、新規ベ
クターのコピー数は細胞集合にわたって高レベルで維持
される。
清アルブミンも又は酵母細胞から分離されたいかなるタ
ンパク質をも示すために用いられ、ヒト由来の生HSA
と同じアミノ酸配列、三次構造及び物理化学的特性を有
する。更にその上、HSA変異体は天然変異体並びにH
SAと同じ活性を有するが適当な場合には問題の活性に
必須でないドメインが切断されている分子を示すよう理
解される。
に精製できる形態で産生されるHSAを可能にする新規
ベクターの遺伝子工学による産物に関する。生産方法の
特徴は、該酵母の増殖培地に成熟生H8Aを十分排泄す
ることであり、従って組換え体タンパク質の精製をかな
り促進する。HSAの生産は該宿主で有効に機能する転
写及び翻訳開始領域及び組換え体タンパク質と該酵母の
分泌経路に導く分泌シグナルに付随したHSAをエンコ
ードするオープン読み取り枠を包含する組換え体プラス
ミドで形質転換された酵母を増殖することによって得ら
れる。
伝子又はその変異体の1つを含む発現カセットを包含す
る。この構築物は、通常発現に必須の要素、分泌又はプ
ラスミド保持が組合わされてベクターを形成するまで適
当なベクターを用いて段階的方法で調製され、次いで所
望のタンパク質を発現排泄されるように規定宿主に導入
することができる。
セスまたはクルベロミセス属であり、好ましくはクルベ
ロミセスマキシアヌス種、その変異株を含み、特にに、
マルキシアヌス変異株ラクチスである。従って本発明に
よれば調製され記載される構築物は微生物学的由来の真
核生物の具体例の種類にあるが好ましくはクルベロミセ
スに指示される。
度まで増殖し、高レベルの生産を生じる工業的菌株であ
ることが好ましい。
、ウィッカーハミイ(Wickerhamii)、K、
ウオルチイ(valtii)特にに、マルキシアヌス変
異株ブルガリクス(bulgaricus) K。
ラルム(drosophilarum)、(K、 ドロ
ソフィラルム)、に、マルキシアヌス変異株マルキシア
ヌス(K、フラギリス)及びK。
が更に特別に言及されるべきである。
、最も簡単な方法はヒト肝臓からメツセンジャーRNA
を分離し、相補性DNA (cDNA)の形態でそのコ
ピーを合成することからなる0次いでクローンされた配
列を別の方法例えば試験管内特定部位の突然変異生成、
プライマー延長、制限、アダプターの挿入又は第2リゴ
デオキシヌクレオチドリン力−による連結によって修飾
することができる0例えばコーディング配列は該宿主に
於けるタンパク質合成(翻訳)の効率を最適にするため
に酵母の好ましいコドンの使用に適応させることができ
る。
配列)は新生タンパク質を宿主細胞の分泌系に導くよう
に導入することができる。このプレ配列はタンパク質、
特にアルブミンの自然N末端リーダーに対応することが
できるか又は別の由来例えばαフェロモン又はキラー毒
素をコードするような酵母遺伝子から得ることができる
。
列は分泌シグナル配列と成熟アルブミンのコーディング
配列の間に挿入することができる。このプロ配列は通常
一般的には少なくとも2種の塩基性アミノ酸、好ましく
はLys−Arg又はArg−Argを含む特異プロテ
アーゼによって切断部位でコーディング配列に結合され
る。
た転写及び翻訳開始部位を該配列の転写及び翻訳を指示
調節するように包含する。これらのプロモーター領域の
選択は使用される個々の宿主に従って異なってよい。
ーターから選択される。サッカロミセス又はクルベロミ
セス型酵母の解糖遺伝子例えばホスホグリセレートキナ
ーゼ(PGK)、グリセルアルデヒド−3−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ(GDP)、ラクターゼ(LAC4
)、エノラーゼ(ENO)、アルコールデヒドロゲナー
ゼ(ADH)をエンコードする遺伝子から誘導されるか
又は他の強い発現遺伝子例えばラクターゼ(LAC4)
、酸ホスファターゼ(PHO5)などから誘導される特
定のプロモーター及び/又はターミネータ−領域が特に
興味深い、これらの制御領域は例えば試験管内突然変異
生成、追加の制御要素又は合成配列の導入又は欠失によ
って修飾することができる。具体的には転写調節要素例
えば別のプロモーターに由来するいわゆるUAS (上
流活性化配列)即ちS、セレビシエGAL10又はに、
ラクチスLAC4遺伝子は選択される炭素源に依存する
異種遺伝子の発現相から酵母培養の増殖相を分離させる
ことができるハイブリッドプロモーターを構築するため
に使用することができる。
ディング配列の3′末端に位置される。
させることができる1種以上のマーカーに融合される。
0418)のような抗生物質に対する耐性を与えるマー
カーであり、これは細菌トランスボゾンTn903又は
銅イオンのような別の毒性化合物のaph (3’ )
−I遺伝子(aph)の該酵母に於ける発現にあること
であり、従って後者は特別の宿主特異性を持たずに使用
することができる。これらの耐性遺伝子は、問題の宿主
に適当な転写及び翻訳シグナルの制御下に置かれる。ま
たS、セレビシェのURA3又はUEU2遺伝子のよう
な栄養要求性を相補するマーカーを使用することもでき
る。
リーは直接宿主を形質転換するために使用することがで
きるしあるいは複製ベクターに挿入することができる。
に存在する領域に相同な配列はこのアッセンブリーに融
合される。該配列は、生物内組換えによって対応部位で
挿入を誘発するように発現カセットの各々の側に位置す
る。また発現カセットは問題の宿主で機能する複製系と
組合わせることもできる。クルベロミセスに対する好ま
しい複製系は最初にに、ドロソフィラルムから分離され
たプラスミドpKD1から誘導される(ファルコン、c
0等、プラスミド第15巻(1986年)248〜25
2頁、Chen、X、J、等、N ucl、 A ai
dsRes第14巻(1986年)4471〜4481
頁)、サッカロミセスに対する好ましい複製系は、酵母
2μプラスミドから誘導される。
ができるか又はpKDl並びに2μプラスミドから誘導
される要素を組合わせることができる。好ましい構築物
は、クルベロミセスの発現が所望される場合プラスミド
pKD1の全配列を含むものである。更に特に好ましい
構築物は異種配列がPKDIに挿入する部位が5acI
部位(p KD 1のB形の4714位、チェン、X、
J、等、Nucl。
〜4481頁)及びM s t 11部位(p KD
1のB形の154位、同書)の間にある197bp領域
に又はこれら2部位の1つあるいはプラスミドpKD1
のSphI部位に局在する。
とができ、例えば各構築段階で酵母より容易に操作する
ことができる大腸菌のような細菌宿主に移入することが
できる。この場合、細菌宿主で機能する複製起点と選択
可能なマーカーを必要とする。また細菌配列の側にある
ように発現ベクターにユニークな制限部位の位置を定め
ることもできる。これは細菌の複製起点を切断によって
排除させベクターを酵母細胞の形質転換前に再連結させ
ることができ、これは高プラスミドコピー数及び安定性
の高いプラスミドを生じることができる0例えば5 ’
−GGCCNNNNNGGCC−3’(SfiI)又
は5 ’ −GCGGCCGC−3’ (N o t
I )のような便宜上の部位を使用することができ、こ
れらは酵母には極めてまれであり、一般に発現プラスミ
ドにはない、これらの部位は、オリゴデオキシヌクレオ
チド方向突然変異生成又は特定のオリゴデオキシヌクレ
オチドリンカー又はアダプターを加えることによってベ
クターに導入することができる。
ているが、プラスミドPKDIから正しく誘導されるベ
クターを用いる操作はアルブミンインターロイキン、t
PA。
他のタンパク質に応用することができる。
主に導入される。形質転換に対する種々のプロトコール
は酵母の場合に記載されている(ジャーマン、F6等、
″6メソツドインイーストジエネテイクス″、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング
ハーバ−5N、Y、1986年)。
な培地で増殖させることができる。
精製することができる。アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動又は他の常法を用いて低温沈降させるか
又は抽出することができる。分泌タンパク質はバッチ培
養又は連続培養から回収することができる。
の具体例及び確実な利点を示す。
セシウム−臭化エチジウム勾配遠心法、制限酵素消化、
ゲル電気泳動法、アガロースゲルからDNAフラグメン
トの電気溶離法、大腸菌の形質転換等は、文献に記載さ
れている(マニアチス、T0等、゛モレキュラークロー
ニング、アラポラトリーマニュアル”コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−コールドスプリングハーバ− N、Y、1982年、アウスベル、F、M。
ーバイオロジー″′、ジョンウイリーアンドサンス、ニ
ューヨーク1987年)。
abs)、ベテスダリサーチラボラトリース(BRL)
又はアマ−ジャムから入手した。
アガロース又は8%アクリルアミドゲルでサイズによっ
て分離し、電気溶離で精製し、フェノールで抽出し、エ
タノールで沈降させ次いでファージT4DNAリガーゼ
([1iolabs)の存在下50mMトリス−HCQ
。
2mMATPを含む緩衝液pH7,4中で装置した。
ントを次の緩衝液、100+++Mグリシン、1βM
MgCQ、、 1mM ZnCQ、。
スファターゼ(CIP、ファーマシア)で処理して脱リ
ン酸化する。同じ操作を5′劣性又はプラントエンド末
端の脱リン酸化に用いるが37℃で15分間、次に56
℃で15分間処理する。酵素を1%SDS及び100m
MNaCnの存在下で反応混合液を68℃に15分間加
熱して失活させ、フェノール/クロロホルムで抽出し、
エタノール沈降させる。
Biolbs)のフレノウフラグメントで行なう。この
反応は5011Mトリス−HCQ。
1mM ジチオトレイトール、50/Ag/muBsA
(ウシ血清アルブミン)pH7,2からなる緩衝液中で
30分間室温で行なわれる。5′劣性末端のプラントエ
ンドは製造業者によって勧められるファージT4DNA
ポリメラーゼ(Biolabs)の存在下で行なわれる
。
クレアーゼ(BRL)で限定処理して行なわれる。
はアマ−ジャムによって配分されたキットを用いてタイ
ロー等によって開発された方法(タイロー、J、W、等
、ヌクレイックアシズRe s 、第13巻(1985
年)8749〜8764頁)に従って行なわれる。
oc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA第
74巻(1977年)5463〜5467頁)に従って
行なわれる。特定DNAフラグメントの酵素増幅は供給
者の勧めに従い’ D N A熱すイクラ−” (パー
キンエルマーセッス)を用いてポリメラーゼチエイン
リアクション操作(ムリス、に、B、及びファローナ。
(1987年)335〜350頁、サイキ、R,に、等
、サイエンス第230巻(1985年)1350〜13
54頁)で行なわれる。
c IPOZYA] 、X74.gaQU。
’t raD36.proA”B” QaaI’。
転換するために使用する。プラスミドDNAをアンピシ
リン又はテトラサイクリン耐性形質転換細胞から適宜精
製する。プラスミドの抽出は、マニアチス等によって記
載される操作(マニアチス、T0等、″モレキュラーク
ローニング、アラポラトリーマニュアル”、コールドス
プリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハ
ーバ−1N、Y、1982年)に従って行なわれ、バー
ンポイン及びドリーによって記載されるアルカリ溶解(
バーンポイン、H,C,及びドリー、J、ヌクレイツク
アシズRes、第7巻(1979年)1513〜15
23頁)から誘導される。迅速プラスミド解析に対して
は、細菌溶解物をホルメス及びクイグレーの方法(ホル
メス、D、S、及びクイグレーM、、 Anal、 B
iochem、第114巻(1981年)193〜19
7頁)に従って調製し、予め精製せずにアガロースゲル
電気泳動分析にかける。エンドヌクレアーゼ制限分析の
後、所望構造を示す組換え体プラスミドは0.5〜IQ
培養液を用いてアルカリ溶解操作(マニアチス、T0等
、“モレキュラークローニング、アラポラトリーマニュ
アル″、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コ
ールドスプリングハーバ−1N、Y、1982年)によ
り大規模に調製し塩化セシウム密度遠心分離によって精
製する。
スからプラスミドDNAの精製はテキストに記載される
。
のクローニング E、1.I HSAをエンコードする相補性DNA
(CDNA)の分離 大腸菌でHSAを発現させることができる組換え体プラ
スミドの構築は前の特許出願欧州特許第0198745
号(欧州特許第198745号、公告臼1986年10
月22日)に詳細に記載されている。概要は、cDNA
Cをグアニジンチオシアネート操作(チャーグウィン、
J、M、等、バイオケミストリー第18巻(1979年
)5294頁)に従ってヒト肝臓から分離したポリ(A
)mRNAから得る。DNA配列分析によりアルブミン
構造遺伝子の重なりフラグメントを含み、これらの重な
りに一般の制限部位を有する3種のクローン(pTIB
ll。
らの部位は、そのプレプロ配列を除いて完全なHSAの
cDNAクローンの再構築(第1図)に使用される。
pXL276の構築は特許出願欧州特許第019874
5号に詳細に記載されており、成熟H8Aのコーディン
グ配列はバクテリオファージλのC■遺伝子のリポソー
ム結合部位(RBS)のATGコドンに枠内で融合して
いる(第2図)。これはHSA遺伝子の翻訳開始コドン
から直上流にNdeI部位を作成する。pXL276は
HSAのプレプロ領域を再構成するために用いられ、ア
ミノ酸“−1”にTaqI部位から直上流のcDNAで
切り取られていることがわかる。
塩基鎖の形のHSAプレプロ配列に相当するDNAフラ
グメント及びプラスミドpUC8のEcoRIとA c
c I部位の間に大腸菌遺伝子の発現シグナルを有す
るpXL276由来120 b p E c o RI
−N d e Iフラグメントを挿入することによっ
て達成される。従ってTaqI部位はこのpXL290
に指定されるプラスミドの挿入体の一端で再編成される
(第2図)、RBSを有するHindm−TaqI小フ
ラグメントとTaqI部位から上流のプレプロ配列をp
UCの8Hind■とPstI部位間にHS A c
D N Aクローン(プラスミドplB11.H8Aの
5#末端を含む)のTaqI−PstIフラグメントと
連結してプラスミドpXL299を得る(第3図)、R
BSとPvuI[部位までプレプロ−H3A配列を有す
るpXL299のHindm−PvuIIフラグメント
をH8Aコーディング配列のレプリコンと3′末端を生
じるpXL276のPvuII−EcoRI大フラグメ
ント及びプロモーターを含むpXL276のE c o
RI −Hi n d mフラグメントと連結させて
プラスミドpXL322を構築する(第4図)。
dI[部位の作製 発現ベクターに容易に組込むことができるプレプロ−H
8Aカセットを得るために上述したプラスミドpXL3
22のNdeI部位をオリゴデオキシヌクレオチド指示
突然変異生成によってHi n d m部位に置き換え
る。このためにプレプロ−H8Aの5′末端を含むpX
L322のHindm−BgQnフラグメントをM l
3 m p 18にサブクローンし、合成オリゴデオ
キシヌクレオチド5 ’ −ATCTAAGGAAAT
ACAAGCTTATGAAGTGGGT−3’を1本
鎖鋳型(アングラインと肉太活字は各々Hi n d
m部位と翻訳開始部位を表わす)にハイブリッド化して
突然変異を生成させる。
変異生成領域のヌクレオチド配列を鎖終結方法を用いて
証明した。完全プレプロ−H3Aをエンコードする配列
はHSA構造遺伝子の3″末端を含む突然変異生成ファ
ージのHi n d m −P v u■フラグメント
とPXL322のPvull−Hindm7ラグメント
をptJc8のHindm部位に挿入して再構築しプラ
スミドpXL869を得る(第6図)、従ってこのプラ
スミドは、3′末端に完全プレプロ−H3A構造遺伝子
並びに非翻訳61bp領域を含む1.87kbHind
mフラグメントを含んでいる。
体H3Aのアミノ酸配列を第7図に示す、いかなる選択
配列をも持たずにMet−H8A構造遺伝子を含むHi
ndIIIカセットは、プラスミドp X L 276
(73M 13誘導体を合成オリゴデオキシヌクレオ
チド5’ −ATCTAAGGAAATACAAGCT
TATGGATGCACACAAG−3’を用いて突然
変異生成させるほかは同じ操作に従って構築される。p
UC8の完全Met−H8Aコーディング配列の再構築
はプラスミドpXL869と同じ方法で得られるプラス
ミドpXL868を生じる。
プラスミドpKD1の分離精製プラスミドpKD1
はフレーア等によって記載されるもの(Mo1. Ca
11. Biol、第7巻(1987年)1180〜1
192頁)から誘導される次の操作に従って後期対数期
培養のに、ドロソフイラルム菌株UCD51〜130
(U、C,D、コレクション、カリフォルニア大学、ダ
ビエス、CA95616)から精製することができる。
デイフコ)、2%グルコース)中IQ培養を遠心し、洗
浄し 1.2Mソルビトール溶液に再浮遊し、細胞をチ
モーリアーゼ(300μg/mA)、25mM EDT
A、50mMホスフェート及びβ−メルカプトエタノー
ル μg / m Q )の存在下でスフェロプラストに変
換する.1.2M ソルビトール溶液で洗浄した後、ス
フェロプラスト(1チューブ当り原培養液250mQに
相当する)を1.2Mソルビトール2.5m12に再浮
遊し、25mMトリス−HCQ、50mMグルコース及
び10mMEDTAを含む同量の緩衝液pH8.0を加
える.次の工程はイソプロパツール14mflを加えて
23℃で15分間行なうDNAの沈降のほかは既に記載
したアルカリ溶解操作(マニアチス,T.等、″モレキ
ュラークローニングアラポラトリーマニュアル″コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ、コールドスプリング
ハーバ−、N.Y。
50ug/mA)で37℃に於て20分間、次に0.5
M NaCQ.0.5%サルコシル及び25mMEDT
A からなる溶液中プロティナーゼK(150μg /
m Q )で60℃に於て1時間処理する.エッペン
ドルフミクロ遠心機で遠心した後、上清をエタノールで
一70℃に於て10分間沈降させ、次に沈降物を溶解し
、DNAを臭化エチジウムの存在下でCsCQ密度勾配
遠心で精製する。
PtJc−URA3 (第8図)はプラスミドpUc1
9のユニークN a r I部位に挿入されたS.セレ
ビシェのURA3遺伝子を含む1.1kb Hind
mフラグメントからなる(ヤニシューペロン,C.等、
ジーン第33巻(1985年)103〜119頁)。
れ,次に大腸菌DNAポリメラーゼエで処理したプラス
ミドpG63 (ゲルボード、C。
1年)173〜180頁)から誘導されプラントエンド
末端を生成する。URA3遺伝子を含む 1.1kbフ
ラグメントを精製し,次にプラスミドpUc19に挿入
し、N a r Iで切断され、大腸菌DNAポリメラ
ーゼエのフレノウフラグメントで処理される。従ってプ
ラスミドpUC−URA3は、大腸菌でプラスミドを保
持する複製起源、大腸菌で形質転換されるアンピシリン
耐性マーカー、ポリリンカー(ユニーク部位としてEc
oRl. Sacl. KpnI。
Hindm)を含むlacZ遺伝子及びに、ラクチスの
uraA変異体で選択可能なマーカーとして作用するS
.セレビシェのURA3を含む。
ユニークAatn部位に挿入されたプラスミドpKD1
の完全配列を含む。
にこのプラスミドを大腸菌DNAポリメラーゼIのフレ
ノウフラグメントで処理することによって得られた,こ
のDNAフラグメントを予めA a t IIで切断し
たpUC−URA3と連結しT4 DNAポリメラー
ゼで処理する.これらの2つのフラグメントの連結は、
EcoRI制限部位を再構築させることができる。プラ
スミドpKD1のE c o R I部位に於けるpU
C−URA3のDNAの挿入はプラスミド安定性及びコ
ピー数の保持に必要とされる遺伝子を失活させない(E
coR1部位は遺伝子BのATGコドンから上流の20
5ヌクレオチドにある。チェン、X、J、等、Nucl
、Ac1ds Res。
としてに、ラクチスuraAclr’細胞を高頻度で形
質転換するプラスミドpCXJ Iは1細胞当り約70
〜100コピーに増幅され、選択圧がなくても安定に保
持される。pUC−URA3によって与えられた複製起
源のためpCXJ 1もまた大腸菌で複製することがで
き、これによってプラスミド構築及び精製工程を促進す
る。外来DNAを挿入するために用いることができるプ
ラスミドPcx、J 1のユニーク部位はpUc19ポ
リリンカーのHi n d m及び5aQI部位である
。
ベクターとしてpcXJlの使用は、独立栄養マーカー
として染色体uraA突然変異を有する菌株に限定され
る。クルイベロミセスの工業的野生型菌株を形質転換す
ることができるように我々は優性抗生物質耐性マーカー
として細菌トランスボゾンTn903の31−アミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ(a p h)遺伝
子を選択し、pCXJ 1に挿入した。aphm伝子は
大腸菌でカナマイシンに耐性を与え、野生型酵母菌株で
発現させる場合には、抗生物質G418(ゲンチシン)
に耐性を与え、細胞増殖の有効なインヒビターである(
ジメネツ。
0年)869〜871頁)、K。
aph遺伝子の細菌転写シグナルはに、ラクチスのキラ
ープラスミドに1から分離された0RFIプロモーター
(p 、cm)に置き換えられる。
れる(第10〜12図)、最初にプラスミドに1の1.
5 kb 5caI−Pst IフラグメントをpBR
322のユニーク5caIとPstI部位の間でサブク
ローンし、アンピシリン感受性及びテトラサイクリン耐
性組換え体プラスミドはpKl−PS1535−6に指
定される(第10図)、1.5kb Sea I−P
s t Iサブクローンフラグメントは線状キラープラ
スミドの一方の末端から誘導され、プラスミドに1によ
って担持される0RF1の5′の半分と上流の約220
塩基対を含む(Sor、F、及びツクハラ、 H,Cu
rr、 Genet、第9巻、(1985年)147〜
155頁)、5caI部位かに1の左側の末端から22
塩基対だけにあるため(第10図)、1.5kb S
ea I−Pst Iフラグメントは恐ら<0RFI(
Pk工)の全プロモーター領域を含む。PKI−PS1
535−6をDdeIで消化させるとその末端(Sca
Iに近い)の一方でpBR322由来の17bpを含む
266bpフラグメント及び他の末端で0RF1の最初
の11コドンを生じる。
処理した後、精製フラグメントをプラスミドpUC−K
anlのユニークXh。
n 903(カナマイシン レジスタンスシーンブロッ
ク1 ファーマシア)由来aph遺伝子を含む1.25
kb EcoRIフラグメントをPOCl2のユニー
クEcoR工部位に挿入して得た。プラスミドpUC−
K a n 202はpUC−KanlをXhoIで消
化した後、S1ヌクレアーゼで簡単に消化し、末端プラ
ントエンドにし、次に大腸1WDNAポリメラーゼIの
フレノウフラグメントでプラントエンドにしたpKl−
PS1535−6のD d e Iフラグメントと連結
して得られる(第11図)。この構築は線状プラスミド
に1の0RF1遺伝子の最初のアミノ酸とT n 90
3のaph遺伝子の5′切断末端の間で得られる枠内融
合を可能にする。
ドン(AGG)をもとに戻すのでap)1の最初の11
アミノ酸は0RFIの最初のアミノ酸に置き換えられて
いる。aphをエンコードする構造遺伝子の開始と共に
Pkよ−aph融合に用いられる0RF1プロモーター
の完全配列は第12図に示される。
築プラスミドpKan707 (第13図)は上述した
プラスミドpcXJ1の誘導体である。これはプラスミ
ドpCXJ 1をHi n d■で切断し、次いで大腸
菌DNAポリメラーゼのフレノウフラグメントで処理す
ることにより構築される0次でプラントエンド末端を有
する直線化プラスミドをPki−aph融合を有するp
UC−Kan202由来り、2 k bScaI−Hn
cllフラグメントと連結させる(第13図)、pUc
−Ka n 202を5caIとHincnで消化させ
るともはや最初の細菌プロモーターを含まないプラント
エンドカナマイシン耐性カセットを生じる。
高いレベルに耐性を与える。pCXJIの場合のように
、プラスミドp K a n 707は高頻度でに、ラ
クチスair’菌株に導入し、選択圧なしで安定に保持
することができる(第14図)、工業的菌株を形質転換
させる効率のよい優性マーカーの存在と組み合わせたほ
とんどのクルイベロミセス菌株の0418に対する著し
い感受性はp K a n 707をクルイベロミセス
属の酵母に極めて有用なりローニングベクターにする。
泌カセットを含む発現 ベクターの構築 E、3.I S、セレビシェのPGKプロモーターの
制御下M e t −HS A及びプレプロ−H8Aに
対する発現力 セットの構築 プラスミドpYG12(第15図)は、S、セレビシェ
のPGK遺伝子のプロモーター及びターミネータ−領域
からなる1、8kb 5a12I−B a m HI制
限フラグメントを含む、このフラグメントは3.0kb
Hindlnゲノムフラグメントから誘導され、構
造遺伝子に相当する1、2kbフラグメントは検出され
ており、翻訳開始ATGと翻訳の終結を指定するTAA
コドンから上流に3oコドンに位置するBglHの間の
領域を包含する(メローJ1等、ジーン第24巻(19
83年)1〜14)。これによって得られる1、8kb
フラグメントの側面にあるH i n d IIIは次
いで破壊され、5aI2I及びB a m HI部位で
各々プロモーター領域から上流にPGK転写ターミネー
タ−から下流に置き換えられる1次いでHi n d
m部位はプロモーターとターミネータ−領域間の結合で
導入され、部位がユニークであるため、異種遺伝子を容
易に導入させることができる。この領域のヌクレオチド
配列は第15図に示される0次いでプラスミドpXL8
68 (E、、1.3参照)由来のM e t −HS
Aをエンコードする1、8kbHindlIIフラグ
メントはプラスミドpYG12のHi n d m部位
に導入されて組換え体プラスミドpYG10を得る。同
様の方法でプラスミドpXL869 (E、1.3参照
)由来のプレプロ−H3A (第15図)をエンコード
するHindInフラグメントをプラスミドpYG12
に挿入してプラスミドpYG11を作成する。結果とし
てサイズが約3.6kbの2つのSa Q I−Bam
HI発現カセットがこうして構築され、これはS、セレ
ビシェのPGK遺伝子プロモーター、続いてM e t
−HS Aあるいはプレプロ−H3Aをエンコードす
る遺伝子最後にm RN Aのポリアデニル化部位を含
むPGK遺伝子の転写ターミネータ−(T、、え)に相
当する領域を包含している。
及びpYG221の構築 上述した発現カセットをベクターpKan707に導入
するためにプラスミドpYG10及びpYG11由来
3.7SaQI−B a m HIフラグメントをプラ
スミドpIC−20Rの対応する部位に初期に於てサブ
クローンして(マーシュ、L6等、ジーン第32巻(1
984年)481〜485頁)、この方法でプラスミド
構築pY018 (プレプロ−H3A)(第16図)及
びpYG22(Met−H3A)を得る。これらの構築
中間体はp K a n 707の対応する部位に直接
挿入することができるSaQ l−5ac I制限フラ
グメントの形をP、l)K/ M e t −HS A
/TPoK及びPP0に/プレプローH8A/TpH,
に発現カセットを生じる(第17図)、後者を酵素5a
fiI及び5acIで消化させるとURA3マーカー並
びにpKDlの遺伝子Bから上流に位置する35bpフ
ラグメントの欠損を生じる。これによって得たpYG1
9(プレプローH3A)(第18図)及びpYG23
(Met−HS A)に指定される構築物は、PpoK
/H8A/TPoK発現カセット、K、ドロソフィラル
ムブラスミドpKD1の本質的に完全な配列、大腸菌で
自律複製させることができる配列並びにアンピシリンの
存在下で大腸菌を0418の存在下でに、ラクチスを選
択されることができる各々β−ラクタマース及び3′−
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをエンコー
ドする遺伝子(PKtプロモーターの制御下)を包含す
る。
するH8A−分泌ベクターが構築される。第19A図に
示される通り、プラスミドpYG208はB a−mH
I / S a Q Iアダプター(5’ −GATC
CGTCGACG−3′)をPGKターミネータ−の下
流に挿入してプラスミドPYG12がら誘導される。
ラグメントは、プラスミドpXL869(プレプローH
SA)から電気溶離により精製され、ベクターpYG2
08のHindl[1部位に正しい配向でクローンして
プラスミドpYG210を生成し、これによって生じた
5aQI発現カセット(PGKプロモーター/プレプロ
−HSA/PGKターミネータ−)は電気溶離により精
製されプラスミドpKan707の5aQI部位にクロ
ーンして発現プラスミドpYG221A及びpYG22
1Bを生成する(第19B図)が、これらはベクターp
Kan707に関して5aQI発現カセットの相対的配
向が互いに異なるだけである。プラスミドPY0221
Bに於て0418への耐性にコードするK IIr遺伝
子に相対する5a12I発現カセットの配向は、プラス
ミドpYG19によってもたらされる5aQI−8ac
I発現カセットのそれと同一である。
ハイブリッドプロモーター の構築 発現プラスミドPYG19に存在するPGKプロモータ
ーの誘発性誘導体を得るためにPGKプロモーターのU
ASをに、ラクチスのLAC4プロモーターから誘導さ
れるUASに置き換えた(ブリュニング、に、D。
984年)2327〜2341頁)、この目的のために
PGKプロモーターを含むpYG12のSaQI−Hi
ndmフラグメントをバクテリオファージM 13 m
p 18にクローンし、pYG14を構築した(第2
0図)0次に上述したプロトコールを用いて2つのNo
tI部位を部位指示突然変異生成によりPGKプロモー
ター領域に導入してpY026を構築した(第20図)
、この目的に使用したオリゴヌクレオチドは 5’−CAAAACCTGTGA GC旦GCCGCT
AGGACCTTG−3’(S(141?)及び 5’−GG TAATTTCTTTCTCGATAA
GCGGCCGCGTGCTTT ATG−3’ (S
q416)である。
置−397−399−536及び−541で導入された
(+1として定義されたATGイニシエーターコドンに
関して、第21図)、この方法で得られた2つのNot
I部位(太文字)はUSAp、にの2つの機能的に異な
るドメイン(第21A図のA及びM)を含むように予め
記載されているPGKプロモーター領域の側面にある(
スタンウェイ、C0等、Nucl、 Ac1ds Ra
s、第15巻(1987年)6855〜6873頁)、
このPGK誘導体を酵素NotIで消化させるとU A
S 、、K が欠失し、次にPGKプロモーターに関
していずれかの配向にクローンしたN o t I部位
(第22図)の側面にあるU A S P、、を含む合
成フラグメントで置換させる。UAS フラグメン
トはハイブリツAC ド化し、次いで以下の4種のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの連結によって得られた。
G TGT AGCGGAAAT ATG TGG T
CCGAG CAA CAG CGT CTT TTT
CTA GTA GTG CGG−3’ (−389)
Sq527上流鎖、フラグメント2 (−388)5’−TCG GTT ACT TGG
TTG ACAττG GTATTT GGA CTT
TGTτGCTACACCATT CACTACTT
G AAG TCG ACTGTG AGC−3’(−
319)Sq52B下流鎖、フラグメント1 (−319)5’−GGCCGCTCA CACTCG
ACTTCA AGTAGT GAA TGG
TGT AGCAACAAA GTCCAA
A丁ACCA ATG TCA ACCAAG T−3
’(−382)Sq525下流鎖、フラグメント2 (−383)5’−AACCGA CCG CACτA
CTAG AAA AAGACG CTG TTG C
TCGGA CCA CAT ATT TCCGCTA
CA CTT TTCACA GC−3’ (−448
)括弧内の数字は野生型LAC4プロモーターのATG
コドン(+1)に関する各オリゴデオキシヌクレオチド
の位置を示す(ブリュニング、に、D、等、NuCl、
Ac1ds Res。
−328〜−435に及ぶ領域はLAC4プロモーター
に見られる3種のUAS要素の1番目を保護するために
示されている(ブリューニング、に、D、等、5th
Intarnat、 Sympos、 Genat、
Industr。
。
、等、Mo1. Ce11. B iol、第7巻(1
987年)4369〜4376頁)、太字で印刷された
文字はに、ラクチスのLAC4遺伝子のUASの側面に
ある2つのNotI部位の一部であるヌクレオチドを示
し、5ct525に相補する5q527の結合配列には
アンダーラインが引かれる。
くのヌクレオチド配列は翻訳開始の効率に影響すると思
われるため(コザック、 M、、 Microbiol
、 Rev、第47巻(1983年)1〜45頁、ハミ
ルトン。
1987年)3581〜3593頁)、PGKプロモー
ターのATG関係を次の通り修飾した0部位指示突然変
異生成により追加のHi n d m制限部位(太字)
をpYG26に担持されるPGKプロモーターの25位
に導入してプラスミドpYGを作成する(第20図)、
この実験に用いられる合成オリゴデオキシヌクレオチド
は5’ −TATATTTGTTGTAAAGCTTA
GATAATTACTTCC−3’(Sq449)であ
る6次いで上述したUASLAcフラグメントをpYG
63−1及びpYG63−2になるPYG29のNot
I部位にクローンした(第22図)、後者プラスミドの
PGK/LAC4ハイブリッドプロモーター領域を5a
ffiI−Hindlllフラグメントとして精製い、
次の2種の相補性オリボデオキシヌクレオチドからなる
合成Hi n dm / B s t E nアダプタ
ーに連結した。
AT ATA AAA ACA ATG^AG TGG
−3’ (Sq451)及び(ii)5’−(rT T
ACCCACTT CAT TGT TTT TAT
ATTτGT TGT AA−3’ (Sq(プレプロ
−H8Aイニシエーターコドンは太字で表わされる)、
このアダプターは野生型PGKプロモーターの直上流に
22bpを再構成しく第21B図)、自然に生じるBs
tE11部位までプレプロ−H8A構造遺伝子の最初の
4つのコドンを包含する1次いでこの方法で得た5af
iI−BatEIIフラグメント(最高イニシエーター
ATG関係のあるPGK/LAC4ハイブリッドプロモ
ーターを担持する)を構築pYG18 (第16図参照
)の対応する制限フラグメント(非突然変異生成PGK
を保護する)に置き換えるために使用した。この手順に
従い、PGKプロモーターに関してUASlAc の
配向が異なるだけの2つの構築中間体を得た。これらの
新しい構築物はSaΩl−8acI発現カセットを作成
するために使用し、p K a n 707の対応する
制限部位にクローンしく第13図参照)、プラスミドp
YG44−5及びpYG44−7をもたらした(第23
図)、これらのプラスミドはUASLAcを保護する合
成NotIフラグメントがpYG44−5に対して野生
型配向及びプラスミドpYG44−7に対して反対の配
向にあることを除いて同遺伝子型である。
の制御下プレプロ−H8A 分泌に対するベクターの構築 ベクターpEPHO(第24図)は、S、セレビシェの
酸ホスファターゼ遺伝子(PHO5)のプロモーター及
゛びターミネータ−領域を保護する0、94 k b
BamHI −Pst I制限フラグメントを含む、
このフラグメントはPH05構造遺伝子の欠失により
2.03kbゲノムBamHI−PstIフラグメント
(Bajwat w、等、 Nucl、 Ac1d R
as。
導される。この欠失は一3位(ATGイニシエーターコ
ドン+1に関して)及び+1109(TAGターミネー
タ−コドンの上流に位置する5au3A部位)、ポリリ
ンカー E c o RI / S m a I /
B a m HIは、プロモーターとターミネータ−の
間の結合で挿入され、異種遺伝子の導入のクローニング
部位として用いることができた。PH05プロモーター
とこのポリリンカー間の結合は、以下に示される(ポリ
リンカーに対応するヌクレオチド配列にはアンダーライ
ンが引かれる)5’−AAATTCGAGATTAG
GAATTCCCGGGGATCC−3’ H8A遺伝子がPH05プロモーター制御及びPGK遺
伝子の非翻訳リーダー領域下で発現される構築物を得る
ために、)Iindm部位をプラスミドpEPHo由来
PH05プロモーターフラグメントの20位に導入した
。
−EcoRIフラグメントをバクテリオファージM 1
3 m p 9のポリリンカーにサブクローンし、得ら
れた1本鎖鋳型(pYGRF3)は次に突然変異誘発プ
ライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド5’ −C
CTAATCTCGAATAAGCTTGCTCTAT
TTG−3’(Sq487:導入されたHindn1部
位は太字で表わされる)を用いて突然変異生成され、プ
ラスミドpYGRF4が生じる(第24図)。
種々の発現カセットの構築を促進するためにポリリンカ
ーのHindu[部位が大腸菌のポリメラーゼエ(フレ
ノウ)の大フラグメントで付着端を処理して破壊される
プラスミドpIC−2ORの誘導体(第16図参照)を
作成した。この新しいクローニングベクター(p IC
−20RAH3)は次にPGK遺伝子のプロモーター及
びターミネータ−領域を含むプラスミドpYG12 (
第15図参照)のSa12I−BamHIフラグメント
を導入するために用いられ、こうしてプラスミドPYG
61を作成した。5aQIHi n d illフラグ
メントとしてプロモーターモジュールをHi n d
m −B a m HIフラグメントとしてターミネー
タ−モジュールを用いることによって、発現される構造
遺伝子がHi n d m制限フラグメントとしてクロ
ーンされている発現カセットを転写開始及び終結シグナ
ルをあらゆる組合わせで作成することができる。これら
の構築中間体を酵素S−a Q I及び5acIで消化
させると新しいカセットは次に酵母クローニングベクタ
ーpKan707の対応する部位に導入される(第17
及び18図参照)。
I−HindmPGKプロモーターフラグメントをPH
05プロモーターを保護するpYGRF4の5ajli
I−Hind■フラグメントに置き換えた。HindI
[Iフラグメント(第23図参照)としてプラスミドP
YG44−5から分離されたプレプロ−H8A構造遺伝
子の挿入及び5aQI−3acIフラグメントとして得
られた発現カセットのプラスミドpKan707への移
入は分泌ベクターpYG51をもたらした(第23図)
。
H05プロモーター(全転写開始部位を含む(ルドルフ
、H0及びハイネン。
USA第84巻(1987年)1340〜1344頁
)第25図)次に非翻訳PGKリーダー配列の21bp
、プレプロ−H8A構造遺伝子、最後にPGKターミネ
ータ−を含む。
制御下HSA分泌に対する ベクターの構築 ポリメラーゼ鎖反応(PCR)技術(ムリスに、B、及
びファローナ、 F、 A、 Math。
頁、サイキ、R,に、等、サイエンス第230巻(19
85年)1350〜1354頁)を用いてに、ラクチス
のLAC4プロモーターをSaQI−Hindm制限フ
ラグメントとして酵母ゲノムDNAがら増幅した。
ノムDNA及び次の合成オリゴデオキシヌクレオチドを
T a q−ポリメラーゼ反応に対するプライマーとし
て使用した(K。
される5aQI及びHindll[部位は太字で表わさ
れる)。
ACAACAGACAGGGAGGGC−3’ 2)5’−A AAGCTT ATCTTTCAGTT
CTCGATGAGTATGTGTGTT−3’ これらのブライマーのデザインは、前にレオナードJ、
M、等によって発表されたLAC4配列に基づいている
(Mo1.Ce11. Biol、第7巻(1987年
)4369〜4376頁)、この方法で得られた5ai
l I −Hind m制限フラグメントは位置−11
98〜−1にゎたるLAC4プロモーター領域を含む(
ATGイニシエーターコドンは+1として定義される)
。
酵素5aQIとHindmで消化され(E、3.4章参
照)、そのヌクレオチド配列はジデオキシ鎖終結法を用
いて確認された(サンガー、Fo等、Proc、 Na
tl、 Acad、 Sci、 USA。
図)に指定されるpKan 707誘導体が得られ、プ
レプロ−H8A遺伝子はに、ラクチスのラクトース/ガ
ラクトース誘発性LAC4プロモーターの制御下で発現
される。この特定構築のHSAイニシェーターコドンの
直上流の配列は、プラスミドPYG44−5(フラグメ
ントHi n d m )から誘導され、従ってPGK
遺伝子の非翻訳リーダーの一部を含む(E、3.3章参
照)。
H8A分泌及びに、ラ クチスのキラー毒素分泌シグナル に対するベクターの構築 相補性合成オリボデキシヌクレオチドの2組を用いて1
次の要素を含むHindm−DraIフラグメントを再
構成した。(i)PGKプロモーターのATG近接21
bp、(…)K、ラクチスのプラスミドに1からのキラ
ー毒素遺伝子の分泌シグナル配列(″ブレ″領域)(ス
ターク、M、J、R,及びボイド。
2頁)及び(i)キラー毒素プレ領域に枠内で融合した
N−末端D r a I部位までのプローH8A遺伝子
の最初の17アミノ酸、この構築に使用される4種のオ
リゴデオキシヌクレオチドは次の通りである。
TAGCTTTACAACAAATATAAAAACA
ATGAATATATTTTACATATTTTTGT
TTTTGCTGTC−3’ 5q998.上流鎖、フラグメント2 5’−ATTCGTTCAAGGTAGGGGTGTG
TTTCGTCGAGATGCACACAAGAGTG
AGGTTGCTCATC:GGTTT−3’ 5q996. 下流鎖、フラグメント15’−AAA
AACAAAAATATGTAAAATATATTCA
TTGTTTTTATATTTGTTGTAAAGCT
A−3’5(1997,下流鎖、フラグメント25’−
AAACCGATGAGCAAC:CTCACTC:T
TGTGTGCATCTCGACGAAACACACC
CCTACCTTGAACGAATGACAGC−3’ 太字で印刷された文字はこの実験で使用したH i n
d m及びDraI部位の一部であるヌクレオチドを
表すし、5q996に相補性の5q998の結合配列は
アンダーラインが引かれる。
のリン酸化の後、二重鎖HindTn−DraIフラグ
メントは第26図に示される図に従って生成した。この
130bpフラグメントはゲル電気泳動によって精製さ
れ。
たH8A構造遺伝子の一部を含む1.04kb Dra
I −XbaIフラグメントに連結した0次いでこの方
法で得られたHindm−XbaIフラグメントをバク
テリオファージM l 3 m p 10にクローンし
てpYG56 (第26図を構築した。この中間体の正
しいヌクレオチド配列はジデオキシ配列化によって確認
した。
によって再構成することができる。(i)今記載したp
YG56構築物から誘導される1、17kb Hind
l[−Xbaエフラグメント(…)HSA遺伝子のカル
ボキシ末端の半分並びにPGKターミネータ−領域を含
むpYG18 (第16図参照)のX b a I −
B a m HIフラグメント及び(iii)プラスミ
ドpYG62のBamHI−Hind■フラグメント、
この後者のプラスミドはPGKプロモーターを担持する
5aQI−Hi n d mフラグメントがプラスミド
pY029(第20図参照)由来の等価の制限フラグメ
ントに置き換えられている構築物pYG61 (E、3
.4章参照)の誘導体である。従っでこの構築に用いら
れるプラスミドPYG62のBamHI−Hindl[
[フラグメントは大腸菌複製起源、アンピシリン耐性遺
伝子及び位置−25で導入されたH i n d m部
位を有するPGKプロモーター(E、3゜4章参照)、
得られたp工C誘導体はpYG57を指定された。この
後者のプラスミドはSaQ l−8ac Iフラグメン
ト情報として用いられ、酵母クローニングベクターpK
an707の対応する部位にクローンされ発現ベクター
pYG58 (第23図)をもたらした。
をに、ラクチスのRAG 2 座に指示する組込みベクターの構 築 Dr、M、ペソロスキーーローベル(インスチチュート
キュリー、オーセイ、フランス)によって親切に提供
されたプラスミドp31/RAG2 :URA3は、ホ
スホグルコースイソメラーゼを最もエンコードしている
と思われるに、ラクチスのRAG2構造遺伝子のプロモ
ーター及びN−末端領域を保護する2、3kbゲノムN
heIフラグメントを含む(ペンロスキー−ローベル2
M0等、Nu c l。
頁)、プラスミドp31/RAG2 : URA3はS
、セレビシェのURA3遺伝子を保護するプラスミドp
cx、y 1(第9図)由来の1.6kbEcoRIフ
ラグメントをRAG2プロモーターのE c o RI
部位に挿入することによって構築された0次いでこの方
法で得た3、9kb NheIフラグメントをプラス
ミドpBR322のユニークNhaI部位にクローンし
た。
V及びS m a Iで切断することによって我々は酵
母分泌ベクターpYG19(第18図)で使用したもの
と同じPGK/プレブローHSA発現カセットを含む3
.7kbフラグメントを得た。このカセットをプラスミ
ドp31/RAG2:tJRA3のユニークS m a
I部位(URA3マーカー遺伝子の3′に位置する)
に挿入するとブレブローH8A発現カセットの配向に関
して互いに異なるだけのpYG60−21及びpYG6
0−5(第27図)を構築した。
A発現カセットとRAG2誘導配列の側面にあるURA
3マーカー遺伝子を含む7.7kbフラグメントを作成
した。これらの後者の配列は、同種組換えによりに、ラ
クチス菌株MW98−8CのRAG2座に全フラグメン
トを組込むことを目標とした(ロススティン、、 R,
J 、Mathods in Enzymol、第10
1巻(1983年)202〜211頁)。
ちの3個に対してサザン分析によって確認した(MW9
8−8G::60−5組込み体クローン#6及びMW9
8−8C: :60−21組込み体クローン#7及び9
)。
HSA発現カセットの1つ(MW98−8C: : 6
0−5組込み体クローン#8及びMW98−8C: :
60−1−21組込み体クローン#11)又は2つ(M
W98−8C::60−s組込み体クローン#4)を有
することが見い出された。確認された組込み体6個全部
をH8A分泌の効率に対して試験した。
ベロミセス種の形質転換 E、4.1 形質転換操作 に、ラクチス菌株MW98−8 C(αuraAarg
1ysK” pKDl” )の形質転換はハイホン等
によって最初に記載され(ハイホン。
U S A第75巻(1978年)1929〜193
3頁)適当に改変されたスフ二〇プラスト形成手法ある
いはポリエチレングリコール(PEG4000、シグマ
)の存在下でDNAの取込みを容易にする酢酸リチウム
(イド、Hl等、J、 Bactariol、第153
巻(1983年)163〜168頁)で全細胞を処理す
ることによって得られた。以下に記載される他の全ての
クルイベロミセス菌株の形質転換は酢酸リチウムで処理
することにより得られたものだけである。
CB557988号として登録されたブタペスト条約の
規定に従ってオランダ、バーンのCentraalbr
eau voor Sckimmelkultursn
(CB S )に寄託されている。
る(ビアフチ1M6等、Curr。
頁)、酢酸リチウムを含む方法を使用した場合、細胞生
育はYPD培地50 m 0928℃で撹拌しなから6
00nmに於ける吸光度(oDs。。)o−e 〜O,
B*−C行ft−)、m胞を低速遠心分離で回収し、T
E無菌溶液(10mMトリス−HCQ pH7,4、1
mMEDTA)で洗浄し、酢酸リチウム溶液3〜4mQ
(TE中0.1M)に再浮遊させて細胞密度約2 X
10’C/mAを得、30℃で1時間中程度に撹拌しな
がら装置する。
ート部分をDNA及びPEG4000の存在下最終濃度
35%で30℃に於て1時間温置する。42℃で5分熱
シヨツクの後細胞を無菌水で2回洗浄し、無菌水0.2
m(!に再浮遊させ、10mfl試験管に移す0次いで
0.7%寒天を含み、46℃で溶融しているYPD培地
を加え、混合液を直ちにYPDプレートに注ぐ、固化後
、更に上面寒天5 m 11の上層を加える。28℃で
18〜24時間温置した装、041B溶液(ゲネチシン
50 m g / m 11、GIBCO,グランドア
イランド、N、Y、)0.16mAをプレート上に拡散
し、28℃で更に4〜5日温置した後、形質転換体を計
数する。
を省く)に直接置くと形質転換されたに、ラクチス細胞
の大きなサイズのクローンが現われてくる。しかしなが
ら低濃度の0418(最終濃度50 u g / m
I! )をコロニーを観察するために用いねばならず、
これは0418や非形質転換細胞から誘導されるものに
一部抵抗する突然変異体の選択を生じる。更に形質転換
効率は耐性遺伝子を18〜24時間表現型発現させた後
、I!察された効率より少なくとも10倍低い。
来プラスミドの分裂安 定性 非選択培地で生育させた後、プラスミドpYG19及び
pYG23の分裂安定性を異なった間隔で測定する。G
418.200μg/ m (1を含むYPDプレート
で生育する細胞の最終及び開始%の比として決定する。
高レベルの発現にもかかわらず例外的に安定である。菌
株MW98−8Cの形質転換体を非選択培地で40個の
細胞に増殖された時、細胞の40〜45%はこれらのプ
ラスミドを保持した。プラスミドPYG19はに、ラク
チス菌株CB5683中、更に高い分裂安定性を示し、
80%以上の細胞が40個の非選択増殖後プラスミドを
保持する。
G19及びpYG 23形質転換体の発現及び分泌 プラスミドp Y G 19 (ブレプローHSA)及
びpYG23 (Met−H8A)を含むK。
選択YPD培地中28℃で一定に攪拌しながら異なる間
隔で測定した。細胞による全ての可能な汚染を取り除く
ために2回の逐次遠心分離(コントロンハームル2−3
65に遠心機に於て4.OOOrpmで5分、次に12
.OOOrpmで10分)して培養上清を得る。2番目
の上清の試料(,0,5mQ)を0.125Mトリス−
HCQ、20%グリセロール、10%2−メルカプトエ
タノール(β−ME)、4,6%ドデシル硫酸ナトリウ
ム(SDS)及び0.4%プロモフェノールブル−を含
む同量の試料緩衝液の存在下95℃に15分間加熱する
。この上清に存在するタンパク質の濃度を所望する場合
、100%W/vトリクロロ酢酸溶液(TCA)0.4
mff1を上清8rnQに加えタンパク質を1時間氷上
に沈降させる。この沈降物質を15.00 Orpmで
20分間遠心して回収した後、63mMトリス−HCQ
、10%グリセロール、5%β−ME、2.3%SDS
及び0.2%ブロモフェノールブルーを含む試料緩衝液
0.5−Q中で95℃に15分間加熱して再溶解する。
を用いて検出される。細胞沈降物(食塩緩衝液で1回洗
浄)0.25mj!の等偏量を氷上に維持し、67mM
リン酸塩、pH7,5m Mβ−ME、1mMフッ化フ
ェニルメチルスルホニル(PMSF)、2μMロイペプ
チン及び2μMペプスタチンA(シグマ)を含む同量の
溶菌緩衝液に再浮遊させる。4℃でリン酸塩緩衝Fft
(67m M 、 p H7)に貯蔵したジルコニウム
ビーズ(直径Q、5mm)0.5mΩを加えた後、細胞
を氷で2分冷却することにより散在された細胞破壊機(
バイオスペック ミニビード−ビータ−バイオスペック
プロダクツ)で7〜30秒間によって破壊される。こ
れらの条件下で細胞破壊の効率は位相差顕微鏡で細胞を
計数して判断した場合90%以上である。ジルコニウム
ビーズのない液体画分をエッペンドルフ管に移し、ビー
ズを溶菌緩衝液0.2mAで3回洗浄した後、同じエッ
ペンドルフ管に集める。この管を4℃で15分間、12
,000gで遠心して可溶性タンパク質画分(上滑)と
不溶性タンパク質画分(沈降物)はこうして特定される
。
ゲル(レムリ、U、に、ネイチュア第227巻(197
0年)680〜685頁)に付随する8、5%5DS−
ポリアクリルアミドゲルに重層し、次いでブロモフェノ
ールブルーがゲルの底部にとどくまで25mAの電流に
かける。
8℃で68時間生育させた後。
23 (Me t−HSA)及びpYG25(発現カセ
ットのないベクター)で形質転換したに、ラクチス菌株
MW98−8Cで得たアルブミンの発現及び分泌を評価
することができる代表的な実験の結果を示す、各試料は
、原培養液100μQに相当し、8.5%ポリアクリル
アミドゲル及びクーマシーブルー染色で泳動させた後、
可溶性画分、不溶性画分及び培養上清を比較することが
できる。
グマ)と同時移動するタンパク質バンドはプラスミドp
YG19又はpYG23で形質転換された細胞から誘導
される試料に検出可能であるが、HSA遺伝子を含まな
いベクターpYG25を含む細胞にはない。
生されるアルブミンは全て不溶性細胞質タンパク質画分
に存在するが、実際にはpYG19 (プレプロHSA
)を用いて発現されるアルブミン全てが細胞上清に輸送
されることは注目される。更に第29図の結果は、プラ
スミドpYG19を含む細胞によって排泄されるアルブ
ミンが著しい量で存在する細胞内だけのタンパク質であ
ることを示す、プラスミドpYG19で形質転換され、
適当な条件下(E、4.6の項参照)で生育したMW9
8−8Cの振盪フラスコ培養の上滑ではアルブミン濃度
が150 m g HS A / Qに達することがで
きる。
ミンの免疫学的検出 アルブミン標準と同時移動する酵母タンパク質の同定は
免疫学的検出で試験することができる。この目的のため
に25 m M トリス塩基、150mMグリシン及び
10%メタノールを含むトランスファ緩衝液中、半ドラ
イプロッティング装置(バイオメトラ)を用いてニトロ
セルロースフィルター(シュライシャー及びシェラエル
、0.45μm)にプロットする。プロッティング時間
は、ゲル簡約0.85mA/am”の電流を用いて30
分である。プロッティング後、フィルターを緩衝液A(
PBS緩衝液[137m M N a CQ 。
中5%スキムミルク末、 0.2%ツウィーン20)で
5分間3回置型した後、H8Aに指示され1 : 10
00に希釈されたウサギポリクローナル抗体を含む緩衝
液A40mfiに30分間温置型る。緩衝液Aでフィル
ターを3回すすいだ後、ウサギ抗体を認識する2番目の
ビオチニル化抗体(ベクタスタインABCイムノバーキ
シダーゼキット、ベクターラボラトリーズ)を緩衝液A
50mAにつき1滴を基準として加える。フィルターを
30分間温置型た後、フィルターを緩衝液B (PBS
中0.2%ツウイーン20)で3回すすいだ後、アビジ
ンDH/ビオチニル化パーオキシダーゼH複合体の存在
下で温度する。アビジン/ビオチニル化パーオキシダー
ゼ複合体は23℃で30分間温置型た後、緩衝液BSm
Q中キットの試薬A及びBの各1滴を希釈することによ
って使用直前に調製する。フィルターを緩衝液B中1:
10の希釈度の複合体(全量50+aQ)に30分間温
置型る。フィルターを緩衝液Bで3〜5秒間再びすすぎ
、0.02%H,O,を含む10m0の溶液及び0.1
Mトリス−HCjl PH7,4中ジアミノベンジジ
ン1 m g / m Qと0.4mg/N1cQ2を
含む溶液10ma中で2〜3分間展開する。第30図は
、K、ラクチスMW98−8Cが抗−HSAポリクロー
ナル抗体によって認識されたタンパク質を発現(pYG
23)及び排泄(PYG19)することを示す、この抗
原物質は、詳細には発現カセットのないベクターで形質
転換された酵母からの細胞抽出液又は培養上清で検出さ
れないため、アルブミン発現カセットの存在と関係があ
る。
ラスコ中比較的低速度で起こる。
養を70〜100時間温置した後置型ると思われる(第
31B図)、100〜240時間の培養では著しい増加
も減少も検出可能でなく、これらの増殖及び温度条件下
でH8Aの良好な安定性を示唆する。この時間中にはタ
ンパク質分解で分解した物質の蓄積がないため、排泄さ
れたアルブミンを分解する細胞片プロテアーゼが存在し
ないことを結論することができる。
19で形質転換された菌株MW98−8Cの生育曲線(
B)は第32図に示され、これらの結果は、細胞が増殖
定常期に達した後にアルブミンの排泄が続くことを示し
ている。この観察は酵母の他の発現系に関する初期の観
察と一致している(ツチョップ。
)1305〜1308頁)。
YG404及びpYG58によ るH8A8Aの効率 HSA5Aの効率をS、セレビシェの PGKプロモーター(プラスミドPYG19゜第29〜
32図)、、ATGの関係を最適にしたPGK/LAC
4ハイブリッドプロモーター(プラスミドpYG44−
5及びpYG44−7.第33図)、S、セレビシェの
PH05プロモーター(プラスミドpYG51゜第34
A図)及びに、ラクチスのLAC4プロモーター(プラ
スミドpYG404.第35図)の制御下で試験した。
レ領域)をプローHSA構造遺伝子(プラスミドpY0
58e第34B図)に枠内で融合し、融合タンパク質の
分泌効率を自然プレプロ−H8A(詳細はプラスミド構
築、第3章参照)と比較した。これらの構築で得られた
結果を次の通り要約することができる。
ブリッドプロモーターから発現される場合培地に分泌さ
れるH S Aのレベルは、ラクトースを中央の対数及
び初期定常増殖期の間で加えた培地を含むグルコース中
で細胞を培養するならば、2〜3倍に増加する(第33
図)、この効果は、ラクトースの添加を等偏量のグルコ
ースに置き換える場合には観察されない(データは示さ
れない)、細胞が単独の炭素源としてラクトースを含む
培地中で培養される場合には1分泌HSAのレベルはグ
ルコース含有培地で得られるものほど高くない(第33
B)、H8A分泌のラクトース介在増加はグルコースの
開始培養に続く細胞の1′誘発”後にII察されるが、
K、ラクチスのLAC4プロモーターのUAS要素の存
在に依存しない、このラクトース介在増加は、H3A分
泌がPGKプロモーター(菌株MW98−8C:形質転
換体に対して第33A、B図、CB52359形質転換
体に対して第35図)又はS、セレビシェのPH05プ
ロモーター(データは示されない)に指示される場合同
様に見い出される。
分泌は、S、セレビシェのPGKプロモーターで得られ
るより低いHSAレベルを生じる(第35図)、他方、
LAC4指示HSA発現はしっかりと調節され、グルコ
ースが唯一の利用できる炭素源である場合CB5235
9形質転換体の培養上清には分泌H3Aを検出すること
ができない。
場合、PH05指示HSA分泌の効率は解糖PGKプロ
モーター(第34A図)を含む構築物で観察されるもの
よりごくわずかに低い。
シグナルの置き換えは、速度論あるいはHSA分泌効率
のいずれにも影響しない(第34図)。
効率 プラスミドpYG19に存在するPGK−フレフロHS
A発現カセットはロススティン。
thods in Enzymol、第101巻(19
83年)202〜211頁、実験の詳細はE、3゜7章
参照)によってに、ラクチス染色体DNAに組込まれて
いる。第36図に示される通り。
H8AのレベルはpKD1由来pYG19(レーン1)
によって得られるものより少なくとも20倍低い、H8
A分泌はRAG座に又はに、ラクチスゲノム(第36図
)のほかで発現カセットの組込みが生ずるにせよ基本的
には同じである。更にその上、URA3選択性マーカー
に関する発現カセットの配向はH8A分泌レベルに著し
い影響を与えなかった(第36図、レーン2及び3)。
2つの発現カセットがゲノムに組込まれていた(第36
図、レーン5)、同様にH8A分泌の効率は形質転換酵
母細胞に有する構造遺伝子のコピ数に直接連鎖している
ように思われる。
於けるH3Aの分泌 プラスミドPYG19.pY0221B又はp K a
n 707はクルベロミセスの次の菌株、ATCC1
6045(K、マルキシアヌス変異株ブルガリクス)、
ATCC24178(K、ウィノカーハミイ)、ATC
C12424(K、マルキシアヌス変異株マルキシアヌ
ス)、ATCC56500(K、ウオルチイ)、ATC
C36906(K、マルキシアヌス変異株ドロソフィラ
ルム)、CB54574 (K。
マルキシアヌス変異株ラクチス)及びMW98−8C(
K、マルキシアヌス変異株ラクチス)を形質転換するた
めに使用した。分泌HSAの検出可能レベルは試験され
る形質転換体すべてで、たとえ異なった菌株中でかなり
の変化が見られるにしても得られた。最も高いレベルは
菌株MW98−8C(CBS579.88)及びCB5
683の形質転換体を用いて見い出され、最も低いレベ
ルは菌株ATCC16045で観察され分解されないH
SAは免疫学的方法でのみ検出することができた(デー
タは示されない)。プラスミドpYG19及びpY02
21Bは試験した全菌株の分泌H8Aの匹敵するレベル
に介在した。
実験ではプラスミドpYG19で形質転換した菌株MW
98−8Cを既に記載した標準条件下で72時間YPD
培地中で増殖させる。培養上清(0,5fi)は遠心分
離によって全ての細胞性汚染をなくし、60%エタノー
ル(V / V )の存在下4℃で15分間温置きれる
。沈降物を遠心分離で回収し、50 m M トリス−
HCQ pH8,0を含む溶液10mQに再溶解し1
次にトリスアクリルブルーカラム(1,B、F、フラン
ス)に充填される。ヒトアルブミンを3 M NaCQ
溶液でこの方ラムから溶離する。HSAを含む両分を5
0 m M )−リス−HCIAに対して透析した後、
これらの両分をMONOQカラム(ファーマシア)で精
製し、NaCj2濃度0.25Mで溶離する。最終段階
に於けるスーパーロース12(ファーマシア)によるク
ロマトグラフィーはHSAをSDSポリアクリルアミド
の銀染色で判断した場合、純度99%以上で得ることが
可能である。
る試験が無いことは組換え体アルブミンの品質を評価す
る簡単な手段を提供しない。このため、精製後に、ラク
チスによって排泄されたアルブミンは従っていくつかの
生物化学的及び免疫学的試験によって確認される。これ
らの試験は1組換え体アルブミンが成熟形態及び天然の
配置構造のに、ラクチスによって分泌されることを示し
、全ての基準に関して血漿から抽出されたヒト血清アル
ブミンと区別できない。
銀染色 上述した通りSDSポリアクリルアミドゲル(7,5%
)(第38C図)により又は“Phastゲル′″系(
ファーマシア、第38A図)を用いて電気泳動を行なう
0組換え体アルブミンの異なった量をヒト血漿から抽出
した標準アルブミン(シグマ)の市販製剤と比較した。
8A図)で染色すると酵母からのアルブミン試料の完全
な均一性を示す。
ゲル、ファーマシア、第38B図)とpH4,0〜7.
0(Immobiline、 LKB)で行なう。組換
え体H8Aの等重点は比較ヒトH3A (p I=4.
8)と一致する。
SAの電気泳動、次いでニトロセルロースフィルターへ
のプロッティング及びE、4.4で記載した条件下で免
疫検出はヒト血漿から抽出した標準アルブミンと同時移
動を示す。これは組換え体プレプロ−H8Aの正しい成
熟かに、ラクチスの分泌過程で起こることを極めて強く
示唆している。非成熟H8Aでの汚染は検出可能でなく
、HSAのシグナル配列及びブロー配列の切断がこの酵
母で効率よく起こることを意味する。
いクロマトグラフィーをスーパーロース12(ファーマ
シア)で実施する。溶離緩衝液(50mMトリス−HC
Q pH8,0)の流速を1rnQ/分で保持する。組
換え体アルブミンと比較アルブミンの濃度は各々0.4
mg/mQと1mg/mQである。アルブミンの溶出は
280nmに於ける吸光度を測定して検出する。両方の
場合とも溶出量は同じである(11.5mQ)。
ルブミンをヒト血漿から誘導される比較アルブミンと同
様に0.31MN a CQの濃度でMono QH
R515カラム(ファーマシア)から溶離する。
平衡にしたカラムを用い、一定流速1 m Q 7分で
組換え体H8A(0,4mg/mQ)と100μ9と比
較H8A(0,5mg/mu)の100μQを注入して
得たクロマトグラフィープロフィルを示す。
ブミンの挙動を緩衝液A(0,1%トリフルオロ酢酸(
T F A)を含む水) とB (0,1%TFAを含
むアセトニトリル)を有するヌクレオシル(C4)カラ
ムにより解析する。第40図はA中20〜80%Bの勾
配で酵母アルブミンの溶出を示し、比較アルブミンと同
じ保持時間を示す。
誘導化の後、組換え体H3Aのアミノ酸組成を逆相クロ
マトグラフィーによって決定する。この方法によって得
られる結果は、ヒト血漿由来の比較アルブミンと明らか
に同じ組成を示す。
作装置の使用はに、ラクチスによって分泌されたH8A
のN末端配列がA s p−AQa−His−Lys−
8er−GQu−V a Q −A Q a −Hi
s −A r g −P h e−Lys−Asp−L
eu−GQYであることを示す。従ってこの配列の決定
は化ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験から誘導され
る結果を確認し、K、ラクチス酵母によって分泌される
アルブミンの正しい完全な成熟を示す。
光は組換え体及び血漿アルブミン337nmで最大)の
両方に対して同じプロフィルを示し、このアミノ酸のま
わりで同じ疎水性条件であることを意味する(第41図
)。
ルブミンは75℃で同じ安定性速度論(第42図)を有
し、タンパク質構造を安定化する結合(疎水性相互作用
及びジスルフィド結合)は両方の場合で同じである。
れる異なったモノクローナル抗体について研究した。第
43図はそれらの特異性を示し、抗体HAI O,HA
I 1及びHAI3は全分子の完全さが維持に必要とさ
れるエピトープに対応する。抗体HA21゜HA6.H
A4.HA3.HA8及びHAIはN末端からC末端ま
でのペプチド鎖に局在ノエヒトープに対応する(トイエ
ン、N、W、Mo1. In mu n 、第22巻(
1985年)1〜10頁、ラプレスル、 CAnal、
Biochem。
た抗体をポリスチレンプレートに吸着させ、アルカリ性
ホスファターゼで標識したアルブミン結合曲線を各抗体
に対して決定する。各抗体に対する飽和曲線はS状が現
われ、50%結合に相当する標識アルブミン量が各抗体
による阻害を研究するために選ばれた。
ミン(シグマ)試料で得たものと比較した。第44図は
試験された9抗体に対して組換え体アルブミンが生アル
ブミンと同様に阻害することを示す、試験の極端な感受
性があるとすれば、観察される差異は重要ではないと思
われる。
発現ベクターを含むカ セット E、7.1 IL−1β構造遺伝子の合成IL−1β
に対応する構造遺伝子の化学的合成は既に記載されてお
り(ユング、Go等、Ann、 In5t、 Pa5t
eur/Microbio1.第139巻(1988年
)129〜146頁)、簡単に言えば構造遺伝子をNd
eI−Hindm制限フラグメントとして14個の合成
オリゴデオキシヌクレオチドから組み立てる。オーロン
等によって発表された配列(Proc、 Natl。
〜7911頁)と比較すると本実施例で使用した合成遺
伝子は次の修飾を含む、1)Hindl11部位を取り
除くために483位のAGCコドン(Ser)をTCC
コドンに置き換える 五)NdeI部位を取り除くため
に506位のCにTを置換するii)翻訳開始メチオニ
ンを含む435位(GAATTCATATG)にEco
RI部位、次にNdeI部位を作製する桓)翻訳終結コ
ドンから直下流にHi n d■部位を導入するために
896位にAAGCTT配列を加える。
はプラスミドpUc19指示PCI131の誘導体に含
まれるE c o Rl−H1ndnI制限フラグメン
トとして利用できる。
びに、ラクチスのキラー毒 素分泌シグナルの制御下IL−1 βを含む分泌ベクターの構築 に、ラクチスのキラープラスミドKl(スターク、M、
J、R及びボイド、A、EMBOJ。
伝子の分泌シグナル(“′プレ″領域)に対応するDN
Aフラグメントを次の2つの合成オリゴデオキシヌクレ
オチドから組み立てた。
ACATATTTTTGTTTTTGCTGTCATT
CGTTCAAGGTAAAAG−3’ SqB : 5’−AATTCTTTTACCTTGA
ACGAATGACAGCAAAAACAAAAATA
TGTAAAATATATTCAT−3’ これらの2つのオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリ
ッド化し、それによってキラー毒素のシグナル配列法に
に、ラクチスのKEXI遺伝子によって産生されるエン
ドペプチダーゼによって認識できる潜在的な切断部位を
示すジペプチドL ys A rg (T anguy
−Rougeau、 C、等、FEBSレターズ第23
4巻(1988年)464〜470頁)を再構成した。
面にある。この構築に於てシグナル配列から下流に位置
する末端だけが機能的EcoRI部位を再生することが
できる。このDNAフラグメントは、プラスミドPEP
GK41の単一EcoRI部位に所望の配向でクローン
されてプラスミドpSPGK1(第45図)を作成する
。PEPGK41はEcoRI部位(第45図で示した
配列参照)によって置き換えられたH i n d m
クローニング部位を除いてプラスミドpYG12(実施
例3で既に記載した)に存在するものと一致するS、セ
レビシェのPGK遺伝子のプロモーターとターミネータ
−を含む5aQI−B a m HIカセットを含む、
使用した方、策の結果としてプラスミドpsPGK1は
合成シグナル配列から下流に構造遺伝子のクローニング
を可能にする唯一のE c o RIを有する。
エンコードする構造遺伝子を得るためにプラスミドpc
1131 (E、7.1項参照)を酵素Hi n d
mで直線とし、大腸菌DNAポリメラーゼエのフレノウ
フラグメントで処理して末端プラントエンドにし、合成
EcoRIリンカ−(5’ −GGAATTCC−3’
)と連結した。酵素EcoRIで切断した後、Met−
IL−1βに対応するフラグメントを電気溶離で精製し
、プラスミドpsPGK1のEcoRI部位にクローン
してプラスミドpSPGK−IL17 (第46図)を
作成した。この構築では、IL−1βにコードする配列
はキラー毒素から誘導される分泌シグナルを有する翻訳
枠内で起こる。
の開始はペンタペプチドLysArg I leHis
Metによるシグナルペプチダーゼ(G in G l
y八)によって認識される切断部位から分離される。
GKプロモーター/分泌シグナル−IL−1β/PGK
ターミネータ−)に対応するS a 11 I −Hi
n d m制限フラグメント源である。このフラグメ
ントは電気溶離で精製され、プラスミドpcXJl(第
9図参照)にクローンされ、同じ酵素で切断してプラス
ミドpsPGK−IL21(第47図)を作成する。プ
ラスミドpUC4K(ファーマシア)は、ゲネチシン(
0418)に耐性の遺伝子源であり、5anI制限フラ
グメントとして電気溶離で精製した0次いでこのフラグ
メントをプラスミドpSPGK−IL21の5aQI部
位にクローンして発現プラスミドbsPGK−IL31
(第48図)を作成した。
御下IL−1βを含む 分泌ベクターの構築 PH05プロモーターの重要性はこれかに、ラクチスの
誘発性発現系を表わし、S。
ン酸塩濃度で抑制され、リン酸塩のない培地中で誘発さ
れる(チェノ、X、J、及びフクハラ、H,ジーン第3
69巻(1988年)181〜192頁)という事実に
ある。
プロモーターとターミネータ−領域からなる0、94k
bpの大きさのBamHI−Ps t I制限フラグメ
ントを含む。このフラグメントは 2.03 k b
PB a m HI −P s t Iゲノムフラグメ
ント(Bajwa、W、等、Nucl、 Ac1d R
es、第12巻(1984年)7721〜7739頁)
から誘導され、酸ホスファターゼをエンコードする構造
遺伝子が一4位(翻訳開始ATGに関して)と翻訳終結
TAGコドンから上流に局在する単一5au3A部位と
の間で欠失されている。プロモーターとそのターミネー
タ−間の結合にEcoRI/SmaI/BamHIポリ
リンカーが挿入され、翻訳開始コドンを含む構造遺伝子
を導入させることができる。
EcoRIフラグメントはプラスミドpEPHoのEc
oRIに所望の配向にクローンされてプラスミド(第4
9図)を作成する。 Met −I L−1βに対応す
るEcoRI制限フラグメントはプラスミドpSPGK
−IL17 (第46図)から精製され、プラスミドp
SPHO4のEcoRI部位にクローンされてプラスミ
ドpsPHo−IL14(第50図)を作成する。この
プラスミドは発現カセット(PHO5プロモーター/分
泌シグナルーIL、−1β/PH05ターミネータ−)
に対応するS a Q I −Hi n d m制限フ
ラグメント源であり、このフラグメントは電気溶離で精
製され、同じ酵素で切断されるプラスミドpCXJIに
クローンされてプラスミドpsPHo−IL23(第5
1 図)全作成する。ゲネチシン(0418)に耐性の
遺伝子を含む5aflI制限フラグメントはプラスミド
pUC4Kから電気溶離で精製され、次にプラスミドp
SPH〇−IL23のSaQ I部位にクローンして発
現プラスミドpsPH0−IL35 (第52図)を作
成した。
由来プラスミドの分裂室 定性 プラスミドpSPGK−IL31及び psPHo−IL35の分裂安定性は時間をおいて行な
われ、非選択培地中で規定された発生数増殖させた後、
最小選択培地(ウラシルで補足されていない)での増殖
能を保持する細胞の%として定義した。第53図に示さ
れる通り、これらの2つのプラスミドは著しく安定であ
るが、PH05プロモーターを含む構築と比較されるP
GKプロモーターを用いる構築間に異なった安定性があ
り、非選択培地で40個の細胞発生後、75%(プロモ
ーター誘発)〜93%(プロモーター誘発しない)の細
胞はプラスミドpsPHo−IL35を維持するが、プ
ラスミドpSPGK−IL31はわずか44%の細胞で
保持される。
の工業利用の見地から潜在的毒性異種タンパク質の生産
相からの酵母培養の増殖相をカップリングしない誘発性
発現系の重要性を示す。
に記載した手法に従ってに、ラクチス菌株MW98−8
Cに移入した。ウラシルを欠く最小培地で形質転換体を
選択した後、わずかのクローンを0418 200gg
/ m Qを含むYPD培地に接種し、IL−1βの分
泌能を研究した。
料をエタノールで処理した(最終濃度60%で一20℃
に於て60分)、沈降物質を遠心分離(15,000g
で20分)で回収し、yK容量の1/10 に95℃で
15゛分間加熱して試料緩衝液cレムリ、U、K。
)に再溶解した後、12.5%ポリアクリルアミドゲル
に析出させた。試料を電気泳動にかけた後、製造業者(
ボーリンガーマンハイム)の指示に従ってエンドグリコ
シダーゼHで試料を前処理して又はせずにゲルをニトロ
セルロース膜にプロットし、ヒトIL−4β(ゲンチー
ム)に対するポリクローナル抗体を用いた後にクーマシ
ーブルーで染色したゲルを変性(第54図)して、ある
いは免疫学的に検出した。
ら得た免疫学的シグナルはエンドグリコシダーゼHでの
処理に感受性であり(見掛けの分子量24kD〜19k
Dに減少)、酵母の組換え体IL−1βがグリコジル化
されることを示す。この結果は、IL−1βのN末端部
分の潜在的なN−グリコジル化部位の存在と一致する(
7位のASn)++プラスミドPSPHO−IL35で
形質転換され、無機リン酸塩のない培地中三角フラスコ
で増殖したに、ラクチスMW98−8Cの培養上清2m
Q(チェノ、X、J、及びフクハラ、H,ジーン第36
9巻(1988年)181〜192頁)を分泌されたI
L−1βを精製するために逆相カラムに直接適用した。
これは組換え体インターロイキンに相当する。この手法
で精製した物質量を分光光度法で定量し、IL−1βが
培養上清1悲につき35mgのレベルでに、ラクチスに
よって分泌されることを推定した。
オシステム)のN末端部分の配列化はキラー毒素の″プ
レ″領域が全く存在しないこと従って酵母シグナルペプ
チダーゼ(スターク、M、J、R,及びボイド、A。
頁)によって認識されるGΩnGQy△切断部位に於て
に、ラクチス菌株MW98−80による有効な成熟を示
す、プラスミドpSPHO−IL35に存在するIL−
1β発現カセットの構築で使用した手順の結果として組
換え体IL−1βのN末端は成熟ヒトIL−1βと一致
されず、マイクロ配列化(LysArgIQeHisM
etAQaPr。
11残基の配列は成熟ヒトIL−1βに対応する配列か
ら上流に更にいくつかのアミノ酸(LysArg I
Q eHisMet)の存在を確認し、特にに、ラクチ
スの酸素KEXI(LysArg八)による切断の潜在
的部位がこの配列関係に認識されないことを示す、従っ
てキラー毒素に対する分泌シグナルと成熟IL−1βに
対する構造遺伝子(GQnGQyΔA Q a P r
o V a Q )間の正しい結合の部位指示突然変
異生成による作製は、正しく成熟分泌したIL−1βを
得ることができる。
ーを含むカセット E、8.I S、セレビシェのPGKプロモーターの
制御下Met−tPA発現 及びプレプロ−tPA分泌のため のベクターの構築 tPAをエンコードする構造遺伝子をプラスミドpXL
348 (Met tPA)及びPXL459 (プ
レプロ−tPA)がら分離しくサーミエントス、P0等
、バイオテクノロジー第7巻(1989年)495〜5
01頁)、その制限地図を第55図に示す。
ドpY G 224 A/B (Met−tP A)
及びpYG225 A/B(プレプローtPA)は次
の図に従って誘導される。
限混合物をリン酸化Xho n −Hln d■アダプ
ター(合成オリゴデオキシヌクレオチド5’ −GAT
CAAGCTT−3’ )と連結する6次いで混合物を
酵素Hi n d mで消化し、Met−tPAをエン
コードする制限フラグメントをベクターpUC8のHi
nd■にクローンして中間体プラスミドpYG205を
作成する。このプラスミドを酵素NdeIで切断し、リ
ン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチド5’ −TAA
GCTTCA−3′及び5’ −TATGAAGCT−
3’の等モル混合物と連結してNde I −Hin
dm−NdeIアダプターを再構成する。試験管内で連
結した後、この混合物をHindll[で消化し、M
e t −t P Aをエンコードする制限フラグメン
トを電気溶離で精製し、ベクターpYG206のHi
n d m部位にクローンしてプラスミドPYG211
を作成する。
酵素NdeIとベクターの自己連結の前の大腸菌ポリメ
ラーゼエのフレノウフラグメントによる付着端の充填で
破壊されているプラスミドptrcsに相当し、従って
プラスミドpYG211はMet tPAのATG開
始コドンに位置する唯一のNdeI制限部位があるMe
t−tPAをエンコードするHind■フラグメントを
含む。プラスミドpYG211中では翻訳開始コドンか
ら上流のヌクレオチド配列は次の通りである。5’ A
AGCTTCATATG、、、3’ プラスミドpYG211はプラスミドpYG219源で
あり、プレプロ−tPAをエンコードするHindll
lフラグメントを含む、このプラスミドはpYG211
のNde l−8stIフラグメントをプラスミドPX
L459のNdeI−8stIフラグメントで置換する
ことによって構築され、プレプロ−tPAのN末端部分
を含む(第55図)、従ってプラスミドpYG211(
Met−tPA)とPYG219(プレプロ−tPA)
はプラスミドpYG211が開始コドンに直接付随した
tPAの成熟型をエンコードする違いを除いて厳密には
同遺伝子型であるが、プラスミドPYG219では成熟
tPA配列はそのプレプロ天然エクスポーション配列に
付随している。
H i n d mフラグメントを電気溶離でプラスミ
ドpYG211とpYG219から精製し、同じ制限酵
素で切断されるベクターpY0208(第19A図参照
)に正しい配向でクローンし、中間体プラスミドpYG
222とpYG223を作成する。これらのプラスミド
は5aQI制限フラグメントとして利用される発現カセ
ットを含み、次いでベクターpKan707にクローン
されてプラスミドpYG224 A/B(Met−t
PA)とpYG225 A/B (プレプロ−tPA)
を作成する。このベクターに関して5aNIカセツトの
A及びB配向は上記の通りプラスミドPYG221 A
/B(プレプロ−H8A)に対して規定された。
YG225 A/B(プレプロ−tPA)を特にE、
4.1項で記載した手法に従ってに、ラクチス菌株MW
98−8Cに移入した。
ーンを選択YPD培地に接種し、tPAの発現分泌能を
次の手法(i)クーマシーブルー染色SDSポリアクリ
ルアミドゲル(ii)ゲルをニトロセルロース膜にプロ
ットし、製造業者の指示(ボーリンガーマンハイム)に
従って使用した脱グリコジル化酵素エンドグリコシダー
ゼH又はグリコペプチダーゼFで細胞画分を前処理した
又はしないヒトtPAに関する一次抗体(バイオプール
)を使用した後、免疫学的検出(ni)PBS緩衝液に
溶解した次の組成1%アガロース、0.1%フィブリノ
ーゲン(カビビトルム)、0.2単位/mΩトロンビン
(シグマ)を有する指示プレートによるフィブリンプレ
ートアッセイに従って研究した。
25B)又は細胞抽出物に特異免疫学的シグナルが検出
されないことを示す。
胞抽出物、特に不溶性タンパク質に相当する両分にかな
りの特異シグナル(1〜10mg/培養液IQ)を生じ
るためこの検出方法は異議はない。
ロモーターの制御下に、ラクチスによって発現分泌され
るプレプロ−tPAの免疫学的検出に必要条件のように
思われる。
現される場合、このタンパク質の不均一な過グリコジル
化によって説明することができる。特にこの過グリコジ
ル化は、PGKプロモーターから発現される酵母組換え
体tPAの弱い抗原性の原因であることができる。
PA)で形質転換されたに、ラクチスMW9B−8Cの
培養上清に酵素活性があることを示すが、プラスミドp
Kan707(対照ベクター)又はpY0224B(M
at−tPA)で形質転換された菌株MW98−8Cの
培養上清に存在しない、従って分泌tPA活性の検出は
tPAのプレプロ配列かに、ラクチスMW98−8G酵
母で機能することを示す、また指示プレートによるtP
A活性の試験は、構築物M a t −t P Aで形
質転換された菌株MW98−8Cの細胞内画分に活性化
があることを示す(結果は示されない)。
体を複製することができる酵母によるtPA分泌レベル
に関して基本的要素である。クルイベロミセス属酵母に
よるベクターpKan707にクローンしたtPAの分
泌能をフィブリノーゲン寒天指示プレートにより上述の
通り試験した。に、ラクチス菌株ATCC34609及
びATCC34610゜ATCC36906(K、ドロ
ソフィラルム)及びに、フラギリスATCC36534
及びATCC36907はに、ラクチス菌株MW98−
8Cのそれと同じ程度のtPA分泌に有効であるが、同
じ条件下で菌株ATCC12424(K、フラギリス)
、ATCC24178(K、ウィッカーハミイ)及びA
TCC56500(K、ワルチ)で実施した試験は、t
PA活性を培養上清に検出することができなかった。
ター含有カセット E、9.IS、セレビシェのPGKプロモーターの制御
下TIMPの発現分泌 に対するベクターの構築 TIMPをエンコードする完全構造遺伝子をプラスミド
pPV2−TIMPから分離した。このベクターはHi
ndlll制限フラグメント(カクレゾレック9M0等
、Bio/Technol。
きるTIMPcDNAからなる。
pY0208 (第19A図)のHindnlに正しい
配向でクローンしてプラスミドpYG220を作成した
。このプラスミドは発現カセット(PGKプロモーター
/TIMP/PGKターミネータ−)に相当する5aQ
Iフラグメント源であり、ベクターpKan707 (
第13図参照)の5aQ1部位にクローンし、ベクター
に関してこの5aflIフラグメントの配向だけが互い
に異なる発現プラスミドpYG226A/Bを作成した
。プラスミドPYG226A/BのA及びB配向を上述
の通りプラスミドpYG221A/B(プレプロ−H3
A)、pYG224A/B (Met−tPA)及びp
YG225A/’B(プレプロ−tPA)に対して規定
した。
た手法に従ってに、ラクチス菌株MW98−8Gに移入
した。041Bの存在下細胞を選択した後、2.3 の
クローンをYPD選択培地に接種し、TIMPの発現分
泌能をクーマシーブルー染色SDSポリアクリルアミド
ゲルであるいはゲルをニトロセルロース膜にプロットし
、細胞画分をエンドグリコシダーゼHで前処理して又は
せずにヒトTIMPに関する一次抗体(Rhana−P
oulencSant6)を用いた後、免疫学的検出に
よって研究した。
化細胞内抽出液(不溶性タンパク質画分)で検出される
が、(非脱グリコジル化培養上清には検出されない(第
57図)。
感受性であり、酵母組換え体TIMPがN−グリコジル
化されることを示す0組換え体TIMPの分泌は、プラ
スミドpY0226Bで形質転換された菌株MW98−
8Cの培養上清を試験管内税グリコジル化した後証明さ
れ、TIMPの天然エキスポーテーシヨン配列かに、ラ
クチスMW98−8Cで機能することを示す。
第CBS 579.88号として登録されたブタベス
ト条約の規定に従ってオランダバーンのCantraa
lbureau voorSchia+malkult
uren (CB S )に寄託されている。
ではなく構築に重要な制限部位のみを示すものである。 第1図 ヒト肝臓から分離したポリ(A)−mRNAか
ら誘導される3種cDNA クローン(テキスト参照)から得ら れたMet−H3Aをエンコードす る完全配列を含むプラスミドpXL 276の構築。 4種の合成オリゴデオキシヌクレオ チドからアルブミンのプレプロ配列 の再構成プラスミドpXL290の 構築。 プラスミドpXL299の構築。 プラスミドpXL322の構築。 プラスミドpXL855の構築。 プラスミドpXL869の構築。 プラスミドpXL869から誘導さ れ、プレプロ−H3A構造遺伝子を 含むHi n d mフラグメントのヌクレオチド及び
アミノ酸配列。濃い矢 印はパプレ″及び″゛プロ″領域末 筆3図 第4図 第5図 第6図 第7図 第2図 端を示す。 第8図 プラスミドpUC−URA3の構築。 第9図 プラスミドPCXJIの構築。 第1O図 プラスミドpK1−PS1535−6の構築
。 第11図 プラスミドpUC−Kan202の構築。 第12図 5caI制限部位からプラスミドに1の0R
FIプロモーター及び0RF 1とTn903由来のアミノグリコ シドホスホトランスフェラーゼをエ ンコードする細菌遺伝子の5′領域 との間の結合を含むヌクレオチド配 列・ 第13図 プラスミドp K a n 707の構築。 第14図 非選択生育条件下菌株MW98−80のプラ
スミドp K a n 707の安定性曲線。 第15図 プラスミドpYG11の構築。 第16図 プラスミドpYG18のW築。 第17図 プラスミドpYG19の構築。 第18図 プラスミドpYG19(プレプロ−H8A)
及びpYG23 (Met− H8A)の例示、各プラスミドの下 にあるヌクレオチド配列はPGK遺 伝子プロモーターと異なった形の H8Aの構造遺伝子と間の結合であ る。 第19図 プラスミドpYG208.pYG210(パ
ネルA)及びpY0221 B(パネルB)の構築。 第20図 プラスミドpYG14.pYG26及びpY
G29の構築。 第21図 A、UAS領域の側面にあるNot工部工部
基入するためにS、セレビ シェのPGKプロモーターの突然変 異生成0部位指示突然変異生成によ って変化する4つの塩基対はNot 1部位の下に星印で示される。 B、 構築物pYG19及びpYG 第22図 第23図 44の非翻訳PGKリーダー配列。 部位指示突然変異生成によって野生 型PGKプロモーターの一25領域 に導入されるHindmは、わくで 示される。 K、ラクチスのLAC4プロモータ ーのUASを含む合成りNAフラグ メントによるUAS、、にの置換及び 合成アダプターを突然変異PGKプ ロモーターに連結することによる PGK野生型ATG関係の再構成。 種々のプロモーター及びH3Aを増 殖培地に分泌することを指示する p K a n 707由来プラスミドに存\ 在するシグナル配列を有する5aQ I−8acI発現カセット。 第24図 −20位にHindm部位を導入するための
S、セレビシェのPH05 プロモーターの部位指示突然変異生 成。 第25図 第26図 第27図 第28図 構築pYG51のATGイニシエー ターコドン近くのプロモーター領域 のヌクレオチド配列 PGKプロモーターの5′非翻訳リ 一ダー配列を含む合成Hindm− DraI DNAフラグメント、K。 ラクチス(プレ領域)のキラー毒素 のシグナル配列及びプローH3A遺 伝子の最初の数コドンの再構成、プ ラスミドPYG56の構築。 プラスミドp31/RAG2 : URA3、pYG6
0−5及びpYG60 −21の図示。 非選択生育条件下プラスミドpYG 19及びpYG23を表現するHSA の分裂安定性、■プラスミドpYG 19で形質転換された菌株MW98 −8C、ロブラスミドpYG23で 形質転換された菌株MW9B−8C1 ΔプラスミドpYG19で形質転換 された菌株CB 5683゜ 第29図 菌株MW98−8CからのHSAの発現及び
排泄を示すクーマン−ブル ー染色後の8.5%5DS−ポリア クリルアミドゲル。レーン1〜4: ヒト血漿(シグマ)から抽出した比 較アルブミンは増加濃度pYG19 、(プレプロ−H8A)、pYG23 (Met−H3A)及びpYG25 (発現カセットのない対照ベクター) ル−ン当り0.2μg、0.6μg。 2μg及び6μgでスポットした。 各レーンは原培養液100μQに等 価のタンパク質量に対応する。a) 可溶性画分、b)不溶性画分、C) 培養上清 第30図 テキストに記載される通りニトロセルロース
にプロットした7、5%ポ リアクリルアミドゲルのイムノブロ ッティング。レーン1〜5:記載さ ねるように種々の濃度でYPD培地 に溶解しTCA (5%最終濃度)で 沈降させたヒト血漿(シグマ)で抽出 した比較アルブミン、従ってH8A 標準の試料は培養上清と同じ方法で 処理した1両方の場合とも、ゲルス ポットは等価容量に対応する。1) HSA100mg/pYG19 (プ レプロ−HSA)及びpYG23 (Me t −HS A) ル−ン、2)50mg/レ
ーン、3)25mg/レー ン、4)12.5mg/レーン、5) 6mg/レーンの濃度で沈降実験。 各レーンは原培養20μaに等価な タンパク質量に対応する。a)培養 上清b)不溶性画分C)可溶性画 分。 第31図 菌株MW98−8GからのHSAの排泄速度
論を示すクーフシ−プル染 色後の8.5%ポリアクリルアミド ゲル。 A、レーンミーミニ記載した通り種々 の濃度でYPD培地に溶解し、TC A(最終濃度5%)で沈降させた比 較H8A (シグマ)(第21図の説明文参照)、指示
された培養年令16 〜61時間の作用として 1)HSA (シグマ)濃度6 m g / p Y G 19pY
g19 HSAの介在分泌ル− ン、2)12.5mg/J、3)25mg/Q、4 )
50 m g / Q 、 5 ) 100m g
/ n 、各試料は培養上清160μ悲の等価量に対応
する。 B、レーンa−e:指示された培養 16〜61時間の年令作用として pYG19.pYG19−HSAの介 在介泌ル−ン当り増加濃度0.4 μg e O−6μg、0.8pg、1.0μg及び1
.2μgでスポットした比 較)ISA (シグマ)、各試料は、培養上清25μΩ
の等価量に対応する。 第32I% A 、プラスミドpYG19で形質転換さ
れ、テキストに記載される通り三 角フラスコで増殖させた菌株MW 98−8CからのHSAの排泄の速 度論のグラフ表示、増殖培地で検出 したアルブミン濃度(mg/J)を 培養年令の作用(時間)として示す。 4種の独立した実験の結果を示す。 B、プラスミドpYG19で形質転換 した菌株MW98−8Cの増殖曲線。 第33図 PGK又はPGK/LAC4ハイブリッドプ
ロモーターの制御下アルブ ミン分泌効率に関する炭素源効果、 プラスミドpYG19及びpYG 44で形質転換したに、ラクチス菌 株MW98−8Cのクーマシーブル ーで染色した培養上清の5O8− PAGE解析。 A、YPD (2%グルコースを含む)(レーン1〜3
)あるいは43時間生 育させた後に2%ラクトースを加え たYPD培地(レーン4〜6)で 211時間生育させた振盪フラスコ 培養からの上清、レーンa及びb: H3Aシグマ各々0.5及び1.0μg、レーン1及び
4プラスミドpYG 44−5、レーン2及び5プラスミ ドpGY44−7、レーン3及び6 プラスミドpYG19゜ B、YPD (2%グルコースを含む)(レーン1,4
及び7)、YPL (2%ラクトースを含む)(レーン
3゜ 6及び9)あるいは2%ラクトース を43時間生育させた後に加えた YPD培地(レーン2,5及び8) で113時間生育させた振盪フラス コ培養からの上清(ル−ン当り 25μり、レーンa、b及びC: H3Aシグマ各+0.25,0.5及 び1.0μg、レーン1〜3ニブラ スミドpY044〜5、レーン4〜 6:プラスミドpYG19.レーン 7〜9:発現カセットのないプラス ミドp K a n 707 m 第34図 アルブミン分泌の効率に関するプロモーター
及びシグナル配列置換の効 果、プラスミドpYG51.pYG 19及びpYG58で形質転換され たに、ラクチス菌株MW9B−8C のクーマシーブルーで染色した培養 上清の5DS−PAGE解析。 A、2%ラクトースを43時間生育さ せた後に加えたYPD培地中で115 時間生育させた振盪フラスコ培養か らの上清(ル−ン当り25μa)。 レーンa、b及びc:HsAジクマ 各々0.2,0.5及び1.0μg、 レーン1ニブラスミドpYG51 (PHO5プロモーター)、 レーン 2ニブラスミドpYG (PGKプロ モーター)。 B、YPD培地中で66時間(レーン 1〜3)又は138時間(レーン4 〜6)生育させた振盪フラスコ培養 からの上清。レーンa、b及びC: H8Aシグマ各々0.25,0.5及 び1.0μg、レーン1.2.4及び 5ニブラスミドpY058 (キラー 毒素分泌シグナル2種の独立した形 質転換細胞)、レーン3及び6:プ ラスミドpYG19 (アルブミン分 泌シグナル)。 第35図 LaO2又はPGKプロモーターの制御下ア
ルブミン分泌の効率に関す る炭素源の効果、プラスミドpYG 404及びpYG19で形質転換し たに、ラクチス菌株CB52359 のクーマシーブルーで染色した培 養上清の5DS−PAGE解析。 第36図 YPD(2%グルコースを含む)(レ ーン1及び4) 、YPL (2%ラクトースを含む)
(レーン3及び6) あるいは2%ラクトースを48時間 生育させた後に加えたYPD培地 (レーン2及び5)で166時間生育 させた振盪フラスコ培養からの上清 (ル−ン当り25μQ)、レーン a、b及びc : H3Aシグマ各々 0.25,0.5及び1.0μg、レ ーン1〜3ニブラスミドpYG404、レーン4〜6:
プラスミドpYG 19゜ プラスミドベースに対して組込まれ たPGK発現カセットの制御下での アルブミン分泌の効率、に、ラクチ ス組込み菌株MW98−8 G::60−5及びMW9
8−8C::60− 21及びプラスミドpYG19で形 質転換された菌株MW98−8Cの 培養上澄の5DS−PAGE及びイ ムノプロット解析、上清(ル−ン 当り25μQ)をYPDで137時 間生育させた振盪フラスコ培養から 取った。 A、PAGE−8DS:レーンa、b。 C及びd:H3Aシグマ各々o、1゜ 0.25,0.5及び1.0μg、レーン1ニブラスミ
ドpYG19で形質 転換した菌株MW98−8C,L/− ン2〜7:6個の非依存性組込み菌 株(各々MW98−8C::60−5 #6.MW98−8C::60−21 #9、MWQ8−8G=:60−21 #7.MW98−8C::60−5# 4、MW98−8C::60−5#8、MW98−8G
==60−21811、E、3.7章参照) B、ウェスターンプロット解析二Aで 示したと同じ試料(ル−ン当り析 第37図 出した上滑25μa) プラスミドPYG19及びpYG 221Bで形質転換した種々のクル イベロミセス菌株のアルブミン分泌 効率。クーマシーブルーで染色した 濃縮培養上清の5DS−PAGE解 析。細胞を0418 (200μg/ mQ)で補足したYPD培地で89 時間生育した。上清をセントリコン 30マイクロフイルトレージヨン単 位(アミコン)を用いて10倍に濃 縮した。ル−ン当り析出した濃縮 上清量をバイオマス生産機能として 標定し、9〜25μQに変化する。 レーンa及びb:H3Aシグマ0.5 及び1.0μg、レーンC及びd:マ イクロフィルトレージョンにかけた HSAシグマ。YPD培地のHSA 溶液をマイクロフィルトレージョン で10倍に濃縮した。濃縮基準の 25及び2.5μρを各々レーンC及 びdに析出させた。レーン1;プラ スミドpY0221Bで形質転換した 菌株ATCC16045(K、マレ キシアヌス変異株ブルガリクス)、 レーン2ニブラスミドpY0221 Bで形質転換した菌株ATCC 24178(K、ウィッカーハミイ)、レーン3ニブラ
スミドPYG19で形 質転換したATCC12424(K。 マルキシアヌス変異株マルキシアヌ ス)、レーン4ニブラスミドpYG 19で形質転換した菌株ATCC 56500(K、ワルチイ)、レーン 5ニブラスミドpYG221Bで形 質転換した菌株ATCC36906 (K、マルキシアヌス変異株ドロソフ ィラルム)、レーン6:プラスミド PYG19で形質転換した菌株CB5 4574 (K、マルキシアヌス変異 第38図 株ラクチス)、レーン7:プラスミ ドp Y G 19で形質転換した菌株CB5683
(K、マルキシアヌス 変異株ラクチス)、レーン8ニブラ スミドPYG19で形質転換した菌 株MW98−8 C(K、マルキシア ヌス変異株ラクチス)、レーン9ニ ブラスミドpKan707 (ベクタ ーのみ)で形質転換した菌株MW 98−8C(K、マルキシアヌス変 異株ラクチス)、レーン10ニブラ スミドpY0221Bで形質転換し た菌株MW98−8C(K、マルキ シアヌス変異株ラクチス)。 電気泳動技術(S=標準 L=酵母 アルブミン) A−銀塩で染色するPAGE− 5D S (Phastゲル、ファーマシア、勾配8〜
25%)L:0.05〜 0.25μg 第39図 第40図 第41図 第42図 第43図 B−等電点点(Phastゲル、PH 4,5〜6.0)、クーマシーブルー で染色、スポット=1μg C−PAGE SDS (7,5%)クーマシーブルー
で染色、 S=0.2 〜1.0μg、 L=0.25〜2.5μ g・ イオン交換クロマトグラフィー−モ ノQ(ファーマシア)、底部酵母 H8A 40μg、上部標準H8A 30μg。 逆相クロマトグラフィー=ヌクレオ シルC4a)I51準H8A b)酵母H8A。 トリプトファン蛍光発光スペクトル、 実線:標準H8A、破線:酵母H8A。 75℃に於ける温度安定性、実線: 標準H8A、破線:酵母H8A。 抗原確認に使用される種々のモノク ローナル抗体によって認識されたア 第44図 第45図 第46図 第47図 ルブミン領域 A、B、C:特異性が第43図で示 される9種のモノクローナル抗体に 関する阻害曲線(テキスト参照)、 アルブミン濃度(μg/mρ)に関 する阻害%、ロ:漂準H3A、麿: 酵母HSA。 プラスミドpsPGK1の構築及び 分泌シグナルとして用いられる合成 EcoRIフラグメントのヌクレオ チド配列の表示。またプラスミド pEPGK41のEcoRIクロー ニング部位を取り囲むヌクレオチド 配列を示す。 プラスミドpSPGK−IL17の 構築及びシグナル配列とMet−IL −1βとの間の結合に対応するヌク レオチド配列の表示。 プラスミドpSPGK−IL21の 構築。 第48図 プラスミドpSPGK−IL31の構築。 第49図 プラスミドPSPH04の構築。 第50図 プラスミドpsPHo−IL14(7)構
築。 第51図 プラスミドpsPHo−IL23の構築。 第52図 プラスミドpsPHo−IL35の構築。 第53図 非選択条件下菌株MW98−8Cのプラスミ
ドpcXJ1.pSPGK −IL31及びpsPHo−IL 35の安定性曲線。 ■pCXJ 1.ムpSPH〇−IL 35(誘発されないプロモーター)。 ΔpsPHo−IL35 (誘発され るプロモーター)、口pSPGK− IL31゜ 第54図 菌株MW98−8C(i’)IL−1β分泌
:クーマシーブルーで染色した項 第55図 第56図 養上滑の5DS−PAGE分析各分 析シスポット試料ラスミドpKan 707(対照ベクター、レーン1)、 pSPGK−IL31 (レーン2)又はpsPHo
−IL35 (L/−ン3)で形質転換されたに、ラク
チス 菌株MW98−8Cの上清0.2 mQに対応する。レーン4は大腸菌 (Rh6ne−Poul、enc 5anta)で産生
されたMet−IL−Lβ 1βgに対応する。形質転
換細胞は0418 200 μg / m Qで補足したYPD培地で3日間生育し
た。この上清をテキス トに記載される通り沈降させて濃縮 した。 プラスミドpXL348 (Met− tPA)及びpXL459 (プレプ ロしPA)の制限地図 分泌tPAの活性試験。 プラスミドpY0225B (プレプ ロ−t PA、レーン1)、pY0 224B (Met−tPA、 レーン2)又はp K
a n 707 (ベクターレーン3)で形質転換さ
れたに、ラ クチス菌株MW98−8Cの培養上 清5μ2を選択YPD培地(0418 200μg/mQ)で5日生育した 後tPA活性を示すプレートにポッ トする。 第57図 プラスミドPY0226B又はpKan7Q
7で形質転換された菌 株MW98−8CのTIMPの発現 及び分泌。 ヒトTIMP0.25μg(Rh8ne−Poulen
c 5ant6.レーン1)、酵母組換え体TIMP(
プラスミドpY0 226B)の細胞内発現、非脱グリ コジル化(レーン2)又はエンドグ リコシダーゼHで処理後(レーン3)、大腸菌組換え体
T I M P試料(Ph8ne−Poulenc 5
ant6.レーン4)、制御ベクターp K a n
707で形質転換された菌株MWQ8−8Gの細胞内画 分、非脱グリコジル化試料(レーン 5)又はエンドグリコシダーゼHで 処理後(レーン6)、非脱グリコジル 化濃縮培養上清、プラスミドρKan 707(レーン7)又はpY0226 B(レーン8)で形質転換された菌 株MW98−8G、培養上清を濃縮 後エンドグリコシダーゼHで処理、 プラスミドpKan707 (レーン 9)又はpY0226B (レーン 10)で形質転換された菌株MW 98−8C、ヒトTIMP O,25μg (RhS
ne−Poulenc 5ant6. レーン11)
。 図面の浄書(内容に変更なし) IG−1 FIG−8 FIG−9 翅1し cal ツヤモー12 pkl ノ FIG−15 31七叉俗しτ)し4く平ご F1α14 二へ 円(o5而す払 ′XA肥シダ1シイ3乙。 )1ind tlr −vp4L づ′口ε−タク1η4カ! c/ml ■ (rng/l) IG−39 撚害乍 (%) i日 3I コ ぴL努5窩しぞ)位ろ曵基廷 IG−53 IG−54 手続補正書 (方式) 平成2年を月74.日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、形質転換酵母に対して選択可能な少 なくとも1種のマーカー、酵母内で発現させることがで
きる配列の制御下ヒト血清アルブミン(HSA)又はそ
の変異体の1種の構造遺伝子であるDNA及び適当な場
合には、この遺伝子によってエンコードされたタンパク
質の増殖培地への排泄を含む発現カセットを安定に保持
することができる酵母を生育させることを特徴とするH
SA又は該変異体の微生物学的製造方法。 2、発現カセットが酵母ゲノムに組込ま れる請求項1記載の方法。 3、発現カセットが酵母内で機能する複 製系を含み、この酵母内で該カセットを安定に保持する
プラスミドの一部を形成する請求項1記載の方法。 4、酵母がサッカロミセス属及びクルベ ロミセス属から選択される請求項1、2又は3記載の1
つの方法。 5、酵母がクルベロミセス属から選択さ れる請求項1、2又は3記載の1つの方法。 6、酵母がクルベロミセスマルキシアヌ スの全種から選択される請求項112又は3記載の1つ
の方法。 7、酵母がクルベロミセスマルキシアヌ ス変異株ラクチスである請求項1、2又は3記載の1つ
の方法。 8、酵母内で機能する複製系がクルベロ ミセスマルキシアヌス変異株ドロソフィラルムから最初
に分離されたプラスミドpKD1の全部又は一部、サッ
カロミセスセレビシエから分離された2μプラスミドの
全部又は一部又はプラスミドpKD1と2μプラスミド
から誘導された要素の組合わせである請求項3〜7記載
の1つの方法。 9、酵母内で機能する複製系がpKD1 配列の全部又は一部である請求項3、6、7又は8記載
の1つの方法。 10、プラスミドpKD1の遺伝子A、B 及びC プラスミドpKD1の逆方向反復 プラスミドpKD1の安定性遺伝子座 pKD1及び酵母内で発現させることが できる配列の制御下タンパク質の構造遺 伝子をエンコードするDNAを含む表現 カセットの複製起点 形質転換酵母に対して選択可能なマーカ ー 及び任意により大腸菌に対する複製起点 及び選択可能なマーカー を包含している発現プラスミドで形質転換されたクルベ
ロミセス属の酵母を増殖培地中で培養させる指定された
タンパク質の製造方法。 11、発現カセット及び選択可能なマーカ ーがpKD1のEcoR I 部位に挿入される請求項8
〜10記載の1つの方法。 12、発現カセット及び選択可能なマーカ ーをpKD1のSac I 及びMstII部位又はpKD
1のSph I 部位によって規定された197ヌクレオ
チドの領域に挿入される請求項8〜11項の1つの方法
。 13、構造遺伝子を発現させることができ る配列がサッカロミセス属及びクルベロミセス属の酵母
の遺伝子から誘導されるプロモーターから選択される請
求項1〜12記載の1つの方法。 14、これらのプロモーターがサッカロミ セス属又はクルベロミセス属の酵母の解糖遺伝子から誘
導される請求項13記載の方法。 15、構造遺伝子を発現させることができ る配列がホスホグリセレート(PGK)、グリセルアル
デヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GPD)
、エノラーゼ(ENO)、アルコールデヒドロゲナーゼ
(ADH)、ラクターゼ(LAC4)又は酸ホスファタ
ーゼ(PHO5)から選択される請求項13記載の方法
。 16、構造遺伝子を発現させることができ る配列がホスホグリセレートキナーゼ(PGK)又は酸
ホスファターゼ(PHO5)をエンコードする遺伝子か
ら選択される請求項 13記載の方法。 17、該タンパク質をエンコードする配列 が該タンパク質の自然N−末端リーダーから選択される
タンパク質エキスポーテーシヨン配列に付随している請
求項1〜17記載の1つの方法。 18、該タンパク質をエンコードする配列 が自然配列と異なるエキスポーテーシヨン配列に付随し
ている請求項1〜17記載の1つの方法。 19、該タンパク質のエキスポーテーシヨ ンをエンコードする配列がα−フェロモン又はキラー毒
素をエンコードする酵母遺伝子から得られた配列である
請求項18記載の方法。 20、タンパク質が インターロイキン アルブミン tPA TIMP から選択される請求項1〜19記載の1つの方法。 21、指定タンパク質をエンコードする配 列が I L−1β プレプロ−HSA Met−HSA プレプロ−tPA Met−tPA及び をエンコードする配列から選択される請求項20記載の
方法。 22、HSAを排泄させることができる配 列がアルブミンのプレプロ自然末端リーダーである請求
項1〜19記載の1つの方法。 23、形質転換酵母に対して選択可能なマ ーカーが抗生物質又は銅イオンに耐性を生じる遺伝子か
ら選択される請求項1〜22記載の1つの方法。 24、選択可能な配列がG418に耐性を 生じる遺伝子である請求項23記載の方法。 25、選択可能な配列がK.ラクチスの線 状プラスミドK1のORF1プロモーターとトランスポ
ゾンのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼとの
融合である請求項24記載の方法。 26、選択可能なマーカーが栄養要求性を 相補する遺伝子である請求項1〜25記載の1つの方法
。 27、菌株がプラスミドpKD1、プレプ ロ−HSA DNA、ホスホグリセレートキナーゼをエ
ンコードする遺伝子の転写開始及び終結配列及びに、マ
ルキシアヌス変異株ラクチスの線状プラスミドに1のO
RF1プロモーターとTn903の3’−アミノグリコ
シドホスホトランスフェラーゼ遺伝子との融合配列を含
むプラスミドで形質転換される請求項1記載の方法。 28、菌株がプラスミドpKD1、Met −HSA DNA、ホスホグリセレートキナーゼをエン
コードする遺伝子の転写開始及び終結配列及びに、マル
キシアヌス変異株ラクチスの線状プラスミドに1のOR
F1プロモーターとTn903の3’−アミノグリコシ
ドホスホトランスフェラーゼ遺伝子との融合配列を含む
プラスミドで形質転換される請求項1記載の方法。 29、菌株がに、マルキシアヌス、K.ウ ィッカーハミイ、K.ワルチイ種である請求項1〜28
記載の1つの方法。 30、菌株がK.ブルガリクス、K.マル キシアヌス変異株ドロソフィラルム、K.マルキシアヌ
ス変異株マルキシアヌス又はK.マルキシアヌス変異株
ラクチス種である請求項29記載の方法。 31、ラクトースを中央の対数および初期 定常増殖期の間で加えたグルコース含有培地で酵母を培
養する請求項1〜30のいずれかに記載の方法。 32、請求項1〜30記載の1つの方法に よって得られたときのヒト血清アルブミン。 33、医薬生成物による請求項31記載の ヒト血清アルブミンの適用。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8810615A FR2635115B1 (fr) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | Procede de preparation de la serum albumine humaine a partir d'une levure |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017519992A (ja) * | 2014-06-20 | 2017-07-20 | ルース, ウルリヒLOOS, Ulrich | Tsh受容体に対する自己抗体の検出 |
Families Citing this family (82)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
FR2676070B1 (fr) * | 1991-04-30 | 1994-09-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisation. |
FR2678636A1 (fr) * | 1991-07-02 | 1993-01-08 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de production de proteines recombinantes et cellules hote utilisees. |
EP0933083A1 (en) | 1991-07-12 | 1999-08-04 | Dsm N.V. | Process for the purification of serum albumin |
US5849874A (en) * | 1991-07-12 | 1998-12-15 | Gist-Brocades, N.V. | Process for the purification of serum albumin |
FR2679920A1 (fr) * | 1991-08-02 | 1993-02-05 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Levures recombinantes hautement stables pour la production de proteines recombinantes, leur preparation et leur utilisation. |
FR2686620B1 (fr) * | 1992-01-27 | 1995-06-23 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Serum-albumine humaine, preparation et utilisation. |
FR2686900B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-07-21 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
FR2686899B1 (fr) | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
FR2693475B1 (fr) * | 1992-07-08 | 1994-09-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procédé d'identification et/ou de clonage de promoteurs transcriptionnels, et utilisation de ces promoteurs pour l'expression de gènes. |
FR2693464B1 (fr) * | 1992-07-08 | 1994-09-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisation. |
FR2693463B1 (fr) | 1992-07-08 | 1994-09-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisation. |
FR2694294B1 (fr) * | 1992-07-30 | 1994-09-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Promoteur de levure et son utilisateur. |
DE4244915C2 (de) * | 1992-08-14 | 1998-12-03 | Widmar Prof Dr Tanner | DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind |
US5728553A (en) | 1992-09-23 | 1998-03-17 | Delta Biotechnology Limited | High purity albumin and method of producing |
CA2136564C (en) * | 1993-11-26 | 2008-04-08 | Kaoru Kobayashi | Process for producing human serum albumin |
EP0699687B1 (en) * | 1994-08-31 | 2004-01-28 | Mitsubishi Pharma Corporation | Process for purifying recombinant human serum albumin |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
GB9902000D0 (en) | 1999-01-30 | 1999-03-17 | Delta Biotechnology Ltd | Process |
CN1258379C (zh) † | 2000-02-08 | 2006-06-07 | 阿勒根公司 | 肉毒杆菌毒素药物组合物 |
US20030118598A1 (en) | 2000-02-08 | 2003-06-26 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
US8632785B2 (en) | 2000-02-08 | 2014-01-21 | Allergan, Inc. | Clostridial toxin pharmaceutical composition containing a gelatin fragment |
US7780967B2 (en) | 2000-02-08 | 2010-08-24 | Allergan, Inc. | Reduced toxicity Clostridial toxin pharmaceutical compositions |
EP1278544A4 (en) | 2000-04-12 | 2004-08-18 | Human Genome Sciences Inc | ALBUMIN FUSION PROTEINS |
US6946134B1 (en) | 2000-04-12 | 2005-09-20 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
DK2279753T3 (en) | 2001-10-10 | 2015-11-23 | Novo Nordisk As | The conversion of peptides and glycokonjugering |
IL161251A0 (en) | 2001-10-10 | 2004-09-27 | Neose Technologies Inc | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
US20080194481A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
EP2277910A1 (en) | 2001-12-21 | 2011-01-26 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
KR100441384B1 (ko) * | 2002-01-08 | 2004-07-21 | 주식회사 안지오랩 | 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질 발현시스템 및재조합 인간 혈청 알부민-팀프-2 융합 단백질 |
KR20110014661A (ko) | 2002-02-07 | 2011-02-11 | 노보자임스 바이오파마 디케이 에이/에스 | 알부민-융합 쿠니츠 도메인 펩타이드 |
US7517671B2 (en) | 2002-02-28 | 2009-04-14 | New England Biolabs, Inc. | Methods and compositions for concentrating secreted recombinant protein |
CN101172091B (zh) | 2007-09-25 | 2011-04-27 | 北京美福源生物医药科技有限公司 | 含人血清白蛋白与皮肤细胞生长因子的融合蛋白护肤产品制备工艺和用途 |
GB0217033D0 (en) | 2002-07-23 | 2002-08-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene and polypeptide sequences |
MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
GB0329681D0 (en) * | 2003-12-23 | 2004-01-28 | Delta Biotechnology Ltd | Gene expression technique |
PL1729795T3 (pl) | 2004-02-09 | 2016-08-31 | Human Genome Sciences Inc | Białka fuzyjne albuminy |
US8591885B2 (en) | 2004-04-30 | 2013-11-26 | Allergan, Inc. | Carbonic anhydrase inhibitor sustained release intraocular drug delivery systems |
US8323666B2 (en) | 2005-08-01 | 2012-12-04 | Allergan, Inc. | Botulinum toxin compositions |
EA015860B1 (ru) | 2005-10-13 | 2011-12-30 | Хьюман Дженом Сайенсиз, Инк. | Способы лечения аутоиммунных заболеваний при использовании антагониста нейтрокина-альфа |
EP2054437A2 (en) | 2006-08-07 | 2009-05-06 | Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. | Albumin-insulin fusion proteins |
CA2695830A1 (en) | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Novozymes Biopharma Dk A/S | Transferrin variants and conjugates |
WO2009127691A1 (en) | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Ablynx N.V. | Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same |
AU2009264214B2 (en) | 2008-06-24 | 2013-06-06 | Technische Universitaet Muenchen | Muteins of hNGAL and related proteins with affinity for a given target |
JP2012515222A (ja) | 2009-01-16 | 2012-07-05 | テバ ファーマシューティカル インダストリーズ リミテッド | 組換えヒトアルブミン−ヒト顆粒球コロニー刺激因子融合タンパク質の安定な製剤 |
JP5936112B2 (ja) | 2009-02-11 | 2016-06-15 | アルブミディクス アクティーゼルスカブ | アルブミン変異体及び複合体 |
IN2012DN00407A (ja) | 2009-08-05 | 2015-08-21 | Pieris Ag | |
EP3660510A3 (en) | 2009-12-07 | 2020-07-08 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Muteins of human lipocalin 2 (lcn2, hngal) with affinity for a given target |
AU2010340358B2 (en) | 2009-12-21 | 2014-07-24 | Pharmathene, Inc. | Recombinant butyrylcholinesterases and truncates thereof |
SI2580236T1 (sl) | 2010-06-08 | 2019-08-30 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteini lipokalina solz, ki vežejo IL-4 R alfa |
CN103154023B (zh) | 2010-08-16 | 2017-04-05 | 皮里斯制药有限公司 | 铁调素的结合蛋白 |
JP6100694B2 (ja) | 2010-11-15 | 2017-03-22 | ピエリス ファーマシューティカルズ ゲーエムベーハー | グリピカン−3(gpc3)に対して親和性を有するヒトリポカリン2の突然変異タンパク質 |
EP2646552B1 (en) | 2010-12-02 | 2017-07-05 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Muteins of human lipocalin 2 with affinity for ctla-4 |
US9572863B2 (en) | 2011-12-13 | 2017-02-21 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Methods for preventing or treating certain disorders by inhibiting binding of IL-4 and/or IL-13 to their respective receptors |
US9522940B2 (en) | 2012-05-23 | 2016-12-20 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Lipocalin muteins with binding-affinity for glypican-3 (GPC-3) and use of lipocalin muteins for target-specific delivery to cells expressing GPC-3 |
CN104768571B (zh) | 2012-07-13 | 2018-11-09 | 酵活有限公司 | 多价异多聚体支架设计和构建体 |
EP2920202B1 (en) | 2012-11-19 | 2018-08-29 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Novel specific-binding polypeptides and uses thereof |
US10126304B2 (en) | 2013-01-16 | 2018-11-13 | George Mason Research Foundation, Inc. | Binding domain mapping |
AU2014230460B2 (en) | 2013-03-14 | 2018-04-05 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novel binding proteins for PCSK9 |
WO2014147489A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Teva Pharmaceutical Industries Ltd. | Recombinant human albumin-human granulocyte colony stimulating factor for the prevention of neutropenia in pediatric patients |
CA2936611A1 (en) | 2014-01-13 | 2015-07-16 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multi-specific polypeptide useful for localized tumor immunomodulation |
WO2015177175A2 (en) | 2014-05-22 | 2015-11-26 | Pieris Ag | Novel specific-binding polypeptides and uses thereof |
CA2874083C (en) | 2014-12-05 | 2024-01-02 | Universite Laval | Tdp-43-binding polypeptides useful for the treatment of neurodegenerative diseases |
EP3250586B1 (en) | 2015-01-28 | 2021-10-27 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Novel proteins specific for angiogenesis |
WO2016131804A1 (en) | 2015-02-18 | 2016-08-25 | Sanofi | Novel proteins specific for pyoverdine and pyochelin |
SG11201708334RA (en) | 2015-05-04 | 2017-11-29 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Anti-cancer fusion polypeptide |
NZ736560A (en) | 2015-05-04 | 2021-12-24 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
BR112017020961A2 (pt) | 2015-05-18 | 2018-07-10 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | muteína, molécula de ácido nucleico, célula hospedeira, método de produção de uma muteína e método de ligação |
EP4219535A1 (en) | 2015-05-18 | 2023-08-02 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Anti-cancer fusion polypeptide |
MX2017014805A (es) | 2015-05-19 | 2018-02-15 | Univ Yale | Composiciones para el tratamiento de condiciones patologicas de calcificacion y sus metodos de uso. |
EP3115371A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-11 | Sanofi | Fusion molecules |
EP3322433B1 (en) | 2015-07-15 | 2023-05-31 | Pieris Pharmaceuticals GmbH | Novel proteins specific for lag-3 |
KR20180083943A (ko) | 2015-11-30 | 2018-07-23 | 피어이스 오스트레일리아 피티와이 엘티디 | 신규한 항-혈관형성 융합 폴리펩타이드 |
TW201725212A (zh) | 2015-12-10 | 2017-07-16 | 第一三共股份有限公司 | 特異性於降鈣素基因相關胜肽的新穎蛋白 |
WO2018087108A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-17 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Proteins specific for cd137 |
MX2019008434A (es) | 2017-01-18 | 2019-11-11 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Muteínas de lipocalina con afinidad de unión por lag-3. |
CA3100119A1 (en) | 2018-07-31 | 2020-02-06 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Fusion protein specific for cd137 and pd-l1 |
MA55069A (fr) | 2019-02-26 | 2022-01-05 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Nouvelles protéines de fusion spécifique à cd137 et gpc3 |
US20230227568A1 (en) | 2020-06-05 | 2023-07-20 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Multimeric immunomodulator targeting 4-1bb |
US20240228562A1 (en) | 2021-04-08 | 2024-07-11 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Novel lipocalin muteins specific for connective tissue growth factor (ctgf) |
WO2022243341A1 (en) | 2021-05-18 | 2022-11-24 | Pieris Pharmaceuticals Gmbh | Lipocalin muteins with binding affinity for ox40 |
WO2024064713A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Seagen Inc. | Novel fusion protein specific for cd137 and cd228 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0079739A3 (en) * | 1981-11-12 | 1984-08-08 | The Upjohn Company | Albumin-based nucleotides, their replication and use, and plasmids for use therein |
BR8307525A (pt) | 1982-05-19 | 1984-08-21 | Unilever Nv | Expressao de proteinas semelhantes a pretrotaumatina em leveduras kluyveromyces |
FR2532656B2 (fr) | 1982-06-02 | 1985-10-18 | Elf Bio Rech | Nouveau vecteur de clonage et d'expression, levure et bacterie transformees par ce vecteur |
FR2579223B1 (fr) | 1985-03-25 | 1988-12-09 | Genetica | Procede de preparation microbiologique de la serum-albumine humaine |
GB8510219D0 (en) | 1985-04-22 | 1985-05-30 | Bass Plc | Isolation of fermentation products |
FI870103A (fi) | 1986-01-13 | 1987-07-14 | Genex Corp | Producering av humanserum albumin i en bacillus-stam. |
FR2594846B1 (fr) | 1986-02-21 | 1989-10-20 | Genetica | Procede de preparation de la serum albumine humaine mature |
IT1203758B (it) * | 1986-03-27 | 1989-02-23 | Univ Roma | Vettori di clonazione e di espressione di geni eterologhi in lieviti e lieviti trasformati con tali vettori |
GB8620926D0 (en) * | 1986-08-29 | 1986-10-08 | Delta Biotechnology Ltd | Yeast promoter |
PT88133B (pt) * | 1987-07-28 | 1995-03-01 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparacao de polipeptideos por expressao em kluyveromyces |
SE459586B (sv) * | 1987-09-14 | 1989-07-17 | Mta Szegedi Biolog Koezponti | Strukturgen som kodar foer autentiskt humant serum albumin och foerfarande foer dess framstaellning |
JP2791418B2 (ja) * | 1987-12-02 | 1998-08-27 | 株式会社ミドリ十字 | 異種蛋白質の製造方法、組換えdna、形質転換体 |
IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
CA2017176A1 (en) * | 1989-05-22 | 1990-11-22 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries Ltd. | Albumin gene-containing plasmid, transformant carrying same, production of such transformant and production of albumin |
-
1989
- 1989-07-03 FR FR898908897A patent/FR2649991B2/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-03 NO NO89893149A patent/NO893149L/no unknown
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- 1989-08-04 JP JP1202715A patent/JP3068139B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-04 EP EP89402217A patent/EP0361991B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1989-08-04 AT AT89402217T patent/ATE187775T1/de active
- 1989-08-04 HU HU893969A patent/HUT51329A/hu unknown
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- 1989-08-05 KR KR1019890011197A patent/KR910004800A/ko not_active Application Discontinuation
- 1989-08-07 NZ NZ230229A patent/NZ230229A/en unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017519992A (ja) * | 2014-06-20 | 2017-07-20 | ルース, ウルリヒLOOS, Ulrich | Tsh受容体に対する自己抗体の検出 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0361991A2 (en) | 1990-04-04 |
NO893149L (no) | 1990-02-06 |
EP0361991A3 (en) | 1992-10-14 |
ATE187775T1 (de) | 2000-01-15 |
PT91381A (pt) | 1990-03-08 |
AU3933289A (en) | 1990-02-08 |
KR910004800A (ko) | 1991-03-29 |
FI893702A (fi) | 1990-02-06 |
PT91381B (pt) | 1995-05-31 |
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FR2649991B2 (fr) | 1994-03-04 |
DK175846B1 (da) | 2005-03-29 |
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FR2649991A2 (fr) | 1991-01-25 |
DE68929115D1 (de) | 2000-01-20 |
DE68929115T2 (de) | 2000-06-15 |
NZ230229A (en) | 1991-07-26 |
DK383189A (da) | 1990-02-06 |
EP0361991B1 (en) | 1999-12-15 |
AU623425B2 (en) | 1992-05-14 |
DK383189D0 (da) | 1989-08-04 |
HUT51329A (en) | 1990-04-28 |
NO893149D0 (no) | 1989-08-03 |
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---|---|---|
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