JPH02276589A - 酵母よりヒト血清アルブミンおよびその他の異種蛋白質を微生物学的に生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換え体ＤＮＡ技術を用いて修飾された酵母
、特にクルベロミセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃａｓ）属を培養することによ
るヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の微生物学的製造方法
に関する。

ＨＳＡは球状の非グリコジル化モノマーの形態を取る分
子量６６キロドルトン（ｋｄ）を有する５８５アミノ酸
のタンパク質である。

その球状構造は９つの二重ループの逐次系列を創製する
１７ジスルフイド結合によって維持される（ブラウン、
Ｊ、Ｒ，アルブミンストラクチュア、ファンクションア
ンドユーセズロゼノア、Ｖ、Ｍ等（編集）、バーガモン
プレス、オックスフォード（１９７７年）。

２７〜５１頁）、ＨＳＡをエンコードする遺伝子は非常
に多形であることが知られており。

３０種以上の明らかに異なる遺伝子変異体が種々の条件
下で電気泳動解析によって検出されている（ウェイトカ
ンプ、Ｌ、Ｒ，等、Ａｎｎ。

Ｈｕｍ、　Ｇａｎｅｔ、第３７巻（１９７３年）２１９
〜２２６頁）、Ｈ８Ａ遺伝子は、１４イントロン配列に
よって１５工キソン配列に分断され推定上の“キャップ
″部位から最初のポリ（Ａ）付加部位まで１６．９キロ
ベース（ｋｂ）以上を包含している。

ヒトアルブミンは肝臓の肝細胞で合成され、そこから血
流に分泌される。これは血中で最も多いタンパク質で約
４０ｇ／ｉｎ血清の濃度を有し、従っていかなる時にも
ヒト体内中に約１６０ｇのアルブミンが循環している。

ＨＳＡの最も重要な役割は血流の正常な浸透性を維持す
ることである。また種々の物質に対して例外的結合能を
有し、更に疎水性分子（例えばステロイド及び胆汁塩）
並びに治療物質の細胞内輸送の役目を果たし、従ってこ
れらを各作用部位に運搬することができる。更にその上
Ｈ８Ａは最近プロスタグランジンの異化作用に関係して
いる。

肝細胞に於けるＨＳＡの合成はまず前駆体プレプロ−）
ＩＳＡを生じ、これは分泌経路に新生ポリペプチドを導
く１８アミノ酸のシグナル配列を含む、このシグナル配
列は、タンパク質が小胞体から放出される前に恐ら（は
同時翻訳処理によって切断される。この最初のタンパク
質分解切断は前駆体プローＨ８Ａを生じこれは循環Ｈ８
Ａの成熟形態では通常存在しないＮ−末端へキサペプチ
ド（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｒｇ
）を含んでいる。

コンバーターゼは恐らくビルジ小胞中に位置し成熟ＨＳ
ＡのＮ末端アスパラギン酸に結合したヘキサペプチドを
切断することによる第２のタンパク質分解段階でプロペ
プチドを除去する（ジュダ、Ｊ、Ｄ、及びキン、Ｐ。

Ｌ、ネイチュア第２７１巻（１９８７年）３８４〜３８
５頁、バサースト、１．Ｃ，等サイエンス第２３５巻（
１９８７年）、３４８〜３５０頁）、シかしながら、処
理されないヒトアルブミンはプロペプチド配列の遺伝性
成熟を持つまれなヘテロ接合体で血流に存在する半分と
非常にまれなホモ接合体でアルブミンの全部を示すこと
ができる（タカハシ。

Ｎ６等Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、
　ＵＳＡ第８４巻（１９８７年）、７４０３〜７４０７
頁）。

これらの変異体の１つはプロアルブミンがキリストチャ
ーチを表わし、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｓ−
Ａｒｇ−Ｇｌｎ−’−Ａｓｐ＋１で始まり、置換基Ａｒ
ｇ−１・・・＞Ｇｌｎはプロペプチドの切断を妨げて成
熟する（ブレナン、Ｓ、Ｏ，及びカレル、Ｒ１Ｗ、ネイ
チュア、第２７４巻（１９７８年）９０８〜９０９頁）
。プロアルブミンＬｉ１ｌａ（アブド、Ｙ０等、ＦＥＢ
Ｓレターズ第１３１巻（１９８１年）２８６〜２８８頁
）及びタケフ（ナカダ等、臨床病理第３０巻（１９８２
年）７９１〜７９６頁）として既知の他の変異体は、次
のＮ末端配列各々Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ａ
ｒｇ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐ
ｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｓｐを有する。こ扛らの各々
の場合に於て観察される突然変異は、成熟ヒトアルブミ
ンのアミノ酸配列を通常先行させ、アルギニンコドンの
唯一の塩基変化を生じる塩基性アミノｉｌＡｒｇ−Ａｒ
ｇ対に影響を及ぼす（タカハシ。

Ｎ１等、Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ第８４巻（１９８７年）７４０３〜７４０７頁
）。

切断後の塩基性アミノ酸対はペプチドホルモン、神経ペ
プチド及びＨ８Ａ以外の血漿タンパク質を包含する他の
タンパク質の突然変異の実質的特徴である（ダグラス、
００等、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、第５
３巻（１９８４年）６６５頁）、最近、肝臓中でプロア
ルブミンをアルブミンに切断するコンバーターゼが酵母
のプロテアーゼｙｓｃＦ　に極めて密接に関係している
であ−ろうことか開示された（バサースト、１．Ｃ，等
、サイエンス第２３５巻（１９８７年）３４８〜３５０
頁）、このカルシウム依存チオールプロテアーゼはサッ
カロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃａｓ　
ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ）のＫＥＸ２遺伝子によってエン
コードされ、ゴルジ装置の膜に恐らくは結合される。、
Ｓ。

セレビシェのＫａｘ２変異体が塩基性アミノ酸Ｌｙｓ−
Ａｒｇ対で各プロタンパク質を切断することができない
ため、α因子と呼ばれるフェロモンの突然変異及びキラ
ー毒素のそれに含まれることが知られている（ジュリウ
ス、Ｄ。

Ｊｏ等、セル第３２巻（１９８３年）８３９頁）、更に
その上、ＫＥＸ２遺伝子によってエンコードされる酵母
酵素は試験管内でアルブミンの正常なプロ配列（Ａｒｇ
−Ａｒｇ）を正しく認識して切断するが、プロアルブミ
ン、キリストチャーチの変異プロ配列（Ａｒｇ−Ｇｉｎ
）を切断しないことは証明することができるパスルスト
、１．Ｃ，等、サイエンス第２３５巻（１９８７年）３
４８〜３５０頁）、ｙｓｃＦプロテアーゼに類似したコ
ンバーターゼは、最近に、ラクチスのＫＥＸＩ遺伝子に
よってエンコードされるとして記載されている（ヴエソ
ロスキーロウベル９Ｍ０等、イースト第４巻（１９８８
年）７１〜８１頁）、この知見を考慮してこれらの酵母
の正しい組換え体ヒトアルブミン変異能及び後者の培地
への分泌能を試験した。

アルブミンは、血漿タンパク質の世界市場の４０％を占
めている。この中で商業上の興味はこの生成物が例えば
手術、事故、出血中の血液損失に埋め合わせるいわゆる
血液容積増量剤で１日当り及び数ｇ範囲の１個当りの服
用量で広く使用される事実から生じている。

現在までＨ３Ａは一般に血液供給者から誘導された血漿
分画の常法によって生産され（コーン、Ｅ、Ｊ、等４　
Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、第６８巻（１９４
６年）４５９頁）、血漿の世界的年間消費量は、９．５
Ｘ１０’ｆｆの範囲にある。またＪ、リアウタウド等（
Ｂｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｆ　ＩＡＢＳ、ブタペスト、Ａ“
ピュアリフィケーションオブプロテインズ、デベロップ
メントオブパイオロジカルスタンダード′°、カーゲル
（編集）、ペイル第２７巻（１９７３年）、１０７頁）
に記載される手法に従ってヒト胎盤から抽出することも
できる。

遺伝子工学及び新しい抽出、精製技術の開発は、ウィル
ス性汚染（例えばＢ型肝炎及びエイズ）がなく低コスト
で高純度且つ良好な安定性を有する改良された生産物を
得る可能性を開発した。しかしながら今のところＨ３Ａ
の工業的規模に十分経済的関心があるほど有効な遺伝子
工学に基づく操作は知られていない。

これは主に適当な三次構造を有し、生ヒトアルブミンの
生理化学特性を有する正しく突然変異した分泌アルブミ
ンを高レベル産生させる有効な宿主／ベクター系がない
ためである。

たとえ哺乳類細胞培養がヒトタンパク質発現に理想的な
選択に思われるとしても、かかる操作の価格は医薬目的
に使用されるアルブミンの現在の販売価格を十分超えて
しまう（クラウスナー、Ａ、バイオテクノロジー第３巻
（１９８５年）１１９〜１２５頁）、この生産物は一般
に数ｇ量で低単位価格で処方されるため、ＨＳＡのバイ
オテクノロジー生産は微生物発酵系でのみ可能であると
思われる。

現在に至るまで遺伝子工学実験の真人な数の多くは経済
的に重要な異種タンパク質の微生物生産に対する宿主生
物として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
を使用している。たとえこのタイプの操作が多くの異種
タンパク質に適当であるように思われたとしても、この
微生物を用いて経済的に許容できる条件下でＨ３Ａを生
産する試み全ては一部しか成功してない。

大腸菌の使用と関係する多くの欠点の１つは、この細菌
がほとんどの場合、異種タンパク質を培地に排泄するこ
とができず更にこれらのタンパク質が細胞区画の１つに
蓄積するという事実にある。所望のタンパク質は従って
細胞物質から分離されねばならず、複雑な費用のかかる
操作のもとである。更にその上、大腸菌は内毒素と病原
体を生じ生産されたタンパク質を汚染し得る。このため
最終生産物、特に後者を医薬産物として用いる場合、残
留内毒素を除去する精製に十分な注意を払わねばならな
い。

分泌タンパク質はしばしばそれらが合成され、細胞質に
蓄積される場合には正しく折りたたまれる特性を失う、
一般に分泌はＨ３Ａに存在するようなジスルフィド結合
を生成させることができるために必要とされる。従って
大腸菌で産生されるＨ８Ａは分泌されないという事実は
それを不溶形態で細胞内に沈降させる（ラック、Ｍｏ等
、バイオテクノロジ−第５巻（１９８７年）１３０９〜
１３１４頁）、従って細菌細胞から抽出した後タンパク
質は変性し、次いで試験管内で再生させなければならな
い。

更にその上大腸菌は酵母及びヒトを含む真核微生物に特
異的な転写後及び翻訳後、修飾を行なうことを可能にす
る細胞機構がない。

ＨＳＡに関して天然Ｈ８Ａ前駆体、即ちプレプロ−ＨＳ
Ａを十分なレベルで発現させるために大腸菌を誘発する
ことは困難であるように思われる。その上、Ｈ８Ａ構造
遺伝子が細菌ｐａｃ又はｏｍｐＡ遺伝子から誘導される
シグナルを分泌するために融合されている人工アルブミ
ンは一般に不完全に処理される（同書）、更にその上プ
レプロ配列のない、即ちＭａｔ−ＨＳＡ形のＨ３Ａ表現
はＮ末端メチオニン残基が大腸菌メチオニンアミノペプ
チダーゼ（ＭＡＰ）によって切り出されないことを示し
ている（同書、欧州特許第１９８７４５号、公告日１９
８６年１０月２２日）。従って大腸菌由来Ｈ８Ａは生体
内の成熟形態から得ることができず、ファージ由来リー
ダー配列を切り出し、次に変生し試験管内で再生するた
めにトリプシン切断によって試験管内で修飾させねばな
らない（欧州特許第２３６２１０号、公告日１９８７年
９月９日）。

他の細菌宿主に関しては枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ）についての研究が最近発表されている（
サウンダース、Ｃ，Ｗ、等Ｊ、　Ｂａｃｔａｎ’ｏｌ。

第１６９巻（１９８７年）２９１７〜２９２５頁）、こ
の研究は原核微生物例えば枯草菌が１分子量ヒトタンパ
ク質例えばＨＳＡを分泌する可能性を有するが、増殖培
地に於ける分泌が枯草菌原形質体即ち正常な細胞壁が酵
素処理によって消化されている細菌細胞を用いたときに
のみ得ることができることもわかっている。更にその上
、修飾Ｈ８Ａのパーセントは生産されるタンパク質のレ
ベルに逆比例し、高発現レベルでは組換え体Ｈ３Ａのほ
とんどは成熟されない形で残る（同書）、その上、枯草
菌からの組換え体ＨＳＡの物理化学的特性に関するデー
タは報告されていない。

更にその上、この微生物によって得られるＨ８Ａ分泌の
レベルは免疫学的方法を用いて培養上清で検出されるＨ
８Ａ量を考慮すれば嘆めて低い（欧州特許第０２２９７
１２Ａ２号、公告日１９８７年７月２２日）。

異種タンパク質の製造に対して細菌宿主の好ましい別の
使用は微生物真核系、例えば酵母又は真菌の使用である
。事実これらの微生物は、更に複雑な真菌生物１例えば
哺乳類細胞に見られる構造及び細胞組織化の全てを有す
る。特に酵母は多くのタンパク質の活性に重要な転写後
及び翻訳後修飾を行なうことができる。更に酵母は工業
的規模の生産に非常に一般的であり、高細胞密度に生育
させることができ、病原性がなく、内毒素を生産せず古
代から食品工業に使用されている。結局哺乳類細胞と対
照的に酵母を用いた遺伝子操作は実施が容易であり、古
典的分子遺伝学は大量のデータを提供している。

酵母という言葉はしばしばサッカロミセスセレビシェ又
はパン酵母を示すために用いられ、二基は最も一般的で
既知の最良種の１つである。以下酵母という言葉は他属
にも用いＳ、セレビシェ種に限定されないことは理解さ
れる。

ケラチンプロモーターの制御下でプレプロ−ＨＳＡの発
現はＳ、セレビシェに於て全タンパク質の約１％の最大
レベルで証明されている（エチェバリー、Ｔ０等、バイ
オテクノロジー第４巻（１９８６年）７２６〜７３０頁
）、シかしながら、この研究に記載される抗Ｈ３Ａ抗体
によって認識される物質は細胞に結合したままであり、
従って培養上清には全く運搬されない、更に組換え体タ
ンパク質の詳細な特徴は報告されていない。

またビール醸造中の発酵後工程を用いるブルーア酵母に
於けるＨＳＡの生産が報告されている（欧州特許第０２
０１２３９号、公告日１９８６年１１月１２日）、これ
もまた得られた生成物に関する量的又は質的データは記
載されていない、更にその上、この工程はＭｅｔ−Ｈ８
Ａの発現即ち成熟アルブミンの配列からすぐ上流のアミ
ノ酸メチオニンで開始するＨ８Ａの対立遺伝子を生ずる
。シグナル配列の欠如は、組換え体ＨＳＡの分泌及び成
熟を排除し、三次構造が確認されていない細胞内アルブ
ミンの蓄積を生じる。更に最終産物に於けるＮ末端メチ
オニンの欠如は証明されていない。

本発明は、大量生産の培養で生育させることができ増殖
培地に生コンホーメーションのＨＳＡを有効に生産及び
排出することができる。

好ましい発現系は宿主としてクルベロミセス属の酵母を
含み、天然に、マルキシアヌス変異株ドロソフィラルム
（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）プラスミドｐＫＤ１由
来のベクターを使用する。

その上、アルブミンを生産する目的で行なわれる探索は
ある種のｐＫＤ１配列の価値と重要性をこれらを組込む
発現プラスミドの効能、特に安定性に於て明らかにした
。

従って本発明はまたアルブミン以外のタンパク質、特に
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、メタロプ
ロテアーゼインヒビター（ＴＩＭＰ）及びインターロイ
キン例えばインターロイキン−１β（ＩＱ−１β）の発
現にｐＫＤ１のこれらの実質的な要素を使用することに
関するが、これらのタンパク質は、ｐＫＤ１プラスミド
誘導体が“一般的″即ち発現及び／又は分泌が所望され
るタンパク質の種類についてたとえあるとしてもほとん
ど依存しないことを示すために実施例としてだけ考慮さ
れる。

クルベロミセス属特にに、マルキシアヌス（変異株ラク
チス及びマルキシアヌスを含み、以後各々に、ラクチス
及びに、フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）と呼称する）
の酵母は重要な微生物であり、バイオテクノロジー工業
に於てかなり商業上の関心を有する。に、ラクチス及び
に、フラギリスは例えば酵素ラクターゼ（β−ガラクト
シダーゼ）の商業生産に用いられる。これらの酵母は、
酪農工業の乳漿主な副産物で生育させることができる。

いくつかのクルベロミセス菌株は家畜飼料に重要な役割
を果たす゛単細胞タンパク質′。

（ｓ　ｅ　ｐ）の大規模な生産に用いられる。結局クル
イベロミセス属の微生物は、いわゆるＧＲＡＳリスト（
Ｇｅｎａｒａｌｌｙ　Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ　Ａｓ５ａ
ｆｅ）に言及されており、これは医薬グレード産物の生
産に重要な要素を表わすものである。

クルベロミセスの遺伝子操作技術は最近開発されたばか
りである。３種のクローニングベクターがこの微生物に
対して記載されている。

ｉ）クルベロミセスゲノムの領域に相同な配列を含むベ
クターを組込み、細胞に導入した後生物内組換えによっ
てクルベロミセス染色体に組込まれる。極めてまれな場
合は有効な選択マーカーの存在を必要とする組込みは二
基らのベクターが細胞内に自律複製できる配列を含まな
い場合に得られる。この系の利点は形質転換菌株の安定
性、即ち組込まれた配列の保持に選択圧を必要としない
通常の栄養支持体で生育することができるという事実で
ある。しかしながら欠点は組込まれた遺伝子が細胞当り
１個又は良くて少数のコピーに存在するだけであること
である。この低遺伝子量はしばしば異種タンパク質の低
レベルの生産となる。

ｉｔ）クルペロミセス種の染色体ＤＮＡから誘導される
自律的複製配列（ＡＲ８）を含むベクターを複製する（
ダス、Ｓ、及びホレンバーグ、ｃ、ｐ、カレントジェネ
ティクス第６巻（１９８２年）１２３〜１２８頁、国際
特許出願ＷＯ８３１０４０５０，公告日１９８３年１１
月２４日、国際特許出願Ｗｏ　８３１０４０５１、公告
日１９８３年１１月２４日）、かかるベクターは有糸分
裂細胞分裂の分離が極めて非相同であり、後者が選択圧
下で生育されるときでさえ高頻度で細胞から損失する結
果となるため中程度の関心があるにすぎない。

ｉｕ）　Ｋ、ラクチスから分離される線状キラープラス
ミドｐＧＫ１−１　（Ｋｌ）（デロウベンコート、Ｌ０
等、Ｊ　、　Ｂａｃｔａｒｉａｌ、第１５４巻（１９８
２年）７３７〜７４２頁、欧州特許第００９５９８６号
、公告日１９８３年１２月７日）からあるいはに、マル
キシアヌス変異株ドロソフィラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉ
ｌａｒｕｍ）から分離される環状プラスミドｐＫＤ１（
欧州特許第０２４１４３５Ａ２号、公告日１９８７年１
０月１４日）から天然酵母プラスミド由来のベクターを
複製する。線状キラープラスミドから誘導される複製配
列を含むベクターは、それらの保持に特別の栄養培地を
必要とし、選択圧下でさえもわずか１５個発生後−定集
団中４０〜９９％の細胞が失われるため、異種タンパク
質の大量生産に実際的な有用性はない（欧州特許第００
９５９８６号、公告日１９８３年１２月７日）、現在ま
で記載されているクルベロミセス属の形質転換に最も有
効なベクター系は細胞内プラスミドＰＫＤ１から誘導さ
れ、ｐＫＤｌの全配列を含む構築は、高頻度で移入する
ことができ、７０〜１００コピーで細胞中に存在し、最
も重要なことには非選択条件下で比較的高安定性を有す
る。しかし、工業的規模の発酵は少なくとも４０個の発
生にプラスミドの安定性を必要とするため欧州特許第０
２４１４３５号に記載されるベクターの有用性は応用を
探索することを制限している。欧州特許第０２４１４３
５号に記載される最も有効なベクター（Ｐ３）でさえも
非選択培地中わずか６個発生後一定集団中細胞の約７０
％が失われる（欧州特許第０２４１４３５号、公告日１
９８７年１０月１４日）、大規模な発酵で選択圧を維持
することは技術上可能であっても選択培地の使用はしば
しばかなり低細胞密度を生じ、十分規定された菌株の使
用を必要とし、この方法を魅力のない、より高価なもの
にする。更にその上、欧州特許第０２４１４３５号は商
業的興味を有する異種タンパク質の発現の単独実施例を
含まない。事実ｐＫＤ１由来ベクターから発現されるこ
とを示した゛１異種１′遺伝子は酵母Ｓ、セレビシェの
ＵＲＡ３遺伝子のみである。従って非酵母遺伝子例えば
哺乳類由来の遺伝子をｐＫＤｌ及びそのクルベロミセス
の多発現に導入するとプラスミド不安定性の増大を生じ
ないことが明らかにされているにとどまっている。

本発明の目的は、クルベロミセス属の酵母を形質転換す
ることができる新規な発現ベクターの生産及び欧州特許
第０２４１４３５号に記載されるものより著しく優れた
プロセッシング安定性特性である。本発明で記載される
新しい構築は非選択培地中５０個発生の増殖後８５〜９
０％の細胞の高コピー数で保持される。従って最適生育
特性のため且つ高細胞密度で長年使用されていたクルベ
ロミセス属の工業用菌株を用いて安定な多コピーベクタ
ーから異種タンパク質を生産することができる。

詳細には本発明は指定タンパク質の製造方法に関し、 プラスミドｐＫＤ１の遺伝子Ａ、Ｂ及びＣプラスミド不
安定性の逆方向反復（ＩＲ）ｐＫＤｌの安定性遺伝子座 ｐＫＤｌの複製起点及び該酵母中で発現させることがで
きる配列制御下で該タンパク質に対して構造遺伝子をエ
ンコードするＤＮＡを含む発現カセット 形質転換酵母に対して選択可能なマーカ及び任意に複製
起点及び大腸菌に対して選択可能なマーカー を包含している発現プラスミドで形質転換されたクルベ
ロミセス属の酵母を増殖培地で培養する。

本発明で記載されるベクターの高安定性はプラスミドｐ
ＫＤ１の特徴を十分利用することによって達成された。

ｐＫＤ１由来ベクターは、高コピー数で安定なプラスミ
ド保持に関与する特殊複製系を含む他の既知のクルベロ
ミセスベクターの全てと異なる。複製起点のほかにこの
系は、２個の逆方向反復、各々の長さ３４６ヌクレオチ
ド及びプラスミドの必須部分である３個の読み取り枠（
遺伝子Ａ。

Ｂ及びＣ）を包含する（チェン、Ｘ、Ｊ、等、Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第１４巻（１９８６年）４４
７１〜４４８１頁）。これらの複製及び安定性要素、遺
伝子Ａ、Ｂ、Ｃ及び逆方向反復（ＩＲ）の保持は極めて
高い分裂安定性を示すベクターを生じる。最も広範囲に
研究された系、Ｓ、セレビシェの構造上関係のある２μ
プラスミドとの類推によってこれらの遺伝子の２つ（Ｂ
及びＣ）によってエンコードされたタンパク質は、恐ら
く分裂細胞分裂中に分割するプラスミドに含まれ位置特
異性レコンビナーゼをエンコードする遺伝子Ａの負の調
節の一部をつとめている（ＦＬＰ、フッチャー、Ａ、Ｂ
、イースト第４巻（１９８８年）２７〜４０頁）。２μ
ＤＮＡの逆方向反復間のＦＬＰ介在組換えは複製の規則
的機構（Ｍｉ胞分裂当り２μプラスミドの二部体の１つ
）から複製のローリングサークル型機構（ｌ細胞当り約
５０コピーに増幅するコピー数同書）までプラスミドを
スイッチすることを示している。この複製の正常な機構
の変化はプラスミドコピー数がＦＬＰリコンビナーゼを
エンコードする遺伝子Ａのリプレッサーとして作用する
遺伝子Ｂ及びＣ産物の十分量を生産させるほど低くなる
とすぐに誘発される。

この機構によって２μ（及び構造上類似したプラスミド
例えばＰＫＤＩであることは確か）のコピー数は自己調
節方法で高レベルに保持され、選択マーカーの存在に依
存しない。

以前に欧州特許第０２４１４３５号で公告されたベクタ
ーはｐＫＤｌ　（Ａ１５）の一部だけを含むかあるいは
中断された遺伝子Ａ（ＰｓｔＩクローニング位置が遺伝
子Ａのコーディング配列内にある（欧州特許第０２４１
４３５Ａ２号、公告臼１９８７年１０月１４日）を含み
、従って定住プラスミドｐＫＤｌの特徴の１つである自
己調節複製系を破壊する。対照的に本発明に記載される
ｐＫＤｌから誘導されるプラスミド構築は、ｐＫＤｌの
重要なオープン読み取り枠の全ての機能的保持に関係す
る。従って以下に記載されるプラスミドの安定性は、プ
ラスミドＰ１及びＰ３に関してかなり高められ、新規ベ
クターのコピー数は細胞集合にわたって高レベルで維持
される。

本発明に於てＨＳＡなる用語は、ヒト由来のいかなる血
清アルブミンも又は酵母細胞から分離されたいかなるタ
ンパク質をも示すために用いられ、ヒト由来の生ＨＳＡ
と同じアミノ酸配列、三次構造及び物理化学的特性を有
する。更にその上、ＨＳＡ変異体は天然変異体並びにＨ
ＳＡと同じ活性を有するが適当な場合には問題の活性に
必須でないドメインが切断されている分子を示すよう理
解される。

本発明は、真核微生物宿主として酵母細胞を用いる容易
に精製できる形態で産生されるＨＳＡを可能にする新規
ベクターの遺伝子工学による産物に関する。生産方法の
特徴は、該酵母の増殖培地に成熟生Ｈ８Ａを十分排泄す
ることであり、従って組換え体タンパク質の精製をかな
り促進する。ＨＳＡの生産は該宿主で有効に機能する転
写及び翻訳開始領域及び組換え体タンパク質と該酵母の
分泌経路に導く分泌シグナルに付随したＨＳＡをエンコ
ードするオープン読み取り枠を包含する組換え体プラス
ミドで形質転換された酵母を増殖することによって得ら
れる。

本発明によれば、新規な構築物はＨＳＡに対する構造遺
伝子又はその変異体の１つを含む発現カセットを包含す
る。この構築物は、通常発現に必須の要素、分泌又はプ
ラスミド保持が組合わされてベクターを形成するまで適
当なベクターを用いて段階的方法で調製され、次いで所
望のタンパク質を発現排泄されるように規定宿主に導入
することができる。

使用される宿主は真核由来、特に酵母、更にサッカロミ
セスまたはクルベロミセス属であり、好ましくはクルベ
ロミセスマキシアヌス種、その変異株を含み、特にに、
マルキシアヌス変異株ラクチスである。従って本発明に
よれば調製され記載される構築物は微生物学的由来の真
核生物の具体例の種類にあるが好ましくはクルベロミセ
スに指示される。

使用される特定宿主は安定であり適当な培地で高細胞密
度まで増殖し、高レベルの生産を生じる工業的菌株であ
ることが好ましい。

ＰＫＤＩ由来プラスミドで形質転換される菌株中１種に
、ウィッカーハミイ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉ）、Ｋ、
ウオルチイ（ｖａｌｔｉｉ）特にに、マルキシアヌス変
異株ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）　Ｋ。

ブルガリクス）、Ｋ、マルキシアヌス変異株ドロソフィ
ラルム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、（Ｋ、　ドロ
ソフィラルム）、に、マルキシアヌス変異株マルキシア
ヌス（Ｋ、フラギリス）及びＫ。

マルキシアヌス変異株ラクチス（Ｋ、ラクチス）の菌株
が更に特別に言及されるべきである。

配列をコードするＨ８Ａは種々の方法で得ることができ
、最も簡単な方法はヒト肝臓からメツセンジャーＲＮＡ
を分離し、相補性ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）の形態でそのコ
ピーを合成することからなる０次いでクローンされた配
列を別の方法例えば試験管内特定部位の突然変異生成、
プライマー延長、制限、アダプターの挿入又は第２リゴ
デオキシヌクレオチドリン力−による連結によって修飾
することができる０例えばコーディング配列は該宿主に
於けるタンパク質合成（翻訳）の効率を最適にするため
に酵母の好ましいコドンの使用に適応させることができ
る。

タンパク質配列のＮ末端に於てシングルペプチド（プレ
配列）は新生タンパク質を宿主細胞の分泌系に導くよう
に導入することができる。このプレ配列はタンパク質、
特にアルブミンの自然Ｎ末端リーダーに対応することが
できるか又は別の由来例えばαフェロモン又はキラー毒
素をコードするような酵母遺伝子から得ることができる
。

更にその上、別のペプチド伸長をエンコードするプロ配
列は分泌シグナル配列と成熟アルブミンのコーディング
配列の間に挿入することができる。このプロ配列は通常
一般的には少なくとも２種の塩基性アミノ酸、好ましく
はＬｙｓ−Ａｒｇ又はＡｒｇ−Ａｒｇを含む特異プロテ
アーゼによって切断部位でコーディング配列に結合され
る。

発現カセットは、コーディング配列の５′末端に結合し
た転写及び翻訳開始部位を該配列の転写及び翻訳を指示
調節するように包含する。これらのプロモーター領域の
選択は使用される個々の宿主に従って異なってよい。

これらの配列は一般に酵母遺伝子から誘導されるプロモ
ーターから選択される。サッカロミセス又はクルベロミ
セス型酵母の解糖遺伝子例えばホスホグリセレートキナ
ーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＤＰ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４
）、エノラーゼ（ＥＮＯ）、アルコールデヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨ）をエンコードする遺伝子から誘導されるか
又は他の強い発現遺伝子例えばラクターゼ（ＬＡＣ４）
、酸ホスファターゼ（ＰＨＯ５）などから誘導される特
定のプロモーター及び／又はターミネータ−領域が特に
興味深い、これらの制御領域は例えば試験管内突然変異
生成、追加の制御要素又は合成配列の導入又は欠失によ
って修飾することができる。具体的には転写調節要素例
えば別のプロモーターに由来するいわゆるＵＡＳ　（上
流活性化配列）即ちＳ、セレビシエＧＡＬ１０又はに、
ラクチスＬＡＣ４遺伝子は選択される炭素源に依存する
異種遺伝子の発現相から酵母培養の増殖相を分離させる
ことができるハイブリッドプロモーターを構築するため
に使用することができる。

意図した宿主で機能する転写及び翻訳終結領域は、コー
ディング配列の３′末端に位置される。

こうして構築された発現カセットは形質転換宿主を選択
させることができる１種以上のマーカーに融合される。

好ましい酵母マーカーは優性マーカー即ちゲネチシン（
０４１８）のような抗生物質に対する耐性を与えるマー
カーであり、これは細菌トランスボゾンＴｎ９０３又は
銅イオンのような別の毒性化合物のａｐｈ　（３’　）
−Ｉ遺伝子（ａｐｈ）の該酵母に於ける発現にあること
であり、従って後者は特別の宿主特異性を持たずに使用
することができる。これらの耐性遺伝子は、問題の宿主
に適当な転写及び翻訳シグナルの制御下に置かれる。ま
たＳ、セレビシェのＵＲＡ３又はＵＥＵ２遺伝子のよう
な栄養要求性を相補するマーカーを使用することもでき
る。

発現カセットと選択できるマーカーからなるアッセンブ
リーは直接宿主を形質転換するために使用することがで
きるしあるいは複製ベクターに挿入することができる。

直接形質転換の場合には、染色体又は常在性プラスミド
に存在する領域に相同な配列はこのアッセンブリーに融
合される。該配列は、生物内組換えによって対応部位で
挿入を誘発するように発現カセットの各々の側に位置す
る。また発現カセットは問題の宿主で機能する複製系と
組合わせることもできる。クルベロミセスに対する好ま
しい複製系は最初にに、ドロソフィラルムから分離され
たプラスミドｐＫＤ１から誘導される（ファルコン、ｃ
０等、プラスミド第１５巻（１９８６年）２４８〜２５
２頁、Ｃｈｅｎ、Ｘ、Ｊ、等、Ｎ　ｕｃｌ、　Ａ　ａｉ
ｄｓＲｅｓ第１４巻（１９８６年）４４７１〜４４８１
頁）、サッカロミセスに対する好ましい複製系は、酵母
２μプラスミドから誘導される。

発現プラスミドは、該複製系の全部又は一部を含むこと
ができるか又はｐＫＤｌ並びに２μプラスミドから誘導
される要素を組合わせることができる。好ましい構築物
は、クルベロミセスの発現が所望される場合プラスミド
ｐＫＤ１の全配列を含むものである。更に特に好ましい
構築物は異種配列がＰＫＤＩに挿入する部位が５ａｃＩ
部位（ｐ　ＫＤ　１のＢ形の４７１４位、チェン、Ｘ、
Ｊ、等、Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、第１４巻（１９８６年）４４７１
〜４４８１頁）及びＭ　ｓ　ｔ　１１部位（ｐ　ＫＤ　
１のＢ形の１５４位、同書）の間にある１９７ｂｐ領域
に又はこれら２部位の１つあるいはプラスミドｐＫＤ１
のＳｐｈＩ部位に局在する。

より便利にはプラスミドはシャ、トルベクターであるこ
とができ、例えば各構築段階で酵母より容易に操作する
ことができる大腸菌のような細菌宿主に移入することが
できる。この場合、細菌宿主で機能する複製起点と選択
可能なマーカーを必要とする。また細菌配列の側にある
ように発現ベクターにユニークな制限部位の位置を定め
ることもできる。これは細菌の複製起点を切断によって
排除させベクターを酵母細胞の形質転換前に再連結させ
ることができ、これは高プラスミドコピー数及び安定性
の高いプラスミドを生じることができる０例えば５　’
　−ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ−３’（ＳｆｉＩ）又
は５　’　−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’　（Ｎ　ｏ　ｔ　
Ｉ　）のような便宜上の部位を使用することができ、こ
れらは酵母には極めてまれであり、一般に発現プラスミ
ドにはない、これらの部位は、オリゴデオキシヌクレオ
チド方向突然変異生成又は特定のオリゴデオキシヌクレ
オチドリンカー又はアダプターを加えることによってベ
クターに導入することができる。

本発明の説明はしばしばヒトアルブミンについて書かれ
ているが、プラスミドＰＫＤＩから正しく誘導されるベ
クターを用いる操作はアルブミンインターロイキン、ｔ
ＰＡ。

ＴＩＭＰ及び該酵母の発現／排出を受けることができる
他のタンパク質に応用することができる。

発現されるコーディング配列のうち、特にｌｆｆ−１β プレプロ−ＨＳＡ Ｍ　ｅ　ｔ　−ＨＳ　Ａ プレプロ−ｔＰＡ Ｍ　ｅ　ｔ　−ｔ　Ｐ　Ａ及び ＴＩＭＰ が言及されるべきである。

発現ベクターの構築が終わるとすぐに後者は、所望の宿
主に導入される。形質転換に対する種々のプロトコール
は酵母の場合に記載されている（ジャーマン、Ｆ６等、
″６メソツドインイーストジエネテイクス″、コールド
スプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリング
ハーバ−５Ｎ、Ｙ、１９８６年）。

次いで形質転換細胞は所望の産物を生産するために適当
な培地で増殖させることができる。

所望産物が排出される場合、種々の方法で培養上清から
精製することができる。アフィニティークロマトグラフ
ィー、電気泳動又は他の常法を用いて低温沈降させるか
又は抽出することができる。分泌タンパク質はバッチ培
養又は連続培養から回収することができる。

次の実施例は限定を意味するものでなく、本発明の特定
の具体例及び確実な利点を示す。

実施例 クローニング一般手法 分子生物学の古典的方法例えばプラスミドＤＮＡの塩化
セシウム−臭化エチジウム勾配遠心法、制限酵素消化、
ゲル電気泳動法、アガロースゲルからＤＮＡフラグメン
トの電気溶離法、大腸菌の形質転換等は、文献に記載さ
れている（マニアチス、Ｔ０等、゛モレキュラークロー
ニング、アラポラトリーマニュアル”コールドスプリン
グハーバ−ラボラトリ−コールドスプリングハーバ− Ｎ、Ｙ、１９８２年、アウスベル、Ｆ、Ｍ。

等（編集）、″′カレントプロトコールインモレキュラ
ーバイオロジー″′、ジョンウイリーアンドサンス、ニ
ューヨーク１９８７年）。

制限酵素はニューイングランドバイオラプス（Ｂｉｏｌ
ａｂｓ）、ベテスダリサーチラボラトリース（ＢＲＬ）
又はアマ−ジャムから入手した。

連結反応に対しては、ＤＮＡフラグメントを　０．７％
アガロース又は８％アクリルアミドゲルでサイズによっ
て分離し、電気溶離で精製し、フェノールで抽出し、エ
タノールで沈降させ次いでファージＴ４ＤＮＡリガーゼ
（［１ｉｏｌａｂｓ）の存在下５０ｍＭトリス−ＨＣＱ
。

１０ｍＭ　ＭＨＣＯ３，１０ｍＭジチオトレイトール、
２ｍＭＡＴＰを含む緩衝液ｐＨ７，４中で装置した。

必要な場合には、３′劣性末端を有するＤＮＡフラグメ
ントを次の緩衝液、１００＋＋＋Ｍグリシン、１βＭ　
ＭｇＣＱ、、　１ｍＭ　ＺｎＣＱ、。

ＰＨ１０，５中３７℃で３０分間仔ウシ腸管アルカリホ
スファターゼ（ＣＩＰ、ファーマシア）で処理して脱リ
ン酸化する。同じ操作を５′劣性又はプラントエンド末
端の脱リン酸化に用いるが３７℃で１５分間、次に５６
℃で１５分間処理する。酵素を１％ＳＤＳ及び１００ｍ
ＭＮａＣｎの存在下で反応混合液を６８℃に１５分間加
熱して失活させ、フェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノール沈降させる。

３′劣性末端の補充は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ　（
Ｂｉｏｌｂｓ）のフレノウフラグメントで行なう。この
反応は５０１１Ｍトリス−ＨＣＱ。

０．４ｍＭ　ｄＮＴＤｓ、１０ｍＭ　Ｍｇ５ｏ４゜０．
１ｍＭ　ジチオトレイトール、５０／Ａｇ／ｍｕＢｓＡ
（ウシ血清アルブミン）ｐＨ７，２からなる緩衝液中で
３０分間室温で行なわれる。５′劣性末端のプラントエ
ンドは製造業者によって勧められるファージＴ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で行なわれる
。

劣性末端の消化は、製造業者によって勧められるＳ１ヌ
クレアーゼ（ＢＲＬ）で限定処理して行なわれる。

試験管内オリゴデオキシヌクレオチド指示突然変異生成
はアマ−ジャムによって配分されたキットを用いてタイ
ロー等によって開発された方法（タイロー、Ｊ、Ｗ、等
、ヌクレイックアシズＲｅ　ｓ　、第１３巻（１９８５
年）８７４９〜８７６４頁）に従って行なわれる。

ヌクレオチド配列は連鎖終結法（サンガーＦ０等、Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第
７４巻（１９７７年）５４６３〜５４６７頁）に従って
行なわれる。特定ＤＮＡフラグメントの酵素増幅は供給
者の勧めに従い’　Ｄ　Ｎ　Ａ熱すイクラ−”　（パー
キンエルマーセッス）を用いてポリメラーゼチエイン　
リアクション操作（ムリス、に、Ｂ、及びファローナ。

Ｆ　、　Ａ　、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、第１５５巻
（１９８７年）３３５〜３５０頁、サイキ、Ｒ，に、等
、サイエンス第２３０巻（１９８５年）１３５０〜１３
５４頁）で行なわれる。

連結ＤＮＡは、次の菌株大腸菌Ｍｃ１０６０（［Ｑａ　
ｃ　ＩＰＯＺＹＡ］　、Ｘ７４．ｇａＱＵ。

ｇａｌＫ、５ｔｒＡ’）又はＴＧＩ　（［Ｑａｃ。

ｐｒｏＡ、Ｂ］　、５ｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ
’ｔ　ｒａＤ３６．ｐｒｏＡ”Ｂ”　　ＱａａＩ’。

ＱａｃＺＭ１５）から得ら九るコンピテント細胞を形質
転換するために使用する。プラスミドＤＮＡをアンピシ
リン又はテトラサイクリン耐性形質転換細胞から適宜精
製する。プラスミドの抽出は、マニアチス等によって記
載される操作（マニアチス、Ｔ０等、″モレキュラーク
ローニング、アラポラトリーマニュアル”、コールドス
プリングハーバ−ラボラトリ−、コールドスプリングハ
ーバ−１Ｎ、Ｙ、１９８２年）に従って行なわれ、バー
ンポイン及びドリーによって記載されるアルカリ溶解（
バーンポイン、Ｈ，Ｃ，及びドリー、Ｊ、ヌクレイツク
　アシズＲｅｓ、第７巻（１９７９年）１５１３〜１５
２３頁）から誘導される。迅速プラスミド解析に対して
は、細菌溶解物をホルメス及びクイグレーの方法（ホル
メス、Ｄ、Ｓ、及びクイグレーＭ、、　Ａｎａｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、第１１４巻（１９８１年）１９３〜１９
７頁）に従って調製し、予め精製せずにアガロースゲル
電気泳動分析にかける。エンドヌクレアーゼ制限分析の
後、所望構造を示す組換え体プラスミドは０．５〜ＩＱ
培養液を用いてアルカリ溶解操作（マニアチス、Ｔ０等
、“モレキュラークローニング、アラポラトリーマニュ
アル″、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コ
ールドスプリングハーバ−１Ｎ、Ｙ、１９８２年）によ
り大規模に調製し塩化セシウム密度遠心分離によって精
製する。

Ｋ、ラクチスの外来ＤＮＡでの形質転換及びに、ラクチ
スからプラスミドＤＮＡの精製はテキストに記載される
。

実施例１　プレプロ−Ｈ３Ａ構造遺伝子を含むカセット
のクローニング Ｅ、１．Ｉ　　ＨＳＡをエンコードする相補性ＤＮＡ　
（ＣＤＮＡ）の分離 大腸菌でＨＳＡを発現させることができる組換え体プラ
スミドの構築は前の特許出願欧州特許第０１９８７４５
号（欧州特許第１９８７４５号、公告臼１９８６年１０
月２２日）に詳細に記載されている。概要は、ｃＤＮＡ
Ｃをグアニジンチオシアネート操作（チャーグウィン、
Ｊ、Ｍ、等、バイオケミストリー第１８巻（１９７９年
）５２９４頁）に従ってヒト肝臓から分離したポリ（Ａ
）ｍＲＮＡから得る。ＤＮＡ配列分析によりアルブミン
構造遺伝子の重なりフラグメントを含み、これらの重な
りに一般の制限部位を有する３種のクローン（ｐＴＩＢ
ｌｌ。

ＰＡＡ３８及びＰｂＤ８、第１図）を分離させる。これ
らの部位は、そのプレプロ配列を除いて完全なＨＳＡの
ｃＤＮＡクローンの再構築（第１図）に使用される。

Ｅ、１．２　　Ｈ８Ａプレプロ−配列の合成プラスミド
ｐＸＬ２７６の構築は特許出願欧州特許第０１９８７４
５号に詳細に記載されており、成熟Ｈ８Ａのコーディン
グ配列はバクテリオファージλのＣ■遺伝子のリポソー
ム結合部位（ＲＢＳ）のＡＴＧコドンに枠内で融合して
いる（第２図）。これはＨＳＡ遺伝子の翻訳開始コドン
から直上流にＮｄｅＩ部位を作成する。ｐＸＬ２７６は
ＨＳＡのプレプロ領域を再構成するために用いられ、ア
ミノ酸“−１”にＴａｑＩ部位から直上流のｃＤＮＡで
切り取られていることがわかる。

再構成は４つのオリゴデオキシヌクレオチド３３〜３６
塩基鎖の形のＨＳＡプレプロ配列に相当するＤＮＡフラ
グメント及びプラスミドｐＵＣ８のＥｃｏＲＩとＡ　ｃ
　ｃ　Ｉ部位の間に大腸菌遺伝子の発現シグナルを有す
るｐＸＬ２７６由来１２０　ｂ　ｐ　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ
　−Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉフラグメントを挿入することによっ
て達成される。従ってＴａｑＩ部位はこのｐＸＬ２９０
に指定されるプラスミドの挿入体の一端で再編成される
（第２図）、ＲＢＳを有するＨｉｎｄｍ−ＴａｑＩ小フ
ラグメントとＴａｑＩ部位から上流のプレプロ配列をｐ
ＵＣの８Ｈｉｎｄ■とＰｓｔＩ部位間にＨＳ　Ａ　ｃ　
Ｄ　Ｎ　Ａクローン（プラスミドｐｌＢ１１．Ｈ８Ａの
５＃末端を含む）のＴａｑＩ−ＰｓｔＩフラグメントと
連結してプラスミドｐＸＬ２９９を得る（第３図）、Ｒ
ＢＳとＰｖｕＩ［部位までプレプロ−Ｈ３Ａ配列を有す
るｐＸＬ２９９のＨｉｎｄｍ−ＰｖｕＩＩフラグメント
をＨ８Ａコーディング配列のレプリコンと３′末端を生
じるｐＸＬ２７６のＰｖｕＩＩ−ＥｃｏＲＩ大フラグメ
ント及びプロモーターを含むｐＸＬ２７６のＥ　ｃ　ｏ
　ＲＩ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントと連結させて
プラスミドｐＸＬ３２２を構築する（第４図）。

Ｅ、１．３　　ＨＳＡ翻訳開始コドンから上流のＨｉｎ
ｄＩ［部位の作製 発現ベクターに容易に組込むことができるプレプロ−Ｈ
８Ａカセットを得るために上述したプラスミドｐＸＬ３
２２のＮｄｅＩ部位をオリゴデオキシヌクレオチド指示
突然変異生成によってＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位に置き換え
る。このためにプレプロ−Ｈ８Ａの５′末端を含むｐＸ
Ｌ３２２のＨｉｎｄｍ−ＢｇＱｎフラグメントをＭ　ｌ
　３　ｍ　ｐ　１８にサブクローンし、合成オリゴデオ
キシヌクレオチド５　’　−ＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴ
ＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴ−３’を１本
鎖鋳型（アングラインと肉太活字は各々Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ｍ部位と翻訳開始部位を表わす）にハイブリッド化して
突然変異を生成させる。

こうしてプラスミドｐＸＬ８５５を得（第５図）、突然
変異生成領域のヌクレオチド配列を鎖終結方法を用いて
証明した。完全プレプロ−Ｈ３Ａをエンコードする配列
はＨＳＡ構造遺伝子の３″末端を含む突然変異生成ファ
ージのＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　−Ｐ　ｖ　ｕ■フラグメント
とＰＸＬ３２２のＰｖｕｌｌ−Ｈｉｎｄｍ７ラグメント
をｐｔＪｃ８のＨｉｎｄｍ部位に挿入して再構築しプラ
スミドｐＸＬ８６９を得る（第６図）、従ってこのプラ
スミドは、３′末端に完全プレプロ−Ｈ３Ａ構造遺伝子
並びに非翻訳６１ｂｐ領域を含む１．８７ｋｂＨｉｎｄ
ｍフラグメントを含んでいる。

Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントの完全配列並びに組換え
体Ｈ３Ａのアミノ酸配列を第７図に示す、いかなる選択
配列をも持たずにＭｅｔ−Ｈ８Ａ構造遺伝子を含むＨｉ
ｎｄＩＩＩカセットは、プラスミドｐ　Ｘ　Ｌ　２７６
　（７３Ｍ　１３誘導体を合成オリゴデオキシヌクレオ
チド５’　−ＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴ
ＴＡＴＧＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧ−３’を用いて突然
変異生成させるほかは同じ操作に従って構築される。ｐ
ＵＣ８の完全Ｍｅｔ−Ｈ８Ａコーディング配列の再構築
はプラスミドｐＸＬ８６９と同じ方法で得られるプラス
ミドｐＸＬ８６８を生じる。

実施例２　酵母クローニングベクターの構築Ｅ、２．１
　　プラスミドｐＫＤ１の分離精製プラスミドｐＫＤ１
はフレーア等によって記載されるもの（Ｍｏ１．　Ｃａ
１１．　Ｂｉｏｌ、第７巻（１９８７年）１１８０〜１
１９２頁）から誘導される次の操作に従って後期対数期
培養のに、ドロソフイラルム菌株ＵＣＤ５１〜１３０　
（Ｕ、Ｃ，Ｄ、コレクション、カリフォルニア大学、ダ
ビエス、ＣＡ９５６１６）から精製することができる。

ＹＰＤ培地（１％酵母エキス、２％バタトーベプトン（
デイフコ）、２％グルコース）中ＩＱ培養を遠心し、洗
浄し　１．２Ｍソルビトール溶液に再浮遊し、細胞をチ
モーリアーゼ（３００μｇ／ｍＡ）、２５ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭホスフェート及びβ−メルカプトエタノー
ル μｇ　／　ｍ　Ｑ　）の存在下でスフェロプラストに変
換する．１．２Ｍ　ソルビトール溶液で洗浄した後、ス
フェロプラスト（１チューブ当り原培養液２５０ｍＱに
相当する）を１．２Ｍソルビトール２．５ｍ１２に再浮
遊し、２５ｍＭトリス−ＨＣＱ、５０ｍＭグルコース及
び１０ｍＭＥＤＴＡを含む同量の緩衝液ｐＨ８．０を加
える．次の工程はイソプロパツール１４ｍｆｌを加えて
２３℃で１５分間行なうＤＮＡの沈降のほかは既に記載
したアルカリ溶解操作（マニアチス，Ｔ．等、″モレキ
ュラークローニングアラポラトリーマニュアル″コール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ、コールドスプリング
ハーバ−、Ｎ．Ｙ。

１９８２年）に対応する．得られた物質をＲＮａｓｅ（
５０ｕｇ／ｍＡ）で３７℃に於て２０分間、次に０．５
Ｍ　ＮａＣＱ．０．５％サルコシル及び２５ｍＭＥＤＴ
Ａ　からなる溶液中プロティナーゼＫ（１５０μｇ　／
　ｍ　Ｑ　）で６０℃に於て１時間処理する．エッペン
ドルフミクロ遠心機で遠心した後、上清をエタノールで
一７０℃に於て１０分間沈降させ、次に沈降物を溶解し
、ＤＮＡを臭化エチジウムの存在下でＣｓＣＱ密度勾配
遠心で精製する。

Ｅ．２．２　　プラスミドｐｃＸＪ１の構築構築中間体
ＰｔＪｃ−ＵＲＡ３　（第８図）はプラスミドｐＵｃ１
９のユニークＮ　ａ　ｒ　Ｉ部位に挿入されたＳ．セレ
ビシェのＵＲＡ３遺伝子を含む１．１ｋｂ　　Ｈｉｎｄ
ｍフラグメントからなる（ヤニシューペロン，Ｃ．等、
ジーン第３３巻（１９８５年）１０３〜１１９頁）。

ＨｉｎｄｍフラグメントはＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍで消化さ
れ，次に大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエで処理したプラス
ミドｐＧ６３　（ゲルボード、Ｃ。

等．　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．第３巻（１　９　８　
１年）１７３〜１８０頁）から誘導されプラントエンド
末端を生成する。ＵＲＡ３遺伝子を含む　１．１ｋｂフ
ラグメントを精製し，次にプラスミドｐＵｃ１９に挿入
し、Ｎ　ａ　ｒ　Ｉで切断され、大腸菌ＤＮＡポリメラ
ーゼエのフレノウフラグメントで処理される。従ってプ
ラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３は、大腸菌でプラスミドを保
持する複製起源、大腸菌で形質転換されるアンピシリン
耐性マーカー、ポリリンカー（ユニーク部位としてＥｃ
ｏＲｌ．　Ｓａｃｌ．　ＫｐｎＩ。

ＢａｍＨｌ．　Ｘｂａｌ．　Ｓａｌｌ．　Ｓｐｈｌ．　
Ｈｉｎｄｍ）を含むｌａｃＺ遺伝子及びに、ラクチスの
ｕｒａＡ変異体で選択可能なマーカーとして作用するＳ
．セレビシェのＵＲＡ３を含む。

プラスミドｐＣＸＪＩ（第９図）はｐＵＣ−ＵＲＡ３の
ユニークＡａｔｎ部位に挿入されたプラスミドｐＫＤ１
の完全配列を含む。

この構築は，ＥｃｏＲＩ部位でｐＫＤｌを直線にし、次
にこのプラスミドを大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレ
ノウフラグメントで処理することによって得られた，こ
のＤＮＡフラグメントを予めＡ　ａ　ｔ　ＩＩで切断し
たｐＵＣ−ＵＲＡ３と連結しＴ４　　ＤＮＡポリメラー
ゼで処理する．これらの２つのフラグメントの連結は、
ＥｃｏＲＩ制限部位を再構築させることができる。プラ
スミドｐＫＤ１のＥ　ｃ　ｏ　Ｒ　Ｉ部位に於けるｐＵ
Ｃ−ＵＲＡ３のＤＮＡの挿入はプラスミド安定性及びコ
ピー数の保持に必要とされる遺伝子を失活させない（Ｅ
ｃｏＲ１部位は遺伝子ＢのＡＴＧコドンから上流の２０
５ヌクレオチドにある。チェン、Ｘ、Ｊ、等、Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

第１４巻（１９８６年）４４７１〜４４８１頁）、結果
としてに、ラクチスｕｒａＡｃｌｒ’細胞を高頻度で形
質転換するプラスミドｐＣＸＪ　Ｉは１細胞当り約７０
〜１００コピーに増幅され、選択圧がなくても安定に保
持される。ｐＵＣ−ＵＲＡ３によって与えられた複製起
源のためｐＣＸＪ　１もまた大腸菌で複製することがで
き、これによってプラスミド構築及び精製工程を促進す
る。外来ＤＮＡを挿入するために用いることができるプ
ラスミドＰｃｘ、Ｊ　１のユニーク部位はｐＵｃ１９ポ
リリンカーのＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ及び５ａＱＩ部位である
。

Ｅ、２．３ に、ラクチスＰｋｔプロモーターと Ｔ　ｎ　９０３の３′−アミノグリコ シドホスホトランスフェラーゼ遺 伝子間の融合の構築 に、ラクチス及び他のクルイベロミセス種の形質転換に
ベクターとしてｐｃＸＪｌの使用は、独立栄養マーカー
として染色体ｕｒａＡ突然変異を有する菌株に限定され
る。クルイベロミセスの工業的野生型菌株を形質転換す
ることができるように我々は優性抗生物質耐性マーカー
として細菌トランスボゾンＴｎ９０３の３１−アミノグ
リコシドホスホトランスフェラーゼ（ａ　ｐ　ｈ）遺伝
子を選択し、ｐＣＸＪ　１に挿入した。ａｐｈｍ伝子は
大腸菌でカナマイシンに耐性を与え、野生型酵母菌株で
発現させる場合には、抗生物質Ｇ４１８（ゲンチシン）
に耐性を与え、細胞増殖の有効なインヒビターである（
ジメネツ。

Ａ、及びデービス、Ｊ、ネイチュア第２８７巻（１９８
０年）８６９〜８７１頁）、Ｋ。

ラクチスでａｐｈ遺伝子を十分強力に発現させるために
ａｐｈ遺伝子の細菌転写シグナルはに、ラクチスのキラ
ープラスミドに１から分離された０ＲＦＩプロモーター
（ｐ　、ｃｍ）に置き換えられる。

Ｐｋニーａｐｈ融合の構築は、いくつかの工程で行なわ
れる（第１０〜１２図）、最初にプラスミドに１の１．
５　ｋｂ　５ｃａＩ−Ｐｓｔ　ＩフラグメントをｐＢＲ
３２２のユニーク５ｃａＩとＰｓｔＩ部位の間でサブク
ローンし、アンピシリン感受性及びテトラサイクリン耐
性組換え体プラスミドはｐＫｌ−ＰＳ１５３５−６に指
定される（第１０図）、１．５ｋｂ　　Ｓｅａ　Ｉ−Ｐ
ｓ　ｔ　Ｉサブクローンフラグメントは線状キラープラ
スミドの一方の末端から誘導され、プラスミドに１によ
って担持される０ＲＦ１の５′の半分と上流の約２２０
塩基対を含む（Ｓｏｒ、Ｆ、及びツクハラ、　Ｈ，Ｃｕ
ｒｒ、　Ｇｅｎｅｔ、第９巻、（１９８５年）１４７〜
１５５頁）、５ｃａＩ部位かに１の左側の末端から２２
塩基対だけにあるため（第１０図）、１．５ｋｂ　　Ｓ
ｅａ　Ｉ−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントは恐ら＜０ＲＦＩ（
Ｐｋ工）の全プロモーター領域を含む。ＰＫＩ−ＰＳ１
５３５−６をＤｄｅＩで消化させるとその末端（Ｓｃａ
Ｉに近い）の一方でｐＢＲ３２２由来の１７ｂｐを含む
２６６ｂｐフラグメント及び他の末端で０ＲＦ１の最初
の１１コドンを生じる。

大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウフラグメントで
処理した後、精製フラグメントをプラスミドｐＵＣ−Ｋ
ａｎｌのユニークＸｈ。

■部位に挿入する（第１１図）。後者のプラスミドはＴ
ｎ　９０３（カナマイシン　レジスタンスシーンブロッ
ク１　ファーマシア）由来ａｐｈ遺伝子を含む１．２５
ｋｂ　　ＥｃｏＲＩフラグメントをＰＯＣｌ２のユニー
クＥｃｏＲ工部位に挿入して得た。プラスミドｐＵＣ−
Ｋ　ａ　ｎ　２０２はｐＵＣ−ＫａｎｌをＸｈｏＩで消
化した後、Ｓ１ヌクレアーゼで簡単に消化し、末端プラ
ントエンドにし、次に大腸１ＷＤＮＡポリメラーゼＩの
フレノウフラグメントでプラントエンドにしたｐＫｌ−
ＰＳ１５３５−６のＤ　ｄ　ｅ　Ｉフラグメントと連結
して得られる（第１１図）。この構築は線状プラスミド
に１の０ＲＦ１遺伝子の最初のアミノ酸とＴ　ｎ　９０
３のａｐｈ遺伝子の５′切断末端の間で得られる枠内融
合を可能にする。

事実０ＲＦＩとａｐｈ間の結合はａｐｈの１２番目のコ
ドン（ＡＧＧ）をもとに戻すのでａｐ）１の最初の１１
アミノ酸は０ＲＦＩの最初のアミノ酸に置き換えられて
いる。ａｐｈをエンコードする構造遺伝子の開始と共に
Ｐｋよ−ａｐｈ融合に用いられる０ＲＦ１プロモーター
の完全配列は第１２図に示される。

Ｅ、２．４　　プラスミドｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７の構
築プラスミドｐＫａｎ７０７　（第１３図）は上述した
プラスミドｐｃＸＪ１の誘導体である。これはプラスミ
ドｐＣＸＪ　１をＨｉ　ｎ　ｄ■で切断し、次いで大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグメントで処理す
ることにより構築される０次でプラントエンド末端を有
する直線化プラスミドをＰｋｉ−ａｐｈ融合を有するｐ
ＵＣ−Ｋａｎ２０２由来り、２　ｋ　ｂＳｃａＩ−Ｈｎ
ｃｌｌフラグメントと連結させる（第１３図）、ｐＵｃ
−Ｋａ　ｎ　２０２を５ｃａＩとＨｉｎｃｎで消化させ
るともはや最初の細菌プロモーターを含まないプラント
エンドカナマイシン耐性カセットを生じる。

得られたプラスミド、ｐＫａｎ７０７は、Ｋ。

ラクチス菌株の０４１８　（＞２．５ｇ／Ｑ）を極めて
高いレベルに耐性を与える。ｐＣＸＪＩの場合のように
、プラスミドｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７は高頻度でに、ラ
クチスａｉｒ’菌株に導入し、選択圧なしで安定に保持
することができる（第１４図）、工業的菌株を形質転換
させる効率のよい優性マーカーの存在と組み合わせたほ
とんどのクルイベロミセス菌株の０４１８に対する著し
い感受性はｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７をクルイベロミセス
属の酵母に極めて有用なりローニングベクターにする。

実施例３　酵母のフルブミンに対して発現及び／又は分
泌カセットを含む発現 ベクターの構築 Ｅ、３．Ｉ　　Ｓ、セレビシェのＰＧＫプロモーターの
制御下Ｍ　ｅ　ｔ　−ＨＳ　Ａ及びプレプロ−Ｈ８Ａに
対する発現力 セットの構築 プラスミドｐＹＧ１２（第１５図）は、Ｓ、セレビシェ
のＰＧＫ遺伝子のプロモーター及びターミネータ−領域
からなる１、８ｋｂ　５ａ１２Ｉ−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ制
限フラグメントを含む、このフラグメントは３．０ｋｂ
　　Ｈｉｎｄｌｎゲノムフラグメントから誘導され、構
造遺伝子に相当する１、２ｋｂフラグメントは検出され
ており、翻訳開始ＡＴＧと翻訳の終結を指定するＴＡＡ
コドンから上流に３ｏコドンに位置するＢｇｌＨの間の
領域を包含する（メローＪ１等、ジーン第２４巻（１９
８３年）１〜１４）。これによって得られる１、８ｋｂ
フラグメントの側面にあるＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩは次
いで破壊され、５ａＩ２Ｉ及びＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位で
各々プロモーター領域から上流にＰＧＫ転写ターミネー
タ−から下流に置き換えられる１次いでＨｉ　ｎ　ｄ　
ｍ部位はプロモーターとターミネータ−領域間の結合で
導入され、部位がユニークであるため、異種遺伝子を容
易に導入させることができる。この領域のヌクレオチド
配列は第１５図に示される０次いでプラスミドｐＸＬ８
６８　（Ｅ、、１．３参照）由来のＭ　ｅ　ｔ　−ＨＳ
　Ａをエンコードする１、８ｋｂＨｉｎｄｌＩＩフラグ
メントはプラスミドｐＹＧ１２のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ部位
に導入されて組換え体プラスミドｐＹＧ１０を得る。同
様の方法でプラスミドｐＸＬ８６９　（Ｅ、１．３参照
）由来のプレプロ−Ｈ３Ａ　（第１５図）をエンコード
するＨｉｎｄＩｎフラグメントをプラスミドｐＹＧ１２
に挿入してプラスミドｐＹＧ１１を作成する。結果とし
てサイズが約３．６ｋｂの２つのＳａ　Ｑ　Ｉ−Ｂａｍ
ＨＩ発現カセットがこうして構築され、これはＳ、セレ
ビシェのＰＧＫ遺伝子プロモーター、続いてＭ　ｅ　ｔ
　−ＨＳ　Ａあるいはプレプロ−Ｈ３Ａをエンコードす
る遺伝子最後にｍ　ＲＮ　Ａのポリアデニル化部位を含
むＰＧＫ遺伝子の転写ターミネータ−（Ｔ、、え）に相
当する領域を包含している。

Ｅ、３．２　　発現プラスミドｐＹＧ１９．ＰＹＧ２３
及びｐＹＧ２２１の構築 上述した発現カセットをベクターｐＫａｎ７０７に導入
するためにプラスミドｐＹＧ１０及びｐＹＧ１１由来　
３．７ＳａＱＩ−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメントをプラ
スミドｐＩＣ−２０Ｒの対応する部位に初期に於てサブ
クローンして（マーシュ、Ｌ６等、ジーン第３２巻（１
９８４年）４８１〜４８５頁）、この方法でプラスミド
構築ｐＹ０１８　（プレプロ−Ｈ３Ａ）（第１６図）及
びｐＹＧ２２（Ｍｅｔ−Ｈ３Ａ）を得る。これらの構築
中間体はｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７の対応する部位に直接
挿入することができるＳａＱ　ｌ−５ａｃ　Ｉ制限フラ
グメントの形をＰ、ｌ）Ｋ／　Ｍ　ｅ　ｔ　−ＨＳ　Ａ
／ＴＰｏＫ及びＰＰ０に／プレプローＨ８Ａ／ＴｐＨ，
に発現カセットを生じる（第１７図）、後者を酵素５ａ
ｆｉＩ及び５ａｃＩで消化させるとＵＲＡ３マーカー並
びにｐＫＤｌの遺伝子Ｂから上流に位置する３５ｂｐフ
ラグメントの欠損を生じる。これによって得たｐＹＧ１
９（プレプローＨ３Ａ）（第１８図）及びｐＹＧ２３　
（Ｍｅｔ−ＨＳ　Ａ）に指定される構築物は、ＰｐｏＫ
／Ｈ８Ａ／ＴＰｏＫ発現カセット、Ｋ、ドロソフィラル
ムブラスミドｐＫＤ１の本質的に完全な配列、大腸菌で
自律複製させることができる配列並びにアンピシリンの
存在下で大腸菌を０４１８の存在下でに、ラクチスを選
択されることができる各々β−ラクタマース及び３′−
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをエンコー
ドする遺伝子（ＰＫｔプロモーターの制御下）を包含す
る。

またプラスミドｐＫａｎ７０７のＵＲＡ３遺伝子を保持
するＨ８Ａ−分泌ベクターが構築される。第１９Ａ図に
示される通り、プラスミドｐＹＧ２０８はＢ　ａ−ｍＨ
Ｉ　／　Ｓ　ａ　Ｑ　Ｉアダプター（５’　−ＧＡＴＣ
ＣＧＴＣＧＡＣＧ−３′）をＰＧＫターミネータ−の下
流に挿入してプラスミドＰＹＧ１２がら誘導される。

プレプロ−ＨＳＡをエンコードするＨ　ｉ　ｎ　ｄ■フ
ラグメントは、プラスミドｐＸＬ８６９（プレプローＨ
ＳＡ）から電気溶離により精製され、ベクターｐＹＧ２
０８のＨｉｎｄｌ［１部位に正しい配向でクローンして
プラスミドｐＹＧ２１０を生成し、これによって生じた
５ａＱＩ発現カセット（ＰＧＫプロモーター／プレプロ
−ＨＳＡ／ＰＧＫターミネータ−）は電気溶離により精
製されプラスミドｐＫａｎ７０７の５ａＱＩ部位にクロ
ーンして発現プラスミドｐＹＧ２２１Ａ及びｐＹＧ２２
１Ｂを生成する（第１９Ｂ図）が、これらはベクターｐ
Ｋａｎ７０７に関して５ａＱＩ発現カセットの相対的配
向が互いに異なるだけである。プラスミドＰＹ０２２１
Ｂに於て０４１８への耐性にコードするＫ　ＩＩｒ遺伝
子に相対する５ａ１２Ｉ発現カセットの配向は、プラス
ミドｐＹＧ１９によってもたらされる５ａＱＩ−８ａｃ
Ｉ発現カセットのそれと同一である。

Ｅ、３．３　　最適ＡＴＧ関係を有するＰＧＫ／ＬＡＣ
ハイブリッドプロモーター の構築 発現プラスミドＰＹＧ１９に存在するＰＧＫプロモータ
ーの誘発性誘導体を得るためにＰＧＫプロモーターのＵ
ＡＳをに、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターから誘導さ
れるＵＡＳに置き換えた（ブリュニング、に、Ｄ。

等、Ｎ　ｕｃｌ、　Ａ　ｃｉｄ　Ｒｅｓ、第１２巻（１
９８４年）２３２７〜２３４１頁）、この目的のために
ＰＧＫプロモーターを含むｐＹＧ１２のＳａＱＩ−Ｈｉ
ｎｄｍフラグメントをバクテリオファージＭ　１３　ｍ
　ｐ　１８にクローンし、ｐＹＧ１４を構築した（第２
０図）０次に上述したプロトコールを用いて２つのＮｏ
ｔＩ部位を部位指示突然変異生成によりＰＧＫプロモー
ター領域に導入してｐＹ０２６を構築した（第２０図）
、この目的に使用したオリゴヌクレオチドは ５’−ＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＡ　ＧＣ旦ＧＣＣＧＣＴ
ＡＧＧＡＣＣＴＴＧ−３’（Ｓ（１４１？）及び ５’−ＧＧ　ＴＡＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＧＡＴＡＡ　
ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＧＣＴＴＴ　ＡＴＧ−３’　（Ｓ
ｑ４１６）である。

これによって４つの塩基対置換（アンダーライン）が位
置−３９７−３９９−５３６及び−５４１で導入された
（＋１として定義されたＡＴＧイニシエーターコドンに
関して、第２１図）、この方法で得られた２つのＮｏｔ
Ｉ部位（太文字）はＵＳＡｐ、にの２つの機能的に異な
るドメイン（第２１Ａ図のＡ及びＭ）を含むように予め
記載されているＰＧＫプロモーター領域の側面にある（
スタンウェイ、Ｃ０等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａ
ｓ、第１５巻（１９８７年）６８５５〜６８７３頁）、
このＰＧＫ誘導体を酵素ＮｏｔＩで消化させるとＵ　Ａ
　Ｓ　、、Ｋ　が欠失し、次にＰＧＫプロモーターに関
していずれかの配向にクローンしたＮ　ｏ　ｔ　Ｉ部位
（第２２図）の側面にあるＵ　Ａ　Ｓ　Ｐ、、を含む合
成フラグメントで置換させる。ＵＡＳ　　　フラグメン
トはハイブリツＡＣ ド化し、次いで以下の４種のオリゴデオキシヌクレオチ
ドの連結によって得られた。

５ｑ５２６　上流鎖、フラグメント１ （−４４８）５’−ＧＧＣＣＧＣＴＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡ
Ｇ　ＴＧＴ　ＡＧＣＧＧＡＡＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＧ　Ｔ
ＣＣＧＡＧ　ＣＡＡ　ＣＡＧ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＴＴＴ
ＣＴＡ　ＧＴＡ　ＧＴＧ　ＣＧＧ−３’　（−３８９）
Ｓｑ５２７上流鎖、フラグメント２ （−３８８）５’−ＴＣＧ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＴＧＧ　
ＴＴＧ　ＡＣＡττＧ　ＧＴＡＴＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ
　ＴＧＴτＧＣＴＡＣＡＣＣＡＴＴ　ＣＡＣＴＡＣＴＴ
Ｇ　ＡＡＧ　ＴＣＧ　ＡＣＴＧＴＧ　ＡＧＣ−３’（−
３１９）Ｓｑ５２Ｂ下流鎖、フラグメント１ （−３１９）５’−ＧＧＣＣＧＣＴＣＡ　ＣＡＣＴＣＧ
　ＡＣＴＴＣＡ　ＡＧＴＡＧＴ　　ＧＡＡ　　ＴＧＧ　
　ＴＧＴ　　ＡＧＣＡＡＣＡＡＡ　　ＧＴＣＣＡＡ　　
Ａ丁ＡＣＣＡ　ＡＴＧ　ＴＣＡ　ＡＣＣＡＡＧ　Ｔ−３
’（−３８２）Ｓｑ５２５下流鎖、フラグメント２ （−３８３）５’−ＡＡＣＣＧＡ　ＣＣＧ　ＣＡＣτＡ
ＣＴＡＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧＡＣＧ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　Ｃ
ＴＣＧＧＡ　ＣＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＣＣＧＣＴＡ
ＣＡ　ＣＴＴ　ＴＴＣＡＣＡ　ＧＣ−３’　（−４４８
）括弧内の数字は野生型ＬＡＣ４プロモーターのＡＴＧ
コドン（＋１）に関する各オリゴデオキシヌクレオチド
の位置を示す（ブリュニング、に、Ｄ、等、ＮｕＣｌ、
　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

第１２巻（１９８４年）２３２７〜２３４１頁）０位置
−３２８〜−４３５に及ぶ領域はＬＡＣ４プロモーター
に見られる３種のＵＡＳ要素の１番目を保護するために
示されている（ブリューニング、に、Ｄ、等、５ｔｈ　
Ｉｎｔａｒｎａｔ、　Ｓｙｍｐｏｓ、　Ｇｅｎａｔ、　
Ｉｎｄｕｓｔｒ。

Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ、　（１９８６年）アラセビツク
。

Ｍｏ等（編集）５５１〜５６０頁、レオナード、Ｊ、Ｍ
、等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ　ｉｏｌ、第７巻（１
９８７年）４３６９〜４３７６頁）、太字で印刷された
文字はに、ラクチスのＬＡＣ４遺伝子のＵＡＳの側面に
ある２つのＮｏｔＩ部位の一部であるヌクレオチドを示
し、５ｃｔ５２５に相補する５ｑ５２７の結合配列には
アンダーラインが引かれる。

著しく発現される真核遺伝子のイニシエーターＡＴＧ近
くのヌクレオチド配列は翻訳開始の効率に影響すると思
われるため（コザック、　Ｍ、、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、　Ｒｅｖ、第４７巻（１９８３年）１〜４５頁、ハミ
ルトン。

Ｒｏ等、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒａｓ、第１５巻（
１９８７年）３５８１〜３５９３頁）、ＰＧＫプロモー
ターのＡＴＧ関係を次の通り修飾した０部位指示突然変
異生成により追加のＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限部位（太字）
をｐＹＧ２６に担持されるＰＧＫプロモーターの２５位
に導入してプラスミドｐＹＧを作成する（第２０図）、
この実験に用いられる合成オリゴデオキシヌクレオチド
は５’　−ＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴＴＡ
ＧＡＴＡＡＴＴＡＣＴＴＣＣ−３’（Ｓｑ４４９）であ
る６次いで上述したＵＡＳＬＡｃフラグメントをｐＹＧ
６３−１及びｐＹＧ６３−２になるＰＹＧ２９のＮｏｔ
Ｉ部位にクローンした（第２２図）、後者プラスミドの
ＰＧＫ／ＬＡＣ４ハイブリッドプロモーター領域を５ａ
ｆｆｉＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントとして精製い、
次の２種の相補性オリボデオキシヌクレオチドからなる
合成Ｈｉ　ｎ　ｄｍ　／　Ｂ　ｓ　ｔ　Ｅ　ｎアダプタ
ーに連結した。

（ｉ　）　５’　−ＡＧＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　Ａ
ＡＴ　ＡＴＡ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＴＧ＾ＡＧ　ＴＧＧ
−３’　（Ｓｑ４５１）及び（ｉｉ）５’−（ｒＴ　Ｔ
ＡＣＣＣＡＣＴＴ　ＣＡＴ　ＴＧＴ　ＴＴＴ　ＴＡＴ　
ＡＴＴτＧＴ　ＴＧＴ　ＡＡ−３’　（Ｓｑ（プレプロ
−Ｈ８Ａイニシエーターコドンは太字で表わされる）、
このアダプターは野生型ＰＧＫプロモーターの直上流に
２２ｂｐを再構成しく第２１Ｂ図）、自然に生じるＢｓ
ｔＥ１１部位までプレプロ−Ｈ８Ａ構造遺伝子の最初の
４つのコドンを包含する１次いでこの方法で得た５ａｆ
ｉＩ−ＢａｔＥＩＩフラグメント（最高イニシエーター
ＡＴＧ関係のあるＰＧＫ／ＬＡＣ４ハイブリッドプロモ
ーターを担持する）を構築ｐＹＧ１８　（第１６図参照
）の対応する制限フラグメント（非突然変異生成ＰＧＫ
を保護する）に置き換えるために使用した。この手順に
従い、ＰＧＫプロモーターに関してＵＡＳｌＡｃ　　の
配向が異なるだけの２つの構築中間体を得た。これらの
新しい構築物はＳａΩｌ−８ａｃＩ発現カセットを作成
するために使用し、ｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７の対応する
制限部位にクローンしく第１３図参照）、プラスミドｐ
ＹＧ４４−５及びｐＹＧ４４−７をもたらした（第２３
図）、これらのプラスミドはＵＡＳＬＡｃを保護する合
成ＮｏｔＩフラグメントがｐＹＧ４４−５に対して野生
型配向及びプラスミドｐＹＧ４４−７に対して反対の配
向にあることを除いて同遺伝子型である。

Ｅ、３．４　　Ｓ、セレビシェのＰＨ０５プロモーター
の制御下プレプロ−Ｈ８Ａ 分泌に対するベクターの構築 ベクターｐＥＰＨＯ（第２４図）は、Ｓ、セレビシェの
酸ホスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ５）のプロモーター及
゛びターミネータ−領域を保護する０、９４　ｋ　ｂ　
　ＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　Ｉ制限フラグメントを含む、
このフラグメントはＰＨ０５構造遺伝子の欠失により　
２．０３ｋｂゲノムＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメント
（Ｂａｊｗａｔ　ｗ、等、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ａｓ。

第１２巻（１９８４年）７７２１〜７７３９頁）から誘
導される。この欠失は一３位（ＡＴＧイニシエーターコ
ドン＋１に関して）及び＋１１０９（ＴＡＧターミネー
タ−コドンの上流に位置する５ａｕ３Ａ部位）、ポリリ
ンカー　Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｓ　ｍ　ａ　Ｉ　／　
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩは、プロモーターとターミネータ−の
間の結合で挿入され、異種遺伝子の導入のクローニング
部位として用いることができた。ＰＨ０５プロモーター
とこのポリリンカー間の結合は、以下に示される（ポリ
リンカーに対応するヌクレオチド配列にはアンダーライ
ンが引かれる）５’−ＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＴＴＡＧ　
ＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ−３’ Ｈ８Ａ遺伝子がＰＨ０５プロモーター制御及びＰＧＫ遺
伝子の非翻訳リーダー領域下で発現される構築物を得る
ために、）Ｉｉｎｄｍ部位をプラスミドｐＥＰＨｏ由来
ＰＨ０５プロモーターフラグメントの２０位に導入した
。

この目的のためｐＥＰＨｏの０．８３　ｋ　ｂＳａｎＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメントをバクテリオファージＭ　１
３　ｍ　ｐ　９のポリリンカーにサブクローンし、得ら
れた１本鎖鋳型（ｐＹＧＲＦ３）は次に突然変異誘発プ
ライマーとしてオリゴデオキシヌクレオチド５’　−Ｃ
ＣＴＡＡＴＣＴＣＧＡＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＡＴ
ＴＴＧ−３’（Ｓｑ４８７：導入されたＨｉｎｄｎ１部
位は太字で表わされる）を用いて突然変異生成され、プ
ラスミドｐＹＧＲＦ４が生じる（第２４図）。

異なったプロモーター及び／又はターミネータ−を含む
種々の発現カセットの構築を促進するためにポリリンカ
ーのＨｉｎｄｕ［部位が大腸菌のポリメラーゼエ（フレ
ノウ）の大フラグメントで付着端を処理して破壊される
プラスミドｐＩＣ−２ＯＲの誘導体（第１６図参照）を
作成した。この新しいクローニングベクター（ｐ　ＩＣ
−２０ＲＡＨ３）は次にＰＧＫ遺伝子のプロモーター及
びターミネータ−領域を含むプラスミドｐＹＧ１２　（
第１５図参照）のＳａ１２Ｉ−ＢａｍＨＩフラグメント
を導入するために用いられ、こうしてプラスミドＰＹＧ
６１を作成した。５ａＱＩＨｉ　ｎ　ｄ　ｉｌｌフラグ
メントとしてプロモーターモジュールをＨｉ　ｎ　ｄ　
ｍ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメントとしてターミネー
タ−モジュールを用いることによって、発現される構造
遺伝子がＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限フラグメントとしてクロ
ーンされている発現カセットを転写開始及び終結シグナ
ルをあらゆる組合わせで作成することができる。これら
の構築中間体を酵素Ｓ−ａ　Ｑ　Ｉ及び５ａｃＩで消化
させると新しいカセットは次に酵母クローニングベクタ
ーｐＫａｎ７０７の対応する部位に導入される（第１７
及び１８図参照）。

この基本手順に従ってプラスミドｐＹＧ６１のＳａ！　
Ｉ−ＨｉｎｄｍＰＧＫプロモーターフラグメントをＰＨ
０５プロモーターを保護するｐＹＧＲＦ４の５ａｊｌｉ
Ｉ−Ｈｉｎｄ■フラグメントに置き換えた。ＨｉｎｄＩ
［Ｉフラグメント（第２３図参照）としてプラスミドＰ
ＹＧ４４−５から分離されたプレプロ−Ｈ８Ａ構造遺伝
子の挿入及び５ａＱＩ−３ａｃＩフラグメントとして得
られた発現カセットのプラスミドｐＫａｎ７０７への移
入は分泌ベクターｐＹＧ５１をもたらした（第２３図）
。

従ってこのプラスミドは１７位までＳ、セレビシェのＰ
Ｈ０５プロモーター（全転写開始部位を含む（ルドルフ
、Ｈ０及びハイネン。

Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＵＳＡ第８４巻（１９８７年）１３４０〜１３４４頁
）第２５図）次に非翻訳ＰＧＫリーダー配列の２１ｂｐ
、プレプロ−Ｈ８Ａ構造遺伝子、最後にＰＧＫターミネ
ータ−を含む。

Ｅ、３．５　　Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターの
制御下ＨＳＡ分泌に対する ベクターの構築 ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）技術（ムリスに、Ｂ、及
びファローナ、　Ｆ、　Ａ、　Ｍａｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、第１５５巻（１９８７年）３３５〜３５０
頁、サイキ、Ｒ，に、等、サイエンス第２３０巻（１９
８５年）１３５０〜１３５４頁）を用いてに、ラクチス
のＬＡＣ４プロモーターをＳａＱＩ−Ｈｉｎｄｍ制限フ
ラグメントとして酵母ゲノムＤＮＡがら増幅した。

鋳型として働く菌株ＣＢ５２３５９から分離される全ゲ
ノムＤＮＡ及び次の合成オリゴデオキシヌクレオチドを
Ｔ　ａ　ｑ−ポリメラーゼ反応に対するプライマーとし
て使用した（Ｋ。

ラクチスのＬＡＣ４プロモーターの上流及び下流に導入
される５ａＱＩ及びＨｉｎｄｌｌ［部位は太字で表わさ
れる）。

１）５’−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＡＴＧＴＡＧＡＧＴＡＧ
ＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＧＧＣ−３’ ２）５’−Ａ　ＡＡＧＣＴＴ　ＡＴＣＴＴＴＣＡＧＴＴ
ＣＴＣＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴ−３’ これらのブライマーのデザインは、前にレオナードＪ、
Ｍ、等によって発表されたＬＡＣ４配列に基づいている
（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、第７巻（１９８７年
）４３６９〜４３７６頁）、この方法で得られた５ａｉ
ｌ　Ｉ　−Ｈｉｎｄ　ｍ制限フラグメントは位置−１１
９８〜−１にゎたるＬＡＣ４プロモーター領域を含む（
ＡＴＧイニシエーターコドンは＋１として定義される）
。

増幅した物質はプラスミドｐｙａｓｔにクローンされた
酵素５ａＱＩとＨｉｎｄｍで消化され（Ｅ、３．４章参
照）、そのヌクレオチド配列はジデオキシ鎖終結法を用
いて確認された（サンガー、Ｆｏ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

第７４巻（１９７７年）５４６３〜５４６７頁）。

前章で記載された一般図式に従いＰＹＧ４０４（第２３
図）に指定されるｐＫａｎ　７０７誘導体が得られ、プ
レプロ−Ｈ８Ａ遺伝子はに、ラクチスのラクトース／ガ
ラクトース誘発性ＬＡＣ４プロモーターの制御下で発現
される。この特定構築のＨＳＡイニシェーターコドンの
直上流の配列は、プラスミドＰＹＧ４４−５（フラグメ
ントＨｉ　ｎ　ｄ　ｍ　）から誘導され、従ってＰＧＫ
遺伝子の非翻訳リーダーの一部を含む（Ｅ、３．３章参
照）。

Ｅ、３．６Ｓ、セレビシェのＰＧＫプロモーター制御下
Ｈ８Ａ分泌及びに、ラ クチスのキラー毒素分泌シグナル に対するベクターの構築 相補性合成オリボデキシヌクレオチドの２組を用いて１
次の要素を含むＨｉｎｄｍ−ＤｒａＩフラグメントを再
構成した。（ｉ）ＰＧＫプロモーターのＡＴＧ近接２１
ｂｐ、（…）Ｋ、ラクチスのプラスミドに１からのキラ
ー毒素遺伝子の分泌シグナル配列（″ブレ″領域）（ス
ターク、Ｍ、Ｊ、Ｒ，及びボイド。

Ａ、ＥＭＢＯＪ、５　（１９８６年）１９９５〜２００
２頁）及び（ｉ）キラー毒素プレ領域に枠内で融合した
Ｎ−末端Ｄ　ｒ　ａ　Ｉ部位までのプローＨ８Ａ遺伝子
の最初の１７アミノ酸、この構築に使用される４種のオ
リゴデオキシヌクレオチドは次の通りである。

５ｑｌＯＯＯ，上流鎖、フラグメント１５’−ＡＧＣＴ
ＴＡＧＣＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＡ
ＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴ
ＴＴＴＴＧＣＴＧＴＣ−３’ ５ｑ９９８．上流鎖、フラグメント２ ５’−ＡＴＴＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴＡＧＧＧＧＴＧＴＧ
ＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧ
ＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣ：ＧＧＴＴＴ−３’ ５ｑ９９６．　　下流鎖、フラグメント１５’−ＡＡＡ
ＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡ
ＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＴＧＴＴＧＴＡＡＡＧＣＴ
Ａ−３’５（１９９７，下流鎖、フラグメント２５’−
ＡＡＡＣＣＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣ：ＣＴＣＡＣＴＣ：Ｔ
ＴＧＴＧＴＧＣＡＴＣＴＣＧＡＣＧＡＡＡＣＡＣＡＣＣ
ＣＣＴＡＣＣＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣ−３’ 太字で印刷された文字はこの実験で使用したＨ　ｉ　ｎ
　ｄ　ｍ及びＤｒａＩ部位の一部であるヌクレオチドを
表すし、５ｑ９９６に相補性の５ｑ９９８の結合配列は
アンダーラインが引かれる。

オリゴデオキシヌクレオチド５ｑ９９６及び５ｑ９９Ｂ
のリン酸化の後、二重鎖ＨｉｎｄＴｎ−ＤｒａＩフラグ
メントは第２６図に示される図に従って生成した。この
１３０ｂｐフラグメントはゲル電気泳動によって精製さ
れ。

プラスミドｐＸＬ８６９　（第６図参照）から分離され
たＨ８Ａ構造遺伝子の一部を含む１．０４ｋｂ　Ｄｒａ
Ｉ　−ＸｂａＩフラグメントに連結した０次いでこの方
法で得られたＨｉｎｄｍ−ＸｂａＩフラグメントをバク
テリオファージＭ　ｌ　３　ｍ　ｐ　１０にクローンし
てｐＹＧ５６　（第２６図を構築した。この中間体の正
しいヌクレオチド配列はジデオキシ配列化によって確認
した。

次に全ブレプローＨＳＡ構造遺伝子は次の３要素の連結
によって再構成することができる。（ｉ）今記載したｐ
ＹＧ５６構築物から誘導される１、１７ｋｂ　Ｈｉｎｄ
ｌ［−Ｘｂａエフラグメント（…）ＨＳＡ遺伝子のカル
ボキシ末端の半分並びにＰＧＫターミネータ−領域を含
むｐＹＧ１８　（第１６図参照）のＸ　ｂ　ａ　Ｉ　−
Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩフラグメント及び（ｉｉｉ）プラスミ
ドｐＹＧ６２のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ■フラグメント、
この後者のプラスミドはＰＧＫプロモーターを担持する
５ａＱＩ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントがプラスミド
ｐＹ０２９（第２０図参照）由来の等価の制限フラグメ
ントに置き換えられている構築物ｐＹＧ６１　（Ｅ、３
．４章参照）の誘導体である。従っでこの構築に用いら
れるプラスミドＰＹＧ６２のＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄｌ［
［フラグメントは大腸菌複製起源、アンピシリン耐性遺
伝子及び位置−２５で導入されたＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ部
位を有するＰＧＫプロモーター（Ｅ、３゜４章参照）、
得られたｐ工Ｃ誘導体はｐＹＧ５７を指定された。この
後者のプラスミドはＳａＱ　ｌ−８ａｃ　Ｉフラグメン
ト情報として用いられ、酵母クローニングベクターｐＫ
ａｎ７０７の対応する部位にクローンされ発現ベクター
ｐＹＧ５８　（第２３図）をもたらした。

Ｅ、３．７　　ＰＧＫ／プレプロ−ＨＳＡ分泌カセット
をに、ラクチスのＲＡＧ　２ 座に指示する組込みベクターの構 築 Ｄｒ、Ｍ、ペソロスキーーローベル（インスチチュート
　キュリー、オーセイ、フランス）によって親切に提供
されたプラスミドｐ３１／ＲＡＧ２　：ＵＲＡ３は、ホ
スホグルコースイソメラーゼを最もエンコードしている
と思われるに、ラクチスのＲＡＧ２構造遺伝子のプロモ
ーター及びＮ−末端領域を保護する２、３ｋｂゲノムＮ
ｈｅＩフラグメントを含む（ペンロスキー−ローベル２
Ｍ０等、Ｎｕ　ｃ　ｌ。

Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　、第１６巻（１９８８年）８７１４
頁）、プラスミドｐ３１／ＲＡＧ２　：　ＵＲＡ３はＳ
、セレビシェのＵＲＡ３遺伝子を保護するプラスミドｐ
ｃｘ、ｙ　１（第９図）由来の１．６ｋｂＥｃｏＲＩフ
ラグメントをＲＡＧ２プロモーターのＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ
部位に挿入することによって構築された０次いでこの方
法で得た３、９ｋｂ　　ＮｈｅＩフラグメントをプラス
ミドｐＢＲ３２２のユニークＮｈａＩ部位にクローンし
た。

プラスミドｐＹ０１８（第１６図）を制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖ及びＳ　ｍ　ａ　Ｉで切断することによって我々は酵
母分泌ベクターｐＹＧ１９（第１８図）で使用したもの
と同じＰＧＫ／プレブローＨＳＡ発現カセットを含む３
．７ｋｂフラグメントを得た。このカセットをプラスミ
ドｐ３１／ＲＡＧ２：ｔＪＲＡ３のユニークＳ　ｍ　ａ
　Ｉ部位（ＵＲＡ３マーカー遺伝子の３′に位置する）
に挿入するとブレブローＨ８Ａ発現カセットの配向に関
して互いに異なるだけのｐＹＧ６０−２１及びｐＹＧ６
０−５（第２７図）を構築した。

プラスミドＰＹＧ６０−２１及びｐｙａｅ。

−５を酵素ＮｈｅＩで切断することによって我々はＨ８
Ａ発現カセットとＲＡＧ２誘導配列の側面にあるＵＲＡ
３マーカー遺伝子を含む７．７ｋｂフラグメントを作成
した。これらの後者の配列は、同種組換えによりに、ラ
クチス菌株ＭＷ９８−８ＣのＲＡＧ２座に全フラグメン
トを組込むことを目標とした（ロススティン、、　Ｒ，
Ｊ　、Ｍａｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１０
１巻（１９８３年）２０２〜２１１頁）。

ＲＡＧ２座での組込みは試験される６個の組込み体のう
ちの３個に対してサザン分析によって確認した（ＭＷ９
８−８Ｇ：：６０−５組込み体クローン＃６及びＭＷ９
８−８Ｃ：　：６０−２１組込み体クローン＃７及び９
）。

残りの３個の組込み体はＲＡＧ２以外の座で組込まれた
ＨＳＡ発現カセットの１つ（ＭＷ９８−８Ｃ：　：　６
０−５組込み体クローン＃８及びＭＷ９８−８Ｃ：　：
６０−１−２１組込み体クローン＃１１）又は２つ（Ｍ
Ｗ９８−８Ｃ：：６０−ｓ組込み体クローン＃４）を有
することが見い出された。確認された組込み体６個全部
をＨ８Ａ分泌の効率に対して試験した。

実施例４　　Ｈ８Ａを発現するプラスミドによるクルイ
ベロミセス種の形質転換 Ｅ、４．１　　形質転換操作 に、ラクチス菌株ＭＷ９８−８　Ｃ（αｕｒａＡａｒｇ
　１ｙｓＫ”　ｐＫＤｌ”　）の形質転換はハイホン等
によって最初に記載され（ハイホン。

Ａ１等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　Ｕ　Ｓ　Ａ第７５巻（１９７８年）１９２９〜１９３
３頁）適当に改変されたスフ二〇プラスト形成手法ある
いはポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００、シグマ
）の存在下でＤＮＡの取込みを容易にする酢酸リチウム
（イド、Ｈｌ等、Ｊ、　Ｂａｃｔａｒｉｏｌ、第１５３
巻（１９８３年）１６３〜１６８頁）で全細胞を処理す
ることによって得られた。以下に記載される他の全ての
クルイベロミセス菌株の形質転換は酢酸リチウムで処理
することにより得られたものだけである。

菌株ＭＷ９８−８Ｇの試料は１９８８年９月１６日に第
ＣＢ５５７９８８号として登録されたブタペスト条約の
規定に従ってオランダ、バーンのＣｅｎｔｒａａｌｂｒ
ｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｋｉｍｍｅｌｋｕｌｔｕｒｓｎ
　（ＣＢ　Ｓ　）に寄託されている。

スフェロプラスト形成に関する修飾は既に記載されてい
る（ビアフチ１Ｍ６等、Ｃｕｒｒ。

Ｇ　ｅｎａｔ、第１２巻（１９８７年）１８５〜１９２
頁）、酢酸リチウムを含む方法を使用した場合、細胞生
育はＹＰＤ培地５０　ｍ　０９２８℃で撹拌しなから６
００ｎｍに於ける吸光度（ｏＤｓ。。）ｏ−ｅ　〜Ｏ，
Ｂ＊−Ｃ行ｆｔ−）、ｍ胞を低速遠心分離で回収し、Ｔ
Ｅ無菌溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　ｐＨ７，４、１
ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄し、酢酸リチウム溶液３〜４ｍＱ
（ＴＥ中０．１Ｍ）に再浮遊させて細胞密度約２　Ｘ　
１０’Ｃ／ｍＡを得、３０℃で１時間中程度に撹拌しな
がら装置する。

得られたコンピテント細胞の浮遊液０．１ｍｊ！アリコ
ート部分をＤＮＡ及びＰＥＧ４０００の存在下最終濃度
３５％で３０℃に於て１時間温置する。４２℃で５分熱
シヨツクの後細胞を無菌水で２回洗浄し、無菌水０．２
ｍ（！に再浮遊させ、１０ｍｆｌ試験管に移す０次いで
０．７％寒天を含み、４６℃で溶融しているＹＰＤ培地
を加え、混合液を直ちにＹＰＤプレートに注ぐ、固化後
、更に上面寒天５　ｍ　１１の上層を加える。２８℃で
１８〜２４時間温置した装、０４１Ｂ溶液（ゲネチシン
５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　１１、ＧＩＢＣＯ，グランドア
イランド、Ｎ、Ｙ、）０．１６ｍＡをプレート上に拡散
し、２８℃で更に４〜５日温置した後、形質転換体を計
数する。

細胞をＹＰＤ＋０４１８プレート（即ち上面寒天の使用
を省く）に直接置くと形質転換されたに、ラクチス細胞
の大きなサイズのクローンが現われてくる。しかしなが
ら低濃度の０４１８（最終濃度５０　ｕ　ｇ　／　ｍ　
Ｉ！　）をコロニーを観察するために用いねばならず、
これは０４１８や非形質転換細胞から誘導されるものに
一部抵抗する突然変異体の選択を生じる。更に形質転換
効率は耐性遺伝子を１８〜２４時間表現型発現させた後
、Ｉ！察された効率より少なくとも１０倍低い。

Ｅ、４．２　　非選択増殖条件下Ｈ３Ａ発現ｐＫＤ１由
来プラスミドの分裂安 定性 非選択培地で生育させた後、プラスミドｐＹＧ１９及び
ｐＹＧ２３の分裂安定性を異なった間隔で測定する。Ｇ
４１８．２００μｇ／　ｍ　（１を含むＹＰＤプレート
で生育する細胞の最終及び開始％の比として決定する。

第２８図に示される通り、両プラスミドは異種遺伝子の
高レベルの発現にもかかわらず例外的に安定である。菌
株ＭＷ９８−８Ｃの形質転換体を非選択培地で４０個の
細胞に増殖された時、細胞の４０〜４５％はこれらのプ
ラスミドを保持した。プラスミドＰＹＧ１９はに、ラク
チス菌株ＣＢ５６８３中、更に高い分裂安定性を示し、
８０％以上の細胞が４０個の非選択増殖後プラスミドを
保持する。

Ｅ、４．３に、ラクチスＭＷ９８−８Ｃ：Ｈ８ＡのＰＹ
Ｇ１９及びｐＹＧ ２３形質転換体の発現及び分泌 プラスミドｐ　Ｙ　Ｇ　１９　（ブレプローＨＳＡ）及
びｐＹＧ２３　（Ｍｅｔ−Ｈ８Ａ）を含むＫ。

ラクチスＭＷ９８−８Ｃ細胞の発現及び分泌レベルは非
選択ＹＰＤ培地中２８℃で一定に攪拌しながら異なる間
隔で測定した。細胞による全ての可能な汚染を取り除く
ために２回の逐次遠心分離（コントロンハームル２−３
６５に遠心機に於て４．ＯＯＯｒｐｍで５分、次に１２
．ＯＯＯｒｐｍで１０分）して培養上清を得る。２番目
の上清の試料（，０，５ｍＱ）を０．１２５Ｍトリス−
ＨＣＱ、２０％グリセロール、１０％２−メルカプトエ
タノール（β−ＭＥ）、４，６％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＳＤＳ）及び０．４％プロモフェノールブル−を含
む同量の試料緩衝液の存在下９５℃に１５分間加熱する
。この上清に存在するタンパク質の濃度を所望する場合
、１００％Ｗ／ｖトリクロロ酢酸溶液（ＴＣＡ）０．４
ｍｆｆ１を上清８ｒｎＱに加えタンパク質を１時間氷上
に沈降させる。この沈降物質を１５．００　Ｏｒｐｍで
２０分間遠心して回収した後、６３ｍＭトリス−ＨＣＱ
、１０％グリセロール、５％β−ＭＥ、２．３％ＳＤＳ
及び０．２％ブロモフェノールブルーを含む試料緩衝液
０．５−Ｑ中で９５℃に１５分間加熱して再溶解する。

アルブミンの細胞内発現は次の通り調製した細胞抽出液
を用いて検出される。細胞沈降物（食塩緩衝液で１回洗
浄）０．２５ｍｊ！の等偏量を氷上に維持し、６７ｍＭ
リン酸塩、ｐＨ７，５ｍ　Ｍβ−ＭＥ、１ｍＭフッ化フ
ェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、２μＭロイペプ
チン及び２μＭペプスタチンＡ（シグマ）を含む同量の
溶菌緩衝液に再浮遊させる。４℃でリン酸塩緩衝Ｆｆｔ
（６７ｍ　Ｍ　、　ｐ　Ｈ７）に貯蔵したジルコニウム
ビーズ（直径Ｑ、５ｍｍ）０．５ｍΩを加えた後、細胞
を氷で２分冷却することにより散在された細胞破壊機（
バイオスペック　ミニビード−ビータ−バイオスペック
　プロダクツ）で７〜３０秒間によって破壊される。こ
れらの条件下で細胞破壊の効率は位相差顕微鏡で細胞を
計数して判断した場合９０％以上である。ジルコニウム
ビーズのない液体画分をエッペンドルフ管に移し、ビー
ズを溶菌緩衝液０．２ｍＡで３回洗浄した後、同じエッ
ペンドルフ管に集める。この管を４℃で１５分間、１２
，０００ｇで遠心して可溶性タンパク質画分（上滑）と
不溶性タンパク質画分（沈降物）はこうして特定される
。

これらの２つの両分を分離し、次に希釈後。

同じ最終容量の試料緩衝液の溶液に溶解する。

これらの試料を９５℃に１５分間加熱し、５％積み重ね
ゲル（レムリ、Ｕ、に、ネイチュア第２２７巻（１９７
０年）６８０〜６８５頁）に付随する８、５％５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルに重層し、次いでブロモフェノ
ールブルーがゲルの底部にとどくまで２５ｍＡの電流に
かける。

第２９図は、Ｇ４１８のないＹＰＤ培地５０ｍｆｉ中２
８℃で６８時間生育させた後。

プラスミドｐＹＧ１９　（プレプロ−ＨＳＡ）、ｐＹＧ
２３　（Ｍｅ　ｔ−ＨＳＡ）及びｐＹＧ２５（発現カセ
ットのないベクター）で形質転換したに、ラクチス菌株
ＭＷ９８−８Ｃで得たアルブミンの発現及び分泌を評価
することができる代表的な実験の結果を示す、各試料は
、原培養液１００μＱに相当し、８．５％ポリアクリル
アミドゲル及びクーマシーブルー染色で泳動させた後、
可溶性画分、不溶性画分及び培養上清を比較することが
できる。

分子量の比較として役に立つ市販のヒトアルブミン（シ
グマ）と同時移動するタンパク質バンドはプラスミドｐ
ＹＧ１９又はｐＹＧ２３で形質転換された細胞から誘導
される試料に検出可能であるが、ＨＳＡ遺伝子を含まな
いベクターｐＹＧ２５を含む細胞にはない。

プラスミドｐＹＧ２３　（Ｍｅｔ−ＨＳＡ）を用いて産
生されるアルブミンは全て不溶性細胞質タンパク質画分
に存在するが、実際にはｐＹＧ１９　（プレプロＨＳＡ
）を用いて発現されるアルブミン全てが細胞上清に輸送
されることは注目される。更に第２９図の結果は、プラ
スミドｐＹＧ１９を含む細胞によって排泄されるアルブ
ミンが著しい量で存在する細胞内だけのタンパク質であ
ることを示す、プラスミドｐＹＧ１９で形質転換され、
適当な条件下（Ｅ、４．６の項参照）で生育したＭＷ９
８−８Ｃの振盪フラスコ培養の上滑ではアルブミン濃度
が１５０　ｍ　ｇ　ＨＳ　Ａ　／　Ｑに達することがで
きる。

Ｅ、４．４　　Ｋ、ラクチスによって産生されるアルブ
ミンの免疫学的検出 アルブミン標準と同時移動する酵母タンパク質の同定は
免疫学的検出で試験することができる。この目的のため
に２５　ｍ　Ｍ　トリス塩基、１５０ｍＭグリシン及び
１０％メタノールを含むトランスファ緩衝液中、半ドラ
イプロッティング装置（バイオメトラ）を用いてニトロ
セルロースフィルター（シュライシャー及びシェラエル
、０．４５μｍ）にプロットする。プロッティング時間
は、ゲル簡約０．８５ｍＡ／ａｍ”の電流を用いて３０
分である。プロッティング後、フィルターを緩衝液Ａ（
ＰＢＳ緩衝液［１３７ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＣＱ　。

２．７ｍＭ　ＫＣｊｌ、４．３ｍＭ　Ｎａ、ＨＰＯ，］
中５％スキムミルク末、　０．２％ツウィーン２０）で
５分間３回置型した後、Ｈ８Ａに指示され１　：　１０
００に希釈されたウサギポリクローナル抗体を含む緩衝
液Ａ４０ｍｆｉに３０分間温置型る。緩衝液Ａでフィル
ターを３回すすいだ後、ウサギ抗体を認識する２番目の
ビオチニル化抗体（ベクタスタインＡＢＣイムノバーキ
シダーゼキット、ベクターラボラトリーズ）を緩衝液Ａ
５０ｍＡにつき１滴を基準として加える。フィルターを
３０分間温置型た後、フィルターを緩衝液Ｂ　（ＰＢＳ
中０．２％ツウイーン２０）で３回すすいだ後、アビジ
ンＤＨ／ビオチニル化パーオキシダーゼＨ複合体の存在
下で温度する。アビジン／ビオチニル化パーオキシダー
ゼ複合体は２３℃で３０分間温置型た後、緩衝液ＢＳｍ
Ｑ中キットの試薬Ａ及びＢの各１滴を希釈することによ
って使用直前に調製する。フィルターを緩衝液Ｂ中１：
１０の希釈度の複合体（全量５０＋ａＱ）に３０分間温
置型る。フィルターを緩衝液Ｂで３〜５秒間再びすすぎ
、０．０２％Ｈ，Ｏ，を含む１０ｍ０の溶液及び０．１
Ｍトリス−ＨＣｊｌ　　ＰＨ７，４中ジアミノベンジジ
ン１　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｑと０．４ｍｇ／Ｎ１ｃＱ２を
含む溶液１０ｍａ中で２〜３分間展開する。第３０図は
、Ｋ、ラクチスＭＷ９８−８Ｃが抗−ＨＳＡポリクロー
ナル抗体によって認識されたタンパク質を発現（ｐＹＧ
２３）及び排泄（ＰＹＧ１９）することを示す、この抗
原物質は、詳細には発現カセットのないベクターで形質
転換された酵母からの細胞抽出液又は培養上清で検出さ
れないため、アルブミン発現カセットの存在と関係があ
る。

Ｅ、４．５　　Ｈ８Ａ８Ａの速度論 第３１Ａ図に示される通り、アルブミンの分泌は三角フ
ラスコ中比較的低速度で起こる。

最大排出レベルは１０’細胞／ｍΩで最初に接種した培
養を７０〜１００時間温置した後置型ると思われる（第
３１Ｂ図）、１００〜２４０時間の培養では著しい増加
も減少も検出可能でなく、これらの増殖及び温度条件下
でＨ８Ａの良好な安定性を示唆する。この時間中にはタ
ンパク質分解で分解した物質の蓄積がないため、排泄さ
れたアルブミンを分解する細胞片プロテアーゼが存在し
ないことを結論することができる。

排出速度論のグラフ表示（Ａ）並びにプラスミドｐＹＧ
１９で形質転換された菌株ＭＷ９８−８Ｃの生育曲線（
Ｂ）は第３２図に示され、これらの結果は、細胞が増殖
定常期に達した後にアルブミンの排泄が続くことを示し
ている。この観察は酵母の他の発現系に関する初期の観
察と一致している（ツチョップ。

Ｊ、Ｆ、等、バイオテクノロジー、第５巻（１９８７年
）１３０５〜１３０８頁）。

Ｅ、４．６　　プラスミドｐＹＧ４４．ＰＹＧ５１゜ｐ
ＹＧ４０４及びｐＹＧ５８によ るＨ８Ａ８Ａの効率 ＨＳＡ５Ａの効率をＳ、セレビシェの ＰＧＫプロモーター（プラスミドＰＹＧ１９゜第２９〜
３２図）、、ＡＴＧの関係を最適にしたＰＧＫ／ＬＡＣ
４ハイブリッドプロモーター（プラスミドｐＹＧ４４−
５及びｐＹＧ４４−７．第３３図）、Ｓ、セレビシェの
ＰＨ０５プロモーター（プラスミドｐＹＧ５１゜第３４
Ａ図）及びに、ラクチスのＬＡＣ４プロモーター（プラ
スミドｐＹＧ４０４．第３５図）の制御下で試験した。

更にに、ラクチスのキラー毒素の分泌シグナル配列（プ
レ領域）をプローＨＳＡ構造遺伝子（プラスミドｐＹ０
５８ｅ第３４Ｂ図）に枠内で融合し、融合タンパク質の
分泌効率を自然プレプロ−Ｈ８Ａ（詳細はプラスミド構
築、第３章参照）と比較した。これらの構築で得られた
結果を次の通り要約することができる。

プラスミドｐＹＧ４４に存在するＰＧＫ／ＬＡＣ４ハイ
ブリッドプロモーターから発現される場合培地に分泌さ
れるＨ　Ｓ　Ａのレベルは、ラクトースを中央の対数及
び初期定常増殖期の間で加えた培地を含むグルコース中
で細胞を培養するならば、２〜３倍に増加する（第３３
図）、この効果は、ラクトースの添加を等偏量のグルコ
ースに置き換える場合には観察されない（データは示さ
れない）、細胞が単独の炭素源としてラクトースを含む
培地中で培養される場合には１分泌ＨＳＡのレベルはグ
ルコース含有培地で得られるものほど高くない（第３３
Ｂ）、Ｈ８Ａ分泌のラクトース介在増加はグルコースの
開始培養に続く細胞の１′誘発”後にＩＩ察されるが、
Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターのＵＡＳ要素の存
在に依存しない、このラクトース介在増加は、Ｈ３Ａ分
泌がＰＧＫプロモーター（菌株ＭＷ９８−８Ｃ：形質転
換体に対して第３３Ａ、Ｂ図、ＣＢ５２３５９形質転換
体に対して第３５図）又はＳ、セレビシェのＰＨ０５プ
ロモーター（データは示されない）に指示される場合同
様に見い出される。

Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモーターの制御下のＨ８Ａ
分泌は、Ｓ、セレビシェのＰＧＫプロモーターで得られ
るより低いＨＳＡレベルを生じる（第３５図）、他方、
ＬＡＣ４指示ＨＳＡ発現はしっかりと調節され、グルコ
ースが唯一の利用できる炭素源である場合ＣＢ５２３５
９形質転換体の培養上清には分泌Ｈ３Ａを検出すること
ができない。

驚くことに細胞が完全培地（Ｙ　Ｐ　Ｄ）で増殖される
場合、ＰＨ０５指示ＨＳＡ分泌の効率は解糖ＰＧＫプロ
モーター（第３４Ａ図）を含む構築物で観察されるもの
よりごくわずかに低い。

Ｋ、ラクチスのキラー毒素のプレ領域によるＨＳＡ分泌
シグナルの置き換えは、速度論あるいはＨＳＡ分泌効率
のいずれにも影響しない（第３４図）。

Ｅ、４．７　　組込み発現カセットによるＨＳＡ分泌の
効率 プラスミドｐＹＧ１９に存在するＰＧＫ−フレフロＨＳ
Ａ発現カセットはロススティン。

Ｒ，Ｊ、によって記載される一段階遺伝子破壊法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、第１０１巻（１９
８３年）２０２〜２１１頁、実験の詳細はＥ、３゜７章
参照）によってに、ラクチス染色体ＤＮＡに組込まれて
いる。第３６図に示される通り。

組込み菌株（レーン２〜７）によって培地に分泌される
Ｈ８ＡのレベルはｐＫＤ１由来ｐＹＧ１９（レーン１）
によって得られるものより少なくとも２０倍低い、Ｈ８
Ａ分泌はＲＡＧ座に又はに、ラクチスゲノム（第３６図
）のほかで発現カセットの組込みが生ずるにせよ基本的
には同じである。更にその上、ＵＲＡ３選択性マーカー
に関する発現カセットの配向はＨ８Ａ分泌レベルに著し
い影響を与えなかった（第３６図、レーン２及び３）。

形質転換体で分泌Ｈ３Ａの２倍の増加が観察されたが、
２つの発現カセットがゲノムに組込まれていた（第３６
図、レーン５）、同様にＨ８Ａ分泌の効率は形質転換酵
母細胞に有する構造遺伝子のコピ数に直接連鎖している
ように思われる。

Ｅ、４．８　　クルベロミセス属の種々の種及び菌株に
於けるＨ３Ａの分泌 プラスミドＰＹＧ１９．ｐＹ０２２１Ｂ又はｐ　Ｋ　ａ
　ｎ　７０７はクルベロミセスの次の菌株、ＡＴＣＣ１
６０４５（Ｋ、マルキシアヌス変異株ブルガリクス）、
ＡＴＣＣ２４１７８（Ｋ、ウィノカーハミイ）、ＡＴＣ
Ｃ１２４２４（Ｋ、マルキシアヌス変異株マルキシアヌ
ス）、ＡＴＣＣ５６５００（Ｋ、ウオルチイ）、ＡＴＣ
Ｃ３６９０６（Ｋ、マルキシアヌス変異株ドロソフィラ
ルム）、ＣＢ５４５７４　（Ｋ。

マルキシアヌス変異株ラクチス）、ＣＢ５６８３（Ｋ、
マルキシアヌス変異株ラクチス）及びＭＷ９８−８Ｃ（
Ｋ、マルキシアヌス変異株ラクチス）を形質転換するた
めに使用した。分泌ＨＳＡの検出可能レベルは試験され
る形質転換体すべてで、たとえ異なった菌株中でかなり
の変化が見られるにしても得られた。最も高いレベルは
菌株ＭＷ９８−８Ｃ（ＣＢＳ５７９．８８）及びＣＢ５
６８３の形質転換体を用いて見い出され、最も低いレベ
ルは菌株ＡＴＣＣ１６０４５で観察され分解されないＨ
ＳＡは免疫学的方法でのみ検出することができた（デー
タは示されない）。プラスミドｐＹＧ１９及びｐＹ０２
２１Ｂは試験した全菌株の分泌Ｈ８Ａの匹敵するレベル
に介在した。

実施例５　増殖培地に分泌したＨＳＡの精製代表的精製
実験ではプラスミドｐＹＧ１９で形質転換した菌株ＭＷ
９８−８Ｃを既に記載した標準条件下で７２時間ＹＰＤ
培地中で増殖させる。培養上清（０，５ｆｉ）は遠心分
離によって全ての細胞性汚染をなくし、６０％エタノー
ル（Ｖ　／　Ｖ　）の存在下４℃で１５分間温置きれる
。沈降物を遠心分離で回収し、５０　ｍ　Ｍ　トリス−
ＨＣＱ　　ｐＨ８，０を含む溶液１０ｍＱに再溶解し１
次にトリスアクリルブルーカラム（１，Ｂ、Ｆ、フラン
ス）に充填される。ヒトアルブミンを３　Ｍ　ＮａＣＱ
溶液でこの方ラムから溶離する。ＨＳＡを含む両分を５
０　ｍ　Ｍ　）−リス−ＨＣＩＡに対して透析した後、
これらの両分をＭＯＮＯＱカラム（ファーマシア）で精
製し、ＮａＣｊ２濃度０．２５Ｍで溶離する。最終段階
に於けるスーパーロース１２（ファーマシア）によるク
ロマトグラフィーはＨＳＡをＳＤＳポリアクリルアミド
の銀染色で判断した場合、純度９９％以上で得ることが
可能である。

実施例６　分泌精製アルブミンの確認 試験管内でアルブミンの生物特性を測定することができ
る試験が無いことは組換え体アルブミンの品質を評価す
る簡単な手段を提供しない。このため、精製後に、ラク
チスによって排泄されたアルブミンは従っていくつかの
生物化学的及び免疫学的試験によって確認される。これ
らの試験は１組換え体アルブミンが成熟形態及び天然の
配置構造のに、ラクチスによって分泌されることを示し
、全ての基準に関して血漿から抽出されたヒト血清アル
ブミンと区別できない。

Ｅ、６．１　　ＰＡＧＥ−ＳＤＳ：クーマシープル及び
銀染色 上述した通りＳＤＳポリアクリルアミドゲル（７，５％
）（第３８Ｃ図）により又は“Ｐｈａｓｔゲル′″系（
ファーマシア、第３８Ａ図）を用いて電気泳動を行なう
０組換え体アルブミンの異なった量をヒト血漿から抽出
した標準アルブミン（シグマ）の市販製剤と比較した。

ゲルをクーマシーブルー（第３８Ｃ図）又は銀塩（第３
８Ａ図）で染色すると酵母からのアルブミン試料の完全
な均一性を示す。

Ｅ、６．２　　等電点分画電気泳動 等電点分画電気泳動をｐＨ４，５〜６．０（Ｐｈａｓｔ
ゲル、ファーマシア、第３８Ｂ図）とｐＨ４，０〜７．
０（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ、　ＬＫＢ）で行なう。組換
え体Ｈ８Ａの等重点は比較ヒトＨ３Ａ　（ｐ　Ｉ＝４．
８）と一致する。

Ｅ、６．３　　生ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング 非変性ポリアクリルアミドゲル（１０％）中級換え体Ｈ
ＳＡの電気泳動、次いでニトロセルロースフィルターへ
のプロッティング及びＥ、４．４で記載した条件下で免
疫検出はヒト血漿から抽出した標準アルブミンと同時移
動を示す。これは組換え体プレプロ−Ｈ８Ａの正しい成
熟かに、ラクチスの分泌過程で起こることを極めて強く
示唆している。非成熟Ｈ８Ａでの汚染は検出可能でなく
、ＨＳＡのシグナル配列及びブロー配列の切断がこの酵
母で効率よく起こることを意味する。

Ｅ、６．４　　分子ふるいクロマトグラフィー分子ふる
いクロマトグラフィーをスーパーロース１２（ファーマ
シア）で実施する。溶離緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣ
Ｑ　ｐＨ８，０）の流速を１ｒｎＱ／分で保持する。組
換え体アルブミンと比較アルブミンの濃度は各々０．４
ｍｇ／ｍＱと１ｍｇ／ｍＱである。アルブミンの溶出は
２８０ｎｍに於ける吸光度を測定して検出する。両方の
場合とも溶出量は同じである（１１．５ｍＱ）。

Ｅ、６．５　７ニオン交換クロマトグラフィ組換え体ア
ルブミンをヒト血漿から誘導される比較アルブミンと同
様に０．３１ＭＮ　ａ　ＣＱの濃度でＭｏｎｏ　　ＱＨ
Ｒ５１５カラム（ファーマシア）から溶離する。

第３９図は５０　ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣＱｐＨ８，０で
平衡にしたカラムを用い、一定流速１　ｍ　Ｑ　７分で
組換え体Ｈ８Ａ（０，４ｍｇ／ｍＱ）と１００μ９と比
較Ｈ８Ａ（０，５ｍｇ／ｍｕ）の１００μＱを注入して
得たクロマトグラフィープロフィルを示す。

Ｅ、６．６　　逆相クロマトグラフィー逆相の酵母アル
ブミンの挙動を緩衝液Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸（
Ｔ　Ｆ　Ａ）を含む水）　とＢ　（０，１％ＴＦＡを含
むアセトニトリル）を有するヌクレオシル（Ｃ４）カラ
ムにより解析する。第４０図はＡ中２０〜８０％Ｂの勾
配で酵母アルブミンの溶出を示し、比較アルブミンと同
じ保持時間を示す。

Ｅ、６．７　　アミノ酸組成 酸加水分解（６ＮＨＣＱ）とフェニルインチオシアニル
誘導化の後、組換え体Ｈ３Ａのアミノ酸組成を逆相クロ
マトグラフィーによって決定する。この方法によって得
られる結果は、ヒト血漿由来の比較アルブミンと明らか
に同じ組成を示す。

Ｅ、６．８　　Ｎ末端配列 エドマン分解（アプライドバイオシステムス）用自動操
作装置の使用はに、ラクチスによって分泌されたＨ８Ａ
のＮ末端配列がＡ　ｓ　ｐ−ＡＱａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−
８ｅｒ−ＧＱｕ−Ｖ　ａ　Ｑ　−Ａ　Ｑ　ａ　−Ｈｉ　
ｓ　−Ａ　ｒ　ｇ　−Ｐ　ｈ　ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌ
ｅｕ−ＧＱＹであることを示す。従ってこの配列の決定
は化ポリアクリルアミドゲル電気泳動実験から誘導され
る結果を確認し、Ｋ、ラクチス酵母によって分泌される
アルブミンの正しい完全な成熟を示す。

Ｅ、６．９　　トリプトファン蛍光 ２９５ｎｍで励起した後、単一トリプトファンの蛍光発
光は組換え体及び血漿アルブミン３３７ｎｍで最大）の
両方に対して同じプロフィルを示し、このアミノ酸のま
わりで同じ疎水性条件であることを意味する（第４１図
）。

Ｅ、６．ｌ　Ｏ熱安定性 比較アルブミン（シグマ）と酵母によって分泌されたア
ルブミンは７５℃で同じ安定性速度論（第４２図）を有
し、タンパク質構造を安定化する結合（疎水性相互作用
及びジスルフィド結合）は両方の場合で同じである。

Ｅ、６．１１　　モノクローナル抗体に対する反応性 組換え体アルブミンの抗原性をヒトアルブミンに指示さ
れる異なったモノクローナル抗体について研究した。第
４３図はそれらの特異性を示し、抗体ＨＡＩ　Ｏ，ＨＡ
Ｉ　１及びＨＡＩ３は全分子の完全さが維持に必要とさ
れるエピトープに対応する。抗体ＨＡ２１゜ＨＡ６．Ｈ
Ａ４．ＨＡ３．ＨＡ８及びＨＡＩはＮ末端からＣ末端ま
でのペプチド鎖に局在ノエヒトープに対応する（トイエ
ン、Ｎ、Ｗ、Ｍｏ１．　Ｉｎ　ｍｕ　ｎ　、第２２巻（
１９８５年）１〜１０頁、ラプレスル、　ＣＡｎａｌ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

第１７４巻（１９８８年）３０８〜３１２頁）。

使用される試験はＥＬＩＳＡ阻害テストである。異なっ
た抗体をポリスチレンプレートに吸着させ、アルカリ性
ホスファターゼで標識したアルブミン結合曲線を各抗体
に対して決定する。各抗体に対する飽和曲線はＳ状が現
われ、５０％結合に相当する標識アルブミン量が各抗体
による阻害を研究するために選ばれた。

阻害は組換え体アルブミンの試料で実施し２血漿アルブ
ミン（シグマ）試料で得たものと比較した。第４４図は
試験された９抗体に対して組換え体アルブミンが生アル
ブミンと同様に阻害することを示す、試験の極端な感受
性があるとすれば、観察される差異は重要ではないと思
われる。

実施例７　インターロイキン−１βの分泌に対する酵母
発現ベクターを含むカ セット Ｅ、７．１　　ＩＬ−１β構造遺伝子の合成ＩＬ−１β
に対応する構造遺伝子の化学的合成は既に記載されてお
り（ユング、Ｇｏ等、Ａｎｎ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｐａ５ｔ
ｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．第１３９巻（１９８８年
）１２９〜１４６頁）、簡単に言えば構造遺伝子をＮｄ
ｅＩ−Ｈｉｎｄｍ制限フラグメントとして１４個の合成
オリゴデオキシヌクレオチドから組み立てる。オーロン
等によって発表された配列（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、第８１巻（１９８４年）７９０７
〜７９１１頁）と比較すると本実施例で使用した合成遺
伝子は次の修飾を含む、１）Ｈｉｎｄｌ１１部位を取り
除くために４８３位のＡＧＣコドン（Ｓｅｒ）をＴＣＣ
コドンに置き換える　五）ＮｄｅＩ部位を取り除くため
に５０６位のＣにＴを置換するｉｉ）翻訳開始メチオニ
ンを含む４３５位（ＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧ）にＥｃｏ
ＲＩ部位、次にＮｄｅＩ部位を作製する桓）翻訳終結コ
ドンから直下流にＨｉ　ｎ　ｄ■部位を導入するために
８９６位にＡＡＧＣＴＴ配列を加える。

従って組換え体ＩＬ−１βをエンコードする構造遺伝子
はプラスミドｐＵｃ１９指示ＰＣＩ１３１の誘導体に含
まれるＥ　ｃ　ｏ　Ｒｌ−Ｈ１ｎｄｎＩ制限フラグメン
トとして利用できる。

Ｅ、７．２　　Ｓ、セレビシェのＰＧＫプロモーター及
びに、ラクチスのキラー毒 素分泌シグナルの制御下ＩＬ−１ βを含む分泌ベクターの構築 に、ラクチスのキラープラスミドＫｌ（スターク、Ｍ、
Ｊ、Ｒ及びボイド、Ａ、ＥＭＢＯＪ。

第５巻（１９８６年）１９５５〜２００２頁）の毒素遺
伝子の分泌シグナル（“′プレ″領域）に対応するＤＮ
Ａフラグメントを次の２つの合成オリゴデオキシヌクレ
オチドから組み立てた。

ＳｑＡ：　５’−ＡＡＴＴＡＴＧＡＡＴＡＴＡＴＴＴＴ
ＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴ
ＣＧＴＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＧ−３’ ＳｑＢ　：　５’−ＡＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＣＴＴＧＡ
ＡＣＧＡＡＴＧＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡ
ＴＧＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＴＣＡＴ−３’ これらの２つのオリゴデオキシヌクレオチドをハイブリ
ッド化し、それによってキラー毒素のシグナル配列法に
に、ラクチスのＫＥＸＩ遺伝子によって産生されるエン
ドペプチダーゼによって認識できる潜在的な切断部位を
示すジペプチドＬ　ｙｓ　Ａ　ｒｇ　（Ｔ　ａｎｇｕｙ
−Ｒｏｕｇｅａｕ、　Ｃ、等、ＦＥＢＳレターズ第２３
４巻（１９８８年）４６４〜４７０頁）を再構成した。

この配列はＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ部位と適合する付着端が側
面にある。この構築に於てシグナル配列から下流に位置
する末端だけが機能的ＥｃｏＲＩ部位を再生することが
できる。このＤＮＡフラグメントは、プラスミドＰＥＰ
ＧＫ４１の単一ＥｃｏＲＩ部位に所望の配向でクローン
されてプラスミドｐＳＰＧＫ１（第４５図）を作成する
。ＰＥＰＧＫ４１はＥｃｏＲＩ部位（第４５図で示した
配列参照）によって置き換えられたＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ
クローニング部位を除いてプラスミドｐＹＧ１２（実施
例３で既に記載した）に存在するものと一致するＳ、セ
レビシェのＰＧＫ遺伝子のプロモーターとターミネータ
−を含む５ａＱＩ−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩカセットを含む、
使用した方、策の結果としてプラスミドｐｓＰＧＫ１は
合成シグナル配列から下流に構造遺伝子のクローニング
を可能にする唯一のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩを有する。

Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ制限フラグメントの形でＩＬ−１βを
エンコードする構造遺伝子を得るためにプラスミドｐｃ
１１３１　（Ｅ、７．１項参照）を酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ｍで直線とし、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼエのフレノウ
フラグメントで処理して末端プラントエンドにし、合成
ＥｃｏＲＩリンカ−（５’　−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３’
）と連結した。酵素ＥｃｏＲＩで切断した後、Ｍｅｔ−
ＩＬ−１βに対応するフラグメントを電気溶離で精製し
、プラスミドｐｓＰＧＫ１のＥｃｏＲＩ部位にクローン
してプラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ１７　（第４６図）を
作成した。この構築では、ＩＬ−１βにコードする配列
はキラー毒素から誘導される分泌シグナルを有する翻訳
枠内で起こる。

成熟ＩＬ−１β遺伝子（ＡｌａＰｒｏＶａｌ、、、、）
の開始はペンタペプチドＬｙｓＡｒｇ　Ｉ　ｌｅＨｉｓ
Ｍｅｔによるシグナルペプチダーゼ（Ｇ　ｉｎ　Ｇ　ｌ
ｙ八）によって認識される切断部位から分離される。

プラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ１７は、発現カセット（Ｐ
ＧＫプロモーター／分泌シグナル−ＩＬ−１β／ＰＧＫ
ターミネータ−）に対応するＳ　ａ　１１　Ｉ　−Ｈｉ
　ｎ　ｄ　ｍ制限フラグメント源である。このフラグメ
ントは電気溶離で精製され、プラスミドｐｃＸＪｌ（第
９図参照）にクローンされ、同じ酵素で切断してプラス
ミドｐｓＰＧＫ−ＩＬ２１（第４７図）を作成する。プ
ラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファーマシア）は、ゲネチシン（
０４１８）に耐性の遺伝子源であり、５ａｎＩ制限フラ
グメントとして電気溶離で精製した０次いでこのフラグ
メントをプラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ２１の５ａＱＩ部
位にクローンして発現プラスミドｂｓＰＧＫ−ＩＬ３１
　（第４８図）を作成した。

Ｅ、７．３Ｓ、セレビシェのＰＨ０５プロモーターの制
御下ＩＬ−１βを含む 分泌ベクターの構築 ＰＨ０５プロモーターの重要性はこれかに、ラクチスの
誘発性発現系を表わし、Ｓ。

セレビシェに於けるようにこのプロモーターが高無機リ
ン酸塩濃度で抑制され、リン酸塩のない培地中で誘発さ
れる（チェノ、Ｘ、Ｊ、及びフクハラ、Ｈ，ジーン第３
６９巻（１９８８年）１８１〜１９２頁）という事実に
ある。

本プラスミドｐＥＰＨＯはＳ、セレビシェのＰＨ０５の
プロモーターとターミネータ−領域からなる０、９４ｋ
ｂｐの大きさのＢａｍＨＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ制限フラグメ
ントを含む。このフラグメントは　２．０３　ｋ　ｂ　
ＰＢ　ａ　ｍ　ＨＩ　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉゲノムフラグメ
ント（Ｂａｊｗａ、Ｗ、等、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒ
ｅｓ、第１２巻（１９８４年）７７２１〜７７３９頁）
から誘導され、酸ホスファターゼをエンコードする構造
遺伝子が一４位（翻訳開始ＡＴＧに関して）と翻訳終結
ＴＡＧコドンから上流に局在する単一５ａｕ３Ａ部位と
の間で欠失されている。プロモーターとそのターミネー
タ−間の結合にＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩポリ
リンカーが挿入され、翻訳開始コドンを含む構造遺伝子
を導入させることができる。

Ｋ、ラクチスキラープラスミドＫｌ　（Ｅ。

７．２項参照）の毒素遺伝子の分泌シグナルに対応する
ＥｃｏＲＩフラグメントはプラスミドｐＥＰＨｏのＥｃ
ｏＲＩに所望の配向にクローンされてプラスミド（第４
９図）を作成する。　Ｍｅｔ　−Ｉ　Ｌ−１βに対応す
るＥｃｏＲＩ制限フラグメントはプラスミドｐＳＰＧＫ
−ＩＬ１７　（第４６図）から精製され、プラスミドｐ
ＳＰＨＯ４のＥｃｏＲＩ部位にクローンされてプラスミ
ドｐｓＰＨｏ−ＩＬ１４（第５０図）を作成する。この
プラスミドは発現カセット（ＰＨＯ５プロモーター／分
泌シグナルーＩＬ、−１β／ＰＨ０５ターミネータ−）
に対応するＳ　ａ　Ｑ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍ制限フ
ラグメント源であり、このフラグメントは電気溶離で精
製され、同じ酵素で切断されるプラスミドｐＣＸＪＩに
クローンされてプラスミドｐｓＰＨｏ−ＩＬ２３（第５
１　図）全作成する。ゲネチシン（０４１８）に耐性の
遺伝子を含む５ａｆｌＩ制限フラグメントはプラスミド
ｐＵＣ４Ｋから電気溶離で精製され、次にプラスミドｐ
ＳＰＨ〇−ＩＬ２３のＳａＱ　Ｉ部位にクローンして発
現プラスミドｐｓＰＨ０−ＩＬ３５　（第５２図）を作
成した。

Ｅ、７．４　　選択増殖条件下ＩＬ−１β発現ｐＫＤｌ
由来プラスミドの分裂室 定性 プラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ３１及び ｐｓＰＨｏ−ＩＬ３５の分裂安定性は時間をおいて行な
われ、非選択培地中で規定された発生数増殖させた後、
最小選択培地（ウラシルで補足されていない）での増殖
能を保持する細胞の％として定義した。第５３図に示さ
れる通り、これらの２つのプラスミドは著しく安定であ
るが、ＰＨ０５プロモーターを含む構築と比較されるＰ
ＧＫプロモーターを用いる構築間に異なった安定性があ
り、非選択培地で４０個の細胞発生後、７５％（プロモ
ーター誘発）〜９３％（プロモーター誘発しない）の細
胞はプラスミドｐｓＰＨｏ−ＩＬ３５を維持するが、プ
ラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ３１はわずか４４％の細胞で
保持される。

これらの結果は、プラスミドｐＫＤ１由来発現ベクター
の工業利用の見地から潜在的毒性異種タンパク質の生産
相からの酵母培養の増殖相をカップリングしない誘発性
発現系の重要性を示す。

Ｅ、７．５ＩＬ−１βの分泌 構築ｐＳＰＧＫ−ＩＬ３１とｐＳＰＨＯ−ＩＬ３５を既
に記載した手法に従ってに、ラクチス菌株ＭＷ９８−８
Ｃに移入した。ウラシルを欠く最小培地で形質転換体を
選択した後、わずかのクローンを０４１８　２００ｇｇ
／　ｍ　Ｑを含むＹＰＤ培地に接種し、ＩＬ−１βの分
泌能を研究した。

分泌されたＩＬ−１βを沈降させるために培養上清の試
料をエタノールで処理した（最終濃度６０％で一２０℃
に於て６０分）、沈降物質を遠心分離（１５，０００ｇ
で２０分）で回収し、ｙＫ容量の１／１０　に９５℃で
１５゛分間加熱して試料緩衝液ｃレムリ、Ｕ、Ｋ。

ネイチュア第２２７巻（１９７０年）６８０〜６８５頁
）に再溶解した後、１２．５％ポリアクリルアミドゲル
に析出させた。試料を電気泳動にかけた後、製造業者（
ボーリンガーマンハイム）の指示に従ってエンドグリコ
シダーゼＨで試料を前処理して又はせずにゲルをニトロ
セルロース膜にプロットし、ヒトＩＬ−４β（ゲンチー
ム）に対するポリクローナル抗体を用いた後にクーマシ
ーブルーで染色したゲルを変性（第５４図）して、ある
いは免疫学的に検出した。

ＩＬ−１βに相当する構築で形質転換した酵母の上清か
ら得た免疫学的シグナルはエンドグリコシダーゼＨでの
処理に感受性であり（見掛けの分子量２４ｋＤ〜１９ｋ
Ｄに減少）、酵母の組換え体ＩＬ−１βがグリコジル化
されることを示す。この結果は、ＩＬ−１βのＮ末端部
分の潜在的なＮ−グリコジル化部位の存在と一致する（
７位のＡＳｎ）＋＋プラスミドＰＳＰＨＯ−ＩＬ３５で
形質転換され、無機リン酸塩のない培地中三角フラスコ
で増殖したに、ラクチスＭＷ９８−８Ｃの培養上清２ｍ
Ｑ（チェノ、Ｘ、Ｊ、及びフクハラ、Ｈ，ジーン第３６
９巻（１９８８年）１８１〜１９２頁）を分泌されたＩ
Ｌ−１βを精製するために逆相カラムに直接適用した。

３５％のアセトニトリルに対応する溶出ピークを集め、
これは組換え体インターロイキンに相当する。この手法
で精製した物質量を分光光度法で定量し、ＩＬ−１βが
培養上清１悲につき３５ｍｇのレベルでに、ラクチスに
よって分泌されることを推定した。

精製ＩＬ−１β（自動操作エドマン分解アプライドバイ
オシステム）のＮ末端部分の配列化はキラー毒素の″プ
レ″領域が全く存在しないこと従って酵母シグナルペプ
チダーゼ（スターク、Ｍ、Ｊ、Ｒ，及びボイド、Ａ。

ＥＭＢＯＪ、第５巻（１９８６年）１９５５〜２００２
頁）によって認識されるＧΩｎＧＱｙ△切断部位に於て
に、ラクチス菌株ＭＷ９８−８０による有効な成熟を示
す、プラスミドｐＳＰＨＯ−ＩＬ３５に存在するＩＬ−
１β発現カセットの構築で使用した手順の結果として組
換え体ＩＬ−１βのＮ末端は成熟ヒトＩＬ−１βと一致
されず、マイクロ配列化（ＬｙｓＡｒｇＩＱｅＨｉｓＭ
ｅｔＡＱａＰｒ。

ＶａＱＡｒｇＳｅｒＬｅｕ）によって決定された最初の
１１残基の配列は成熟ヒトＩＬ−１βに対応する配列か
ら上流に更にいくつかのアミノ酸（ＬｙｓＡｒｇ　Ｉ　
Ｑ　ｅＨｉｓＭｅｔ）の存在を確認し、特にに、ラクチ
スの酸素ＫＥＸＩ（ＬｙｓＡｒｇ八）による切断の潜在
的部位がこの配列関係に認識されないことを示す、従っ
てキラー毒素に対する分泌シグナルと成熟ＩＬ−１βに
対する構造遺伝子（ＧＱｎＧＱｙΔＡ　Ｑ　ａ　Ｐ　ｒ
　ｏ　Ｖ　ａ　Ｑ　）間の正しい結合の部位指示突然変
異生成による作製は、正しく成熟分泌したＩＬ−１βを
得ることができる。

実施例８　　ｔＰＡの発現分泌に対して酵母発現ベクタ
ーを含むカセット Ｅ、８．Ｉ　　Ｓ、セレビシェのＰＧＫプロモーターの
制御下Ｍｅｔ−ｔＰＡ発現 及びプレプロ−ｔＰＡ分泌のため のベクターの構築 ｔＰＡをエンコードする構造遺伝子をプラスミドｐＸＬ
３４８　（Ｍｅｔ　　ｔＰＡ）及びＰＸＬ４５９　（プ
レプロ−ｔＰＡ）がら分離しくサーミエントス、Ｐ０等
、バイオテクノロジー第７巻（１９８９年）４９５〜５
０１頁）、その制限地図を第５５図に示す。

プラスミドｐＸＬ３４８（Ｍｅｔ−ｔＰＡ）、プラスミ
ドｐＹ　Ｇ　２２４　　Ａ／Ｂ　（Ｍｅｔ−ｔＰ　Ａ）
及びｐＹＧ２２５　　Ａ／Ｂ（プレプローｔＰＡ）は次
の図に従って誘導される。

（Ｍｅｔ−ｔｐＡ） （プレプロ−ｔＰＡ） プラスミドｐＸＬ３４８を酵素ＸｈｏＩ［で消化し、制
限混合物をリン酸化Ｘｈｏ　ｎ　−Ｈｌｎ　ｄ■アダプ
ター（合成オリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＧＡＴ
ＣＡＡＧＣＴＴ−３’　）と連結する６次いで混合物を
酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　ｍで消化し、Ｍｅｔ−ｔＰＡをエン
コードする制限フラグメントをベクターｐＵＣ８のＨｉ
ｎｄ■にクローンして中間体プラスミドｐＹＧ２０５を
作成する。このプラスミドを酵素ＮｄｅＩで切断し、リ
ン酸化合成オリゴデオキシヌクレオチド５’　−ＴＡＡ
ＧＣＴＴＣＡ−３′及び５’　−ＴＡＴＧＡＡＧＣＴ−
３’の等モル混合物と連結してＮｄｅ　Ｉ　−Ｈｉｎ　
ｄｍ−ＮｄｅＩアダプターを再構成する。試験管内で連
結した後、この混合物をＨｉｎｄｌｌ［で消化し、Ｍ　
ｅ　ｔ　−ｔ　Ｐ　Ａをエンコードする制限フラグメン
トを電気溶離で精製し、ベクターｐＹＧ２０６のＨｉ　
ｎ　ｄ　ｍ部位にクローンしてプラスミドＰＹＧ２１１
を作成する。

ベクターｐＹＧ２０６は、唯一のＮ　ｄ　ｅ　Ｉ部位が
酵素ＮｄｅＩとベクターの自己連結の前の大腸菌ポリメ
ラーゼエのフレノウフラグメントによる付着端の充填で
破壊されているプラスミドｐｔｒｃｓに相当し、従って
プラスミドｐＹＧ２１１はＭｅｔ　　ｔＰＡのＡＴＧ開
始コドンに位置する唯一のＮｄｅＩ制限部位があるＭｅ
ｔ−ｔＰＡをエンコードするＨｉｎｄ■フラグメントを
含む。プラスミドｐＹＧ２１１中では翻訳開始コドンか
ら上流のヌクレオチド配列は次の通りである。５’　Ａ
ＡＧＣＴＴＣＡＴＡＴＧ、、、３’ プラスミドｐＹＧ２１１はプラスミドｐＹＧ２１９源で
あり、プレプロ−ｔＰＡをエンコードするＨｉｎｄｌｌ
ｌフラグメントを含む、このプラスミドはｐＹＧ２１１
のＮｄｅ　ｌ−８ｓｔＩフラグメントをプラスミドＰＸ
Ｌ４５９のＮｄｅＩ−８ｓｔＩフラグメントで置換する
ことによって構築され、プレプロ−ｔＰＡのＮ末端部分
を含む（第５５図）、従ってプラスミドｐＹＧ２１１（
Ｍｅｔ−ｔＰＡ）とＰＹＧ２１９（プレプロ−ｔＰＡ）
はプラスミドｐＹＧ２１１が開始コドンに直接付随した
ｔＰＡの成熟型をエンコードする違いを除いて厳密には
同遺伝子型であるが、プラスミドＰＹＧ２１９では成熟
ｔＰＡ配列はそのプレプロ天然エクスポーション配列に
付随している。

Ｍｅｔ　　ｔＰＡ及びプレプロｔＰＡをエンコードする
Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントを電気溶離でプラスミ
ドｐＹＧ２１１とｐＹＧ２１９から精製し、同じ制限酵
素で切断されるベクターｐＹ０２０８（第１９Ａ図参照
）に正しい配向でクローンし、中間体プラスミドｐＹＧ
２２２とｐＹＧ２２３を作成する。これらのプラスミド
は５ａＱＩ制限フラグメントとして利用される発現カセ
ットを含み、次いでベクターｐＫａｎ７０７にクローン
されてプラスミドｐＹＧ２２４　　Ａ／Ｂ（Ｍｅｔ−ｔ
ＰＡ）とｐＹＧ２２５　Ａ／Ｂ　（プレプロ−ｔＰＡ）
を作成する。このベクターに関して５ａＮＩカセツトの
Ａ及びＢ配向は上記の通りプラスミドＰＹＧ２２１　Ａ
／Ｂ（プレプロ−Ｈ８Ａ）に対して規定された。

Ｅ、８．２　　ｔＰＡの分泌 構築物ｐＹＧ２２４　Ａ／Ｂ（Ｍｅｔ−ｔＰＡ）及びｐ
ＹＧ２２５　　Ａ／Ｂ（プレプロ−ｔＰＡ）を特にＥ、
４．１項で記載した手法に従ってに、ラクチス菌株ＭＷ
９８−８Ｃに移入した。

０４１８の存在下で細胞を選択した後、いくつかのクロ
ーンを選択ＹＰＤ培地に接種し、ｔＰＡの発現分泌能を
次の手法（ｉ）クーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル（ｉｉ）ゲルをニトロセルロース膜にプロ
ットし、製造業者の指示（ボーリンガーマンハイム）に
従って使用した脱グリコジル化酵素エンドグリコシダー
ゼＨ又はグリコペプチダーゼＦで細胞画分を前処理した
又はしないヒトｔＰＡに関する一次抗体（バイオプール
）を使用した後、免疫学的検出（ｎｉ）ＰＢＳ緩衝液に
溶解した次の組成１％アガロース、０．１％フィブリノ
ーゲン（カビビトルム）、０．２単位／ｍΩトロンビン
（シグマ）を有する指示プレートによるフィブリンプレ
ートアッセイに従って研究した。

これらの実験結果は、未処理培養上清（構築物ｐＹ０２
２５Ｂ）又は細胞抽出物に特異免疫学的シグナルが検出
されないことを示す。

構築物ｐＹＧ２２４　Ａ／Ｂ　（Ｍｅｔ−ｔＰＡ）は細
胞抽出物、特に不溶性タンパク質に相当する両分にかな
りの特異シグナル（１〜１０ｍｇ／培養液ＩＱ）を生じ
るためこの検出方法は異議はない。

脱グリコジル化酵素の使用はＳ、セレビシェのＰＧＫプ
ロモーターの制御下に、ラクチスによって発現分泌され
るプレプロ−ｔＰＡの免疫学的検出に必要条件のように
思われる。

この説明は、このプロモーターの制御下でこの菌株で発
現される場合、このタンパク質の不均一な過グリコジル
化によって説明することができる。特にこの過グリコジ
ル化は、ＰＧＫプロモーターから発現される酵母組換え
体ｔＰＡの弱い抗原性の原因であることができる。

第５６図は、プラスミドＰＹＧ２２５Ｂ（プレプロ−ｔ
ＰＡ）で形質転換されたに、ラクチスＭＷ９Ｂ−８Ｃの
培養上清に酵素活性があることを示すが、プラスミドｐ
Ｋａｎ７０７（対照ベクター）又はｐＹ０２２４Ｂ（Ｍ
ａｔ−ｔＰＡ）で形質転換された菌株ＭＷ９８−８Ｃの
培養上清に存在しない、従って分泌ｔＰＡ活性の検出は
ｔＰＡのプレプロ配列かに、ラクチスＭＷ９８−８Ｇ酵
母で機能することを示す、また指示プレートによるｔＰ
Ａ活性の試験は、構築物Ｍ　ａ　ｔ　−ｔ　Ｐ　Ａで形
質転換された菌株ＭＷ９８−８Ｃの細胞内画分に活性化
があることを示す（結果は示されない）。

Ｅ、８．３　　ｔＰＡ分泌に関する宿主菌株の影響 宿主細胞の選択は、プラスミドｐＫａ　ｎ７０７の誘導
体を複製することができる酵母によるｔＰＡ分泌レベル
に関して基本的要素である。クルイベロミセス属酵母に
よるベクターｐＫａｎ７０７にクローンしたｔＰＡの分
泌能をフィブリノーゲン寒天指示プレートにより上述の
通り試験した。に、ラクチス菌株ＡＴＣＣ３４６０９及
びＡＴＣＣ３４６１０゜ＡＴＣＣ３６９０６（Ｋ、ドロ
ソフィラルム）及びに、フラギリスＡＴＣＣ３６５３４
及びＡＴＣＣ３６９０７はに、ラクチス菌株ＭＷ９８−
８Ｃのそれと同じ程度のｔＰＡ分泌に有効であるが、同
じ条件下で菌株ＡＴＣＣ１２４２４（Ｋ、フラギリス）
、ＡＴＣＣ２４１７８（Ｋ、ウィッカーハミイ）及びＡ
ＴＣＣ５６５００（Ｋ、ワルチ）で実施した試験は、ｔ
ＰＡ活性を培養上清に検出することができなかった。

実施例９　　ＴＩＭＰの発現分泌に対する酵母発現ベク
ター含有カセット Ｅ、９．ＩＳ、セレビシェのＰＧＫプロモーターの制御
下ＴＩＭＰの発現分泌 に対するベクターの構築 ＴＩＭＰをエンコードする完全構造遺伝子をプラスミド
ｐＰＶ２−ＴＩＭＰから分離した。このベクターはＨｉ
ｎｄｌｌｌ制限フラグメント（カクレゾレック９Ｍ０等
、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ。

第５巻（１９８７年）５９５〜５９８頁）として利用で
きるＴＩＭＰｃＤＮＡからなる。

この制限フラグメントを電気溶離で精製し、構築中間体
ｐＹ０２０８　（第１９Ａ図）のＨｉｎｄｎｌに正しい
配向でクローンしてプラスミドｐＹＧ２２０を作成した
。このプラスミドは発現カセット（ＰＧＫプロモーター
／ＴＩＭＰ／ＰＧＫターミネータ−）に相当する５ａＱ
Ｉフラグメント源であり、ベクターｐＫａｎ７０７　（
第１３図参照）の５ａＱ１部位にクローンし、ベクター
に関してこの５ａｆｌＩフラグメントの配向だけが互い
に異なる発現プラスミドｐＹＧ２２６Ａ／Ｂを作成した
。プラスミドＰＹＧ２２６Ａ／ＢのＡ及びＢ配向を上述
の通りプラスミドｐＹＧ２２１Ａ／Ｂ（プレプロ−Ｈ３
Ａ）、ｐＹＧ２２４Ａ／Ｂ　（Ｍｅｔ−ｔＰＡ）及びｐ
ＹＧ２２５Ａ／’Ｂ（プレプロ−ｔＰＡ）に対して規定
した。

Ｅ、９，２　　ＴＩＭＰの分泌 構築物ｐＹＧ２２６Ａ／Ｂ　（ＴＩＭＰ）を既に記載し
た手法に従ってに、ラクチス菌株ＭＷ９８−８Ｇに移入
した。０４１Ｂの存在下細胞を選択した後、２．３　の
クローンをＹＰＤ選択培地に接種し、ＴＩＭＰの発現分
泌能をクーマシーブルー染色ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲルであるいはゲルをニトロセルロース膜にプロットし
、細胞画分をエンドグリコシダーゼＨで前処理して又は
せずにヒトＴＩＭＰに関する一次抗体（Ｒｈａｎａ−Ｐ
ｏｕｌｅｎｃＳａｎｔ６）を用いた後、免疫学的検出に
よって研究した。

ＴＩＭＰに対応する免疫学的シグナルは非脱グリコジル
化細胞内抽出液（不溶性タンパク質画分）で検出される
が、（非脱グリコジル化培養上清には検出されない（第
５７図）。

この免疫学的シグナルは脱グリコジル化酵素での処理に
感受性であり、酵母組換え体ＴＩＭＰがＮ−グリコジル
化されることを示す０組換え体ＴＩＭＰの分泌は、プラ
スミドｐＹ０２２６Ｂで形質転換された菌株ＭＷ９８−
８Ｃの培養上清を試験管内税グリコジル化した後証明さ
れ、ＴＩＭＰの天然エキスポーテーシヨン配列かに、ラ
クチスＭＷ９８−８Ｃで機能することを示す。

注 菌株ＭＷ９８−８Ｃの試料は、１９８８年９月１６日に
第ＣＢＳ　　５７９．８８号として登録されたブタベス
ト条約の規定に従ってオランダバーンのＣａｎｔｒａａ
ｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒＳｃｈｉａ＋ｍａｌｋｕｌｔ
ｕｒｅｎ　（ＣＢ　Ｓ　）に寄託されている。

【図面の簡単な説明】

図面に示されるプラスミドの図形は拡大して描いたもの
ではなく構築に重要な制限部位のみを示すものである。 第１図　ヒト肝臓から分離したポリ（Ａ）−ｍＲＮＡか
ら誘導される３種ｃＤＮＡ クローン（テキスト参照）から得ら れたＭｅｔ−Ｈ３Ａをエンコードす る完全配列を含むプラスミドｐＸＬ ２７６の構築。 ４種の合成オリゴデオキシヌクレオ チドからアルブミンのプレプロ配列 の再構成プラスミドｐＸＬ２９０の 構築。 プラスミドｐＸＬ２９９の構築。 プラスミドｐＸＬ３２２の構築。 プラスミドｐＸＬ８５５の構築。 プラスミドｐＸＬ８６９の構築。 プラスミドｐＸＬ８６９から誘導さ れ、プレプロ−Ｈ３Ａ構造遺伝子を 含むＨｉ　ｎ　ｄ　ｍフラグメントのヌクレオチド及び
アミノ酸配列。濃い矢 印はパプレ″及び″゛プロ″領域末 筆３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第２図 端を示す。 第８図　プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３の構築。 第９図　プラスミドＰＣＸＪＩの構築。 第１Ｏ図　プラスミドｐＫ１−ＰＳ１５３５−６の構築
。 第１１図　プラスミドｐＵＣ−Ｋａｎ２０２の構築。 第１２図　５ｃａＩ制限部位からプラスミドに１の０Ｒ
ＦＩプロモーター及び０ＲＦ １とＴｎ９０３由来のアミノグリコ シドホスホトランスフェラーゼをエ ンコードする細菌遺伝子の５′領域 との間の結合を含むヌクレオチド配 列・ 第１３図　プラスミドｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７の構築。 第１４図　非選択生育条件下菌株ＭＷ９８−８０のプラ
スミドｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７の安定性曲線。 第１５図　プラスミドｐＹＧ１１の構築。 第１６図　プラスミドｐＹＧ１８のＷ築。 第１７図　プラスミドｐＹＧ１９の構築。 第１８図　プラスミドｐＹＧ１９（プレプロ−Ｈ８Ａ）
及びｐＹＧ２３　（Ｍｅｔ− Ｈ８Ａ）の例示、各プラスミドの下 にあるヌクレオチド配列はＰＧＫ遺 伝子プロモーターと異なった形の Ｈ８Ａの構造遺伝子と間の結合であ る。 第１９図　プラスミドｐＹＧ２０８．ｐＹＧ２１０（パ
ネルＡ）及びｐＹ０２２１ Ｂ（パネルＢ）の構築。 第２０図　プラスミドｐＹＧ１４．ｐＹＧ２６及びｐＹ
Ｇ２９の構築。 第２１図　Ａ、ＵＡＳ領域の側面にあるＮｏｔ工部工部
基入するためにＳ、セレビ シェのＰＧＫプロモーターの突然変 異生成０部位指示突然変異生成によ って変化する４つの塩基対はＮｏｔ １部位の下に星印で示される。 Ｂ、　構築物ｐＹＧ１９及びｐＹＧ 第２２図 第２３図 ４４の非翻訳ＰＧＫリーダー配列。 部位指示突然変異生成によって野生 型ＰＧＫプロモーターの一２５領域 に導入されるＨｉｎｄｍは、わくで 示される。 Ｋ、ラクチスのＬＡＣ４プロモータ ーのＵＡＳを含む合成りＮＡフラグ メントによるＵＡＳ、、にの置換及び 合成アダプターを突然変異ＰＧＫプ ロモーターに連結することによる ＰＧＫ野生型ＡＴＧ関係の再構成。 種々のプロモーター及びＨ３Ａを増 殖培地に分泌することを指示する ｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７由来プラスミドに存＼ 在するシグナル配列を有する５ａＱ Ｉ−８ａｃＩ発現カセット。 第２４図　−２０位にＨｉｎｄｍ部位を導入するための
Ｓ、セレビシェのＰＨ０５ プロモーターの部位指示突然変異生 成。 第２５図 第２６図 第２７図 第２８図 構築ｐＹＧ５１のＡＴＧイニシエー ターコドン近くのプロモーター領域 のヌクレオチド配列 ＰＧＫプロモーターの５′非翻訳リ 一ダー配列を含む合成Ｈｉｎｄｍ− ＤｒａＩ　　ＤＮＡフラグメント、Ｋ。 ラクチス（プレ領域）のキラー毒素 のシグナル配列及びプローＨ３Ａ遺 伝子の最初の数コドンの再構成、プ ラスミドＰＹＧ５６の構築。 プラスミドｐ３１／ＲＡＧ２　：　ＵＲＡ３、ｐＹＧ６
０−５及びｐＹＧ６０ −２１の図示。 非選択生育条件下プラスミドｐＹＧ １９及びｐＹＧ２３を表現するＨＳＡ の分裂安定性、■プラスミドｐＹＧ １９で形質転換された菌株ＭＷ９８ −８Ｃ、ロブラスミドｐＹＧ２３で 形質転換された菌株ＭＷ９Ｂ−８Ｃ１ ΔプラスミドｐＹＧ１９で形質転換 された菌株ＣＢ　５６８３゜ 第２９図　菌株ＭＷ９８−８ＣからのＨＳＡの発現及び
排泄を示すクーマン−ブル ー染色後の８．５％５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル。レーン１〜４： ヒト血漿（シグマ）から抽出した比 較アルブミンは増加濃度ｐＹＧ１９ 、（プレプロ−Ｈ８Ａ）、ｐＹＧ２３ （Ｍｅｔ−Ｈ３Ａ）及びｐＹＧ２５ （発現カセットのない対照ベクター） ル−ン当り０．２μｇ、０．６μｇ。 ２μｇ及び６μｇでスポットした。 各レーンは原培養液１００μＱに等 価のタンパク質量に対応する。ａ） 可溶性画分、ｂ）不溶性画分、Ｃ） 培養上清 第３０図　テキストに記載される通りニトロセルロース
にプロットした７、５％ポ リアクリルアミドゲルのイムノブロ ッティング。レーン１〜５：記載さ ねるように種々の濃度でＹＰＤ培地 に溶解しＴＣＡ　（５％最終濃度）で 沈降させたヒト血漿（シグマ）で抽出 した比較アルブミン、従ってＨ８Ａ 標準の試料は培養上清と同じ方法で 処理した１両方の場合とも、ゲルス ポットは等価容量に対応する。１） ＨＳＡ１００ｍｇ／ｐＹＧ１９　（プ レプロ−ＨＳＡ）及びｐＹＧ２３ （Ｍｅ　ｔ　−ＨＳ　Ａ）　ル−ン、２）５０ｍｇ／レ
ーン、３）２５ｍｇ／レー ン、４）１２．５ｍｇ／レーン、５） ６ｍｇ／レーンの濃度で沈降実験。 各レーンは原培養２０μａに等価な タンパク質量に対応する。ａ）培養 上清ｂ）不溶性画分Ｃ）可溶性画 分。 第３１図　菌株ＭＷ９８−８ＧからのＨＳＡの排泄速度
論を示すクーフシ−プル染 色後の８．５％ポリアクリルアミド ゲル。 Ａ、レーンミーミニ記載した通り種々 の濃度でＹＰＤ培地に溶解し、ＴＣ Ａ（最終濃度５％）で沈降させた比 較Ｈ８Ａ　（シグマ）（第２１図の説明文参照）、指示
された培養年令１６ 〜６１時間の作用として　１）ＨＳＡ （シグマ）濃度６　ｍ　ｇ　／　ｐ　Ｙ　Ｇ　１９ｐＹ
ｇ１９　ＨＳＡの介在分泌ル− ン、２）１２．５ｍｇ／Ｊ、３）２５ｍｇ／Ｑ、４　）
　５０　ｍ　ｇ　／　Ｑ　、　５　）　１００ｍ　ｇ　
／　ｎ　、各試料は培養上清１６０μ悲の等価量に対応
する。 Ｂ、レーンａ−ｅ：指示された培養 １６〜６１時間の年令作用として ｐＹＧ１９．ｐＹＧ１９−ＨＳＡの介 在介泌ル−ン当り増加濃度０．４ μｇ　ｅ　Ｏ−６μｇ、０．８ｐｇ、１．０μｇ及び１
．２μｇでスポットした比 較）ＩＳＡ　（シグマ）、各試料は、培養上清２５μΩ
の等価量に対応する。 第３２Ｉ％　Ａ　、プラスミドｐＹＧ１９で形質転換さ
れ、テキストに記載される通り三 角フラスコで増殖させた菌株ＭＷ ９８−８ＣからのＨＳＡの排泄の速 度論のグラフ表示、増殖培地で検出 したアルブミン濃度（ｍｇ／Ｊ）を 培養年令の作用（時間）として示す。 ４種の独立した実験の結果を示す。 Ｂ、プラスミドｐＹＧ１９で形質転換 した菌株ＭＷ９８−８Ｃの増殖曲線。 第３３図　ＰＧＫ又はＰＧＫ／ＬＡＣ４ハイブリッドプ
ロモーターの制御下アルブ ミン分泌効率に関する炭素源効果、 プラスミドｐＹＧ１９及びｐＹＧ ４４で形質転換したに、ラクチス菌 株ＭＷ９８−８Ｃのクーマシーブル ーで染色した培養上清の５Ｏ８− ＰＡＧＥ解析。 Ａ、ＹＰＤ　（２％グルコースを含む）（レーン１〜３
）あるいは４３時間生 育させた後に２％ラクトースを加え たＹＰＤ培地（レーン４〜６）で ２１１時間生育させた振盪フラスコ 培養からの上清、レーンａ及びｂ： Ｈ３Ａシグマ各々０．５及び１．０μｇ、レーン１及び
４プラスミドｐＹＧ ４４−５、レーン２及び５プラスミ ドｐＧＹ４４−７、レーン３及び６ プラスミドｐＹＧ１９゜ Ｂ、ＹＰＤ　（２％グルコースを含む）（レーン１，４
及び７）、ＹＰＬ　（２％ラクトースを含む）（レーン
３゜ ６及び９）あるいは２％ラクトース を４３時間生育させた後に加えた ＹＰＤ培地（レーン２，５及び８） で１１３時間生育させた振盪フラス コ培養からの上清（ル−ン当り ２５μり、レーンａ、ｂ及びＣ： Ｈ３Ａシグマ各＋０．２５，０．５及 び１．０μｇ、レーン１〜３ニブラ スミドｐＹ０４４〜５、レーン４〜 ６：プラスミドｐＹＧ１９．レーン ７〜９：発現カセットのないプラス ミドｐ　Ｋ　ａ　ｎ　７０７　ｍ 第３４図　アルブミン分泌の効率に関するプロモーター
及びシグナル配列置換の効 果、プラスミドｐＹＧ５１．ｐＹＧ １９及びｐＹＧ５８で形質転換され たに、ラクチス菌株ＭＷ９Ｂ−８Ｃ のクーマシーブルーで染色した培養 上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 Ａ、２％ラクトースを４３時間生育さ せた後に加えたＹＰＤ培地中で１１５ 時間生育させた振盪フラスコ培養か らの上清（ル−ン当り２５μａ）。 レーンａ、ｂ及びｃ：ＨｓＡジクマ 各々０．２，０．５及び１．０μｇ、 レーン１ニブラスミドｐＹＧ５１ （ＰＨＯ５プロモーター）、　レーン ２ニブラスミドｐＹＧ　（ＰＧＫプロ モーター）。 Ｂ、ＹＰＤ培地中で６６時間（レーン １〜３）又は１３８時間（レーン４ 〜６）生育させた振盪フラスコ培養 からの上清。レーンａ、ｂ及びＣ： Ｈ８Ａシグマ各々０．２５，０．５及 び１．０μｇ、レーン１．２．４及び ５ニブラスミドｐＹ０５８　（キラー 毒素分泌シグナル２種の独立した形 質転換細胞）、レーン３及び６：プ ラスミドｐＹＧ１９　（アルブミン分 泌シグナル）。 第３５図　ＬａＯ２又はＰＧＫプロモーターの制御下ア
ルブミン分泌の効率に関す る炭素源の効果、プラスミドｐＹＧ ４０４及びｐＹＧ１９で形質転換し たに、ラクチス菌株ＣＢ５２３５９ のクーマシーブルーで染色した培 養上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ解析。 第３６図 ＹＰＤ（２％グルコースを含む）（レ ーン１及び４）　、ＹＰＬ　（２％ラクトースを含む）
（レーン３及び６） あるいは２％ラクトースを４８時間 生育させた後に加えたＹＰＤ培地 （レーン２及び５）で１６６時間生育 させた振盪フラスコ培養からの上清 （ル−ン当り２５μＱ）、レーン ａ、ｂ及びｃ　：　Ｈ３Ａシグマ各々 ０．２５，０．５及び１．０μｇ、レ ーン１〜３ニブラスミドｐＹＧ４０４、レーン４〜６：
プラスミドｐＹＧ １９゜ プラスミドベースに対して組込まれ たＰＧＫ発現カセットの制御下での アルブミン分泌の効率、に、ラクチ ス組込み菌株ＭＷ９８−８　Ｇ：：６０−５及びＭＷ９
８−８Ｃ：：６０− ２１及びプラスミドｐＹＧ１９で形 質転換された菌株ＭＷ９８−８Ｃの 培養上澄の５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びイ ムノプロット解析、上清（ル−ン 当り２５μＱ）をＹＰＤで１３７時 間生育させた振盪フラスコ培養から 取った。 Ａ、ＰＡＧＥ−８ＤＳ：レーンａ、ｂ。 Ｃ及びｄ：Ｈ３Ａシグマ各々ｏ、１゜ ０．２５，０．５及び１．０μｇ、レーン１ニブラスミ
ドｐＹＧ１９で形質 転換した菌株ＭＷ９８−８Ｃ，Ｌ／− ン２〜７：６個の非依存性組込み菌 株（各々ＭＷ９８−８Ｃ：：６０−５ ＃６．ＭＷ９８−８Ｃ：：６０−２１ ＃９、ＭＷＱ８−８Ｇ＝：６０−２１ ＃７．ＭＷ９８−８Ｃ：：６０−５＃ ４、ＭＷ９８−８Ｃ：：６０−５＃８、ＭＷ９８−８Ｇ
＝＝６０−２１８１１、Ｅ、３．７章参照） Ｂ、ウェスターンプロット解析二Ａで 示したと同じ試料（ル−ン当り析 第３７図 出した上滑２５μａ） プラスミドＰＹＧ１９及びｐＹＧ ２２１Ｂで形質転換した種々のクル イベロミセス菌株のアルブミン分泌 効率。クーマシーブルーで染色した 濃縮培養上清の５ＤＳ−ＰＡＧＥ解 析。細胞を０４１８　（２００μｇ／ ｍＱ）で補足したＹＰＤ培地で８９ 時間生育した。上清をセントリコン ３０マイクロフイルトレージヨン単 位（アミコン）を用いて１０倍に濃 縮した。ル−ン当り析出した濃縮 上清量をバイオマス生産機能として 標定し、９〜２５μＱに変化する。 レーンａ及びｂ：Ｈ３Ａシグマ０．５ 及び１．０μｇ、レーンＣ及びｄ：マ イクロフィルトレージョンにかけた ＨＳＡシグマ。ＹＰＤ培地のＨＳＡ 溶液をマイクロフィルトレージョン で１０倍に濃縮した。濃縮基準の ２５及び２．５μρを各々レーンＣ及 びｄに析出させた。レーン１；プラ スミドｐＹ０２２１Ｂで形質転換した 菌株ＡＴＣＣ１６０４５（Ｋ、マレ キシアヌス変異株ブルガリクス）、 レーン２ニブラスミドｐＹ０２２１ Ｂで形質転換した菌株ＡＴＣＣ ２４１７８（Ｋ、ウィッカーハミイ）、レーン３ニブラ
スミドＰＹＧ１９で形 質転換したＡＴＣＣ１２４２４（Ｋ。 マルキシアヌス変異株マルキシアヌ ス）、レーン４ニブラスミドｐＹＧ １９で形質転換した菌株ＡＴＣＣ ５６５００（Ｋ、ワルチイ）、レーン ５ニブラスミドｐＹＧ２２１Ｂで形 質転換した菌株ＡＴＣＣ３６９０６ （Ｋ、マルキシアヌス変異株ドロソフ ィラルム）、レーン６：プラスミド ＰＹＧ１９で形質転換した菌株ＣＢ５ ４５７４　（Ｋ、マルキシアヌス変異 第３８図 株ラクチス）、レーン７：プラスミ ドｐ　Ｙ　Ｇ　１９で形質転換した菌株ＣＢ５６８３　
（Ｋ、マルキシアヌス 変異株ラクチス）、レーン８ニブラ スミドＰＹＧ１９で形質転換した菌 株ＭＷ９８−８　Ｃ（Ｋ、マルキシア ヌス変異株ラクチス）、レーン９ニ ブラスミドｐＫａｎ７０７　（ベクタ ーのみ）で形質転換した菌株ＭＷ ９８−８Ｃ（Ｋ、マルキシアヌス変 異株ラクチス）、レーン１０ニブラ スミドｐＹ０２２１Ｂで形質転換し た菌株ＭＷ９８−８Ｃ（Ｋ、マルキ シアヌス変異株ラクチス）。 電気泳動技術（Ｓ＝標準　Ｌ＝酵母 アルブミン） Ａ−銀塩で染色するＰＡＧＥ− ５Ｄ　Ｓ　（Ｐｈａｓｔゲル、ファーマシア、勾配８〜
２５％）Ｌ：０．０５〜 ０．２５μｇ 第３９図 第４０図 第４１図 第４２図 第４３図 Ｂ−等電点点（Ｐｈａｓｔゲル、ＰＨ ４，５〜６．０）、クーマシーブルー で染色、スポット＝１μｇ Ｃ−ＰＡＧＥ　ＳＤＳ　（７，５％）クーマシーブルー
で染色、　Ｓ＝０．２ 〜１．０μｇ、　　Ｌ＝０．２５〜２．５μ　ｇ・ イオン交換クロマトグラフィー−モ ノＱ（ファーマシア）、底部酵母 Ｈ８Ａ　４０μｇ、上部標準Ｈ８Ａ ３０μｇ。 逆相クロマトグラフィー＝ヌクレオ シルＣ４ａ）Ｉ５１準Ｈ８Ａ　ｂ）酵母Ｈ８Ａ。 トリプトファン蛍光発光スペクトル、 実線：標準Ｈ８Ａ、破線：酵母Ｈ８Ａ。 ７５℃に於ける温度安定性、実線： 標準Ｈ８Ａ、破線：酵母Ｈ８Ａ。 抗原確認に使用される種々のモノク ローナル抗体によって認識されたア 第４４図 第４５図 第４６図 第４７図 ルブミン領域 Ａ、Ｂ、Ｃ：特異性が第４３図で示 される９種のモノクローナル抗体に 関する阻害曲線（テキスト参照）、 アルブミン濃度（μｇ／ｍρ）に関 する阻害％、ロ：漂準Ｈ３Ａ、麿： 酵母ＨＳＡ。 プラスミドｐｓＰＧＫ１の構築及び 分泌シグナルとして用いられる合成 ＥｃｏＲＩフラグメントのヌクレオ チド配列の表示。またプラスミド ｐＥＰＧＫ４１のＥｃｏＲＩクロー ニング部位を取り囲むヌクレオチド 配列を示す。 プラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ１７の 構築及びシグナル配列とＭｅｔ−ＩＬ −１βとの間の結合に対応するヌク レオチド配列の表示。 プラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ２１の 構築。 第４８図　プラスミドｐＳＰＧＫ−ＩＬ３１の構築。 第４９図　プラスミドＰＳＰＨ０４の構築。 第５０図　　プラスミドｐｓＰＨｏ−ＩＬ１４（７）構
築。 第５１図　プラスミドｐｓＰＨｏ−ＩＬ２３の構築。 第５２図　プラスミドｐｓＰＨｏ−ＩＬ３５の構築。 第５３図　非選択条件下菌株ＭＷ９８−８Ｃのプラスミ
ドｐｃＸＪ１．ｐＳＰＧＫ −ＩＬ３１及びｐｓＰＨｏ−ＩＬ ３５の安定性曲線。 ■ｐＣＸＪ　１．ムｐＳＰＨ〇−ＩＬ ３５（誘発されないプロモーター）。 ΔｐｓＰＨｏ−ＩＬ３５　（誘発され るプロモーター）、口ｐＳＰＧＫ− ＩＬ３１゜ 第５４図　菌株ＭＷ９８−８Ｃ（ｉ’）ＩＬ−１β分泌
：クーマシーブルーで染色した項 第５５図 第５６図 養上滑の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析各分 析シスポット試料ラスミドｐＫａｎ ７０７（対照ベクター、レーン１）、 ｐＳＰＧＫ−ＩＬ３１　　（レーン２）又はｐｓＰＨｏ
−ＩＬ３５　（Ｌ／−ン３）で形質転換されたに、ラク
チス 菌株ＭＷ９８−８Ｃの上清０．２ ｍＱに対応する。レーン４は大腸菌 （Ｒｈ６ｎｅ−Ｐｏｕｌ、ｅｎｃ　５ａｎｔａ）で産生
されたＭｅｔ−ＩＬ−Ｌβ　１βｇに対応する。形質転
換細胞は０４１８　２００ μｇ　／　ｍ　Ｑで補足したＹＰＤ培地で３日間生育し
た。この上清をテキス トに記載される通り沈降させて濃縮 した。 プラスミドｐＸＬ３４８　（Ｍｅｔ− ｔＰＡ）及びｐＸＬ４５９　（プレプ ロしＰＡ）の制限地図 分泌ｔＰＡの活性試験。 プラスミドｐＹ０２２５Ｂ　（プレプ ロ−ｔ　ＰＡ、レーン１）、ｐＹ０ ２２４Ｂ　（Ｍｅｔ−ｔＰＡ、　レーン２）又はｐ　Ｋ
　ａ　ｎ　７０７　（ベクターレーン３）で形質転換さ
れたに、ラ クチス菌株ＭＷ９８−８Ｃの培養上 清５μ２を選択ＹＰＤ培地（０４１８ ２００μｇ／ｍＱ）で５日生育した 後ｔＰＡ活性を示すプレートにポッ トする。 第５７図　プラスミドＰＹ０２２６Ｂ又はｐＫａｎ７Ｑ
７で形質転換された菌 株ＭＷ９８−８ＣのＴＩＭＰの発現 及び分泌。 ヒトＴＩＭＰ０．２５μｇ（Ｒｈ８ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎ
ｃ　５ａｎｔ６．レーン１）、酵母組換え体ＴＩＭＰ（
プラスミドｐＹ０ ２２６Ｂ）の細胞内発現、非脱グリ コジル化（レーン２）又はエンドグ リコシダーゼＨで処理後（レーン３）、大腸菌組換え体
Ｔ　Ｉ　Ｍ　Ｐ試料（Ｐｈ８ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ　５
ａｎｔ６．レーン４）、制御ベクターｐ　Ｋ　ａ　ｎ　
７０７で形質転換された菌株ＭＷＱ８−８Ｇの細胞内画 分、非脱グリコジル化試料（レーン ５）又はエンドグリコシダーゼＨで 処理後（レーン６）、非脱グリコジル 化濃縮培養上清、プラスミドρＫａｎ ７０７（レーン７）又はｐＹ０２２６ Ｂ（レーン８）で形質転換された菌 株ＭＷ９８−８Ｇ、培養上清を濃縮 後エンドグリコシダーゼＨで処理、 プラスミドｐＫａｎ７０７　（レーン ９）又はｐＹ０２２６Ｂ　（レーン １０）で形質転換された菌株ＭＷ ９８−８Ｃ、ヒトＴＩＭＰ　　Ｏ，２５μｇ　（ＲｈＳ
ｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ　５ａｎｔ６．　　レーン１１）
。 図面の浄書（内容に変更なし） ＩＧ−１ ＦＩＧ−８ ＦＩＧ−９ 翅１し ｃａｌ ツヤモー１２　　ｐｋｌ ノ ＦＩＧ−１５ ３１七叉俗しτ）し４く平ご Ｆ１α１４ 二へ 円（ｏ５而す払 ′ＸＡ肥シダ１シイ３乙。 ）１ｉｎｄ　ｔｌｒ　−ｖｐ４Ｌ づ′口ε−タク１η４カ！ ｃ／ｍｌ ■ （ｒｎｇ／ｌ） ＩＧ−３９ 撚害乍 （％） ｉ日 ３Ｉ コ ぴＬ努５窩しぞ）位ろ曵基廷 ＩＧ−５３ ＩＧ−５４ 手続補正書 （方式） 平成２年を月７４．日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、形質転換酵母に対して選択可能な少 なくとも１種のマーカー、酵母内で発現させることがで
   きる配列の制御下ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はそ
   の変異体の１種の構造遺伝子であるＤＮＡ及び適当な場
   合には、この遺伝子によってエンコードされたタンパク
   質の増殖培地への排泄を含む発現カセットを安定に保持
   することができる酵母を生育させることを特徴とするＨ
   ＳＡ又は該変異体の微生物学的製造方法。 ２、発現カセットが酵母ゲノムに組込ま れる請求項１記載の方法。 ３、発現カセットが酵母内で機能する複 製系を含み、この酵母内で該カセットを安定に保持する
   プラスミドの一部を形成する請求項１記載の方法。 ４、酵母がサッカロミセス属及びクルベ ロミセス属から選択される請求項１、２又は３記載の１
   つの方法。 ５、酵母がクルベロミセス属から選択さ れる請求項１、２又は３記載の１つの方法。 ６、酵母がクルベロミセスマルキシアヌ スの全種から選択される請求項１１２又は３記載の１つ
   の方法。 ７、酵母がクルベロミセスマルキシアヌ ス変異株ラクチスである請求項１、２又は３記載の１つ
   の方法。 ８、酵母内で機能する複製系がクルベロ ミセスマルキシアヌス変異株ドロソフィラルムから最初
   に分離されたプラスミドｐＫＤ１の全部又は一部、サッ
   カロミセスセレビシエから分離された２μプラスミドの
   全部又は一部又はプラスミドｐＫＤ１と２μプラスミド
   から誘導された要素の組合わせである請求項３〜７記載
   の１つの方法。 ９、酵母内で機能する複製系がｐＫＤ１ 配列の全部又は一部である請求項３、６、７又は８記載
   の１つの方法。 １０、プラスミドｐＫＤ１の遺伝子Ａ、Ｂ 及びＣ プラスミドｐＫＤ１の逆方向反復 プラスミドｐＫＤ１の安定性遺伝子座 ｐＫＤ１及び酵母内で発現させることが できる配列の制御下タンパク質の構造遺 伝子をエンコードするＤＮＡを含む表現 カセットの複製起点 形質転換酵母に対して選択可能なマーカ ー 及び任意により大腸菌に対する複製起点 及び選択可能なマーカー を包含している発現プラスミドで形質転換されたクルベ
   ロミセス属の酵母を増殖培地中で培養させる指定された
   タンパク質の製造方法。 １１、発現カセット及び選択可能なマーカ ーがｐＫＤ１のＥｃｏＲ I 部位に挿入される請求項８
   〜１０記載の１つの方法。 １２、発現カセット及び選択可能なマーカ ーをｐＫＤ１のＳａｃ I 及びＭｓｔII部位又はｐＫＤ
   １のＳｐｈ I 部位によって規定された１９７ヌクレオ
   チドの領域に挿入される請求項８〜１１項の１つの方法
   。 １３、構造遺伝子を発現させることができ る配列がサッカロミセス属及びクルベロミセス属の酵母
   の遺伝子から誘導されるプロモーターから選択される請
   求項１〜１２記載の１つの方法。 １４、これらのプロモーターがサッカロミ セス属又はクルベロミセス属の酵母の解糖遺伝子から誘
   導される請求項１３記載の方法。 １５、構造遺伝子を発現させることができ る配列がホスホグリセレート（ＰＧＫ）、グリセルアル
   デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）
   、エノラーゼ（ＥＮＯ）、アルコールデヒドロゲナーゼ
   （ＡＤＨ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４）又は酸ホスファタ
   ーゼ（ＰＨＯ５）から選択される請求項１３記載の方法
   。 １６、構造遺伝子を発現させることができ る配列がホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）又は酸
   ホスファターゼ（ＰＨＯ５）をエンコードする遺伝子か
   ら選択される請求項 １３記載の方法。 １７、該タンパク質をエンコードする配列 が該タンパク質の自然Ｎ−末端リーダーから選択される
   タンパク質エキスポーテーシヨン配列に付随している請
   求項１〜１７記載の１つの方法。 １８、該タンパク質をエンコードする配列 が自然配列と異なるエキスポーテーシヨン配列に付随し
   ている請求項１〜１７記載の１つの方法。 １９、該タンパク質のエキスポーテーシヨ ンをエンコードする配列がα−フェロモン又はキラー毒
   素をエンコードする酵母遺伝子から得られた配列である
   請求項１８記載の方法。 ２０、タンパク質が インターロイキン アルブミン ｔＰＡ ＴＩＭＰ から選択される請求項１〜１９記載の１つの方法。 ２１、指定タンパク質をエンコードする配 列が I Ｌ−１β プレプロ−ＨＳＡ Ｍｅｔ−ＨＳＡ プレプロ−ｔＰＡ Ｍｅｔ−ｔＰＡ及び をエンコードする配列から選択される請求項２０記載の
   方法。 ２２、ＨＳＡを排泄させることができる配 列がアルブミンのプレプロ自然末端リーダーである請求
   項１〜１９記載の１つの方法。 ２３、形質転換酵母に対して選択可能なマ ーカーが抗生物質又は銅イオンに耐性を生じる遺伝子か
   ら選択される請求項１〜２２記載の１つの方法。 ２４、選択可能な配列がＧ４１８に耐性を 生じる遺伝子である請求項２３記載の方法。 ２５、選択可能な配列がＫ．ラクチスの線 状プラスミドＫ１のＯＲＦ１プロモーターとトランスポ
   ゾンのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼとの
   融合である請求項２４記載の方法。 ２６、選択可能なマーカーが栄養要求性を 相補する遺伝子である請求項１〜２５記載の１つの方法
   。 ２７、菌株がプラスミドｐＫＤ１、プレプ ロ−ＨＳＡ　ＤＮＡ、ホスホグリセレートキナーゼをエ
   ンコードする遺伝子の転写開始及び終結配列及びに、マ
   ルキシアヌス変異株ラクチスの線状プラスミドに１のＯ
   ＲＦ１プロモーターとＴｎ９０３の３’−アミノグリコ
   シドホスホトランスフェラーゼ遺伝子との融合配列を含
   むプラスミドで形質転換される請求項１記載の方法。 ２８、菌株がプラスミドｐＫＤ１、Ｍｅｔ −ＨＳＡ　ＤＮＡ、ホスホグリセレートキナーゼをエン
   コードする遺伝子の転写開始及び終結配列及びに、マル
   キシアヌス変異株ラクチスの線状プラスミドに１のＯＲ
   Ｆ１プロモーターとＴｎ９０３の３’−アミノグリコシ
   ドホスホトランスフェラーゼ遺伝子との融合配列を含む
   プラスミドで形質転換される請求項１記載の方法。 ２９、菌株がに、マルキシアヌス、Ｋ．ウ ィッカーハミイ、Ｋ．ワルチイ種である請求項１〜２８
   記載の１つの方法。 ３０、菌株がＫ．ブルガリクス、Ｋ．マル キシアヌス変異株ドロソフィラルム、Ｋ．マルキシアヌ
   ス変異株マルキシアヌス又はＫ．マルキシアヌス変異株
   ラクチス種である請求項２９記載の方法。 ３１、ラクトースを中央の対数および初期 定常増殖期の間で加えたグルコース含有培地で酵母を培
   養する請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。 ３２、請求項１〜３０記載の１つの方法に よって得られたときのヒト血清アルブミン。 ３３、医薬生成物による請求項３１記載の ヒト血清アルブミンの適用。