PT91381B - Processo para a preparacao microbiologica de albumina de soro humano e de outras proteinas heterologas a partir de levedura - Google Patents

Description

RHÔNE-POULENC SANTÉ

PROCESSO PARA Α PREPARAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ALBUMINA DE SORO HUMANO E DE OUTRAS PROTEÍNAS HETERÓLOGAS

A PARTIR DE LEVEDURA

A presente invenção refere-se a um método microbiológico para a preparação de albumina do soro humano (HSA) através da cultura de uma levedura, especialmente do género Kluvveromycesmodificado pela utilização de técnicas de ADN — recombinante.

A HSA é uma proteína de 585 aminoácidos com um peso molecular de 66 kilodaltrons (kd) que toma a forma de um monémero não glicosilado globular. A sua estrutura globular . é sustentada por 17 ligações de dissulfureto que criam uma série sequencial de nove aneis duplos (Brown, J.R., in Albumin Structure, Function and Uses, Rosenoer, V.M. et al. (eds.), Pergamon Press, Oxford, (1977) 27 - 51)« Sabe-se que os genes que codificam a HSA são altamente polifórficos e, identificaram-se mais de 30 variantes genéticas aparentemen te diferentes por análise electroforética em diversas condições (Weitkamp, L.R. al., Ann. Hum. Genet. 37 (1973) 219-226). 0 gene de HSA divide-se em 15 exões por l4 sequências de intrões e compreende mais do que 16,9 kilobases (kb) a partir do sítio putativo Cap até ao primeiro sítio de adi2 ção poli (A).

A albumina humana sintetiza—ae nos hepatócitos do fígado a partir do qual é lançada na corrente sanguínea, é a proteina mais abundante no sangue, com uma concentração de cerca de 40 g/litro de soro; existem, por isso, cerca de l6o gramas de albumina circulante no corpo humano, em qualquer altura. A função mais importante da HSA é manter a osmo laridade normal da corrente sanguínea. Possui, também, uma capacidade excepcional para se ligar a diversas substâncias e desempenha, para além disso, uma função no transporte endó geno de moléculas hidrofóbicas (por exemplo, esteroides e sais biliares) bem como de diversas substâncias terapêuticas que podem, assim, ser transportadas para os respectivos sítios de acção. Para além disso, a HSA foi recentemente impljL cada no catabolismo das prostaglandinas.

A sínt ese de HSA nos hepatócitos proporciona,pri^ meiro, um precursor, o prepro-HSA, que contém uma sequência principal de 18 aminoácidos que comandam o polipeptido nascente até ao estado secretor. Esta sequência principal e, provavelmente clivada, por processamento transferencial simultâneo, antes da proteina se libertar do retículo endoplás^ mico. Esta primeira clivagem proteolitica proporciona o precursor pro-HSA que ainda contem um hexapeptido na extremidade N (Arg-Gli-Val-Fen-Arg-Arg), que não se encontra normal mente presente na forma madura da HSA circulante.

Uma convertase, que se encontra provavelmente localizada nasvesiculas de Golgi, remove o propeptido num segundo passo proteolítico por clivagem da ponte hexapeptidicapara o ácido aspartico de extremidade N da HSA madura (judah, J.D. e Quinn, P.L., Nature 271 (1987) 3θ4-3δ5; Bathurst, J.C. e outros, Science 235 (l9®7) 348-350). No entanto, a albumina humana não tratada pode representar metade da que se encontra presente na corrente sanguinea, em raros indivíduos heterozigóticos que 3S0 portadores de uma mutação hereditária na sequência propeptidica e, a totalidade da albumina nalguns, extremamente raros, homozigóticos (Takahashi, N. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 7403-7^07). Designa-se uma destas variantes por pro-albumina Christchurch e inicia-se com a sequência Arg-Gli-Fen-Arg-Gln ^Asp⁺^, na qual a substituição de Arg --- Gin evita a clivagem do propeptido assim mutado (Brennan, S.O. e Carrel, R.W. , Nature 274 (1978) 908-909). Outras variantes conhecidas como pró-albumina Lille (Abdo, Y. e outros, FEBS Letters 131 (l98l) 286-288) e Takefu (Negata e outros, Rinsho Byori 30 (1982) 791-796) po ssuem, respectivamente, as seguintes sequências na extremidade N : Arg-Gl±-Val-Fen-Arg-His-Asp e Arg-Gli-Val-Fen-Arg-Pro-Asp. Em cada um destes casos, as mutações obser vadas afectam o par de aminoácidos básicos Arg-Arg, que precedem normalraente a seguência de aminoácidos da albumina humana madura e que resultam da alteração de uma única base no códâo da arginina (Takahashi, N. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 7403-7407).

A clivagem após um par de aminoácidos básicos e uma caracteristica essencial da maturação de outras proteínas, incluindo hormonas peptídicas, neuropeptídicas e proteí4 -

nas plasmáticas diferentes de HSA (Douglass, 0. e outros,

Annu. Rev. Biochem. 53 (1984) 665 pp.). Descobriu-se recentemente que a convertase que cliva a pró-albumina em albumina no fígado, se encontra, provavelmente, estreitamente relacionada com a protease yscF da levedura (Bathurst, I.C. e outros, Science 235 (ΐ9θ7) 348 - 350)· Esta protease de tiol, dependente do cálcio, é codificada pelo gene KEX2 de Saccharomyces cerevisiae e encontra-se provavelmente ligada à membrana do aparelho de Golgi. Sabe-se que se encontra envolvida na maturaçSo da feromona, referida como o factor alfa e na toxina mortal, uma vez que os mutantes Kex2 de S. cerevisiae sâo imcapazes de clivar as respectivas pró-proteínas no par de aminoácidos básicos Lis-Arg (Julius, D.J. e outros, Cell 32 (1983) 839 pp.). Para além disso, pode demons trar-se que o enzima da levedura codificado pelo gene KEX2 reconhece e cliva correctamente a pró-sequência normal (Arg-Arg) da albumina in vitro, mas nSo cliva a pró-sequência mutada (Arg-Gln) da pró—albumina de Chrisstchurch (Bathurst, I.C. e outros, Science 235 (1987) 348 - 350)· Descreveu-se, recentemente, uma convertase análoga á protease yscF como sendo codificada pelo gene KEX1 de K. lactis (wéaolowski-Louvel, M. e outros, Yeast 4^ (ΐ9θθ) 71 - 8l) . Com esta finalidade, ensaiou—se a capacidade destas leveduras para amadurecerem correctamente a albumina humana recombinante e segre gá-la no meio de cultura.

A albumina atingiu os 4θ% do mercado mundial nas proteínas plasmáticas. 0 seu interesse comercial reside no

facto de se utilizar amplamente este produto, por exemplo nos chamados expansores do volume sanguíneo para compensar as perdas de sangue durante as cirurgias, acidentes, hemorrogias e, em doses por dia e por indivíduo em intervalos múl tiplo de gram.

Até agora,produziu-se geraimente a HSA segundo técnicas convencionais de fraccionamento do plasma derivado dos dadores de sangue (Cohn, E.J. e outros, J. Am. Chem. Soc.

(1946) 459 pp), encontrando—se o consumo anual de plasma, , 6 a nível mundial, situado na faixa dos 9,5 x 10 litros. Também pode ser extraída a partir da placenta humana, de acordo com a técnica descrita por J. Liautaud e outros (l3th Intern. Congress de IABS, Budapest; A: Purification of proteins. Development of biological Standard, Karger (ed.),

Bale, (1973) 107 pp.).

desenvolvimento da engenharia genética e as novas técnicas de extracçâo e purificação tornaram possível a obtenção de produtos melhorados, de pureza superior e de melhor estabilidade sem contaminação vírica (por exemplo, hepatite B e SIDA) e a um custo mais baixo. No entanto não se conhece ainda nenhum processo com base na engenharia gene tica que seja suficientemente eficaz para ter interesse iconómico na produção em escala industrial de HSA.

Isto deve-se principalmente à falta de um sistema hospedeiro/vector eficaz que permitisse a produção a alto nível de uma albumina madura segregada correctamente, que possuísse uma estrutura terciária adequada e que possuísse

as propriedades fisico-químicas da albumina humana natural.

Ainda que a utilização de culturas de células de mamíferos possa parecer a escolha ideal para a expressão das proteínas humanas, o custo de um tal processo rondaria o pre ço normal de venda da albumina utilizada para fins farmacêuticos (Klausner, A., Biotechnology 2. (Ι9θ5) 119 - 125). Uma vez que este produto é muitas vezes prescrito em quantidades multi-gram e a umhixo preço por unidade, parece que a produ ção biotecnológica de HSA é susceptível de ser efectuada ape nas com sistemas de fermentação microbiana.

Atéhá pouco tempo atrás, na grande maioria das experiências de engenharia genética, utilizava-se a Escherichia coli como o organismo hospedeiro para a produção microbiana de proteínas heterólogas de importância económica. Ap£ sar deste tipo de processo parecer satisfatório para diversas proteínas heterólogas, todas as tentativas para produzir HSA em condições económicas aceitáveis utilizando este organismo foram apenas parcialmente bem sucedidas. Uma das maiores desvantagens associadas à utilização de E. coli reside no facto de esta bactéria ser, na maioria dos casos, incapaz de excretar as proteínas heterólogas para o meio de cultura, acumulando—se, por isso, essas proteínas num dos compartimen tos celulares. A proteína desejada tem de ser separada do material celular o que dá origem a procedimentos complexos e dispendiosos. Para além disto, a E. coli produz endotoxinas e pirogéneos que podem contaminar as proteínas produzidas. Por esta razão, deve ter-se um grande cuidado na purificação /

para se removerem as endotoxinas residuais no produto final, especialmente quando este último for utilizado como um produto medicíàl.

As proteínas segregadas perdem muitas vezes a propriedade de se multiplicarem correctamente se forem sinte tizadas e acumuladas no citoplasma. Geralmente é necessária a segregação para tornar possível a formação de ligações de dissulfureto tais como as que se encontram presentes na HSA.

facto da HSA produzida na E. coli não ser segregada deste modo, origina a sua precipitação intracelular numa forma insolúvel (Latta, M. e outros, Bio/techonology (ΐ9δ7) 1309-1314). Por consequência, após a extracção a partir das célii las bacterianas a proteína tem de ser desnaturadae, novamente naturada in vitro.

Para além disso, a E. coli perde o seu mecanL· mo celular tornando possível efectuar modificações pós-tran*cricionais e pós-transferenciais específicas dos organismos eucarioticos, incluindo leveduras e organismos humanos. No que se refere à HSA, parece ser difícil induzir a E. coli a expressar a um nível satisfatório o precursor natural de HSA, isto é, o prepro-HSA. Além disto, as albuminas artificiais, nas quais o gene estrutural de HSA se fundio com sinais de secreção, derivados dos genes pac ou cmpA, bacterianos, processaram—se geralmente de um modo imcompleto (ibid). Além disto, a expressão de HSA sem a sequência prepro, isto é, na forma de Met-HSA, demonstra que o resíduo de metionina da extremidade N, não foi excisado pela metio nina-aminopeptidase (MAP) (ibid.; Pedido de Patente Europeia EP 198 7^5, publ. 22.lO.i986). Como consequência, a HSA deri vada da E. coli não pode ser contida na forma madura in vivo se tem de ser modificada in vitro, por clivagem triptica no sentido de excisar a sequência principal derivada do fogo, a seguir à desnaturação e renaturaçâo in vitro (Pedido de Patente Europeia EP 236 210, publ. Ο9.Ο9·19θ7).

No que diz respeito a outros hospedeiros bacte— rianos, publicaram-se recentemente estudos sobre a secreção de HSA pelo Bacillus subtllis (Saunders, C.W. e outros, J. Bacteriol 169 (ΐ9θ7) 2917 - 2925). Apesar deste estudo indicar que um organismo procariótico, tal como o B. subtllis, possui o potencial para segregar proteínas humanas de eleva do peso molecular, tais como a HSA, também demonstra que a excressão no meio de crescimento se pode obter quando se utilizam apenas protoplastos de B. subtilis.isto é, células bacterianas cuja parede celular normal foi digerida por tra tamento enzimático. Além disto, a percentagem de HSA modificada é inversamente proporcionar ao nível de proteína prg duzida: a níveis elevados de expressão, a maioria de HSA recombinante mantém—se na forma imatura (ibid). Para além disso, não se referiram dados respeitantes às propriedades fisico—químicas de HSA recombinante de B. subtilis. Alem disso, o nível de excressão de HSA que se obtém por este microorganismo é muito baixo em relação as quantidades de HSA detectadas em sobrenadantes de cultura utilizando métodos imunológicos (Pedido de Patente Europeia EP 0 229 712A2, publ. 22.O7.i987).

Uma alternativa atraente à utilização de hospedeiros bacterianos, para a preparação de proteínas heterólogas, e a utilização de sistemas eucarióticos microbianos tais como leveduras ou fungos. Com efeito, estes organismos possuem todas as características de estrutura e de organiza ção celular encontradas nos organismos eucarióticos mais complexos tais como as células dos mamíferos. As leveduras são especialmente capazes de efectuar as modificações pós—transcricionais e pós-transferenciais que são importantes para a actividade de muitas proteínas. Para além disso, as leveduras sâo muito comuns na produção em escala industrial podem desenvolver—se a elevadas densidades celulares, não sâo patogénicas, não produzem endotoxinas e utilizam-se na indústria alimentar desde os tempos mais remotos. Fi_nai_mente em contraste com as células dos mamíferos, as manipulações genéticas com leveduras sâo fáceis de executar e a genética clássica e molecular proporcionaram um amplo conjunto de dados.

Utiliza-se, frequentemente, o termo levedura para indicar a Saccharomyces cerevisiae ou fermento de padeiro, que é uma das espécies mais vulgares e melhor conhecida. Daqui em diante o termo levedura aplicar-se-à a outros géneros e não se limitará à espécie S. cerevisiae.

Demonstrou-se que a expressão de prepro—HSA sob o controlo do promotor de quelatina em S. cerevisiae, a níveis máximos de cerca de 1% de proteínas totais (Etcheverry,

T. e outros, Bio/Technology A (1986) 726-730). No entanto, o material conhecido pelos anticorpos anti-HSA, que se des10 crevem neste estudo, encontram-se associados às células e, por esse motivo, não sao verdadeiramente canalizados para o sobrenadante da cultura. Para além disso, não foi referida a caracterização pormenorizada da proteína recombinante.

Ja foi também feita referência à produção de HSA em fermentadores de leveduras utilizando um processo de pós-fermentação durante a fermentação da cerveja (Pedido de Patente Europeia EP 0 201 239, publ. 12.11.1986). Mais uma vez não se faz referência a dados quantitativos ou qualitativos no que diz respeito ao produto obtido. Para além disso, este processo conduz à expressão de Met-HSA, isto é, um alelo de HSA que se.inicia com o aminoácido metionina imediatamente a montante da sequência da albumina madura. A ausência de uma sequência principal evita a secreção e maturação de HSA recom binante e provoca a acumulação de uma albumina intracelular cuja estrutura não foi caracterizada. Além disso, não foi demonstrada a ausência da metionina da extremidade N, no produto final.

A presente invenção descreve a produção de estirpes modificadas de leveduras, por meios de engenharia gené^ tica, que se podem desenvolver em culturas para produção em massa e que sâo capazes de produzir e excretar eficazmente HSA, na sua configuração original, no meio de cultura.

Um sistema de expressão preferencial envolve le^ veduras do género Kluyveromyces como hospedeiro e utiliza vectores derivados do plasmídio natural pKDl de K. marxianus var. drosophilarum.

Além disso, a pesquisa efectuada no sentido de se produzir albumina revelou o valor e a importância de determinadas sequências de pKDl na eficácia e, especialmente na estabilidade, dos plasmídios de expressão que as incorpo ram.

A presente invenção refere-se ainda à utilização de elementos de pKDl na expressão das proteínas, que não sejam albuminas, no activador especial do plasminogéneo teci dular (tPA), inibidor da metalo-protease (TIMP) e interleucinas, por exemplo, interleucina 1 J5 (IL-1J3 ), considerando-se estas proteínas apenas como exemplos, com a finalidade de se demonstrar que a utilização dos derivados do plasmídio pKDl é genérica”, isto é, grandemente dependente, senão na totalidade, da natureza das proteínas cuja expressão e/ou secreção se pretende.

As leveduras do género kluyveromyces, e especialmente a K. marxianus (incluindo as variedades lactis e marxianus que serão referidas daqui em diante como K. lactis e K, fragills, respectivamente) são organismos importantes e de interesse comercial considerável na indústria biotecnol<5 gica. Utiliza-se K. lactis e K. fragills, por exemplo para a produção industrial do enzima lactase (JB-galactosidase) . Estas leveduras são capazes de se desenvolver em soro de leite coagulado, um sub—produto principal da indústria de lactícinios. Utilizam-se diversas estirpes de kluyveromices para a produção em grande escala de proteína celular simples (PCS) que- desempenha uma funão importante na alimen12

tação do gado. Finalmente, mencionaram-se nero Kluyveromyces ria chamada lista GRAS nized As Safe), que representa um factor

X dução de produtos farmacêuticos.

organismos (Generally importante do géRecogna proApénas se desenvolveram recentemente as técnicas de manipulação genética da Kluyveromyces.Descreveram-se. para este organismo, três tipos de vectores de clonagem:

i) vectores de integração contendo sequências homologas para regiSes do genoma do Kluyveromyces, os quais, depois de serem introduzidos nas células, sâo integrados nos cromossomas do Klyveromyces por recombinação in vivo. Obtém-se a integração, um fenómeno muito raro que necessita da presença de um marcador de selecção eficaz, quando estes vectores não contêm sequências que permitam a replica^ ção autónoma na célula. A vantagem deste sistema é a estabilidade das estirpes transformadas, isto é, o facto destas se poderem desenvolver num meio de suporte nutritivo normal sem necessidade de uma pressão selectiva para a manutenção das sequências integradas. A desvantagem reside contudo no facto dos genes integrados se encontrarem presentes apenas numa, ou na melhor das hipóteses, num pequeno número de cópias por célula. Esta baixa quantidade de genes origina frequentemente um baixo nível de produção de produção de uma proteína heteróloga.

ii) vectores de replicação contendo sequências

de replicaçSo autónoma (SRA) derivadas do ADN cromo£ sómico de Kluyvermyces (Das, S. e Hollenberg, C. P., Corrent Genetics (1982) 123 - 128; Pedido de Paten te Internacional WO 83%O4O5O, publ. 24.11.1983; Pedido de Patente Internacional WO 83/θ4θ51, publ. 24.ll.i983). Estes vectores dSo de interesse moderado, uma vez que a sua segregação na divisão das células mitóticas e muito pouco homogénea, originando a sua perda a partir das células, mesmo quando estas ultimas se desenvolveram a uma pressão selectiva.

iii) vectores de replicação derivados a partir de plasmídios de leveduras naturais, quer do plasmídio linear mortal, pGKl-1 (Kl), isolado do K. lactis (de Louvencourt, L. e outros, J. Bacteriol. 15^ (1982) 737 - 742; Pedido de Patente Europeia EP 0 095 986, publ. O7.i2.i983), a partir do plasmídio circular pKDl isolado a partir de K. marxianuavar, drosophilarum Pedido de Patente Europeia EP

24l 435 A2, publ. i4.lO.i987). 0· vectores contendo sequências de replicação derivadas, do plasmídio linear de Killer não possuem utilidade prática para a produção em massa de proteínas heterólogas, uma vez que é necessário um meio nutritivo especial para a sua manu tenção e uma vez que se perdem 40 a 90% das células numa dada população, decorridas apenas 15 gerações, mesmo a uma pressão selectiva (Pedido de Patente Euro peia No. 0 095 986, publicado em 1983-12-07). 0 sistema de vector mais eficaz descrito até à data, para

- l4 transformação do gene Kluyveromyces, deriva do plasmí^ dio endógeno pKDl: transferir-se, com elevada frequência, construções contendo a sequência completa de pKDl que se encontram presentes nas células em 70-100 cópias e, de um modo mais importante, possuem uma estabilidade relativamente elevada em condições não selectivas. Todavia, a utilidade dos vectores descritos na patente de invenção europeia No. 0 241 435» limita—se a aplicações em investigação atendendo a que as fermentações em escala industrial necessitam de uma estabilidade do plasmídio durante pelo menos 40 gerações. Mesmo o vector mais eficaz ( P3) , descrito na patente de invenção europeia N? 024l 435 perde-se em cei? ca de 70$ das células de uma dada populaçSo, descritas apenas 6 gerações num meio não selectivo (Pedido de Patente Europeia EP O 24l 435 A2, publ. 14.10.19^7). Apesar de ser tecnicamente realizável a manutenção da pressão de selecção numa fermentação em larga escala, a utilização do meio selectivo origina muitas vezes uma densidade celular consideravelmente mais baixa e requer a utilização de estirpes toem definidas, tornan do esta abordagem menos atractiva e mais dispeniosa.

Para além disso, a patente de invenção europeia No.

24l 435 não contém um único exemplo de expressão de uma proteína heteróloga de interesse comercial. Na realidade, o único gene heterólogo cuja expressão se indica, a partir dos vectores derivados de pKDl é o gene URA3 de levedura S. cerevlsiae. Resta ainda demonstrar que a introdução de um gene de não levedura, por exemplo com origem num animal mamífero, em pKDl e a sua sobre-expressâo no Kluyveromyces não origina um acréscimo na instabilidade plasmídica.

Um dos objectivos da presente invenção consiste na produção do genero Kluyveromyces e possuindo características de estabilidade marcadamente superiores ãs descritas no Pedido de Patente Europeia No.

24l 435· Demonstrar—se—à que as novas construções descritas na presente invenção se mantêm num elevado número de cópias em 85-90$ das células decorridas 50 gerações desenvolvidas em meio não selectivo. Deste modo, é possível produzir proteínas heterólogas a partir de vectores de multicópias estáveis utilizando estirpes industriais do género Klyveromyces que se utilizou durante muitos anos tendo em conta as suas óptimas propriedades de desenvolvimento e densidades celulares de nível elevado.

A presente invenção refere-se, especialmente, a um tné todo para a preparação de uma proteína específica, consistindo este método na cultura, num meio de desenvolvimento, de uma levedura do género Kluyveromyces transformada com um plasmídio de expressão que compreende:

— os genes A, B e C_ do plasmídio pKDl

- as repetições invertidas do plasmídio pKDl (IR) — o locus de estabilidade do plasmídio pKDl,

- a origem de replicação de pKDl e uma sequência de expressão contendo um ADN que codifica o gene es16 trutural para a referida proteína sob o controlo de sequências que permitem a sua expressão na referida levedura,

- um marcador de selecção para a levedura transfor mada,

- e, eventualmente, uma origem de replicação e um marcador de selecção para a Escherichia coli.

Atingiu-se a elevada estabilidade dos vectores descritos na presente invenção, por exploração completa das características do plasmídio pKDl. Os vectores derivados de pKDl diferem de todos os outros vectores Kluyveromyces, conhecidos pelo facto de conterem um sistema de replicação especializado, responsável pela manutenção do plasmídio de um modo estável num elevado número de cópias. Para além de uma origem de replicação, este sistema compreende duas repetições invertidas, cada uma delas com 346 nucleótidos de exten são e três sequências abertas de interpretação (genes A, B e C) que constituem parte integrante do plasmídio (Chem. X.J. e outros, Nucl. Acids. Res. l4 (1986) 4471 - 448l). A reten ção destes elementos de replicação e de estabilidade, genes A, B e (3 e as repetições invertidas (Ri) originam vectores que exibem uma estabilidade mitótica muito elevada. Por ana logia com o sistema mais exaustivamente estudado, o do plas^ mídio 2 /u relacionado estruturalmente com S. cerevisiae, as proteínas codificadas por dois destes genes (B e Cj encontram-se, provavelmente, envolvidas na partição plasmídica durante a divisão mitótica das células, e, podem tomar parte na regulação negativa do gene A que codifica uma recombinase específica de um sítio (FLP; Futcher, A.B., Yeast h. (1988)

- 4θ) . Demonstrou-se que a recombinaçâo medida por FLP, entre as repetições invertidas do ADN de 2 /1 desviam o plas^ mídio de um modo de replicação regular (uma duplicação de plasmídio 2 /u por divisão celular) para um modo de replicaçâo de tipo círculo primitivo (amplificação do número de cópias para cerca de 50 cópias por célula; ibid). Esta alte ração no modo de replicação normal é induzida logo que o número de cópias do plasmídio se torna demasiado baixo, para permitir a produção de quantidades suficientes do gene e (3 que actuam como repressores do gene A que codifica a recombinase FLP. De acordo com este mecanismo, o número de cópias de 2 /j (e muito provavelmente de plasmídios estruturalmente semelhantes, tal como pKDl) mantêm-se a nível elevado de um modo auto—regulado e não depende da presença de um marcador de selecção.

Os vectores previamente publicados na Patente de invenção europeia No. 0 24l 435 continham apenas só uma parte de pKDl (A15) ou continham ura gene A interrompido (Pl e P3 nos quais o local de clonagem PstI se encontrava localizado na sequência de código do gene A (Pedido de Patente Europeia EP 0 24l 435 A2, pubi. 14.10.1987), destruindo, deste modo, o sistema de replicação auto-regulado, que constitui uma das características do plasmídio residente pKDl.

Em contrapartida, as construções plasmídicas derivadas de pKDl, que se descrevem na presente invenção, respeitam a integridade funcional de todas as sequências abertas de lei tura importantes de pKDl. Como consequência, a estabilidade dos plasmídios e seguir descritos encontra-se consideravelmente aumentada no que se refere aos plasmídios Pl e P3, e o número de cópias dos novos vectores mantem-se a um nível elevado ao longo da população celular.

Na presente invenção utilizar—seà o termo HSA para referir qualquer albumina sérica de origem humana ou qualquer proteína isolada das células de leveduras e que pos sua a mesma sequência aminoácida, estrutura terciária e propriedades fisico-quimicas da HSA primitiva de origem humana. Para além disso, entende-se que as variantes de HSA apresentam variantes naturais, bem como moléculas que possuem a mes ma actividade de HSA mas, a partir das quais, quando adequado, se truncarem os domínios não essenciais para a actividade em questão.

A presente invenção refere-se à criação, através da engenharia genética, de novos vectores que possibilitem a produção de HSA numa forma facilmente purificável utilizando células de levedura como um hospedeiro microbiano eucariótico. Uma das características do método de produção e a excreção eficaz da HSA, madura, nativa no meio de crescimento das referidas leveduras, facilitando deste modo, considerável mente a purificação da proteína recombinante. Obtem—se a produção de HSA por cultura das leveduras transformadas com um plasmídio recombinante que compreende uma região de início de transcrição e transferência que funciona de modo eficaz nos referidos hospedeiros e uma sequência de interpretação aberta que codifica a HSA precedida de um sinal de secreção que conduz a proteína recombinante para o nível secretor das referi19 das leveduras.

De acordo com a presente'-ifivenção, as novas cons^ truções incluem sequências de expressão contendo o gene estru tural de HSA ou uma das suas variantes. Preparam-se as construções, habitualmente, passo a passo, utilizando os vectores adequados até que os elementos essenciais para expressão, secreção ou conservação plasmídicas se tenham combinado para formar um vector que pode ser introduzido no hospedeiro(s) definido(s) de modo a expressar e a excretar a proteína desejada. Os hospedeiros utilizados são de origem eucariótica, e_s pecialmente leveduras, mais especialmente do género Saccharomyces ou Kluyveromyces e, de preferência, a espécie Kluyveromyces marxianus var. lactis. Deste modo, de acordo com a presente invenção, as construções que se prepararam e descreveram, encontram—se na essência dos exemplos em organismos eucarió ticos de origem microbiana, mas orientam-se, preferencialmente para o Kluyveromyces.

Os hospedeiros que devem utilizar-se, de um modo especial, deverão ser, preferencialmente, estirpes industriais estáveis, que se desenvolvam a densidades celulares elevadas em meios adequados e possuam um elevado nível de produção .

Entre as estirpes que se podem transformar com plasmídios derivados de pKDl, deverão mencionar-se de um modo particular as estirpes das espécies K. Vickerhamii, K. Waltii e especialmente, K. marxianus var. bulgaricus (Κ. bulgaricus),

K. marxianus var. drosophilarum (K. drosophilarum), K. marxia20 nus var. marxianus (K. fragilis) e K. marxianus var. lac tis (Κ. lactis).

Pode obter-se a sequência que codifica HSA segundo diversas vias, a mais simples das quais consiste no iso lamento do ARN mensageiro do fígado humano e sintese das suas cópias na forma de ADN complementar (cADN). Pode então modificar-se as sequências clonadas segundo diferentes métodos tais como mutagénese comandada de um sítio, in vi tro, alongamento do precursor, restrição, inserção de adaptadores ou ligação com ligantes de oligodesoxinucleótidos. Pode adaptar-se a sequência de código, por exemplo, para a utilização de codões preferenciais na levedura, no sentido de se optimizar a eficácia da síntese da proteina (transferência) no referido hospedeiro.

Na extremidade N da sequência da proteina, pode introduzir-se um péptido principal para dirigir a proteína nascente para o nível secretor da célula hospedeira. Esta pré-sequência pode corresponder à sequência principal natural da extremidade N da proteina especialmente na albumina, ou pode ter outra origem, pode obter-se por exemplo, a partir de genes de levedura tais como os que codificam a feromona alfa da toxina mortal.

Para além disso, pode interpor-se uma pro-sequên cia que codifica outra extensão peptídica, entre a sequência principal de secreção e a sequência que codifica a albumina madura. Esta pro-sequência une-se, normalmente, à sequência codificante num sítio de clivagem por uma protease específica que engloba, geralmente, dois aminoácidos, de preferencia, f

Lis-Arg ou Arg-Arg.

A sequência de expressão englobará uma região de início de transcrição e de transferência unida á extremida de 5 da sequência codificante, para comandar e regular a trans crição e transferência da referida sequência. A escolha destas regiões promotoras varia de acordo com o hospedeiro utilizado. Estas sequências são normalmente escolhidas a partir de promotores derivados de genes de leveduas. Apresenta especial interesse determinadas regiões promotoras e/ou regiões terminais derivadas de genes glicolíticos de levedura de tipo Saccharomyces ou Kluyveromyces, tais como os agentes que codificam a fosfoglicerato-quinase (PGK), gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GDP), enolases (ENO), álcool-desidrogenases (ADH) ou derivados de outros genes fortemente expressos tais como a lactase (LAC4), a fosfatase ácida (PH05) e similares. Podem modificar-se estas regiões de controlo, por exemplo, por muta genese in vi tro, por introdução de elementos de controlo adicionais ou sequências de sintese ou por anulações. Podem utilizar-se, por exemplo, elementos reguladores de transcrição, tais como os chamados UAS (sequências de activação a montante) originários de outros promotores, por exemplo, o do gene de S. cerevisiae GALIO ou K. lactis LAC4, para se constrirem promotores hibridos que possibilitam a separação da fase de crescimento de uma cultura de levedura da fase de um gene heterólogo, dependendo da fonte de carbono escolhida. Uma região de terminus de transcrição e de transferência, que é funcional no hospedeiro, encontrar-se-á posicionada na extremidade 3 da sequência de código.

Fundir-se-a a sequência de expressão assim cons truída com um ou mais marcadores tornando assim possível selec cionar os hospedeiros transformados. Os marcadores de leveduras preferenciais, são os marcadores dominantes, isto é, os marcadores que conferem resistência aos antibióticos tais como a geneticina (G4l8) como é o caso da expressão na referida levedura do gene aph(3 *)-I (aph) do transposão bacteriano Tn9O3 ou de qualquer outro composto tóxico tais como os iões de cobre, embora se possa utilizar o último sem especificidade hospedeira especial. Colocar-se-ão estes genes resistentes sob o controlo de sinais de transcrição de transferência adequados no hospedeiro em questão. Também é possível utilizar marcadores auxotróficos complementares tais como os genes UBA3 ou

LEU2 de 5. cerevisiae.

Pode utilizar-se a associação que consiste na sequência de expressão e do marcador de selecção para transformar directamente o hospedeiro ou pode-se inseri-la no vector de replicação. No caso de uma transformação directa, funde-se com esta associação as sequências homólogas das regiões presentes num cromossoma ou num plasmídio residente. As referidas sequências localizar—se—ão de cada um dos lados da sequência de expressão de modo a induzir uma inserção no sítio homólogo por recombinação in vivo. Também se pode combinar a sequência de expressão com um sistema de replicação que é fun cional ho hospedeiro em questão. Um sistema de replicação preferencial para o Kluyveromyces deriva do plasmídio pKDl, isolado inicialmente a partir de K.drosophilarum (Falcone, C.

et al., Plasmid 15 (1986)248-252; Chem, X. J. et al.,

Nucl

Acids Res. 14 (1986) 4471 - 4481.). Um sist ema de replicação preferencial para o Saccharomyces deriva do plasmídio 2u de levedura. 0 plasmídio de expressão podem conter total ou parcialmente os referidos sistemas de replicação ou pode combinar elementos derivados de pKDl, bem como do plasmídio 2 u.

As construções preferenciais qão aquelas nas quais o sítio da inserção das sequências estranhas em pKDl se encontra localizado numa região de 197 pb que se situa entre o local sSacl (posição 4714 de forma B de pKDl; Chen, X. J. et al. , Nucl. Acids Res. l4 (1986) 4471 - 448l) e o sítio Ns til (posição 154 da forma B de pKDl; ibid.), ou num desses dois sítios, ou em alternativa no sítio Sphl do plasmídio pKDl.

Para maior conveniência, o plasmídio pode ser um vector de transporte; como tal, pode ser transferido para um hospedeiro bacteriano tal como a E. coli, onde pode ser raani pulado mais facilmente do que na levedura em cada um dos passos de construç3o. Neste caso, é necessário existir uma origem de replicação e um marcador de selecção a funcionar ho hospedeiro bacteriano. Também é possível posicionar os sítios da restrição que são únicos no vector de depressão pelo que estes flaquearão as sequências bacterianas. Isto torna possível a eliminação, mediante clivagem, da orgiem de replicação e a nova ligação do vector antes da transformação das células de levedura, o que pode originar um número de cópias mais elevado do plasmídio e um acréscimo na estabilidade plasmídica. Podem utilizar-se, por exemplo, sítios convencientes tais como 5’-GGCCNNNNNGGCC-3' (Sfil) ou 5'-GCGGCCGC-3’ (Notl) embora sejam extremamente raros nas leveduras e se encontrem geraímente

-L ausentes de um plasmídio de expressão. Podem introduzir-se estes plasmídios no vector por mutagenese comandada por um oligo^ nicleótido ou por adição de ligantes oligodesoxi-nucleotídicos ou adaptadores.

Apesar da presente invenção fazer referência frequentemente à albumina humana, o procedimento utilizando os vectores correctamente derivados do plasmídio pKDi aplica-se às albuminas, interleucinas, tPA, TIMP e outras proteínas susceptíveis de beneficiarem da expressão/excreção nas referidas leveduras.

Entre as sequências de código que se podem expressar, deverão mencionar-se, especialmente,

- 11-1

- prepro-HSA

-; Met-HSA

- prepro-tPA

-Met-tPA, e

- TIMP.

Uma vez completa a construção do vector de expressão, introduzir-se-á este último no hospedeiro desejado. No caso das leveduras, encontram-se descritos diversos protoco los de transformação (Sherman, F. eoutros, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1986). Depois podem desenvolver-se os transformantes num meio adequado no sentido de se produzir o produto desejado.

Se o produto desejado fór excretado, pode ser purificado te da cultura, a cromatografia convencionais.

tir de culturas segundo diversas vias, a partir do sobrenadanPode ser crioprecipitado ou extraído utilizando de afinidade, electroforese ou outras técnicas Pode recuperar-se a proteina secretada a parpor lotes ou de culturas contínuas.

Proporcionam-se os exemplos que se seguem sem qualquer limitação implicita, que demonstram os aspectos especiais da presente invenção e determinadas vantagens.

DESCRIÇÃO DAS GRAVURAS

Os diagramas dos plasmídios que se paresentam nas figuras, não se encontram traçados a escala, e apenas se indicam os sítios de restrição importantes para as construções.

Fig. 1 : Construção do plasmídio pXL276 que contém a sequência completa que codifica Met-HSA, obtida a partir de três clones de ADN (ver texto) derivado do mARN de poli(A) isolado do fígado humano.

Fig. 2 ; Reconstituição da sequência prepro da albumina a partir de quatro oligo-desoxi-nucleotidos de síntese;

		construção	do	plasmídio	pXL29O.
Fig.	3 :	Construção	do	plasmídio	pXL299.
Fig.	4 ;	Construção	do	plasmídio	pXL322.
Fig.	5 :	Cons trução	do	plasmídio	pXL855.
Fig.	6 :	Construção	do	plasmídio	pXL869.

Fig. 7 · Sequência nucleotídica e aminoácida do fragmento Hind

III derivado do plasmídio pXL869 e que contém o gene estrutural de prepro-HSA. As setas a cheio indicam o

-τ' extremo das regiões pre e pro.

Fig.	8 :	Cons trução	do plasmídio	pUC-URA3.
Fig.	9 :	Construção	do plasmídio	pCXJl.
Fig.	10:	Cons trução	do plasmídio	pKl-PS1535-6.
Fig.	11:	Construção	do plasmídio	pUC-kan202.
Fig.	12	: Sequência	núcleo tídica	do promotor 0RF1 do

kl a partir do sítio de restrição Seal e incluindo a união entre 0RF1 e a região 5 do gene bacteriano que codifica a aminoglicosidofosfotransferase derivada de Tn9O3.

Fig. 13 ί Construç3o do plasmídio pKan7O7.

Fig. l4 ; Curva de estabilidade do plasmídio pKan7O7 na estirpe MW98-BC em condições de crescimento n3o selectiva s .

Fig.	15 :	bonstrução	do	plasmídio	pYGll.
Fig.	l6 :	Construção	do	plasmídio	pYGl8.
Fig.	17 :	Construção	do	plasmídio	pYG19.
Fig.	18 :	Ilustração	do s	plasmídios pYG19 (prepro-HSA) e

pYG23 (Met-HSA.) . A sequência nucleotídica que aparece sob cada um dos plasmídios consiste na união entre o promotor do gene PGK e os genes estruturais para diferentes formas de HSA.

Fig. 19 : Construção dos plasmídios pYG2O8, pYG210 (painel A) e pYG221B (painel B).

Fig. 20 : Construção dos plasmídios pYGl4, pYG2ó e pYG29.

Fig. 21 : A. Mutagénese no promotor PGK de S♦ cerevisiae para introduzir sítios No ti flaqueando as regiões UAS. Abaixo dos sítios No ti indicam-se por meio de asteriscos os quatro pares de bases alterados pela mutagénese comandada de um sítio.

B. Indicam-se por meio de uma caixa as sequências principais de PGK não transferidas nas construções pYG19 θ pYG44. 0 sítio HindIII introduzido na região -25 do promotor PGK de tipo primiti^ vo por mutagénese comandada de um sítio.

Fig. 22 : Substituição de UASpGk por um fragmento de ADN de síntese contendo o UAS do promotor LAC4 de K. lactis e a reconstituição do contexto de ATG de tipo primitivo de PGK da ligação de um adaptador de síntese ao promotor que sofreu a mutagénese.

Fig. 23 : Sequências de expressão SalI-SacI com diversos pro motores e sequências principais presentes nos plasmídios derivados de pKan7O7 que comandam a secreção de HSA no meio de crescimento.

Fig. 24 : Mutagénese dirigida de um sítio do promotor PHO5 de

S. cerevisiae para introduzir um sítio HindIII na posição -20.

Fig. 25 : Sequência nucleotídica da região promotora próxima do codão de iniciação ATG, na construção pYG51.

Fig. 26 : Reconstituição de um fragmento de ADN de síntese

HindIII-Dral contendo a sequência principal não transferida de 5' do promotor PGK, a sequência prin cipal da toxina mortal de K. lactis (pre-região) e os primeiros poucos codões do gene pro-HSA.

Construção do plasmídio pYG5ú.

Fig. 27 5 Representação esquemática dos plasmídios P31/RAG2:URA3, pYGÓO-5 e pYGóO-21.

Fig. 28 : Estabilidade mitótica dos plasmídios que expressam

HSA, pYG19 e pYG23, em condições de crescimento não selectivas; quadrados preenchidos, estirpe MW98-8C transformada com o plasmídio pYG19; quadrados não preenchidos, estirpe MW98-BC transformada com o plasmídio pYG23; triângulos não preenchidos, estirpe CBS683 transformada com o plasmício pYG19.

Fig. 29 : Gel de poliacrilamida -SDS e 8,5 após coloração com azul de Coomassie, demonstrando a expressão e excreção de HSA a partir da estirpe MW98-8C. Pistas 1-4: albumina de referência extraída do plasma humano (Sigma) reconhecida em concentrações crescentes: 0,2 ug. Ojó^Aíg, 2 ^ug e 6 /ag por pista.

pYG19 (prepro-HSA), pYG23 (Met-HSA) e pYG25 (vector de controlo sem sequência de expressão): cada pista corresponde a uma quantidade de proteina equi valente a lOOyul da cultura original. a) fracções solúveus; b) fracções insolúveis; c) sobrenadar tes de cultura.

Fig. 30 : Análise da mancha imunológica de um gel de poliacrilamida a 7,5 % manchado sobre nitrocelulose conforme descrito no texto. Pistas 1-5í albumina de referência extraída do plasma humano (Sigma) que se dissolveu num meio YPD e diversas concentrações e cuja precipitação se efectuou com TCA (concentração final de 5 ^°) , conforme descrito. Também se trataram as amostras de HSA normalizadas do mesmo modo que os sobrenadantes da cultura.

Em ambos os casos, as manchas de gel correspondem a volumes equivalentes. l) ensaios de precipitação com uma concentração de HSA de 100 mg/l;

2) ‘ 50 mg/l; 3) 25 mg/l; 4) 12,5 mg/l; 5) 6 mg/ /l. pYG19 (prepro-HSA) e pYG23 (Met-HSA); cada uma das pistas corresponde a uma quantidade de pro. teina equivalente a 20yul da cultura original, a) sobrenadantes da cultura; b) fracções insolúveis; c) fracções solúveis.

Fig. 31 ί Gel de poliacrilamida a 8,5 %, após coloração com Azul de Coomassie, demonstrando os efeitos cinéticos da excreção de HSA a partir da estirpe MW98-BC.

A, representação gráfica dos efeitos cinéticos da excreção de HSA a partir da estirpe MW98-8C transformada com o plasmídio pYG19 e desenvolvida em meio de Erlenmeyer, conforme descrito no texto.

Indica-se a concentração de albumina detectada no meio de crescimento (mg/l) em função do tempo de cultura (horas). Apresentam-se os resultados de quatro ensaios independentes.

B, curva de desenvolvimento da estirpe Í4W98-8C transformada com o plasmídio pYG19·

Fig. 33 : Efeito da fonte de carbono na eficácia da secreção da albumina sob o controlo de PGK ou de um promotor híbrido PGK/LAC4 : análise SDS-PAGE dos sobrenadantes da cultura, corados com Azul de Coomassie de K. lactis estirpe MV98-8C transformada com os plasmídios, pYG19 e pYG44.

A, Sobrenadantes (l2,5 ul por pista) ou culturas em frascos agitados desenvolvidas durante 211 horas em YPD (contendo glucose a 2$) (pistas 1-3) ou em meio YPD ao qual se adicionou lactose a 2 $, decorridas 43 horas de desenvolvimento (pistas a e b : HSA (Sigma) 0,5 θ 1,0 /ug, respectívamente; pi_s tas 1 e 4 : plasmídio pYG44—5; pistas 2 e 5; pla_s mídio pYG44-7; pistas 3 e 6; plasmídio pYG19.

B, Sobrenadantes (25/ul por pista) de culturas em frascos agitados desenvolvidas durante 113 horas em YPD (contendo glucose a 2 %) (pistas 1, 4 e 7), YPL (contendo lactose a 2$) (pistas 3, 6 e 9) ou meio YPD ao qual » adicionou lactose a 2 $ decorri das 43 horas de crescimento (pistas 2, 5 θ 8) .

Pistas a, b, e c: HSA (Sigma) 0,25, 0,5 θ 1,0 ug, respectívamente; pistas 1-3; plasmídio pYG44—5; pistas 4-6; plasmídio pYG19; pistas 7-9» pias31 mídio pKan7O7 sem sequência de expressão.

Fig. 34 í Efeito das substituições do promotor e da sequência principal na eficácia da secreção da albumina: análise SDS-PAGE de sobrenadantes de uma cultura corados com Azul de Coomassie de K. lactil estirpe MW98-8C transformados com os plasmídios pYG51, pYG19 e pYG58.

A, Sobrenadantes (25 ul por pista) de culturas em frascos agitados desenvolvidas durante 115 horas em meio YPD ao qual se adicionou lactose a 2^, decorridas 43 horas de desenvolvimento. Pistas a, b e c': HSA (Sigma) 0,2, 0,5 θ 1,0 ug, respectivamente; pista 1: plasmídio pYG51 (promotor PH05); pista 2: plasmídio pYG19 (promotor PGK).

B, Sobrenadantes (25 ul por pista) de culturas em frascos agitados fèsenvolvidas durante 66 horas (pistas 1—3) ou 138 horas (pistas 4-6) em meio YPD. Pistas a, b e c; HSA (Sigma) 0,25, 0,5 θ 1,0 ug, respectivamente; pistas 1, 2,4 e 5: plasmídios pYG58 (sinal de secreção da toxina mortal, dois transformantes independentes); pistas 3 θ 6: plasmídio pYG19 (sinal de secreção da albumina).

Fig. 35 : Efeito da fonte de carbono na eficácia da secreção da albumina sob o controlo do promotor LAC4 ou PGK: análise SDS-PAGE de sobrenadantes de cultura corados com Azul Coomassie da K. lactis estirpe

CBS2359 transformados com o plasmídio pYG404 e

pYG19Sobrenadantes (25 ul por pista) de culturas em fras cos agitados, desenvolvidas durante 166 horas em YPD (contendo glucose a 2$) (pistas 1 e 4), YPL (contendo lactose a 2 %) (pistas 3 e 6) ou em meio YPD a que se adicionou após 48 horas de desenvolvimento (pistas 2 e 5). Pistas a, b, e c: HSA (Sigma) 0, 25, 0,5 e 1,0 /Ug, respectivamente; pista 1-3: plasmídio pYG4o4; pistas 4-6: plasmídio pYG19Fig. 36 : Eficiência da secreção de albumina sob controle de um integrado, versus uma sequência de expresàão basea da num plasmídio PGK: SDG PAGE e análise imunoblastica dos sobrenadantes da cultura de integrante de K. lac tis, estirpes MW98-8C. 60-5 e MW98-8C; 60-21 e da estirpe MW98-8C, transformada com o plasmídio pYG19. Fizeram-se amostras (25 /1 P^or pista) de sobrenadantes de culturas em frascos agitados, desenvolvidas em

YPD durante 137 8.

A, PAGE-SDS; Pistas a, b, c e d; HSA Sigma 0,1, 0,25 0,5 θ 1,0 /Jg, respectivamente; pista 1: estirpe MW98-8C transformada com o plasmídio pYG19; pistas 2-7;

estirpes integrantes independentes, respectivamente MW98-8C::60-5+ 6, MW98-8C::6O-21# 9, 1MW98-8C: :60-21=#= 7, MW98-8C: :6O-5=H= 4, MW98-8C: :60-548, MW98-8C::6O-2141I, respectivamente (ver capítulo E.3.7).

B, Análise de mancha Western: as mesmas amostas indicadas em A (25 ul de sobrenadante depositado por

pis

Fig. 37

Eficácia de secreção de albumina em diversas estirpes Kiuyveromyces transformadas com os plasmídios pYG19 e pYG221B: análise SDS-PAGE de sobrenadantes de cultura concentrados, corados com Azul de Coomassie. Desenvolveram-se as células em meio YPD com G4l8 (200 ytig/ml) durante 89 horas. Concentraram-se os sobrenadantes dez vezes por microfiltração utili^ zando um centricon de 30 unidades de microfiltração (Amicon). Normalizou-se o volume de sobrenadante concentrado depositado por pista em função da produção de biomassa, que variou entre 9 θ 25 /Ul.

As pistas a e b; 0, 5 ^e 1,0 yug de HSA (Sigma) res — pectivamente; pistas c e d; HSA (Sigma) submetida a microfiltração. Concentrou-se 10 vezes uma solução de HSA em meio YPD (10 mg/l) por microfiltração. D£ positaram-se 25 θ 2,5 Λΐ do concentrado normalizado respectivamente, nas pistas c e d. Pista 1: estirpe ATCCl6o45 (K.marxianus var. bulgaricus) transforma da com o plasmídio pYG22lB; pista 2: estirpe ATCC24178 (K. wickerhamii) transformada com o pla_s mídio pYG22lB; pista 3: estirpe ATCC12424 (K. marxianus var. marxianus) transformada com o plasmídio pYG19; pista 4: estirpe ATCC565OO (K. waltii) trans formada com o plasmídio pYG19í pista 5ί estirpe ATC C 36906 (K. marxianus var. drosophilarum) trans for mada com o plasmídio pYG221B; pista 6: estirpe CBS4574 (K. marxianus var. lac ti s) transformada

com o plasmídio pYG19; pista 7: estirpe CBSÓ83 (X. marxianus var. lactis) transformada com o plas^ ídio pYGlQ; pista 8: estirpe MW98-8C (X. marxianus var. lactis) transformada com o plasmídio pYG19; ' pista 9i estirpe MV98-8C (K. marxianus var. lactis) transformada com o plasmídio pKaç7O7 (só vector); pista 10: estirpe MV98-8C (x. marxianus var. lactis) transformada com o plasmídio pYG221B.

Fig. 38 i Técnicas electroforéticas (S=normalizadas, L=albumina de levedura)

A - PAGE-SDS (Phast gel, Pharmacia, gradiente 8-25 ^b) coloração com sais de prata, S ^^Jg, L.de 0,05 a 0,25 jug.

B - Focalização isoeléctrica (Phast gel, pH 4,5-6,θ), coloração com Azul de Coomassie, manchas = = 1

C - PAGE SDS (7,5 $) coloração com Azul da Coomassie.

S = 0,2 - 1,0 Tig, L= 0,25-2,5 jug.

Fig. 39 í Cromatografia de permuta de iões - Mono Q (Pharmacia). Fundo: 40 ^hg de HSA de levedura; cimo:

ug de HSR normalizada.

-Fig. 40 : Cromatograf ia de fase inversa = Nucleosilo C4, a)

HSA normalizada; b) HSA de levedura.

Fig. 4l : Espectrometria de emissão de fluorescência do trip tofaro. Linha a cheio: HSA normalizada; linha a tracejado: HSA de levedura.

Fig. 42 : Estabilidade térmica a 75°C. Linha a cheio: HSA normalizada; linha a tracejado: HSA de levedura.

Fig. 43 : Regiões de alumina reconhecidas por diferentes an ticorpos monoclonais utilizados para caracterização antigénica.

Fig. 44 : A, B, C: curvas de inibição (ver texto) que se r_e ferem aos novos anticorpos monoclonais utilizados, cuja especificidade se indica na Fig. 43.: percentagem de inibição como função de concentração da albumina (/ig/ml); quadrados não preenchidos: HSA normalizada; quadrados preenchidos: HSA de levedura.

Fig. 45 : Construção do plasmídio pSPGKl e indicação da sequência nucleotídica do fragmento de síntese EcoRI utilizado como um sinal de secreção. Também se indica que rodeia o sítio de elonagem do plasmídio pEGK4l.

Fig.	46 :	Construção do plasmídio sequência nucleotídica a sequência de sinal e	pSPGK—IL17 θ indicação da * correspondente a junção entre Met-IL-1£.
Fig.	47 :	Cons trução	do	plasmídio	pSPGK-IL21.
Fig.	48 :	Construção	do	plasmídio	pSPGK-IL31.
Fig.	49 :	Cons trução	do	plasmídio	pSPH04.
Fig.	50 :	Construção	do	plasmídio	pSPHO-ILl4.
Fig.	51 :	Construção	do	plasmídio	pSPHO-IL23.

Fig. 52 : Construção do plasmídio pSPHO-IL35.

Fig. 53 · Curvas de estabilidade dos plasmídios pCXJl, pSPGK-IL31 θ pSPHO-IL35 na estirpe ?1W98-8C em condições não selectivas: quadrados preenchidos, pCXJl: triângulos preenchidos, pSPHO-IL35 (promotor não induzido); triângulos não preenchidos pSPHO-IL35 (promotor induzido): quadrados não preenchidos, pSPGK-IL31.

Fig. 54 : Secreção de IL-lJ3 na estirpe MW98-8C, Análise

SDS-PAGE dos sobrenadantes de culturas coradas com Azul de Coomassie.

Ceda uma das amostras manchadas corresponde a 0,2 ml de sobrenadante de K. lactis, estirpe MW98-8C transformada com o plasmídio pKan7O7 (vector de controlo, pista l), pSPGK-IL31 (pista 2) ou com pSPHO-IL35 (pista 3); a pista 4 correis ponde a 1 ug de Met-Il-lJ3 produzido na E. coli (Rhône-Poulenc Santé). Desenvolveram-se as células transformadas durante três dias etn meio YPD enriquecido com 200 yug/ml de G4l8. Concentraram-se os sobrenadantes por precipitação, conforme descri to no texto.

Fig. 55 : Mapa de restrição dos plasmídios pXL348 (Met-tPA) e pXL459 (prepro-tPA)

Fig. 56 :

Ensaio de actividade de tPA segregado.

Efectuou-se uma mancha de 5 jul de sobrenadante de cultura de K. lactis, estirpe MV98-8C, transformada

Fig. 57:

com o plasmidio pYG225B (prepro-tPA, pista l), com o plasmidio pYG224B (Met-tPA, pista 2) ou com pKan7O7 (vector, pista 3), que indicou a presença de actividade de tPA após 5 dias de crescimento em meio selectivo YPD (200 ^g/ml de G4l8).

Expressão e selecção de TIMP na estirpe MV98-8C transformafa com o plasmidio pYG226B ou pKan7O7.

0,25 ug de TIMP humano (Rhône-Poulenc Santé, pista l): expressão intracelular de TIMP recombinante de levedura (plasmidio pYG22ÓB), não desglicosinado (pista 2) ou após tratamento com endoglicosidase H (pista 3); amostra de TIMP recombinante de

E. coli (Rhône-Poulenc Santé, pista 4); fracções intracelulares da estirpe MV98—8C transformada com o vector de controlo pKan7O7 amostra não desglicc> silada (pista 5) ou após tratamento com endoglicosidade H (pista 6), sobrenadantes de cultura concentrada não desglicosilada: estirpe MV98-8C tran£ formada com plasmidio pKan7O7 pista 7) ou pYG72óB (pista S); sobrenadantes de cultura concentrados, depois tratados com endoglicosidase H; estirpe MV98-8C transformada com o plasmidio pKan7O7 (pista 9) ou com o plasmidio pYG226B (pista 10); 0,25 >-tg de TIMP humano (Rhône-Poulenc Santé, pista ll).

EXEMPLOS

Técnicas

Gerais de clonagem

Encontram-se descritas na literatura (Maniatis, /

T. e outros, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982; Ausu bei, F.M. e outros (eds), Current Protocols in Molecular Bicç logy, John Wiley &. Sons, New York 1987) os métodos clássicos da biologia molecular tais como a centrifugação em gradiente de cloreto de césio brometo de etídio, do ADN plasmídico digestão com enzimas de restrição, electroforese sobre gel, electro-eluição de fragmentos de ADN a partir de geles de agarose, transformação na E. coli e similares.

Obtiveram-se os enzimas de restrição a partir dos New England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham.

Para ligação, separam-se os fragmentos de AND , de acordo com as dimensões, geles de agarose a 0,7 % ou sobre geles de acrilamida a 8 purificaram—se por electro-elui ção, extrairam-se com fenol, precipitaram—se com etanol e, depois incubaram-se num fempâo constituídos por Tris-HCL 50 mM, MgCl^ 10 mM, ditiotreitol 10 mM, ATP 2 mM, a um pH 7,4, na pre sença de ADN ligase T4 de bacteriófago (Biolabs).

Se necessário, desfosforilam-se os fragmentos de ADN que possuam extremidades 3' reentrantes, por tratamento com fosfatase alcalina intestinal de vitela (CIP, Pharmacia) a 37°C, durante 30 minutos, no tampão seguinte: glicina 100 mM, MgCl^ 1 mM, Ζηθΐ£ 1 mM, e um pH 10,5· Utilizou-se idêntico pro cedimento de desfosforilação para as extremidades 5 reentrantes ou complementares, mas o tratamento teve a duração de 15 minutos a 37°C e depois 15 minutos a 56°C. Inactiva-se o enzima por aquecimento da mistura reaccional a 68°C durante 15 minutos na

presença de SDS a 1 com fenol/clorofórmio e NaCl 100 mM, seguindo-se a e a precipitação com etanol.

extracção

Efectua-se a coraplementarização da extremidade reentrante 3', com o fragmento Klennow da ADN polimerase da E. coli (Biolabs). A reacção efectua-se a temperatura am biente, durante 30 minutos num tampão que compreende Tris-HC1 50 mM, dNTPs 0,4 mM, MgSO^ 10 mM, ditiotreitol 0,1 mM, ,Ug/ml de BSA (albumina de soro de bovino), a um pH 7,2. A complementarização das extremidades 5' reentrantes efectua-se na presença de ADN polimerase T4 de bacteriófago (Biolabs), de acordo com as instruções do fabricante. A digestão das extremidades reentrantes efectua-se por tratamento limitado com buclease Sl (BRL), de acordo com as instruções do fabricante.

Efectua-se a mutagénese dirigida de um oligo-desoxi-nucleótido, de acordo com o método desenvolvido por Taylor e outros (Taylor, J.W. e outros, Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749 - 8764), utilizando o Kit distribuído por Amersham. Efectuou-se a sequência nucleotídica de acordo com o método de terminus de cadeia (Sanger F. e outros, Proc. Natl, Acad. Sei. USA, 74 (1977) 5463 - 5467). Efectuou-se a amplificação enzima tica dos fragmentos específicos de ADN de acordo com o procedimento de Reacção de Cadeia de Polimerase (Mullis K.B. e Falo^ ona F.A. Meth. Enzym. 155 (ΐ9θ7) 335 - 350, Saiki R.K. e outros, Science 230 (1985) 1350-1354), com um ciclizador térmi^ co de ADN (Perkin Elmer Cetus), seguindo as recomendações do f ornecedor.

Utiliza-se o ADN ligado para transformar as células competentes obtidas a partir das seguintes estirpes

- 4θ Ε. coli MClOóO (/iacPOZYA/, Χγ4, galU . galK. strA^r) ou TG1 (/ lac pro A,B7, supE, thi, hsdD5/E¹traD3ó. proA⁺B+, lacl^q, lacZ M15). Purifica-se o ADN plasmídico a partir de transformantes resistentes á amplicilina ou tetraciclina, consoante adequado. Efectua-se a extracçao do ADN plasmídico de acordo com o procedimento descrito por Maniatis e outros (Maniatis, e outros Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982), que deriva do método de lise alcalina descrito por Birnboim e Doly (Birnboim, H.C. e Doly, J., Nucleic Acids Res. _7 (l979) 1513 -1523). Para uma análise plasmídica rápida, preparam-se os lisatos bac terianos de acordo com o método de Holmes e Quigley (Holmes,

D.S. e Quigley,' Μ. , Anal. Biochem. 114 (1981) I93 - 197), e submeteram-se a análise electroforética sobre gel de agarose sem purificaç3o prévia. Apos análise de endonuclease restrição de preparam-se em larga escala os plasmídios recombinantes, que apresentaram a estrutura desejada, de acordo com o procedimento de -lise alcalina (Maniatis, T. e outros, Molecular Cloning; a Laboratory Manual, Cold Sring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., 1982), utilizando culturas de 0,5 a 1 litro e, purificaram—se por centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio.

Encontram-se descritas no texto a transformação de K. lactis com ADN estranho e a purificação do ADN plasmídico de K. lactis.

Exemplo 1: CLONAGEM DE UMA SEQUÊNCIA CONTENDO 0 GENE ESTRUTURAL DE prepro-HSA

E.l. .

Isolamento de um clone de ADN complementar (cADN) que

- 4l -

codifica HSA.

A construção de plasmídios recombinantes que permitem a expressão de HSA na E. coli foi pormenorizadamente descrita no anteriorPedido de Patente europeia No. 0198745 (pedido de patente Europeia No. 198 7^5 publicada em 22.10. 1986). Em resumo, obteve-se o cADN a partir de mAJRN poli(A) isolado a partir do fígado humano de acordo com o procedimento de guanida (Chirgwin, J.M. e outros Biochemistry 18 (1979) 5294 pp.). A análise da sequência de ADN permitiu o isolamento de três clones ( pTIBll, pAA38 e pÓD8), Figura l) que contêm os fragmentos de encaixe do gene estrutural da albumina e possuíam sítios de restrição comuns nesses fragmentos de encaise. Utilizaram-se estes sítios na reconstrução do clone de cADN para HSA (Figura l) que se encontra completo com excepçâo da sua sequência prepro.

E. 1.2. Síntese de sequência prepro de HSA

No plasmídio pXL276, cuja construção se encontra descritz detalhadamente no pedido de patente Europeia No.

198 745, fundiu-se estruturalmente a sequência que codifica a HSA madura com o codão ATG do sítio de ligação ribossómica (RBS) do gene CII do bacteriófago lambda (Figura ²). Isto gera-se no sítio Ndel imediatamente a montante a partir do codão de iniciação de transferência do gene HSA. Utiliza-se o pXL27ô para reconstituição da região prepro de HSA, que se descobriu ser truncado no cADN logo a montante do sítio Taql no aminoácido -1. Consegue-se a reconstituição inserindo um fragmento de ADN correspondente à sequência prepro de HSA

- 42 forma de quatro oligo-desoxinucleótidos de 33—36 bases de extensão (Sq32, Sq34, Sq35 ® Sq38; Figura 2) e um fragmento

EcoRI-Ndel de 120 pb derivado de pXL276 portador de sinais de expressão dos genes de E. coli entre os sítios EcoRI do pla_s mídio pUC8. Destemodo, reconstitui-se o sítio Taql numa extremidade da inserção deste plasmídio designado por pXL290 (Figura 2). Ligou-se o pequeno fragmento HindIII-Tqal portador de RBS e da sequência prepro a montante do sítio Tqal com o fragmento Taql-PstI do clone de cADN de HSA (plasmídio plBll que contém a extremidade 5 de HSA) entre os locais HindIII e PstI de pUCB, para proporcionar o plasmídio pXL299 (Figura 3). Construiu-se o plasmídio pXL322 ligando o fragmento HindlII-PvuII de pXL299, portador do RBS e da sequência prepro de HSA acima do sítio pvuli, com o grande fragmento pvuII-EcoRI de pXL276, que suporta o replicação e a extremidade 3 da sequência que codifica HSA e com o fragmento EcoRI-HindIII de pXL276 que contém o promotor (Figura 4).

E. 1.3. Criação de um sítio HindIII a montante do codão de início de transferência

No sentido de se obter uma sequência prepro-HSA susceptível de ser facilmente integrada em vectores de expressão, alterou-se o sítio Ndel do plasmídio pXL322, descrito an teriormente, no sítio HindIII por mutagénese dirigida de um oligonucleótido. Com esta finalidade, subclonou-se o fragmento HindIII-BglII de pXL322, contendo a extremidade 5' do gene de prepro-HSA, no interior de ?113mpl8 e e, efectuou-se a mutagénese por hibridizaçâo do oligodesoxi-nucleotido de sintese,

- 43 5'-ATCTAAGGAAATACAAGCTTATGAAGTGGGT-3' com a matriz de cordão simples (as sequências sublinhadas e a cheio, representam, respectivamente, o sítio HindIII e o sítio de início de trans ferência). Obteve-se, assim, o plasmídio pXL855 (Figura 5), cuja sequência nucleotídica de região que sofreu mutagénese se verificou pela utilização do método de terminação de cadeia. Reconstituiu-se a sequência que codifica a prepro-HSA completa, por inserção do fragmento HindIII-PvulI do fogo que sofreu mutagénese e do fragmento PvulI-HindIII de pXL322, que contém a extremidade 3' do gene estrutural de HSA, no sítio HindIII de pUC8 para proporcionar o plasmídio pXL869 (Figura

6). Este plasmídio, contém, por isso, um fragmento HindIII de 1,87 Kb que cohtém o gene estrutural de prepro-HSA completo bem como uma região não transferida de 6l pb na sua extremida de 3'· Na Figura 7, indica-se a qequência completa do fragmen to HindIII assim como a sequência aminoácida de HSA recombinante. Construiu-se uma sequência HindIII contendo o gene estrutural de Met-HSA sem qualquer sinal de secreção, seguindo um procedimento idêntico excepto no facto de se ter efectuado a mutagénese de um derivado M13 do plasmídio pXL276 utilizando o oligo-desoxi-nucleótido 5¹-ATCTAAGGAAATACAAGCTTATGGATGCACAC AAG-3'. A reconstituição da sequência que codifica Met-HSA com pleta no pUC8 proporciona o plasmídio pXL868, que se obteve de modo idêntico ao plasmídio pXL869Exemplo 2: CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE CLONAGEM DE LEVEDURAS

E.2.1. Isolamento e purificação do plasmídio pKDl

Pode purificar-se o plasmídio pKDl, a partir de

4uma última fase de crescimento logarítmico de uma cultura de

K. drosophilarum UCD 51-130 (U.C.D. collection, University of Califórnia, Davies, CA 95Ú1Ó) de acordo com o procedimento seguinte, derivado do descrito por Fleer e outros (Mol. Biol.

(1987) 1180 - 1192). Centrifugou-se uma cultura de 1 litro em meio YPD (extracto de levedura a 1%. Bactó-peptona (Difco)a 2% glucose a 2%), lavou-se e efectuou-se a sua suspensão numa solução de sorbitol 1,2 M e converteram-se as células em esfero plastos na presença de zimoliase (300 ug/ml), EDTA 25 mM, fosfato 50 mM e J-S-mercapto-etanol (lyug/^rnl)· Após lavagem numa solução de sorbitol a 1,2 M, voltou a efectuar-se nova suspensão dos esferoplastos (correspondendo a 250 ml de cultura origi nal por tubo) em 2,5 ml de sorbitol 1,2 M e adicionou-se o mes mo volume de tampão constituído por Tris-HCl 25 mM, glucose 50 mM e EDTA 10 mM, a um pH 8,0. Os passos subsequentes correspondem ao procedimento de lise alcalina já descrito (Maniatis, T. e outros, Molecular Cloning; a Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982), com excepção da precipitação que se efectuou a 23°C, durante 15 minutos, adicionando l4 ml de isopropanol. Trata-se o material obtido com RNase (50 ^/íg/ml) a 37°C, durante 20 minutos e depois com proteinase K (150 >ug/ml) numa solução que compreende NaCl 0,5 M, sarcosilo a 0,5 % e EDTA 25 mM, durante 1 hora, a 60°C. Após centrifugação numa microcentrifugadora Eppendorf, precipitaram-se os sobrenadantes com etanol durante 10 minutos a -70°C e, depois dissolveram-se os agregados e purificou-se o ADN por centrifugação em gradiente de densidae de CsCl, na presença de brometo de etídio.

E.2.2. Construção do plasmídio pCXJl

A construção intermédia pUC-URA3 (Figura 8), consiste num fragmento HindIII de 1,1 Kb, contendo o gene URA3 de S. cerevisiae inserido no único sítio NarI do plasmídio pUC19 (Yanisch-Perron, C. e outros, Gene 33 (1985) 103 - 119)· 0 fragmento HindIII deriva do plasmídio pG63 (Gerbaud,

C. e outros Curr. Genet. A (ΐ9θΐ) 173 - Ι8θ) que foi digerido com HindIII e depois tratado com o fragmento Klenow de ADN polimerase I de E, coli, para dar origem a extremidades complemen tares. Purificou-se o fragmento de 1,1 Iíb contendo o gene UR A 3 e depois inseriu-se no plasmídio pUC19, cortado com NarI e tratado com o fragmento Klenow da ADN polimerase I da E. coli. 0 plasmídio pUC-URa3 contém, por isso: uma origem de replicação para a conservação do plasmídio na B. coli, o marcador da resis tência à amplicilina para transformações na E. coli, o gene la cZ, contendo uma região de ligação múltipla (EcoRI, Saci,

Kpnl, BamHI, Xbal, Sall, Sphl, HindIII, como sítios únicos) e o gene URA3de S. cerevisiae que serve como um marcador selec cionavel nos mutantes uraA de K. la c tis .

plasmídio pCXJl (Figura 9) contém a sequência completa do plasmídio pKDl inserida no único sítio Aatll de pUC-URA3. Esta construção obteve-se por linearização de pKDl no sítio EcoRI e tratamento deste plasmídio com o fragmento Klenow de AND polimerase I da E. coli. Liga-se este fragmento de ADN com pIJC—URA3, cortado previamente com aatll e, tratado com ADN polimerase T4. A ligação destes dois fragmentos permite a reconstituição dos sítios EcoRI. A inserção do ADN de pUC-URA3

no sítio EcoRI do plasmídio pKDl não inactiva qualquer gene necessária para a conservação da estabilidade do plasmídio e do número de cópias (encontrando-se o sítio EcoRI localizado 205 nucleótidos (nt) a montante do codão ATG do gene B; Chen, X.J. e outros Nucl. Acids Res. l4 (1986) 4471 - 448l). Como consequência, o plasmídio pCXJl, que transforma alta frequência as células K. lactis uraA cir°, e amplificado em cerca de 70-100 cópias por células e conserva-se de modo estável mesmo na ausência de pressão selectiva. Devido à origem de replicaçâo com que o pUC-URA3 contribuiu, o plasmídio pCXJl também se pode replicar na E. coli , facilitando deste modo, a construção do plasmídio e os passos de purificação. Os únicos sítios do plasmídio pCXJl que se podem utilizar para se inserir ADN estranho são os sítios HindIII a Dali da região de ligação múltipla de pUC19.

E.2.3. Construção de uma fusão entre o promotor pKl de K. lactis e o gene de aminoglicosido fosfotransferase de Tn9O3

A utilização de pCXJl como um vector para a transformação de K. lactis e de outras espécies Kluyveromyces limita-se a estirpes portadoras da mutação cromossómica uraA como um marcador auxotrófico. Com o intuito de tornar possível transformarem-se estirpes industriais primitivas de Kluyveromyces , escolheu-se o gene de amonoglicosido transferase (aph) do transposão bacteriano TnQO3 como marcador dominante de resistência antibiótica que se inseriu em pCXJl. 0 gene aph confere resistência a canamicina na E. coli e, se expresso nas estirpes de levedura de tipo selvagem, confere resistência ao antibiótico G4l8 (geneticina), que é um inibidor potente do crescimento celular (Jimenez, A. e Bavie; J., Nature 287 (1980) 869 - 871). Para permi tir uma expressão su ficientemente forte do gene aph em K. lactis, substituiram-se os sinais de transcrição bacteriana do gene aph pelo promotor 0RF1 (pkl) isolado a partir da toxina mortal do plasmídio Kl de K, lactis.

A construção de Pkl-aph efectua-se em diversos passos (Figuras 10 a 12). Em primeiro lugar efectua-se a subclonagem do fragmento Scal-PstI do plasmídio Ll entre os únicos sítios Seal e PstI de pBR322. Designa-se por pKl-PS1535 (Figura IO) o plasmídio recombinante sensível à amplicilina e resistente á tetraciclina. 0 fragmento subclonado Scal-PstI de 1,5 Kb, deriva de urna extremidade do plasmídio linear mortal: contém a porção 5' 8e 0RF1 transportada pelo plasmídio Kl e cerca de 220 pares de bases a montante (Sor,

F. e Fukuhara, H., Curr. Genet. 9. (ΐ9θ5) 147 - 155). Uma vez que o sítio Seal se encontra localizada a apenas 22 pares de bases da extremidade esquerda de Kl (Figura IO), o fragmento Scal-PstI de 1,5 Kg contém, provavelmente, a região promotora completa de 0RF1 (pkl). A digestão de pKl-PS1535-6 com Ddel proporcionou um fragmento de 266 pares de bases contendo 17 pb derivados de pBR322 numa das extremidades (próximo de Seal) e os primeiros 11 codões de 0RF1 na outra extremidade. Após tratamento com o fragmento Klenow de ADN polimerase I de E. coli, insere-se o fragmento purificado no único sítio Xhol do plasmídio pUC-Kanl (Figura ll). Obteve-se o último plasmídio por inserção de um fragmento EcoRI de 1,25 kb contendo o gene a ph derivado de Tn9O3 (Kanamycin Resistence Gene Block, Pharmacia) no único sítio de pUC19. Obteve-se o plasmídio pUC-kan202 efectuando a digestão de pUC-kanl com Xhol, seguida de uma breve digestão com nuclease Sl, tornando as extremidades complementares, seguindo-se-lhe a ligação com o fragmento Ddel de pKl-PSl535-6, tornando as extremidades complementares com o fragmento Klenow de ADN polimerase I de E. coli (Figura ll). Esta construção torna possível obter-se uma fusão estrutural entre os primeiros 11 aminoácidos do gene 0RF1 do plasmídio linear Kl e a extremidade 5 truncada do gene aph de Tn9O3. De facto, a junção entre 0RF1 e aph restaura o décimo segundo codâo de aph (AGG) uma vez que os primeiros onze aminoácidos de aph foram substituídos pelos primeiros onze aminoácidos de 0RF1. Na Figura 12, apresenta-se a sequência completa do pro motor 0RF1 utilizado para a fusão Pkl-aph, conjuntamente com o início do gene estrutural que codifica aph.

E.2.4. Construção do plasmídio pKan 707 plasmídio pKan7O7 (Figura 13) deriva do plasmídio pCXJl, anteriormente descrito. Constroi-se cortando o plasmídio pCXJl com KindIII e tratando-o depois com o fragmeri to Klenow de ADN polimerase I de E.co1i. Depois liga-se o plasmídio linearizado com extremidades niveladas, com o fragmento Scal-HincII, de 1,2 Kb, derivado do plasmídio pUC-Kan202 portador da fusão pkl-aph (Figura 13). A digestão de pDC-Kan202 com Seal e HincII proporciona uma sequência resistente à canamicina de extremidades complementares contendo apenas o promo- 49 tor bacteriano original. C plasmídio obtido, pKan7O7, confere resistência a níveis muito elevados de G4l8 ( ;> 2,5 g/l) às estirpes de K. la eti s♦ Tal como no caso de pCXJl, o plasmídio pKan7O7 pode ser introduzido nas estirpes K. lactis circo a uma frequência elevada amplificado até 70-100 cópias por célula e conservar-se de modo está\'el na ausência de pressão sele_c tiva (Figura l4). A grande sensibilidade a G4l8 da maioria das estirpes de Kluvveromyces, combinada com um marcador dominante eficaz permitindo a transformação de estirpes industriais, torna pKan7O7 um vector de clonagem muito útil para as le_ veduras do género Kluyveromyces.

Exemplo 3: CONSTRUÇÃO DE VECTORES DE EXPRESSÃO CONTENDO AS

SEQUÊNCIAS DE EXPRESSÃO E/OU SECREÇÃO PARA A ALBUMINA NAS LEVEDURAS

E.3.1. Construção de sequência de expressão para Met-HSA e prepro-HSA sob o controlo do promotor PGK de S. cerevisiae plasmídio pYG12 (figura 15), contém um fragmento de restrição SalI-BamHI de 1,8 kb, que consiste nas regiões promotora e terminante do gene PKG de S. cerevisiae.Este fragmento deriva de um fragmento genómico HindIII de 3,0 Kb a partir do qual se eliminou um fragênto de 1,2 Kb corresponden te ao gene estrutural e que compreende uma região entre o ATG d de iniciação de transferência e o sítio BglII localizado 30 codões a montante do codão TAA que especifica o termo da trans ferência (Mellor, J. e outros, Gene 24 (1983) 1 - l4). Destroem-se depois os sítios HindIII que flanqueia o fragmento de

1,8 Kg obtidos desse modo, e substituem-se por um sítio Sall e

BamHI, respectivamente a montante da região promotora e a jusante do terminante de transcrição PGK. Introduz-se, depois um sítio HindIII, na junção entre as regiões promotora e de terminus; uma vez que o sítio é único possibilita a fácil in trodução dos genes heterólogos. Na Figura 15, apresenta-se a sequência nucleotídica desta região. Depois introduz-se o frag mento HindIII de 1,8 Kb derivado do plasmídio pXL&68 (ver E.I. 3.) e que codifica a Met-HSA, no sítio HindIII do plasmídio pYGl2 para proporcionar o plasmídio recombinante pYGlO. De um modo semelhante, origina-se o plasmídio pYGll, pela inserção no plasmídio PYG12 de um fragmento HindIII derivado do plasmídio pXL869 (ver E.I.3) ^{r e} que codifica a prepro-HSA (Figu ra 15)· Como consequência, construiram-se assim duas sequências de expressão SalI-BamHI de cerca de 3,6 Kb de extensão, compreendendo o promotor do gene PGK de S. cerevisiae (PPGK), seguido do gene que codifica ou a Met-HSA ou a prepro-HSA e finalmente a região correspondente ao terminante de transcrição do gene PGK (TPGK), uma região que engloba o sítio de poliadenilação do mARN.

E.3.2. Construção dos plasmídios de expressão pYG19, pYG23 e pYG221

Com o objectivo de se introduzirem as sequências de expressão anteriormente descritas no vector pKan7O7, subclonaram-se, numa primeira fase, os fragmentos SalI-BamHI de 3,7 Kb, derivados dos plasmídios pYGlO e pYGll, nos sítios correspondentes do plasmídio pIC-20R (Marsh, L. e outros,

Gene 32 (1984) 48l - 485), para proporcionar, deste modo, as construções plasmídicas PYG18 (prepro-HSA) (Figura l6) e PYG22

1(Met-HSA). Estas construções intermédias proporcionam seguências de expressão PpGK/f-iet-HSA/TpGK e PpGK/prepro-HSA/TpGK na forma de fragmentos de restrição que podem ser inseridos direjc tamente nos sítios correspondentes de pKan7O7 (Figura 17)· A digestão dos últimos com as enzimas Sall e Saci conduz à eliminação do marcador URA3 assim como a do fragmento de 357 pares de bases localizado a montante do gene E de pKDl. As cons trução assim obtidas, designadas por pYG19 (prepro-HSA) (Figu ra ltí) e pYG23 (Mest-HSA), compreendem as sequências de expre£ são PPGK/HSA/TPGK, a sequência virtualmente completa do plasmí dio pKDl do K. drosophilarum, as sequências que permitem a replicação autónoma na E. coli, bem como os genes que codificam a ^-lactamase e 3'-aminoglicosido transferase (sob o controlo do promotor Pkl), tornam possível a selecção, respectivamente, de E. coli na presença de amplicilina e K. lactis, na presença de G4l8.

Também se constituíram os vectores de secreção de HSA que retêm o gene URA3 do plasmídio pKan7O7· Conforme se indica na Figura 19A, o plasmídio pYG2O8 derivado do plasmí dio pYG12 por inserção de um adaptador BamHl/Sal (5'-GATCCGTC GACG-3') a jusante do terminante PGK. Purificou-se o fragmento HindIII que codifica a prepro-HSA por electro-eluição, a partir do plasmídio pXL869 (prepro-HSA) e, clonou-se no sentido correcto no sítio HindIII do vector pYG2O8 para dar origem ao plasmídio pYG210. Purificou-se a sequência de expressão Sall originada deste modo (promotor PGK/prepro-HSA/terminante PGK) por electro-eluição e clonou-se no sítio Sall do plasmídio pKan7O7 para originar os plasmídios de expressão pYG221A

2e pYG221B (Figura 19 B), que apenas diferem um do outro no sentido relativo da sequência de expressão Sall no que respeita ao vector pKan7O7. No plasmídio pYG221B o sentido da sequência de expressão Sall que se refere ao gene Km que co. difica a resistência a G4l8 é idêntica a da sequência de expressão de Saltl-SacI suportada pelo plasmídio pYG19.

E.3.3 Construção do promotor hidrido PGK/LAC com contexto de ATG optimizado

No sentido de se obter um derivado susceptível de ser induzido do promotor PGK presente no plasmídio de expressão pYG19, substituiu-se o UAS do promotor PGK pelo UAS derivado do promotor LAC4 de K. lactis (Breuning, K.D. e outros, Nucl. Acid Res. 12 (l984) 2327 - 234l). Com esta finalidade efectuou-se a clonagem do fragmento SalI-HindIII de pYGl2, contendo o promotor PGK no bacteriófago M13mpl8, proporcionando a construção de pYGl4 (Figura 20). Utilizando o protocolo anteriormente descrito, introduziram-se então, dois sítios Notl na região promotora de PGK por mutagenese comanda da de um sítio, dando origem a construção de pGY26 (Figura 20). Os oligonicleotidos que se utilizaram, com este propósito, foram:

5'-CAAAACCTGTGA GCGGCCGCTAGGACCTTG-3'(Sp4l7) e

5'-GGTAATTTCTTTCTCGATAA GCGGCCGCGTGCTTT ATG-3’ (Sq4l6).

Deste modo, introduziu-se um total de alterações de quatro pares de bases (sublinhados) nas posiçõoes -379, -399, -536 e, -541 ( no que se refere ao codão de ini^ ciação ATG definido como +1;(Figura 2l). Os dois sítios Notl (letras a cheio) obtidos deste modo flanqueiam a região do promotor PGK, que se referiu previamente conter dois domínios funcionalmente distintos (A e M, na Figura 21 A) de UAS (Stanway, C. e outros, Nucl. Acids Res. 15 (19^7) 6855 -6873). A digestão deste derivado de PGK com o enzima Notl permite a eliminaç3o de UASp^ ^{e a sua} subsequente substituição por um fragmento de síntese contendo o UASj^q flanqueado por sítios Notl (Figura 23), clonados em qualquer dos sentidos, no que se refere ao promotor PGK. Obteve-se o fragmento UAS^^^ por hibridização e subsequente ligação dos quatro oligo-desoxinucleotidos seguintes:

Sq526, cordão superior, fragmento 1:

(-448)5'GGC CGC TGT GAA AAG TGT AGC GGA AAT ATG TGG TCC GAG CAA CAG CGT CTT TTT CTA GTA GTG CGG-3' (-389)

Sq527, cordão superior, fragmento 2:

(-388) 5'-TCG GTT ACT TGG TTG ACA TTG GTA TTT GGA CTT TGT TGC TAC ACC ATT CAC TAC TTG AAG TCG AGT GTG AGC-3' (-319)

Sq528, cordão inferior, fragmento 1:

(-319) 5'-GGC CGC TCA CAC TCG ACT TCA AGT AGT GAA TGG TGT AGC AAC AAA GTC CAA ATA CCA ATG TCA ACC AAG T-3' (-382)

Sq525, cordão inferior, fragmento 2:

(-383) 5'-AAC CGA CCG CAC TAC TAG AAA AAG ACG CTG TTG CTC GGA CCA CAT ATT TCC GCT ACA CTT TTC ACA GC-3' (-448)

Os números entre parenteses indicam a posição de cada oligodesoxinucleotido no que se refere ao codão ATG (+l) no promotor LACA de tipo primitivo (Breunig, K.D. e

4. ( ’ outros, Nucl. Acids Res., 12 (1084) 2327 - 234l). Demonstrou-se que a região que abrange as posições de -328 a -435 engloba o primeiro dos três elementos UAS encontrados no pro. motor LAC4 (Breuning, K.D e outros, 5th Internat. Sympos. Genet. Industr. Microorgan. (1986) Alacevic M. e outros (eds.) 551 - 56O; Leonardo, J.M. e outros, Mol. Cell. Biol. (1987) 4369 - 4376). As letras impressas a cheio representam nucleotidos que fazem parte dos dois sítios No tl que flanqueiam o UAS do gene LAC4 de K . lactis: a sequência da junção de Sq527 complementar de Sq525, encontram-se sublinhadas.

Uma vez que se pensa que a sequência próxima do ATG de iniciação dos genes eucarióticos expressos, influencia a eficácia de iniciação de transferência (Kozak, Μ., Microbiol , Rev. 47 (1983) 1 - 45; H amilton, R. e outros, Nucl. Acid Res. 15 (1987) 3581 - 3593), modificou-se o contexto de ATG do promotor PGK, conforme se segue: através da mutagenese dirigiria de uin local, introduzindo-se um sítio de restrição Hindlll adicional (a cheio) na posição -25 do promotor PGK transportado por pYG2ó, originando assim o plasmidio pYG29 (Figura 20). 0 oligonucleotido que se utilizou nesta nesta experiência foi 5’-TATATTTG7'TGTAAGCTTAGATAATTACTTCC-3' (Sq449). Depois cio nou-se o fragmento UAS anteriormente descrito, nossítios No tl de pYG29 originando os plasmídios pYG63-l e pYG63-2 (Figura 22). Purificaram-se as regiões de promotor hibrido FGK/LAC4 dos últimos plasmídios como fragmentos Sall-Hindlll e ligaram-se a um adaptador de síntese HindIIl/BstEII compostos dos dois seguin tes oligonucleotjdos complementares: (i) 5'-AGC TTT ACA ACA AAT ATA AAA ACA ATG AAG TGG-3' (Sq45l) e (ii) 5'-GT TAC CCA CTT CAT

TGT TTT TAT ATT TGT TGT AA-3' (Sq452) o codão de iniciação de

prepro-HSA encontra-se representado por letras a cheio). Este adaptador reconstitui os 22 pb, imediatamente a montante do promotor PGK de tipo primitivo (Figura 21 B) e compreende os quatro primeiros codões do gene estrutural de prepro-HSA acima de um sítio BstElI natural. Depois, utilizaram-se os fragmentos Saltl-BstElI obtidos de acordo com este processo (que trans portam o promotor hibrido PGK/LAC4 com um constexto de ATG de iniciação optimizado), para substituir o fragmento de restrição correspondente (albergando o promotor FGK que não sofreu mutageneses) na construção de pYGl8 (ver Figura l6). Seguindo esta estratégia, obtiveram-se duas construções intermédias que apenas diferem na orientação de UAS com relação ao promotor PGK. Utilizaram-se estas novas construções para originar as sequências de expressão Sall-Sacl que se clonaram nos sítios de restrição correspondentes de pKan7O7 (Ver Figura 13), proporcionando os plasmídios pYG44-5 θ PYG44-7 (Figura 23). Estes plasmídios são isogénicos com excepção do facto de o fragmento Notl de síntese, que alberga o UAS^^^ se encontrar no sentido de tipo primitivo para o PYG44-5 e no sentido contrário para o plasmídio pYG44-7.

E.3.4

Construção de um vector para a secreção de prepro-HSA sob o controlo do promotor PH05 de S. cerevisiae de restrição motora e de cerevisiae .

BamHT-P s tl vector pEPHO (Figura 24) contém um fragmebto BamHI-PstI de 0,94 Kb que alberga a região proterminus do gene da fosfatase ácida (PH05) de S. Este fragmento deriva de um fragmento genómico de 2,03 Kb (Bajwa, W. e outros, Nucl. Acid Res.

(lQ84) 7721 — 7739) por anulação do gene estrutural PH05.

Esta anulação compreende as posições -3 (emielação ao codão de iniciação ATG + l) e +1109 ( o sítio Sau3A localizado a montante do codão de terminus TAG). Inseriu-se uma região de liga^ ção múltipla EcoRl/Smal/BamHI na junção entre o promotor e o terminante e pode utilizar-se como local de clonagem para a in trodução de um gene heterólogo. A junção entre o promotor PHO5 e esta região de ligação múltipla indica-se a seguir (a sequêri cia nucleotídica que corresponde à região de liganão múltipla encontra-se sublinhada):

5'-AAATTCGAGATTAG GAATTCCCGGGGATCC-3'

No sentido de se obter uma construção na qual o gene HSA se expresse sob o controlo do promotor PHO5 e a região principal não transferida do gene PGK, introduziu-se um sítio HindIII na posição -20 do fragmento promotor PHO5 derivado do plasmídio pEPHO. Com esta finalidade subclonou-se o fragmeri to SalI-EcoRI de pEPHO de 0,83 Kb da região de ligação múltipla do bacteriófago M13mp9 e, depois, efectuou-se a mutagenese da matriz de corsão simples resultante (pYGRF3), utilizando o oligodesoxinucleotido 5'-CCTAATCTCGAATAAGCTTGCTCTATTTG-3' (Sq487; o fragmento HindIII introduzido encontra-se representado em caracteres a cheio) como um aprontador mutagénico, originando o plasmídio pYGRF4 (Figura 24).

Para facilitaa a construção de uma diversidade de sequências de expressão contendo diferentes promotores e/ou terminantes, originou—se um derivado de plasmídio pIC-20R (ver Figura 16), no qual se destruiu o sítio HindIII da região de li. gaçâo múltipla por tratamento das extremidades coesas com o grande fragmento de polimerase 1 (Klenow) de E. coli. Depois

X.

- 57 utilizou-se este novo vector de clonagem (pIC-2ORAH3) para in troduzir o fragmento Sa11-BamHI do plasmídio pYG12 (ver Figu ra 15) contendo as regiões promotora e de terminus do gene de PGK, originando assim o plasmídio pYGél. Utilizando módulos promotores como fragmentos Sall-HindIII e módulos de terminus como fragmentos HindIII-BamHI. podem originar-se sequências de expressão com qualquer combinação dos sinais de iniciação ou de terminus de transcrição nos quais se clonou o gene estru ral que se pretende expressar aob forma de um fragmento de res trição HindIII. A digestão destas construções intermédias com os enzimas Sall e Saci permite a consequente introdução de novas sequências de expressão nos sítios correspondentes do vec tor de clonagem de levedura pKan7O7 (ver Figuras 17 θ 18).

Segundo esta estratégia de base, substituiu-se o fragmento do promotor PGK Sall-HindIII do plasmídio pYGÓl pe lo fragmento Sall-HindIIII de pYGRF4 que alberga o promotor PHO5. A inserção do gene estrutural de prepro-HSA, isolado do plasmídio pYG44-5 como fragmento HindIII (ver Figura 23) e a transferência da sequência de expressão resultante, como fragmento SalI-SacI, para o plasmídio pKan7O7, proporcionou o vector de secreção pYG^l (ver Figura 23). Deste modo, este plasmjí dio contém o promotor PHO5 de S. cerevisiae até 3 posiçâo-17 (incluindo todos os sítios de iniciação de transcrição) (Rudolph, H, e Hinnen, A., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84 (1987) 1340 - 1344), Figura 25) seguido de 21 pares de bases da sequen cia principal não transferida de PKG, o gene estrutural de prepro

-HSA e, finalmente, o codão de terminus de PI< G.

- 58 Ε.3·5 Construção de um vector para a secreção de HSA sob o controlo do promotor LAC4 de K. lactis.

Utilizando a técnica de reacção em cadeia de polimerase (PCR) (MuIIís K.B. e Faloona F.A., Meth. Enzim.

155 (1987) 335 - 350; Saiki P.K. e outros, Science 230 (1985) 135O-I354),amplificou-se o promotor CAC4 de K. lactis a partir de ADN genómico de levedura sob a forma de um fragmento de restrição SaII-HindíII. 0 ADN genómico total isolado a partir da estirpe CBS2359 serviu como matriz e utilizaram-se os oligo desoxinucleotidos de síntese que se seguem, como iniciadores da reacção de polimerase Taq (os sítios Sall e HindíII introduzidos a montante e a jusante do promotor LAC4 de K, lactis encontram-se representados por letras mais cheias):

1) 5'-CCC GTCGAC ATGTAGAGTAGACAACAGACAGGGAGGGC-3'

2) 5'-A AAGCTT ATCTTTCAGTTCTCGATGAGTATGTGTGTT -3'

A configuração destes iniciadores baseou-se na sequência de LAC4 previamente descrita por Leonardo J.M. e outros (Mol. Cell. Biol. (IQ87) 4369 -4376). 0 fragmento de restrição Sall-HindíII obtido deste modo, contém a região promotora de LAC4, abrangendo as posições -II98 a -1 (sendo o codão de iniciação ATG definido corno + l). Digeriu-se o material amplificado com os enzimas Sall e HindíII, clonou-se no plasrní dio pYG6l ver caítulo E.3.4) e confirmou-se a sua sequência nucleotídica utilizando o método de terminus de cadeia didesixi: (Sanger F. e oiHros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74., (1977)

5463-5467).

Seguidn e esquema geral descrito no capítulo an5 9terior, obteve-se um derivado de pKan7O7, designado por pYG4o4 (Figura 23), no qual o gene de prepro-HSA se expressa sob o controlo do promotor LAC4 susceptivel de induzir a lactose, de K. lactis. A sequência imediatamente a montante do codão de iniciação de HSA, na sua construção específica, deriva do pla_s mídio pYG44-5 (fragmento HindIII) e por isso contém parte da sequência principal não transferida do gene de PGK (ver capítulo E. 3.3) ·

E.3.6. Construção de um vector para secreção de HSA sob o con trolo do promotor PGK de K. cerevisiae e sinal de se ereção da toxina mortal de K, lactis ' Utilizando dois pares de oligodesoxinucleotidos complementares de sintese, reconstituiu-se um fragmento HindlII-Dral que contem os seguintes elementos: i) Os 21 pb proximais do ATG do promotor PKG, ii) a sequência principal da secreção (pre-região) do gene da toxina mortal do plasmídio Kl de K. lactis (stark M.J.P. e Boyd A., EMBO J. 5 (1986) 1995 - 2002), e iii) os primeiros 17 aminoácidos do gene pro-HSA até ao sítio Dral da extremidade N, estruturalmente fundidos com a pre-região da toxina mortal. Os quatro oligodesoxinucleotidos utilizados para esta construção foram os seguintes:

SqlOOO, cordão superior, fragmento 1:

5’AGCTTAGCTTTACAACAAATATAAAAACAATGAATATATTTTACATATTTTTGTTTTT

GCTGTC-3'

Sq998, cordão superior, fragmento 2:

5'-ATTCGTTCAAGGTAGGGGTGTGTTTGGTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCA

TCGGTTT-3' /

Sq996, cordão inferior, fragmento 1

5'AAAAACAAAAATATGTAAAATATATTCATTGTTTTTATATTTGTTGTAAAGCTA-3'

Sq997, cordão inferior, fragmento 2:

5'-AAACCGATGAGCAACCTCACTCTTGTGTGCATCTCGACGAAACACACCCCTACCTT

GAACGAATGACAGC-3'

As letras impressas a cheio representam os nucleotidos que fazem parte dos sítios HindIII e Dral utilizados neste ensaio; a sequência de junção de Sq996, complementar de Sq996, encontra-se sublinhada.

Após fosforilação dos oligodesoxinucleotidos Sq99é e Sq998, originou-se um fragmento HindIII-Dral de cordão duplo, de acordo com o esquema apresentado na Figura 26. Purificou-se este fragmento de 130 pb, por electroforese sobre gel e ligou-se a um fragmento Dral-Xbal contendo parte do gene estrutural de HSA isolado do plasmídio pXL869 (ver Figura 6). Colonou-se o fragmento HindiII-Xbal obtido mediante este procedimento, no bacteriófago M13mpl0, originando a construção pYG56 (Figura 26). Confirmou-se a sequência nucleotídica correcta deste plasmídio por sequenciação didesoxi.

Pode então reconstituir-se o gene estrutural com pleto de prepro-HSA por ligação dos seguintes três elementos: i) o fragmento HindIII-Xbal derivado de pYG^ú, constituído conforme descrito, ii) o fragmento Xbal-BamHI de pYGl8 (ver Figura l6) contendo a porção terminal carboxi do gene assim como a região de terminus de PGK e iii) um fragmento EamHI-HindiII do plasmídio pYG62. Este último plasmídio é um derivado da cons trução pYGól (ver capítulo E.3·^) no qual o fragmento Sall61

-HindIII, portador do promotor PGK, foi substituído pelo fragmento de restrição equivalente derivado do plasmídio pYG29 (ver Figura 20). Deste modo o fragmento BamHI-HindIII do plasmídio pYGÓ2, utilizado nesta construção, contém a origem de replicação da B« coli, o gene de resistência à amplicilina e o promotor PGK com um sítio HindIII introduzido na posição -25 (ver capítulo E.3.4). 0 derivado pIC resultante designou-se por pUG57. Utilizou-se este último plasmídio como fonte de um frag mento Sa ΙΙ-Sa cl que se clonou nos sítios correspondentes do vec_ tor de clonagem de leveduras pKan7O7 proporcionando o vector de expressão pYG5S (Figura 23).

E.3.7 Construção de um vector integrante para comandar uma sequência de secreção PGK/prepro-HSA para o locus RAG2 de K. lactis plasmídio p3l/RAG2:URA3 (Figura 27) amavelmente cedido pelo (Dr. M. Wesolowski-Louvel (institut Curie, Orsay, France) contém um fragmento genómico Nhel de 2,3 Kb que alberga o promotor e a região da extremidade N do gene estrutural de

RAG2 de K. lactis que, na maioria dos casos, codifica a fosfo— glucoseisomerase (Wésolowsski-Louvel M. e outros, Nucl. Acid Res, l6 (1988) 1714). Construiu-se o plasmídio p3l/RAG2:URA3 por inserção de um fragmento EcoRI de 1,6 kb derivado do plasmidio pCXJl (Figura 9), que alberga o gene URA3 de S. cerevisiae, no sítio EcoRI do promotor RAG2. Depois, clonou-se o fragmento Nhel de 3,9 kb assim obtido, no único sítio Nhel do plasmídio pBR322,

Por corte do plasmídio pYGl8 (Figura l6) com os enzimas de restrição EcoRV e Smal, obteve-se um fragmento de

3,7 kb contendo a mesma sequência de expressão PGh/prepro-HSA utilizada no vector de secreção de levedura pYG19 (Figura ló). A inserção desta sequência no único sítio Smal do plasmídio p3l/RAG2: URA3 (localizado na extremidade 3' do gene marcador URA3) originou as construções pYG6O-2l e pIGóO-5 (Figura 27) que apenas diferem uma da outra no que se refere à orientação da sequência de expressão prepro-HSA.

Por corte dos plasmídios pYGóO-21 e pYG6O-5 com o enzima Nhel origina-se um fragmento de 7,7 kb contendo a sequência de expressão eoo gene marcador de URA3, franquea do pelas sequências derivadas de RAG2. Estas últimas sequên cias servem para se conseguir a integração do fragmento completo até ao locus de RAG2 de K. lactis estirpe MW9S-8C através de recombinação homóloga. (Rotbstein R.J. Methods in Enzymol. 101 (1983) 202 - 21l). Confirmou-se a integração no locus RAG2 por análise de mancha Southern de três dos seis integrantes ensaiados (MK98-8C::60-5 clone integrante ==£> e MW98-8C::60-21 clones integrantes 4^7 ^e 9)· Verificou-se que os três integrantes restantes eram portadores de uma MV98-8C : : 60-5, clone integrante =$6 ^e I*5W98-8C : : 60-21, clone integran te =^ll) ou duas (MV98-8C; ; 60-5 clone integrante 4^4) sequêii cias de expressão de HSA integradas noutros locais diferentes de RAG2. Ensaiaram-se os seis integrantes confirmados, quanto â sua eficácia, na secreção de HSA.

Exemplo 4: TRANSFORMAÇÃO DA ESPÉCIE KLUYVEROMYCES COM PLASMÍDICS QUE EXPRESSAM HSA

E.4.1 Procedimentos de transformação

Obtiveram-se os transformadores de K. lactis.

estirpe MW98-8C ( qÇ uraA arg lys K+ pKDl°) de acordo com técnicas de formação de esferoplastos inicialrnente descritas por (Hinnen, A e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75 (l97S) 1929 - 1933) e adapt aram-se adequadamente, ou por tratamento da totalidade das células com acetato de lítio (ito, H. e outros, J. Bacteriol. 153 (1983) 163 - l68), o que favorece a in corporação de ADN na presença de polietilenoglicol (PEG 4000, Sigma). Obtiveram-se os transformantes de todas as outras estirpes de Kluyveromyces a seguir descritas., exclusivamente, por tratamento com acetato de lítio.

Depositou-se uma amostra da estirpe MW98-8C no Centraalbureau voor Schimmelkulturen (CBS) em Baarn Netherlands de acordo com o estabelecido no tratado de Budapeste onde foi registada em l6.09*1988 com o número CBS 579.88.

Já haviam sido descritas as modificações referentes à formação de esferoplastos (Bianchi, M. e outros, Curr. Genet. 12 (1987) 185 - 192). Quando se utiliza o método que envolve acetato de lítio, efectua-se o desenvolvimento celular a 28°C em 50 ml de meio YPD, com agitação e a uma densidade óptica de 600 nm (0D 6θθ) entre 0,6 e 0,8. Recolhem-se as células por centrifugação a baixa velocidade, lavam-se numa solução este rilizada de TE ( Tris-HCl 10 mM. , a um pH 7,4, EDTA 1 mM), efec tua-se novamente a sua suspensão numa solução de 3-4 ml de acetato de lítio (0,l m em TE) para se obter uina densidade celular g

de cerca de 2 x 10 c/ml e depois incubam-se a 30 C durante 1 hora com agitação moderada.

Incubaram-se, alíquotas de 0,1 ml ria suspensão resultante das células competentes, a 30°C, durante uma hora,

na presença de ADN e de PEG 4000 a uma concentração final de 35 Após choque térmico durante 5 minutos a 42°C, lavaram-se as células duas vezes com água esterilizada, voltou a efe_c tuar-se nova suspensão de 0,2 ml de água esterilizada e, trans feriram-se para tubos de 10 ml. Adicionou-se, então o meio YPD (5 ml) contendo agar a 0,7 $ θ conservado em fusão a 46°C e colocou-se imediatamente a mistura sobre lâminas YPD. Após solidificação adicionou-se uma camada adicional de 5 ml de agar da parte superior. Decorridas 18 a 24 horas de incubação a 28°C aspergiu-se sobre as lâminas 0,l6 ml de uma solução de G4l8 (Genecitin 50 mg/ml, GIBCO, Grand Island, N.Y.) e contaram-se os transformantes, decorridos 4-5 dias de incubação adicional a 28°C.

A colocação das células directamente na placa sobre YPD + G4l8 (isto é, omitindo a utilização do agar da parte superior) origina o aparecimento de clones de grandes dimensões para as células transformadas de K. lactis. No entanto deve utilizar-se uma concentração de G4l8 mais baixa (concentração final de 50 ug/ml) para se observarem as colonias, o que conduz à selecção dos mutantes parcialmente resistentes a G4l8 e derivados de células não transformadas. Para além disto, a efi cácia da transformação é, pelo menos, dez vezes inferior à eficácia observada após a expressão fenotípica do gene de resistência durante 18 a 24 horas.

E.4.2 Estabilidade mitótica dos plasmídios derivados de pKDi que expressão HSA em condições de crescimento não selec tivas

Mediu-se a estabilidade mitótica dos plasmídios

pYG19 θ pYG23, em intervalos de tempo diferentes, após desen volvimento em meio não selectivo; determinou-se, como razão entre as percentagens inicial e final de crescimento celular em lâminas YPD contendo 200 jag/ml de G4l8. Conforme se indica na Figura 28, ambos os plasmídios se mostraram excepcionalmente estáveis apesar do elevado nível de expressão de um gene heterólogo. Quando os transformantes da estirpe MW9S-8C se envolvem num meio não selectivo durante 40 gerações celulares, 40-45¹¾ das células mantiveram esses plasmídios.0 pias rnídio pYG19 apresenta uma estabilidade mitótica ainda mais elevada no K. Lactis, estirpe CB8683: mais de 80 das células conservaram o plasmídio após 40 gerações de crescimento não selectivo.

E.4.3 Transformantes de pYG19 e pYG23 de K. lactis MW98-8C: expressão e secreção de HSA

Os níveis de expressão e de secreção de células de K. lactis MV98-8C, contendo os plasmídios pYG19 (pre pro-KSA) e pYG23 (Met-HSA) determinam-se decorridos diferentes intervalos de tempo, após o desenvolvimento a 28°C num meio YPD não selectivo e com constante agitação. Obtêm-se os sobrenadantes da cultura por duas centrifugações consecutivas (5 minutos a 4000 rpm numa centrifugadora Kontron Hermie Z-365 K.) e depois, durante 10 minutos, al2000 rpm) no sentido de se eliminarem todas as contaminações possíveis pelas células. Aqueceu-se a 95°C uma amostra do segundo sobrenadante (0,5 ml), durante 15 minutos na presença de igual volume de tampão de amostra, contendo Tris-HCL O,125M, glicerol a 20^° 2-mercapto-etanol a 10 % (j3_ME), dodec il-sulf a to de sódio a

4,6 (USS) e azul de bromofenol a 0,4 5, Quando se deseja uma concentração de proteínas presentes no sobrenadante, adiciona-se 0,4 ml de uma solução de ácido tricloroacético (TCA) 100 ‘io p/v a 8 ml de sobrenadante e as proteínas precipitam em gelo durante uma hora. Recupera-se o material precipitado por centrifugação durante 20 minutos a 15000 rpm a depois solubiliza-se novamente, por aquecimento a 95°C, durante 15 minutos em 0,5 ml de tampão de amostra contendo Tris-HCl 63 mM, glicerol a 10 ?o, j3->lE a 5 DSS a 2,3 % e azul de bromofenol a 0,2^.

Detecta-se a expressão intracelular da albumina utilizando extractos de células preparados conforme se segue: efectua-se uma nova suspensão do equivalente a 0,25 ml de um agregado celular (lavado uma vez em solução tampão sa lina) no mesmo volume de tampão de lise conservado em gelo e fosfato 67 mM, a um pH 7, -ME 5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo lmM (FFMS), isupeptina, 2 uM e pepestatina A 2^uM (Sigma). Após adição de 0,5 ml de gotas de zircónio (0,5 mm de diâmetro) armazenado em tampão de fosfato (67 mM, a um pH 7,4) a 4°C, efectuou-se a ruptura das células por 7 períodos consecutivos de 30 segundos com um dispositivo de ruptura celular (Biospec Mini Bead-Beater, Biospec Products) intervalados por períodos de arrefecimento em gelo de 2 minutos. Nestas condições a eficácia da ruptura celular é superior a 90 conforme se verificou por contagem das células num microscópio de contraste de fase. Transferiu-se a fracção líquida despojada das pérolas de zircónio para um tubo Eppendorf e lavaram-se as pérolas 3 vezes com 0,2 ml de tampão de lise e depois recolheram -se no mesmo tubo Eppendorf. Por centrifugação do tubo, duran

te 15 mintutos a 4°C e a 12000 g, definiu-se uma fracção proteica solúvel (sobrenadante) e uma fracção proteica insolúvel (agregado). Separaram-se estas duas fracções e depois corrigiram-se no mesmo volume final de uma solução de tampão de amos, tra, após diluição.- Aqueceram-se estas amostras durante 15 minutos a 95°C e disposeram-se em camadas sobre um gel de DSS/ /poliacrilamida a 8,5 % precedida de um gel de agregação a 5%¹ (Laemli, RU Nature; 277; 1970 p. 680-685) θ, depois, submeteram-se a uma corrente de 25 mA até o azul de bromofenol atin gir o fundo do gel.

A Figura 29 indica o resultado de um ensaio t.í pico que torna possível fazer uma abordagem da expressão e secreção da albumina obtida com K. lactis estirpe MV98-8C trans formada com os plasmídios pYG19 (prepro-HSA) , pYG23 (Met—HSA) e pYG25 (desprovido de sequência de expressão) após desenvolvimento em 50 ml de meio VPD sem G4l8 a 28°C, durante 68 horas. Cada uma das amostras corresponde a 100 yjl da cultura original e torna possível a comparação das fracções solúveis e insolúveis e sobrenadantes de cultura, após migração num gel de poliacrilamida a 8,5 e, coloração com azul de Coomassie. Detecta-se uma banda de proteína que migra conjuntamente com a albumina comercial que serve como uma referência de peso mole cular nas amostras derivadas das células transformadas com os plasmídios pYG19 e pYG23, mas não nas células contendo o vector pYG25 que não contem o gene de KSA. Deverá ter-se em conta que, embora a totalidade da albumina expressa utilizando pYG19 (prepro-HSA) seja virtualmente exportada para o sobrenadante da cultura, toda a albumina produzida utilizando o plasmídio

8pYG23 (Met-HSA) se encontra presenta na fracção proteica ci toplásmica insolúvel. Para além disso, os resultados apresentados na Figura 29, demonstram células que contém o plasmídio celular presente em quantidad dante de uma cultura num balão formada com o plasmídio pYG19 propriadas ver secção E.4.6.), de atingir 150 mg de HSA/litro.

E.4.4. Detecção imunológica c lactis.

que a albumina excretada pelas pYG19 é a única protéina extra, s significativas. No sobrenade agitação, de MW98-8C transé desenvolvida em condições aa concentração da albumina poa albumina produzida pelo K.

. Pode ensaiar-se a identidade das proteínas de levedura que migraram conjuntamente com a albumina normalizada por detecção imunológica. Com esta finalidade, mancha-se um gel de poliacrilamida sobre um filtro de nitrocelulose (Schlei cher e Schuell, 0,45 >Um) utilizando um aparelho para efectuar manchas semi-seco (Biometra) num tampão de transferência conten do base TRis 25 mM, glicina 150 mM e metanol a 10^. 0 tempo de efectuaçâo de mancha e de 30 minutos utilizando uma corrente de aproximadamente 0,85 mA/cm e de superfície do gel. Após ter— -se efectuado a mancha, incuba-se o filtro 3 vezes, durante 5 minutos com 50 ml de tampão A leite em pó desnatado a 5 Tween 20 a 0,2 em tampão PBS (NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na^PO^ 4,3 mM), seguido da incubação durante 30 minutos em 40 ml de tampão A contendo anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra HSA e diluídos a 1:1000. Após três lavagens do filtro com tampão A, adiciona-se um segundo anticorpo biotinilado que reconhece os anticorpos do coelho (Kit Vectastais ABC Immuno Feroxidase,

Vector Laboratories), com base numa gota por 50 ml de tampão A. Após incubação do filtro durante 30 minutos, lava-se três vezes o filtro com tampão B (Tween 20 0,2 % em PBS) e depois incuba-se na presença de um complexo avidina DH/peroxidase H biotinilade. Prepara-se o complexo de avidina/peroxidase bioti nilada imediatamente antes de se utilizar, diluindo 1 gota de cada um rios reagentes A e B rio conjunto em 5 ml de tampão B, após incubação a 23°C, durante 30 mintos. Encuba-se o filtro numa dimuição do complexo de 1:10 em tampão B (50 ml no total) durante 30 minutos. Lava-se o filtro novamente com tampão B, durante períodos de 3 a 5 minutos e desenvolve-se durante 2-3 minutos numa solução de 10 ml contendo 1^0^ ^a /° e 10 ml de uma solução contendo 1 mg/ml de diaminobenzidina e 0,4 mg/ /NiCl^ em Tris-HCl 0,1, M, a um pH 7,4. A Figura 30 indica que K. lactis MW98-8C expressa (pYG23) e excreta (pYG19) uma proteína reconhecida pelos anticorpos policlonais anti-HSA.Este material antigénico encontra-se especialmente associado com a presença de uma sequência que expressa a albumina apesar de não ser detectável nos extractos celulares ou nos sobrenadantes da cultura a partir de leveduras transformadas com o vector sem a sequência de expressão.

E.4.5 Efeitos Cinéticos da Secreção de HSA

Conforme se indica na Figura 31A, a secreção da albumina realiza-se com efeitos cinéticos relativamente ba_i xos nuin tubo de Erlenmever. Os níveis máximos de excreção pare cem ter lugar após ~0 a 100 horas de incubação de uma cultura inoculada originalmente e 105 células/ml (Figura 31B). Não se detectou qualquer acréscimo ou decréscimo significativo entre

as 100 e 240 horas de cultura, o que sugere uma boa estabilidade de USA çestas condições de crescimento e de temperatura.

Uma vez que não houve acumulação de material de degradação proteolitica durante este período, pode concluir-se que não se encontrava presente nenhuma protease extracelular que pudesse degradar a albumina excretada.

Na Figura 32, apresenta-se uma representação gráfica dos efeitos cinéticos da excreção (a) bem como a curva de crescimento da estirpe MV98-8C transformada com o plasmí dio pYG19 (B); estes resultados indicam que a excreção da albumina continua a afectuar-se depois das células terem atingi^ do a fase de crescimento estacionário. Esta observação está de acordo com observações anteriores que se referem a outros sistemas de expressão nas leveduras (Tschopp, J. F. e outros, Brio/Technologv (1987) 1305 - 1308) .

E.4.6 Eficácia de secreção de HSA com os plasmídios pYG44, _PYG51, pYG4o4 e pYG58

Ensaiou—se a eficácia da secreção de HSA sob o controlo do promotor PGK de S. cerevisiae (plasmídios pYG19; Figuras 29 e 32), um promotor hibrido PGK/LAC4que optimiza o contexto de ATG (plasmídios pYG44-5 e pYG44-7; Figura 33), o promotor PH05 de S. cerevisiae (plasmídios pYG51? Figura 34 A) e o promotor LAC4 de K. lactis (plasmídio pYG4o4; Figura 35)· Para além disso, fundiu-se estruturalmente a sequência principal de secreção (pré-região) da toxina mortal de K. lactis com o gene estrutural de pro-HSA (plasmídio pYG58; Figura 34 B) e comparou-se a eficácia de secreção da proteína de fu-u- Λ são com a de prepro-HSA natural (para pormenores das constru ções plasmídicas ver capítulo 3). Podem resumir-se os resulta <:os obtidos com estas construções, conforme se segue:

nível de HSA segregado no meio de cultura, quando expresso a partir do promotor hibrido PGK/LAC4 presente no plasmídio pGY44 aumenta duas a três vezes se se cultiva rem as células em meio contendo glucose ao qual se adicionou lactose a meio da fase de crescimento exponencial e antes da fase de crescimento estacionário (Figura 33)· Não se observa este efeito se a adição de lactose for substituída por uma quantidade de glucose (não se indicam os dados). Se se cultivarem as células em meio contendo lactose como fonte de carbono, os níveis de HSA secretada não são tão elevados como os obtidos com meio contendo glucose (Figura 33B). No entanto o acréscimo de secreção de HSA mediado por lactose que se obser va após indução” das células a seguir â cultura inicial em glucose não depende apenas da presença do elemento UAS do pro motor LAC4 de K.la ctis. Este acréscimo mediado pela lactose, verifica-se iguaimente quando a secreção de HSA é comandada pelo promotor PGK (Figuras 33 A, B para os transformantes da estirpe MW98-8C; Figura 35 para os transformantes DBS2359) ou o promotor PHO5 de S. cerevisiae (dados não indicados).

A secreção de HSA sob o controlo do promotor LAC4 de K. lactis origina níveis mais baixos de HSA como os obtidos com o promotor PGK de S. cerevisiae (Figura 35). Por outro lado, a expressão de HSA comandada pelo promotor LAC4 é regulada de um modo firme: não se pode detectar HSA nos sobre nadantes da cultura de CBS2359, quando a única fonte de car72

bono disponível for a glucose (Figura 35)

De uni modo surpreendente, quando as células se desenvolvem num meio completo (YPD), a eficácia de secreção de HSA comandada pelo promotor PHO5 situa-se apenas ligeiramente abaixo da observada com construções contendo o promotor glicolítico PGK (Figura 34a) .

Λ substituição da sequência de sinal de secreção de HSA pela pre-região da toxina mortal de K. lactis não influencia nem os efeitos cinéticos nem a eficácia da secreção de HSA (Figura 34).

E.4.7 Eficácia de secreção de HSA com sequências de expressão integradas

Integrou-se a sequência de expressão de prepro -HSA -PGK presente na plasmídio pYGl<9, no ADN cromossómico de K. 1actis de acordo com o método de ruptura do gene num único passo descrito por Rothstein, R.J. (Methods in Enzymol. 101 (1983) 202 - 211; para detalhes experimentais ver capítulo E.3.7)· Conforme se indica na Figura 36, os níveis de HSA secretada no meio de cultura pelas estirpes integrantes (pistas 2-7) são, pelo menos, vinte vezes inferiores aos obtidos pelo derivado de pKDl, pYG19 (pista l). A secreção de HSA foi basicamente a mesma quando a integração da sequecncia de expressão ocorreu no locus de RAG2 ou no genoma de K. lactis (Figura 36). Para além disso, o sentido da sequência de expressão no que se refere ao gene marcador seleccionável URA3 não influi de modo significativo nos níveis de secreção de HSA (Figura 36) pistas 2 e 3. Observou-se, contudo, um acréscimo duplo de HSA secretada com transformantes, quando se integraram duas sequen

cias de expressão do genoma (Figuras 36, pista 5). Em resumo, a eficácia da secreção parede estar directamente relacionada com o número de cópias do gene estrutural transportado numa célula de levedura transformada.

E.4.8 Secreção de HSA numa diversidade de espécies e de estirpes do género Kluyveromyces

Utilizaram-se os plasmídiso pYG19, pYG221B ou pKan7O7 para transformar as seguintes estirpes de Kluyveromyces: ATCCl6o45 (K, marxianus var. bulgaricus ) , ATCC24178 (K. wyckerha mii), ATCC12424 (Κ. marxianus var. marxianus),

ATCC565OO (Κ. valtii), AT CC36906 (K. marxianus var. drosophilarum), CBS4574 (K. marxianus var. lactis) CBS683 (K. marxianus var. lactis) e MW98-8C (K. marxianus var. lactis) . Obtiveram-se níveis detectáveis de HSA segregada em todos os transformantes observados, apesar de se terem observado varia ções apreciáveis entre as diferentes espécies. Os níveis mais elevados verificaram-se utilizando transformantes de estirpes MV98-8C (CBS57^q,88) e CBS683, tendo-se observado o nível mais baixo com a estirpe ATCC16O45, quando apenas se pode detectar a HSA não degradada, utilizando métodos imunológicos (dados não apresentados). Os plasmídios pYG19 θ pYG221B veiculam níveis semelhantes de HSA em todas as estirpes ensaiadas.

Exemplo 5: PURIFICAÇÃO DE HSA SEGREGADA NO MEIO DE DESENVOLVIMENTO

Num ensaio de purificação típica, desenvolve-se a estirpe MV98-8C transformada com o plasmídio pYG19, num meio YPD, durante ~2 horas nas condições normalizadas anterior mente descritas. Liberta-se um sobrenadante da cultura (0,5 li. tros de todas as contaminações celulares por centrifugação e incuba-se a 4°C durante 15 minutos, na presença de etanol a 60% (v/v). Recupera-se o precipitado por centrifugação, volta -se a efectuar nova diluição em 10 ml de uma solução que compreende Tris-HCl 50 mM, a um pH 8,0 e depois verte-se numa coluna de azul Trisacrilo (i.B.F., França). Elui-se a albumina humana a partir desta coluna com uma solução de NaCl 3M. Após diálise das fracções contendo HSA contra Tris-HCl 50 mM, purificam-se estas fracções numa coluna MONO Q (Pharmacia) e eluem-se com uma concentração de NaCl de 0,25 M. Numa fase final a cromatografia sobre Superose 12 (Pharmacia possibilita a obtenção de HSA a uma pureza superior a 99 %, conforme se verificou a partir da coloração com sais de prata de geles de poliacrilamida LSS.

Exemplo 6 : CARACTERIZAÇÃO LA ALBUMINA SEGREGADA E PURIFICADA

A falta de um ensaio que torna possível medir in vitro as propriedades biológicas da albumina, não proporciona um meio fácil para se estabelecer a qualidade da albumina recombinante. Por esta razão, após a purificação, caracteriza-ee a albumina excretada pelo K. lactis de acordo com diversos ensaios físico—químicos e imunológicos. Estes ensaios demonstram que a albumina recombinante é segregada pelo K. lactis numa forma madura e na sua configuração nativa: não se distingue da albumina do soro humano extraída a partir do pias ma, no que se refere a todos os critérios.

Ε.6.. PAGE DSS: Coloração com Azum de Coomassie e Prata.

Efectua-se a electroforese sobre um gel de poliacrilamida DSS (7,5 />) (Figura 38 C) , conforme anteriormente descrito, ou utilizando o sistema de Phast Gel (Phar macia, Figura 38a). Compararam-se diferentes quantidades de albumina recombinante com uma preparação comercial de albumina normalizada (Sigma) extraída a partir de plasma humano. A coloração do gel com Azul de Coomassie (Figura 38C), ou com sais de prata (Figura 38-A.) indica a completa homogeneidade das amostras de albumina de levedura.

E.ó.2 Focalização Isoeléctrica

Efectua-se a focalização isoeléctrica a um pH situado entre 4,5 θ 6,0 (Phast Gel, Pharmacia, Figura 38b) e a um pH entre 4,0 e 7,0 (Immobiline, LKB). 0 ponto isoeléctri co de HSA recombinante e idêntico ao do HSA humana de referência (pl=4,8).

E.6.3 PAGE Nativa e Mancha imunolégica.

A electroforese de HSA recombinante num gel de poliacrilamida não desnaturado (10^-) , seguida de mancha efec tuada sobre um filtro de nitrocelulose e a imunodetecção nas condições anteriormente descritas na secção E.4.4., revelaria uma migração simultânea com a albumina normalizada extraída do plasma humano. Isto sugene, dum modo firme, que a maturação correcta de prepro-HSA recombinante tem lugar durante o proces so de secreção em K. lactis. Não se detectou HSA imaturo, o que implica a clivagem da sequência principal e da prepro-sequência de HSA se tenha efectuado eficazmente nesta levedura.

E.6.4 Cromatografia por crivagem molecular

Efectua-se a cromatografia por crivagem molecular com uma coluna superose 12 (Pharmacia). G_onservou__se o débito do tampão de eluição (Tris-HCl 50 mM, a um pH 8,0) a 1 ml/minuto. As concentrações de albumina recombinante e de albumina de referência, foram respectivamente, de 0,4 e de 1 mg/ml. Detectou-se a eluição na albumina, medindo a absorvência a 280 nm. Em ambos os casos, o volume de eluição foi i_ dênticp (ll,5 ml).

E.6.5 Cromatografia de permuta de aniões

Eluiu-se a ambumina recombinante, a partir de uma coluça MONO Q HR 5/5 (Pharmacia) a uma concentração de 0,31 M de NaCl, tal como a albumina de referência derivada do plasma humano. A Figura 39 indica as silhuetas cromatográficas obtidas para injecções de 100 ul de HSA recombinante (0,4 mg/ /ml) e da HSA de referência (0,5 mg/ml) utilizando uma coluna equilibrada com Tris-HCl 50 mM, a um pH 8,0 e, a um débito constante de 1 ml/minuto.

E.6.6 Cromatografia de fase invenrsa

Analizou-se o comportamento da albumina de l_e vedura por cromatografia de fase inversa numa coluna (C4) de nucleosilo com tampões A (água contendo ácido trifluoroacético a 0,1 % (TFA) e B (acetonitrilo contendo TFA a 0,1 %). A Figura 40 apresenta a eluição, com um gradiente de 20 a 80^ de B em A, da albumina de levedura, que apresenta o mesmo tempo de retenção da albumina de referência.

Ε.6.7. Composição aminoácida

Determinou-se a composição aminoácida da KSA recombinante por cromatografia de fase inversa, após hidrólise ácida (HCl 6λ^τ) e derivação com fenilisotiocianilo. Os resulta dos obtidos de acordo com este método demonstram claramente, uma composição idêntica à da albumina de referência derivada do plasma humano.

E.6.8 Sequência de extremidade N

A utilização de um aparelho automático para de gradação de Edman (Applied Biosvstems) indica que a sequência da extremidade N da HSA segregada por K . lactis e Asp-Ala-His-Lis-Ser-Glu-Val-Ala-His-Arg-Fen-Lis-Asp-Gli. A determinação desta sequência confirma os resultados derivados de ensaios electroforéticos sobre geles de poliacrilamida nativa e demonstra a maturação correcta e completa da albumina segregada pela levedura K. lactis.

E.6.9 Fluorescência do triptofano

Após a excitaçao a 295 nm, a emissão de fluorescência do triptofano simples apresenta o mesmo perfil para as albuminas recombinantes e plasmídicas (máximo a 337 nm) o que indica um meio hidrofóbico idêntico em redor desta aminoácido (Figura 4l).

E.6.10 Estabilidade Térmica

A albumina de referência (Sigma) e a albumina segregada pela levedura possuem estabilidade cinética idêntica a 75°C (Figura 42) o que sugere que as ligações que estabilizam a estrutura proteica (ligação dissulfureto e interacções hidro78 fóbicas) são idênticas em ambos os casos.

E.6.11 Reactividade contra os anticorpos monoclonais

Estudou-se a antigenicidade da albumina recombinante com diferentes anticorpos monoclonais dirigidos contra a albumina humana. A Figura 43 indica a sua especificidade: os anticorpos HA10, HA11 e HA13 correspondem a hepitopes cuja conservação requer a integridade de toda a molécula. Os anticorpos HA21, HA6, HA4, HA3, HA8 e HA1 correspondem a epitopes localizados ao longo da cadeia peptidica a partir da extremidade N até à extremidade C (Doyen, e outros, Mol. Immun. 22 (IQ85) 1 - 10; Lapresie, C., Anal. Biochem. 174 (ld88) 3O8-312).

teste utilizado foi um ensaio de inibição ELISA. Efectuou-se a adsorção com diferentes anticorpos em lâminas de poliestireno e estabeleceu-se para cada um dos anticorpos uma curva de ligação da albumina marcada radioactivamen te com fosfatase alcalina. As curvas de saturação para cada an ticorpo apresentavam uma aparência sigmoide e escolheu-se para estudar a inibição causada por cada um dos anticorpos a quantidade de albumina marcada radioactivamente correspondente a 50£ da ligação.

Efectuou-se a inibição com amostras de albumina recombinante e comparou-se com a obtida com uma amostra de albumina do plasma (Sigma). A Figura 44 indica que, para os novos anticorpos ensaiados, a albumina recombinante possui o mesmo poder de inibição da albumina nativa. Dada a extrema sen sibilidade do ensaio, as diferenças observadas não são sufici79 entemente signifi ca tiva s .

Exemplo 7: VECTORES L)E EXPRESSÃO DE LEVEDURA, CONTENDO UMA SEQUÊNCIA PARA A SECREÇÃO DE INTERLEUCINA-lβ .

E.7.1 Síntese do gene estrutural IL-1

A síntese química do gene estrutural que corresponde a IL-ljS já foi anteriormente descrita (Jung, G. e outros, Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 139 (ΐ9δθ) 129 - l46); em resumo, montou-se o gene estrutural a partir de l4 oligo— desoxinucleotidos assim como de um fragmento de restrição NdeO- Hindlll. Em comparação com a sequência publicada por Auron e outros (proc. Acad. Sei. 8l (1^84) 7907 - 791l), o εθne de síntese utilizado no presente exemplo contém as modifica ções seguintes: i) substituição do codão AGC (Ser) na posição 483 pelo codão TCC no sentido de se eliminar o sítio Hindlll; ii) substituição d.e T por C na posição 506 pa_ ra eliminar o sítio Ndel, iii) criação de um sítio EcoRI seguido de um sítio Ndel na posição 435 (GAATTCATATG) inclij indo a metionona de início de transferência; iv) adição da sequência AAGCTT na posição 896, no sentido de se introduzir um sítio Hindlll imediatamente a jusante do codão de terminação de transferência.

gene estrutural que codifica IL-1 .0 recombinante, encontra-se, assim disponível, na forma de um fragmento de restrição EcoRI-Hindlll contido num derivado do pla_s rnídio pUC19 designado por pCI131.

E.7.2 Construção de um vector de secreção contendo IL—lj3 sob o controlo do promotor PGK de S. cerevisiae e o sinal de secreção de toxina mortal de K. lactis.

Construiu-se o fragmento de ADN que correspon de ao sinal de secreção (região pre) do gene da toxina toxi^ na do plasmídio mortal Kl de K. lactis (Stark. M.J.R. e Boyd, A., EMBO J. 2 (1986) I955-2OOO2) a partir dos dois oligodesoxioligonucleotidos de síntese, que se seguem:

SqA : 5’-AATTATGAATATATTTTACTATTTTTTTTTTGCTGTCATTCGTT

CAAGGTAAAAG-3'

SaB : 5'-AATTCTTTTACCTTGAACGAATGACAGCAAAAACAAAAATATGT

AAAATATATTCAT-3'

Hibridizaram-se estes dois oligonucleotidos, reconstituindo, deste modo, a sequência principal da toxina mortal seguida de um dipeptido Lis-Arg, que representa um sítio potencial de clivagem reconhecível por uma endopeptidase produzida pelo gene KEX1 de K. lactis (Tanguy-Rougeau, C.e outros., FEBS Letters 234 (1988) 464 - 470). Esta sequência encontra-se flanqueada por extremidades coesivas compatíveis com as de um sítio EcoRI. Nesta construção, apenas o extremo situado a jusante da sequência de sinal pode regenerar um sítio EcoRI funcional. Clonou-se este fragmento de ADN no sentji do pretendido, no único sítio EcoRI do plasmídio pEGPGK4l5 originando desse modo o plasmídio pSPGKl (Figura 45). O plasmídio pEPGK4l contém se qequência Sa11-BamHI que contém o promotor e o finalizador do gene de PGK de S. cerevisiae, idêntico ao que se encontra presente no plasmídio pYG12 (descrito anteriormente no Exemplo 3) com excepção do sítio de cio.

nagem HindIII. que foi substituído por um sítio EcoRI (ver sequência dada na Figura 45). Como resultado da estratégia uti lizada, o plasmídio pSPGKl possui um único sítio EcoRI o que permite a conagem dos genes estruturais a jusante da sequência de sinal, de síntese.

No sentido de se obter o gene estrutural que codifica IL-1J3 na forma de um fragmento de restrição EcoRI, linearizou-se o plasmídio pCI131 (ver secção E.7.l) com o enzima HindIII, tratou-se com o fragmento Klenow de ADN polimerase IJ3 da E. coli para tornar as extremidades complementares e ligou-se com um ligante de síntese EcoRI (5’GGAATTCC-3 ' ). Após clivagem com o enzima EcoRI, purificou-se o fragmento que corresponde a Met-IL-lj3 por electroeluição e clonou-se no sítio EcoRI do plasmídio pSPGKl para dar origem ao plasmídio pSPGK-IL-17 (Figura 46). Nesta construção, a sequência que codifica IL-lj3 ocorre na mesma sequência de transferência que o sinal de secreção derivado da toxina mortal. 0 início do gene maduro de IL-1/3 (AlaProVal. . . ) encontra —se separado do sítio de clivagem reconhecido pela peptidase de sinal (GlnGli) pelo pen tapeptido LisArglleHisMet.

plasmídio pSPGK-IL17 é a fonte de um fragmento de restrição SalI-HindIII que corresponde á sequência de expressão (promotor PGK/lL-1& de sinal de secreção/terminante PGK); purificou-se este fragmento por electro-eluição e clonou-se no plasmídio pCXJl (ver Figura 9), clivou-se com os mesmos enzimas para originar o plasmídio pSPGK-IL21 (Figura 47). 0 plasmídio pUC4K (Pharmacia) e a fonte do gene de resistência à geneticina (G4lG), que se purificou por electro-elui ção sob a forma de um fragmento de restrição Sall. Depois, cio. rou-se este fragmento no sítio Sall do plasmídio pSPGK-IL21 pa. ra originar o plasmídio de expressão pSPGK-IL31 (Figura 48).

E.7.3 Construção de um vector de secreção contendo IL-1J3 sob o controlo do promotor PHO5 de S. cerevisiae.

A importância do promotor PHOg reside no facto deste representar um sistema de expressão susceptível de ser induzido no LK. lactis: tal como em S. cerevisiae, este promotor é reprimido por elevadas concentrações de fosfato inorgânico e induzido em meio com carência de fosfato (Chen, X.

J. e Fukuhara, H., Gene 369 (1988) l8l - 192).

plasmídio da mesma família que lhe deu origem, pEPHO contém um fragmento de restrição BamHI-Ρstl de 0,94 kpb de extensão, que consiste nas regiões promotoras e de terminus do gene de PH05 de S.cerevisiae. Este fragmento deriva de um fragmento genómico de 2,03 Kpb BamHI-Ps tl (Bajwa, e outros, Kucl. Acid Res. 12 (1984) 7721 - 7739) no qual se elinii nou o gene estrutural que codifica a fosfatase ácida entre as posições -4 em relação ao codão de início de transferência ATG) e o único sítio Sau3A localizado a montante do codão de termi nus de transferência TAG. Na junção entre o promotor e o seu terminante, inseriu-se uma região de ligação múltipla EcoRI/ /Smal/BamHI, o que permite a introdução de um gene estrutural incluindo o seu codão de iniciação.

Efectuou-se a clonagem do fragmento EcoRI que corresponde ao sinal de secreção do gene da toxina de K. lactis do plasmídio Kl mortal (ver secção E.7.2) no sentido pre83 tendido no sítio EcoRI do plasmidio pEPHO para se originar o plasmidio pSPHO4 (Figura 49). Purificou-se o fragmento de res triçâo EcoRI que corresponde a Met-IL-1 , a partir do plasmí. dio pSPGK-IL17 (Figura 46) e clonou-se no sítio EcoRI do plasmídio pSPOH4 para dar origem ao plasmidio pSPOH-ILl4 (Figura 50). Este plasmidio foi a fonte de um fragmento de restrição Sall-Hindlll que corresponde à sequência de expressão (promotor PHO5/terminante IL-1iô /PHC5 do sinal de secreção); purificou-se este fragmento por electroeluição e clonou-se no plasmidio pCXJl e foi digerido pelos mesmos enzimas para originar o pias mídio pSPOH-IL23 (Figura 51) . Purificou-se por electro eluição a partir do plasmidio pUC4K, o fragmento Sall que contem o ge ne que confere resistência à geneticina (G4l8) e depois clonou -se no sítio Sall do plasmidio pSPHO-IL23 para dar origem ao plasmidio de expressão pPSHO-IL35 (Figura 52).

E.7.4 Estabilidade mitótica dos plasmídios derivados de pKDl que expressam IL-Ι^β em condições não selectivas de de^ senvolvimen to .

Seguiu-se a estabilidade mitótica dos plasmídios pSPGK-IL31 e pSPHO-IL35, a diferentes intervalos de tempo e definiu-se como a percentagem de células que conservaram a capacidade de se desenvolverem num meio mínimo selectivo (não enriquecido como uracilo) após desenvolvimento de um número iefinido de gerações, em meio não selectivo. Conforme se indj. ca na Figura 53, estes 2 plasmídios são vincadamente esíáveis apesar de existir uma estabilidade diferente entre a construção que utiliza o promotor PGK em comparação com a construção que contém o promotor PKO5: após 4θ gerações de células em

4meio não selectivo, mantiveram-se 75 7 (promotor induzido) a 90^ (promotor não induzid) o plasmídio pSFHO-IL35, enquanto o plasmídio p5PGK-IL31 θ apenas retido por 44 8. das células. Estes resultados demonstram a importância de um sistema de expres são susceptível de ser induzido que não acoplado à fase de cre_s cimento de uma cultura de produção de uma proteína heteróloga potencialmente toxica, no ponto de vista de uma exploração industrial dos vectores de expressão derivados do plasmídio pKBl.

E.7.5 Secreção de IL-1J3

Transferiram—se as construções pSPGK-IL4l e pSPHO-ZL35 para K. lactis, estirpe mV’98 —8C de acordo com as té_c nicas anteriormente descritas. Após selecção dos transformantes em meio mínimo desprovido de uracilo, inocularam-se alguns clones em meio YPD contendo 200 jug/ml de G4l8 e estudou-se a sua capacidade para segregar IL-lj3.

Trataram-se amostras do sobrenadante de cultura com etanol (6θ minutos, a 20°C numa concentração final de 60^b) no sentido de se originar a precipitação do IL-1J3 segre gado. Recuperou-se o material precipitado por centrifugação (20 minutos a 15 000 g) e solubilizou-se novamente em tampão amostra (Laemli, U.K. Nature 227 (1970) 680 - 685) por aquecimento a 95°C durante 15 mintuos num décimo do volume original antes de se ter depositado num gel de poliacrilamida a 12,5 Após eiectroforese das amostras, detectou-se a secreção de II-1/3 ou nos geles desnaturados corados com azul de Coomassie (Figura 54) ou por detecção imunológica apos efectuar-se a man cha no gel sobre membranas de nitrocelulose e, utilizando anti corpos monoclonais dirigidos contra IL-1/? humana (Genzime),

ou sem tratamento prévio das amostras com endoglicosidase H, de acordo com as instruções do fabricante (Poheringer Nannheim).

sinal imunologico obtido a partir dos sobrje nadantes das leveduras transformadas com as construções correspondentes a IL-1J3 é sensível ao tratamento com endoglicosidase H (decréscimo no peso molecular aparente de 24 KD até 19KD), demonstra que IL-IJ^ recombinante da levedura se encon tra glicosilado. Este resultado está de acordo com a presença de um potencial sítio de glicosilação N, na porção da extremidade N de IL-ΐβ (Asn na posição 7).

.Aplicou-se directamente numa coluna de fase inversa, 2 ml do sobrenadante de uma cultura de K. Lactis MV98-8C, transformada com o plasmídio pSPHO-IL35 ^e, desenvolvida num meio de Erlenmeyer, desprovido de fosfato inorgânico (Chen, X.J. e Fukuhara, H., Gene 36b (1988) 181-192), no sentido de se purificar IL-1J3 segregaria : recolheu-se o pico de eluição correspondente a 35 de acetonitrilo e que correspon de à interleucina recombinante. De terminou-se por espectrosfotometria a quantidade de material purificado por esta técni. ca, o que permite estimar que 11-1 e segregada por K. lactis ao nível de 35 ^mg P°^r litro de sobrenadante de cultura.

A sequência da porção da extremidade N de

11-1J3. purificada (automated Edman degradation, Applied Biosystems) indica a total ausência da região pre da toxina mortal e, devido a isso, a maturação efectiva por K. lactis. estirpe MW98-8C no sítio de clivagem GlnGl que seria reconhecido por uma peptidase de sinal de levedura (Stark, M.J.R.

e Boyd , A., EMBO J. J5 (1986) 1955-2002). Como resultado da e_s tratégia utilizada na construção da sequência que expressa Ι1-1Λ presente no plasmídio pSPHO-IL35, a extremidade terminal N de I1-1J3 recombinante não pode ser idêntica a de IL-lJ3 humano madura: a disposição dos primeiros onze resíduos determinada por micro-sequência (LysArglleHisMetAlaProValArgSer Eeu) confirma a presença de diversos aminoácidos adicionais (LisArglleHisí-iet) a montante da sequência que corresponde a I1-1J3 huamno maduro e demonstra em especial que o sítio potencial de clivagem pelo enzima KEX1 de K. lactis (lisArg) não é reconhecida no contexto desta sequência. A A criação por mutagenese especifica de um sítio, de uma junção correcta entre o sinal de secreção para a toxina mortal e o gene estru tural para IL-ljB madura (GlnGliAlaProVa1) pode também possibilitar a obtenção de I1-1J3 segregado, correctamente amadure eido .

Exemplo 8: VECTORES DE EXPRESSÃO DE LEVEDURAS CONTENDO UMA SEQUÊNCIA PARA A EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE tPA

E.8.1 Construção de vectores para a expressão de Met-tPA e secreção de prepro-tPA sob o controlo do promotor PGK de S. cerevisiae

Isolou-se o gene estrutural que codifica tPA a partir dos plasmídios pXL348 (Met-tPA) e pXL459 (prepro-tPA) (Sarmientos, P. e outros Bio/Technology Z (1989) 495-501), cujos mapas de restrição se apresentam na Figura 55·

Principalmente pelos plasmídios pXL348 (Met-tPA), derivaram-se os plasmídios pYG224 a/B (Met-tPA) e pIG225 a/B (propro-tPA), de acordo com o seguinte diagrama:

BAD ORIGINAL

Inserção cie um sítio

Xholl localizado ini_e diatamente a jusante do gene estrutural pXL3^tí (Met-flA)

Inserção de um sítio HindIII imediatamente a montante do sítio Xdel e sub-cionagem do fragmento HindIII no pYG?06 (pUCS Xdel) pYG2O5 pYGOll

Substituição do fragmento Xdel-SstI de pYG2’k (Met-tPA) pelo fragmento Xdel-SstI de pXLAçO ( prepro-tPA )«

PYG219

Inserção do fragmento HindIII de pYG211 (Met)tPA) em pYG208

Inserção do fragmento HindIII de pYG2l9 (prepro-tPA) em pYG208 pYG222 pYG?23

Introdução das sequências de expressão Sall de pYG222 e pYG223 no plasmídio pKan 707 pYG22q a/B (prepro-tPA) pYG2?4 A/E (Met-tPA)

Dirigiu-se o plasmídio pXL43tí com o enzima

XholI, e ligou-se a mistura de restrição com um adaptador fos

BAD ORíGíNAL !

......rj

- S8 forilado XhoII-HindIII (oligodesoxinucleotido de sintese 5'-GATCAAGCTT-3'); depois, efectuou-se a digestão de mistura com o enzima HindIII e clonou-se o fragmento de restrição que codifica Met-tPA no sítio HindIII do vector pUC8 para originar o plasmídio intermédio pYG2O5· Cortou-se este plasmídio com o enzima Ndel e ligou-se com uma mistura equimolar de oligodesoxinucleotidos de síntese 5'-TAAGCTTCA-3¹ e 5¹7TATGAA GCT-3' o que reconstitui um adaptador Ndel-HindIII-Ndel; após ligação in vitro, digeriu-se a mistura de ligação com HindIII e purificou-se o fragmento de restrição que codifica Met-tPA, por electroeluição e clonou-se no sítio HindIII do vector pYG20ó para originar o plasmídio pYG211. 0 vector pYG20ó corresponde ao plasmídio pUC8 no qual se destruiu o único sítio Ndel, por clivagem com o enzima Ndel e se complementarizou as extremidades coesivas com o fragmento Klenow de polimerase I de E. coli antes de se ligar o vector a si próprio; deste modo o plasmídio pYG211 contem o fragmento HindIII que codifica Met-tPA no qual existe um único sítio de restrição Ndel localizado no codão de iniciação ATG de Met-tPA. No plasmídio pYG211, a sequência nucleotídica a montante do codão de iniciação de transferência é a seguinte: 5'-AAGCTTCATATG...-3'.

plasmídio pIG211 é a fonte do plasmídio que contém pYG219, que contém um fragmento HindIII que codifica prepro-tPA. Construiu-se este plasmídio por substituição do fragmento Ndel-SstI de pYG211 pelo fragmento Ndel-SstI do plasmídio pXL459, que contém a porção da extremidade N de prepro-tPA (Figura 55); os plasmídios pYG211 (Met-tFA) e pYG211 (prepro-tPA) são, por isso, rigorosamente isogénicos, excepto

no facto do plasmídio pYG2ll codificar a forma madura de tPA, precedida imediatamente pelo codão de iniciação, enquanto que no plasmídio pYG219 a sequência madura de tPA se encontra pre cedida pela sua sequência de exportação natural prepro.

Purificaram-se os fragmentos HindIII que codificam Met-tPA e prepro-tPA por electroeluição a partor dos plasmídios pYG211 e pYG2l9 e clonou-se no sentido correcto no vector pYG208 (ver Figura IÇA), cortaram-se com os mesmos enzimas de restrição, o que deu origem aos plasmídios intermédios, pYG222 e pYG223. Estes plasmídios contém uma sequência de expressão disponível na forma de um fragmento de restrição Sall, que depois se clonou no vector pKan7O7 para dar origem aos plasmídios pYG224 a/B (Met-tPA) e pYG225 A/B (prepro-tPA). Os sentidos A e B das sequências Sall, no que se refere ao ve_c tor definiram-se como anteriormente se efectuou para os plasmídios pYG221 A/B (prepro-HSA).

E.8.2 Secreção de tPA

Transferiram-se as construções pYG224 A/B (Met-tPA) e pYG225 á/B (prepro-tPA), em particular, para a estirpe de K. lactis ?rW9Ó-8C, de acordo com técnicas descritas na secção E.4.1. Após selecção das células na presença de G4l8, inocularam-se alguns elones em meio selectivo YPD e estudou-se a sua capacidade para expressar e segregar tPA, de acordo com as seguintes técnicas: i) sobre geles de poliacrilamida de DSS tingidos com azul de Coomassie; ii) por detecção imunológica após ter-se efectuado manchas de gel sobre membranas de nitrocelulose e utilização de anticorpos primários

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dirigidos contra o tPA humano (Bioppol) com ou sem tratamento prévio des fraeções celulares com enzimas de disglicolisação endoglicosidade H ou glucopeptidase F, que se utilizaram de a cordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim); iii) num ensaio de placa de fibrina sobre placas indicadoras com a seguinte composição: agarose a 1$, fabrinogénio a 0,1 $ (Kabi Vitrura), 0,2 unidades/ml de trombina (Sigma) dissolvidas em tampão PBS.

Os resultados destes ensaios demonstram que não se detectam sinais imunológicos específicos nos sobrenadantes de cultura não tratados (construção pYG225B), ou nos extractos celulares. Nâo pode ser posto em questão o método de detecção, uma vez que as construções pYG224 A/Β (Met-tPA) proporcionam um sinal específico grande (entre 1 e 10 m/litro de cultura) nos extractos celulares e especialmente na fracção correspondente às proteínas insolúveis.

A utilização de enzimas de desglicolização surge como um resuisito prévio de detecção imunológica de pre — pro-tPA expressa e segregada por K. lactis com o controlo do promotor pGK de S. cerevisiae. Pode explicar-se esta observa ção por hiperglicolização heterogenea desta proteina quando expressa nesta estirpe sob o controlo deste promotor. Esta hi perglicosilaçâo pode ser responsável, especialmente pela fraca antigenicidade de tPA recombinante de levedura expressa a partir do promotor PGK.

A Figura demonstra a presença de uma actividade enzimática nos sobrenadantes de cultura de K. lactis

MV98-8C transformados com o plasmídio pKanYO? de controlo) o u

pYG224B (Met-tPA). A detecção de uma actividade secretora de tPA demonstra que a sequência prepro de tPA é funcional na le_ vedura K, lac ti s MV9S-8C, 0 ensaio da actividade de tPA nas placas indicadoras também demonstra a presença de actividade nas fracções intracelulares da estirpe MW98-8C transformada com a construção Met-tPA (resultado não documentado).

£.8.3 Influência da estirpe hospedeira na secreção de tPA

A selecção de uma célula hospedeira e um fector fundamental no que se refere aos níveis de secreção de tPA pelas leveduras capazes de replicarem derivados do plasmí^ dio pIían7O7. Ensaiou-se a capacidade das leveduras do género kluyveromyces para segregarem tPA cionado no vector pKan7O7, conforme anteriormente referido nas placas indicadoras de fibrinogénio-agar. (Κ. drosophilarum). e K. fragilis ATCC 36534 e ATCC 369C7 pos suem um potencial para a secreção de tPA de grandeza idêntica ao da K . lactis estirpe MW98-8C, enquanto que os ensaios efêctúadòeínas mesmas condições nas estirpes ATCC 12424 (K. fragilis) , ATCC 24178 (K. wickerhamii) e ATCC

565OO (K. waltii) não tornavam possível detectar tPA nas sobrenadantes da cultura.

Exemplo 9: VECTORES DE EXPRESSÃO DE LEVEDURAS CONTENDO UMA SEQUÊNCIA PARA A EXPRESSÃO E SECREÇÃO DE TIMP

E.9.I Construção de vectores para a expressão e secreção de

TIMP sob o controlo do promotor PGK de S. cerevisiae

Isolou-se o gene estrutural que codifica TIMP a partir do plasmídio pPV2-TIMP. Este vector consiste no cADN de TIMP disponível na forma de um fragmento de restrição

HindIII (Kaczorek, M. e outros, Eio/Technol. (1987) 595-598). Purifi cou-se este fragmento de restrição por electroeluição e clonou-se no sentido correcto no sítio HindIII da construção intermediária pYG208 (ver Figura 19A) para dar origem ao plasmídio pGY22C. Este plasmídio é a fonte de um fragmento Sall que corresponde à sequência de expressão (promotor PGK/TIMP/ terminante PGI<) que se clonou no sítio Sall do vector pKan7C7 (ver Figura 13) para dar origem aos plasmídios de expressão pYG22ó a/B, que apenas diferem um do outro no sentido deste fragmento Sall, no que se refere ao vector. Os sentidos A e B dos plasmídios pYG226 A/B definiram-se conforme anterior mente referido para os plasmídios pYG221 A/B (prepro-HSA), pYG224 A/B (Met/tPA) e pYG225 A/B (prepro-tPA)

E.9.2 Secreção de TIMP

Transferiram-se as construções pYG226 A/B (TIMP) para a estirpe de K. lactis MW98-8C de acordo com técni. cas anteriormente descritas. Após selecção das células na presença d e G4l8, inocularam-se alguns clones em meio selectivo YPD e estudou-se a sua capacidade para expressar e segregar

TIMP, quer com geles de poliacrilamida DSS corados com azul de Coomassie, quer por detecção imunologica após ter-se efectuado a mancha de gel sobre membranas de nitrocelulose e a utilização de anticorpos primários dirigidos contra TIMP humano (Rhône-Poulenc Santé), com ou sem tratamento prévio das fracções celulares com endoglicosidase H.

Detecta-se nos extractos celulares não desglicosilados (fracções proteicas insolúveis) um sinal imunológico

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que corresponde a TIMF, mas não nos sobrenadantes de culturas não desglicosimados (Figura 57). Este sinal imunológico é sensível ao tratamento com enzimas òesglicosilantes, o que demonstra que a TIMP recombinante de levedura é N-desglicosilada. Demonstrou-se a secreção de TIMP recombinante, após desglicosilação in vitro de um sobrenadante de estirpe MV/98-8C transformada com o plasmídio pYG22óB (Figura 57), o que indica que a sequência de exportação natural de TIMP é funcional em K. lactis MV98-8C.

Nota

Depositou-se uma amostra da estirpe MW98-8C em Centraalbureau voorSchimmelkulturen (CES) em Baarn, Holanda, de acordo com o estabelecido no Tratado de Budapeste, onde foi registada em ΐ6.Ο9·θ9, com o número CES 579 88.

Claims (24)

1. - Processo para a preparação microbiolõgica de albumina de soro humano (HSA) ou uma das suas variantes, caracterizado pelo facto de se desenvolver uma levedura susceptível de proporcionar o suporte estável de uma banda de expressão contendo pelo menos um marcador seleccionãvel para as leveduras transformáveis, permitindo o ADN do gene estrutural para HSA ou para a referida variante sob o controlo de sequências a sua expressão.na levedura e, quando adequado, a excreção de proteína codificada por este gene no meio de desenvolvimento.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a banda de expressão estar integrada no genoma de levedura.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri95zado pelo facto de a banda de expressão formar parte de um plasmídeo possuindo um sistema de replicação que funciona em levedura e proporciona o suporte estável da referida banda nesta levedura.

4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de as leveduras serem escolhidas entre os géneros Saccharomyces e Kluyveromyces.

5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a levedura ser escolhida a partir do género Kluyveromyces.

6. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a levedura ser escolhida entre todas as variedades de Kluyveromyces marxianus.

7. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a levedura ser Kluyveromyces marxianus var. lactis.

ou uma combinação de elementos derivados do plasmideo pKDl e do plasmideo 2

9.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 3,6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de o sistema de replicação que funciona em levedura ser todo ou parte da sequência pKDl.

10.- Processo para a preparação de uma proteina especificada, caracterizado pelo facto de se cultivar, num meio de desenvolvimento, uma levedura do género Kluyveromyces transformada com um plasmídio de expressão incluindo:

- genes A, B e C do plasmideo pKDl,

- as repetições invertidas do plasmideo pKDl,

- os sítios de estabilidade do plasmideo pKDl,

- a origem de replicação de pKDl e uma banda de expressão contendo um ADN que codifica o gene estrutural para a referida proteína sob o controlo de sequências que permitem a sua expressão na referida levedura,

- um marcador seleccionãvel para a levedura transformada,

12.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 8 a 11, caracterizado pelo facto de a banda de expressão e o marcador seleccionãvel se inserirem numa região de 197 nucleotidos definida pelos sítios Saci e MstII de pKDl, ou o sítio Sphl de pKDl.

13. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de as sequências que permitem a expressão do gene estrutural serem escolhidas a partir de promotores derivados de genes de leveduras do género Saccharomyces ou Kluyveromyces.

14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de estes promotores serem derivados de genes glicolíticos de leveduras do género Saccharomyces ou Kluyveromyces.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de as sequências que permitem a expressão do gene estrutural serem escolhidas a partir de genes que codificam fosgene estrutural serem escolhidas a partir dos genes que codificam fosfoglicerato-quinase(PGK) ou fosfatase ácida (PHO5).

17.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo facto de as sequências que codificam a referida proteína serem precedidas por uma sequência de exportação da proteína que ê escolhida a partir do terminal N natural principal da referida proteína.

18. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo facto de a sequência que codifica a referida proteína ser precedida por uma sequência de exportação diferente da sequência natural.

19. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de a sequência que codifica a exportação da referida proteína ser a sequência obtida a partir dos genes de levedura que codificam a alfa-feromona ou a toxina assasina.

-9 921. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de a sequência que codifica a proteína especificada ser escolhida entre as sequências que codificam:

- IL-1

- prepro-HSA

- Met-HSA

- prepro-tPA

- Met - tPA e

- TIMP.

22. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo facto de a sequência que permite a excreção de HSA ser o terminal natural prepro principal de albumina .

23. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo facto de os marcadores seleccionãveis para as leveduras transformadas serem escolhidos entre os genes que proporcionam resistência aos antibióticos ou aos iões cobre.

0RF1 do plasmideo linear Kl de K. lactis e a aminoglicosido fosfo transferase do transposão Tn 903.

26.- Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo facto de o marcador seleccionãvel ser um gene que complementa as auxotrofias.

27. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a estirpe ser transformada com um plasmideo que contém plasmideo pKDl, ADN de prepro - HSA, as sequências de terminação e de iniciação da transcrição do gene que codifica fosfoglicerato-quinase e as sequências da fusão entre o promotor 0RF1 do plasmideo linear Kl de K.marxianus var.lactis e o gene de 3'-aminoglicosido-fosfotransferase de Tn9O3.

28. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a estirpe ser transformada com um plasmideo que contém plasmideo pKDl, ADN de Met-HSA, sequências de terminação e de iniciação da transcrição do gene que codifica fosfogliK. marxianus, Κ. Wickerhamii, Κ. Waltii.

30. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de a estirpe ser da espécie K. bulgaricus,

K. marxianus var. drosophilarum, K. marxianus var. marxianus ou

K. marxianos var. lactis.

31. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo facto de se cultivarem as leveduras em meio contendo glicose ao qual se adiciona lactose num momento compreendido entre o pnto de metade do logaritmo do desenvolvimento e a fase de desenvolvimento estacionário.

32. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incorporar, como ingrediente activo, albumina de soro humano quando preparada de acordo com as reivindicações anteriores,