PT99802A - Processo de expressao de um gene heterologo e/ou de secreccao de uma proteina usando fragmentos de adn derivados do gene da fosfatase acida de pichia pastoris e de plasmideos contendo esses fragmentos de adn - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento refere-se ao campo da biotecnologia recombinante utilizando sistemas de vectores de expressão de levedura. Num aspecto o invento refere-se a novos fragmentos de ADN contendo todo, ou parte, do gene da fosfatase ácida da levedura Pichia pastoris (SEQ ID N2:l). Num outro aspecto, o invento refere-se a novos vectores contendo fragmentos de ADN derivados do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Ns:l). Ainda”noutro aspecto o invento refere-se a células hospedeiras transformadas com vectores contendo fragmentos derivados do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l). Em outro aspecto o invento refere-se à utilização dos fragmentos de ADN acima descritos para facilitar a expressão e/ou a secreção de proteínas heterólogas na levedura.

Antecedentes do Invento À medida que a biotecnologia do ADN se foi desenvolvendo nos últimos anos, tornou-se possível a produção controlada por microorganismos de uma variedade enorme de polipéptidos úteis. Muitos polipéptidos, como por exemplo a hormona do crescimento humano, interferões de leucócitos, insulina humana e pró-insulina humana, já foram produzidos por vários microorganismos. Espera-se que a aplicação continuada de técnicas já disponíveis, permita a produção de outros produtos polipéptido, úteis.

As técnicas básicas empregues no campo da tecnologia do ADN recombinante são conhecidas pelos peritos na arte. Os elementos que estão, desejavelmente, presentes para a prática da tecnologia do ADN recombinante incluem, mas não lhes estão limitados: (1) um gene que codifica um ou mais polipéptido(s) desejado(s) e associado funcionalmente com sequências de controlo adequadas, necessárias para a expressão do gene no organismo hospedeiro;

73 295 32 427—PT -3- (2) um vector no qual o gene possa ser inserido; (3) um organismo hospedeiro adequado no qual o vector que transporta o gene possa ser transformado; (4) se é desejada a secreção da proteína heteróloga, uma sequência de sinal capaz de dirigir a proteína heteróloga para a via de secreção da célula hospedeira e, depois disso, para fora da célula; (5) um sistema de transformação; e (6) um processo de selecção dos transformantes.

As contruções de gene recombinante podem ser projectadas de modo que a proteína recombinante transite da via de secreção do hospedeiro e seja segregada para os meios de crescimento. A secreção é um modo desejado de expressão recombinante por várias razões. Primeiro, algumas proteínas heterólogas têm um efeito tóxico no organismo hospedeiro. Quando esses produtos de gene heterólogo são segregados, em vez de acumulados dentro do hospedeiro, eles têm menos probabilidade de interferirem com as funções celulares normais. Segundo, algumas proteínas que são inactivas quando produzidas intracelularmente são activas quando segregadas. Terceiro, a secreção para o meio evita a necessidade de abrir as células hospedeiras de modo a recuperar o produto. A purificação do produto é muito mais fácil e eficaz em termos de custos quando o produto está presente no meio de crescimento. E, quarto, uma vez que o produto recombinante está presente no meio nutriente, o produto desejado pode ser removido continuamente e os meios podem ser reciclados. A maior parte das proteínas segregadas são expressas inicialmente dentro da célula numa forma precursora ou de pré--proteína, contendo uma extensão amino terminal apensa, chamada péptido de sinal. 0 péptido de sinal desempenha um papel essencial no transporte do polipéptido que lhe está apenso para e/ou através das membranas celulares limitantes. Este péptido de sinal é, depois, clivado proteoliticamente por uma peptidase de sinal durante ou após a secreção, para originar um produto proteína maduro. A secreção de uma proteína heteróloga ou estranha pode ser conseguida por ligação da sequência de codificação do ADN heterólogo ao ADN que codifica o péptido de sinal. Seria desejável isolar uma sequência de sinal que codifica este péptido de sinal, que facilitaria a secreção.

As sequências de sinal são especialmente úteis na criação de vectores de expressão. 0 uso destes vectores tornaria possível transformar células hospedeiras compatíveis de modo a que elas produzissem e segregassem produtos de gene heterólogo. Exemplos de sequências de sinal que têm sido usadas para segregar com sucesso proteínas recombinantes a partir de hospedeiros levedura incluem aquelas do factor de emparelhamento alfa de Saccharomvces cerevisiae. o factor de emparelhamento â e gene de toxina assassina. 0 isolamento de uma sequência de sinal de uma levedura metilotrófica, como a Pichia pastoris, não foi descrito.

Convenientemente, o promotor que é empregue nestes vectores para regular a expressão dos produtos de gene heterólogo pode ser o promotor que está associado nativamente com a sequência de sinal. Seria especialmente vantajoso se o promotor associado nativamente com a sequência de sinal proporcionasse um nivel elevado de transcrição de ADN e responda a estímulos ambientais exógenos. Um exemplo deste promotor é a região reguladora 5' do gene da fosfatase ácida (PHQl) de Pichia pastoris (SEQ ID Na:2), que é transcrito a um nível elevado em resposta à ausência de fosfato nos meios e reprimido pela presença de fosfato nos meios. É frequentemente desejável transformar um hospedeiro Pichia pastoris com uma construção de ADN recombinante que se integre numa posição precisa no genoma da Pichia pastoris. As sequências 5' e 3' que flanqueiam o gene PHQl de Pichia pastoris , também conhecidas, respectivamente, como primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis, são usados em vectores de expressão para

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73 295 32 427-ΡΤ -5- dirigirem a integração de sequências recombinantes no locus PHOl. A capacidade para integrar ADN recombinantes no locus PHOl é vantajosa por, pelo menos, duas razões: 1) no desenvolvimento de estirpes de expressão de Pichia pastoris com cópias múltiplas das mesmos, ou de diferentes, cassetes de expressão no locus PHOl ou noutro locus de Pichia. ou 2) integração estável de uma ou mais cassetes de expressão apenas no locus PHOl. numa estirpe hospedeira Pichia pastoris na qual disrupção de ura gene essencial ou de um gene da via metabólica do metanol é indesejável.

As células nas quais o gene PHOl sofreu disrupção mostram uma perda concomitante de actividade do enzima fosfatase ácida. 0 fenótipo Pho", indicador da disrupção do gene, pode ser seleccionado por plaqueamento das células em placas indicadoras de baixo fosfato e permitindo que as colónias se desenvolvam durante a noite. As colónias nas quais o gene PHOl sofreu disrupção são brancas, ao passo que aquelas colónias que têm um gene PHOl intacto são verdes. Esta selecção colorimétrica proporciona um método fácil e rápido para a detecção de células que têm cassetes de expressão integradas correctamente no locus PHOl e assim provocaram a sua disrupção.

Assim, seria uma contribuição significativa para a arte isolar uma sequência de sinal que facilitasse a secreção de proteínas a partir de uma células hospedeira.

Adicionalmente, seria vantajoso isolar uma região reguladora 5' que proporcionasse níveis altos de transcrição de ADN e que responda a estímulos ambientais exógenos.. Correntemente, não é conhecida na arte qualquer região reguladora 5# que seja transcrita a nível alto em resposta à ausência de fosfato nos meios e que posa ser usada com a levedura de alta produção em fermentação Pichia pastoris.

Seria, adicionalmente, vantajoso isolar o gene estrutural da fosfatase ácida (AP).

Seria, também, desejável proporcionar novos vectores 73 295 32 427-ΡΤ I3EWW) -6- r Ϋ 0P- compreendendo fragmentos do gene da fosfatase ácida.

Seria, adicionalmente, vantajoso isolar uma sequência de terminação de transcrição 3'.

Seria, também, vantajoso proporcionar vectores integrativos que dirigissem a integração no locus PH01 de Pichia pastoris.

Seria adicionalmente vantajoso proporcionar um processo para identificar as células com a disrupção ("disruptants").

Assim, é um objectivo do presente invento proporcionar uma sequência de sinal que facilite a secreção de proteínas a partir de células. É, também um objectivo deste invento proporcionar uma região reguladora 5,7 transcrita em resposta à ausência de fosfato.

Um outro objectivo do presente invento é proporcionar a sequência de ADN do gene estrutural da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:4). É um objectivo adicional deste invento proporcionar novos vectores compreendendo uma região reguladora e/ou sequência de sinal ligada operativamente a um sequência heteróloga de ADN que codifica pelo menos um polipéptido e meios para induzir a referida região reguladora a facilitar a expressão da referida sequência heteróloga de ADN. É ainda um objectivo deste invento proporcionar uma sequência de terminação de transcrição 3' a partir do gene da fosfatase ácida.

Ainda outro objectivo deste invento é proporcionar vectores integrativos que dirigissem a integração no locus PHOl de Pichia pastoris.

Um objectivo adicional deste invento é proporcionar um processo de indentificar células com a disrupção.

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Outros aspectos, objectivos e vantagens do presente invento tornar-se-ão evidentes a partir da descrição, exemplos e reivindicações que se seguem.

Sumário do Invento

De acordo com o presente invento proporciona-se um novo fragmento de ADN compreendendo a sequência de sinal do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:3) que facilita a secreção de proteínas a partir de células.

Um aspecto adicional deste invento proporciona um novo fragmento de ADN compreendendo a região reguladora 5' do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Ns:2).

Em ainda outro aspecto deste invento proporciona-se um novo fragmento de ADN compreendendo a sequência de ADN do gene estrutural da fosfatase ácido (AP) de Pichia pastoris (SEQ ID Na :4).

Outro aspecto deste invento proporciona novos vectores compreendendo a região reguladora e/ou a sequência de sinal ligada operativamente a uma sequência de ADN heterólogo que codifica pelo menos um polipétido, e meios de induzir a referida região reguladora a facilitar a expressão da referida sequência de ADN heterólogo.

Num outro aspecto deste invento proporcionam-se novos vectores de ADN compreendendo uma sequência de terminação de transcrição 3' do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Ns:5).

Um outro aspecto deste invento proporciona vectores integrativos que dirigem a integração directa do vector no locus PH01 de Pichia pastoris.

Ainda outro aspecto deste invento é proporcionar um processo de identificar células com a disrupção.

73 295 32 427-PT

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Breve Descricão das Ficruras A Figura 1 proporciona um mapa de restrição do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l).

Descricão Detalhada do Invento 0 presente invento proporciona um novo fragmento de ADN isolado compreendendo um gene da fosfatase ácida, incluindo o seu promotor (ou região reguladora 5'), sequências de sinal de terminação de transcrição e flanqueadoras, derivadas de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l). A fosfatase ácida (AP) é uma enzima extracelular segregada pela Pichia pastoris e por outras leveduras em condições de falta de fosfato inorgânico. A a fosfatase ácida segregada catalisa a remoção de fosfato de substratos orgânicos, tornando, assim, disponível o fosfato para o crescimento e sobrevivência celular. 0 gene que codifica a fosfatase ácida foi isolado e estudado em várias espécies de leveduras e a natureza regulável da expressão do gene da fosfatase ácida foi localizada no elemento promotor da fosfatase ácida. Em condições de baixas concentrações de fosfato inorgânico nos meios, o promotor da fosfatase ácida (ou região reguladora 5') é "ligado", o gene da fosfatase ácida é transcrito e traduzido, subsequentemente, na enzima fosfatase ácida. A enzima fosfatase ácida acabada de sintetizar liberta fosfato de substratos orgânicos e toma o fosfato disponível para a célula. 0 aumento subsequente na concentração de fosfato modula o promotor da fosfatase ácida, o que resulta na redução da transcrição do gene da fosfatase ácida concomitante com uma menor necessidade de proteína fosfatase ácida. Assim, o promotor da fosfatase ácida pode ser induzido ou reprimido, respectivamente, por concentrações baixas ou altas de fosfato. A identificação e isolamento do promotor da fosfatase ácida de Pichia pastoris é significativa. Uma vez que a regulação da expressão do fosfatase ácida varia entre as espécies de leveduras para as quais esta expressão foi analisada, espera-se que a regulação estrita 73 295 32 427-ΡΤ observada para a expressão da fosfatase ácida em Pichia pastoris dependa da biodisponibilidade e utilização das sequências promotoras homólogas. A identificação e o isolamento da sequência de sinal do gene PH01 de Pichia pastoris (SEQ ID Na:3) é significativa por, para além de ser a primeira sequência de sinal isolada de um gene de Pichia pastoris. ela representa a primeira sequência de sinal isolada a partir de uma levedura metilotrófica. Verificou-se que era equivalente ou superior a sequências de sinal nativas, e.q, a sequência de sinal do tPA ( Activador de Plasminogénio Tissular) ou o gene da invertase, na direcção da secreção de proteínas heterólogas de Pichia pastoris, e.q.. tPa ou invertase. É frequentemente desejável integrar vectores de expressão recombinantes no genoma do hospedeiro em vez de os manter como elementos de replicação autónoma. Os vectores integrados são significativamente mais estáveis do que os vectores autónomos e são preferidos para a prática do presente invento. Especificamente, preferem-se vectores integrativos, lineares, específicos de local, tal como os descritos na U.S. 4 882 279, que é aqui incorporada para referência. Estes vectores compreendem uma sequência disposta em série de pelo menos 1) um primeiro fragmento de ADN inserível; 2) um gene marcador seleccionável; e 3) um segundo fragmento de ADN inserível. 0 primeiro e o segundo fragmentos de ADN têm, cada um, pelo menos cerca de 200 nucleótidos de comprimento e têm sequências de nucleótidos que são homólogas a porções do ADN genómico da espécie a ser transformada. Os vários componentes do vector integrativo estão dispostos em série, formando um fragmento linear de ADN de modo que a cassete de expressão e o gene marcador seleccionável estão posicionados entre a extremidade 3' do primeiro fragmento de ADN inserível e a extremidade 5' do segundo fragmento de ADN inserível. Os primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis estão orientados, um relativamente ao outro, no fragmento linear disposto em série, do mesmo modo que estão orientados no genoma progenitor. ><s -10- 73 295 32 427-ΡΤ

Sequências de nucleótidos úteis para o primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis são sequências de nucleótidos que são homólogas a porções separadas do local genómico nativo no qual a modificação genómica vai ocorrer. Assim, por exemplo, se a modificação genómica vai ocorrer no locus do gene da fosfatase ácida, os primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis devem ser sequências homólogas a porções separadas do locus do gene da fosfatase ácida. Para que a modificação genómica ocorra, os dois fragmentos de ADN inseríveis devem estar orientados, um em relação ao outro, no fragmento linear, na mesma orientação relativa em que existem no genoma progenitor. Exemplos de sequências de nucleótidos que podem ser usadas como os primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis são sequências de nucleótidos seleccionadas de entre o grupo que consiste em gene PH01 da fosfatase ácida, gene A0X1 da álcool-desidrogenase, gene HIS4 da histidinol-desidrogenase e gene DHAS da di--hidroxiacetona-sintetase. 0 primeiro fragmento de ADN inserível pode conter uma região reguladora operável que pode compreender a região reguladora usada na cassete de expressão. 0 uso do primeiro fragmento de ADN inserível como a região reguladora para uma cassete de expressão é uma concretização preferida do invento. Opcionalmente, um local ou locais de inserção e uma sequência de terminação 3', podem ser colocados imediatamente em posição 3' em relação ao primeiro fragmento de ADN inserível. Esta conformação do vector integrativo, linear, específico para local, tem a vantagem adicional de proporcionar um local pronto para o inserção de um gene estrutural sem a necessidade da adição de um sequência de terminação 3', compatível.

Também é necessário incluir pelo menos um gene marcador seleccionável no ADN usado para transformar a estirpe hospedeira. Isto facilita a selecção e o isolamento daqueles organismos que incorporam o ADN transformante. O gene marcador confere um traço fenotípico ao organismo transformado que o hospedeiro não tinha, e.q.. restabelecimento da capacidade para a produção de um aminoácido específico, ao passo que o hospedeiro não transformado ' %.·ί2Ρ 73 295 32 427-ΡΤ -11- ¢/.. ι ίϊ tem um defeito na via biossintética do aminoácido específico, ou uma resistência a antibióticos e semelhantes. Exemplos de genes marcadores seleccionáveis podem ser seleccionados de entre o grupo que consiste no gene HIS4 e no gene ARG4 de Pichia pastoris e Saccharomvces cerevisiae, no gene (SUG2) de Saccharomvces cerevisiae e o gene da resistência à canamicina, G418R, dos elementos transponíveis Tn60l ou Tn903 de E. coli.

Se o primeiro elemento de ADN inserível não contém uma região reguladora, será necessária uma região reguladora adequada a ser inserida, ligada operavelmente, no gene estrutural, de modo a proporcionar uma cassete de expressão operável. Semelhantemente, se não é proporcionada qualquer sequência de terminação 3' no local de inserção para completar a cassete de expressão, uma sequência de terminação 3' deverá ser ligada operativamente ao gene estrutural a ser inserido. É importante que a integração ocorra numa posição do genoma que não tenha um efeito prejudicial na célula hospedeira. Foi uma verificação surpreendente que a integração de uma construção de expressão recombinante no locus do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (PHOl) não é prejudicial para o hospedeiro Pichia e leva a uma integração estável das sequências recombinantes. A integração dirigida no locus PHOl é conseguida pela utilização das sequências 5' e 3' que flanqueiam o gene PHOl de Pichia Pastoris (que são, também, referidos como primeiro e segundo fragmentos de ADN inseríveis), nos vectores de expressão recombinantes.

Uma verificação adicional foi um processo de selecção de células transformadas para se indentifiçarem aquelas que integravam as sequências do vector de expressão por disrupção do locus PHOl. As células nas quais o gene PHOl sofreu disrupção mostram uma perda concomitante da actividade da enzima fosfatase ácida. 0 fenótipo Pho“, indicador da disrupção de PHOl pode ser seleccionado por plaqueamento das células em placas indicadoras de fosfato e permitindo que as colónias se desenvolvam durante a noite. As colónias nas quais o gene PHOl apresenta disrupção são 1 73 295 32 427-ΡΤ -12-

Μ' [J vszmr brancas, ao passo que as colónias com um gene PHOl intacto são verdes. Esta selecção colorimétrica proporciona um processo rápido e fácil para a detecção de células que integraram correctamente cassetes de expressão no locus PHOl.

Representa-se na Pigura 1 um mapa de restrição parcial do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l). Este gene foi caracterizado adicionalmente pela sequência de nucleótidos que é proporcionada na Tabela 1. São, também, proporcionados pelo presente invento novos fragmentos de ADN que compreendem a região reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Ns:2), a sequência de sinal (SEQ ID Ns:3), o gene estrutural (SEQ ID N2:4) e a sequência de terminação de transcrição 3· (SEQ ID Ns:5).

As tabelas seguintes mostram as sequências do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l) e seus fragmentos.

Tabela 1

Gene da Fosfatase Ácida SEQ ID Na;1;

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290

ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTICATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT

MetPheSerProlleLeuSer -13-

-13- 73 295 32 427—PT 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCAC LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGAGCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrIleAspGInAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCX AspAlaAlaTrpTyrGluGInGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 73 295 32 427-ΡΤ

- 4 -14- 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTGTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeul.eu 990 1010 1030

GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GlnlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330

TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLGuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA SerEnd 1470 1490 1510

ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC ,.v ,.v

73 295 32 427-ΡΤ -15-

Tabela 2

Região Reguladora 57 SEP ID Ne:2;

BamHI -390 -370 -350

GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290

ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230

AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170

TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110

TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50

TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10

ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC

Tabela 3

Seguência de Sinal SEP ID Na:3: 10

sequência de sinal PHP1—>ATGTTTTCTCCTATTCTAAGT

MetPheSerProIleLeuSer 30 50

CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG

LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAla -16-

-16- 73 295 32 427-PT

Tabela 4

Gene Estrutural da Fosfatase Ácida SEP ID Na:4: 70

GTTGAGTTGCAGCAC

ValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHIsLeu1leAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGGTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg -17- 73 295 32 427-ΡΤ ψ;

Vi*

750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTGAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970

GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerTlirGlulleValProtletGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAAGGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTGCTAGCGACTTGAAGTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu

TCATAA

SerEnd 73 295 32 427-ΡΤ -18-

Tabela 5

Sequência de terminação de transcrição 3' SEP ID Na;5: 1410 1430 1450

AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA 1470 1490 1510

1530 1550 1570

ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG

BamHI

GTTCAATGGATCC 0 gene da fosfatase ácida é recuperado de culturas de Pichia pastoris como Pichia pastoris NRRL Y-11430 por processos apresentados nos Exemplos seguintes. Um processo geral de recuperação do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ XD NB:l) consiste na utilização de uma sonda de fosfatase ácida, tal como sondas de baixo fosfato (LP) descritas nos exemplos seguintes, para fazer a selecção de uma biblioteca de ADN de Pichia pastoris. Podem ser seleccionadas ou sintetizadas outras sondas com base na sequência descrita na Tabela 1. A hibridação das sondas pode ser realizada por qualquer protocolo adequado conhecido dos peritos na arte. As bibliotecas de Pichia pastoris podem ser preparadas por técnicas conhecidas na arte incluindo, mas não lhes estando limitadas, o método descrito por Cregg et al (1985), Mol. Cell Bio. 5. 3376-3385.

Alternativamente a região reguladora 57 da fosfatase ácida (SEQ ID Na:2), a sequência de sinal (SEQ ID Ne:3), o gene estrutural (SEQ ID N2:4) e a região reguladora 37 (SEQ ID N®:5) podem ser obtidos por síntese da sequência adequada, tal como definida nas Tabelas 1-5, usando meios químicos ou enzimáticos conhecidos. Meios adequados incluem, mas não lhes estão limitados, procedimentos químicos com base na química do fosfotriéster, do fosfito ou do cianoetilfosforamideto.

Os peritos na arte também reconhecerão que a região

73 295 32 427-ΡΤ -19-reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris. isolada, (SEQ ID Na i 2), a sequência de sinal (SEQ ID Na:3), o gene estrutural (SEQ ID Na:4) e a sequência de terminação da transcrição 3' (SEQ ID Na:5) do presente invento, quando comparadas com a região reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris. a sequência de sinal, o gene estrutural as sequências de terminação da transcrição 3', isoladas subsequentemente podem conter um número de diferenças de nucleótidos de minimis devido a variação clonal ou a erro de sequenciação, que possam ocorrer. A modificação da região reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:2), da sequência de sinal (SEQ ID Na:3), do gene estrutural (SEQ ID Na:4) e da sequência de terminação da transcrição 3' (SEQ ID Na:5) também podem ser realizadas, como por adição de ADN ligador ou realizando mutagénese (por exemplo mutagénese M13) para proporcionar ou remover local(locais) de restrição e semelhantes.

Uma vez recuperado o gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris. ele pode ser mantido ou replicado em sistemas hospedeiro-plasmideo, eucariotas ou procariotas, como pBR322 mantido em E. coli. ou em qualquer outro sistema adequado, conhecido na arte.

Os peritos na arte também reconhecerão que também podem ser incorporadas numerosas sequências de ADN, adicionais, no vector empregue, tal como ADN plasmídico bacteriano, vários gene marcadores, ADN de bacteriófago, sequência de replicação autónoma e ADN centromérico, para referir apenas alguns exemplos representativos. A região reguladora 5' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:2) está contida no fragmento de ADN prolongando-se do nucleótido -339 até cerca do nucleótido 0, tal como é mostrado na figura 1 e na Tabela 2. Este fragmento é capaz de efectuar a transcrição do ADN em ARN quando ligado operativamente à, e posicionado na, extremidade 5' de uma sequência de ADN heterólogo codificando

73 295 32 427-ΡΤ -20 pelo menos um polipéptido.

Para utilizar a região reguladora 5' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:2) aqui descrita, o fragmento descrito na Figura 1 e na Tabela 2 pode ser ligado operativamente a sequências de ADN heterólogo que codificam pelo menos um polipéptido. Para os fins desta descrição as sequência de ADN hetrólogo são combinações de sequências de ADN que não ocorrem naturalmente no hospedeiro ou em associação com a referida região reguladora. Sequências de ADN heterólogo, adequadas, codificando pelo menos um polipéptido, que podem ser ligadas operativamente com a região reguladora 5' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:2) incluem, mas lhes estão limitadas, activador de plasminogénio tissular, albumina de soro humano e invertase. As sequências de ADN heterólogo usadas no presente invento devem conter um codão de início 5' ATG, um codão de paragem 3' e podem incluir, adicionalmente, sequências de nucleótidos para estabilizarem o ARNm ou para dirigirem a poliadenilação. A combinação da região reguladora 5· da fosfatase ácida (SEQ ID Ns:2) ligada operativamente a uma sequência de ADN heterólogo pode ser inserida num vector adequado. São possíveis numerosas combinações vector de levedura-hospedeiro e são conhecidas dos peritos na arte. Podem, também, estar presentes sequências adicionais como genes marcadores ou outras sequências que tornam o vector capaz de amplificação do crescimento e de propagação rápida em bactérias ou leveduras. Células hospedeiras adequadas que podem ser transformadas com um vector contendo a região reguladora 5' da fosfatase ácida incluem leveduras como aquelas dos géneros Saccharomyces. Pichia e Hansenula. preferivelmente Pichia. e muito preferivelmente Pichia pastoris. A transformação de uma célula hospedeira adequada com um vector contendo a região reguladora 5' da fosfatase ácida (SEQ ID NB:2) pode ser conseguida por qualquer técnica de transformação adequada conhecida dos peritos na arte.

73 295 32 427-ΡΤ A região reguladora 5' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:2) é controlada pela concentração de fosfato nos meios. Especificamente, esta região reguladora é desreprimida por baixas concentrações de fosfato. Consequentemente, a região reguladora 5' é regulada por mudança da concentração de fosfato presente nos meios. A sequência de sinal da fosfatase ácida (SEQ ID Na:3) está contida no fragmento de ADN que se prolonga do nucleótido 1 até cerca do nucleótido 66, como é mostrado na Figura 1 e na Tabela 3. Para utilizar a sequência de sinal da fosfatase ácida (SEQ ID N2:3) aqui descrita, o fragmento descrito na Figura 1 e na Tabela 3 pode ser ligado operativamente a sequências de ADN heterólogo que codificam pelo menos um polipéptido. Sequências de ADN heterólogo, adequadas incluem, mas não estão limitadas às sequências seleccionadas de entre o grupo que consiste em activador de plasminogénio tissular, albumina de soro humano e invertase. A combinação da sequência de sinal da fosfatase ácida (SEQ ID Na:3) ligada operativamente a uma sequência de ADN heterólogo pode, então, ser ligada a um promotor adequado. Convenientemente, o promotor que é empregue pode ser o promotor associado à sequência de comando. Alternativamente, pode substituir-se o promotor de PH01 que ocorre naturalmente por outros promotores heterólogos que poderiam permitir a regulação da transcrição. Um exemplo de um promotor heterólogo adequado, seria o promotor da álcool-oxidase (A0X1) (ou região reguladora 5') de Pichia pastoris descrito na U.S. 4 808 537, que é aqui incorporada para referência.

Vectores adequados nos quais o fragmento de ADN contendo a sequência de sinal da fosfatase ácida (SEQ ID N2:3) pode ser inserido, podem ser obtidos como descrito anteriormente. Adicionalmente, as células hospedeiras adequadas que podem ser transformadas com o vector resultante contendo um fragmento de ADN que codifica uma sequência de sinal incluem leveduras como as dos géneros Saccharomvces, Hansenula e Pichia. sendo preferida a -22- , -22- , c :y~ 73 295 32 427-ΡΤ

Pichia pastoris. A transformação destas células hospedeiras pode ser conseguida por qualquer meio adequada, conhecido dos peritos na arte. A sequência de sinal que está ligada operativamente a uma proteína que foi produzida por um destes sistemas vector/hospedeiro pode dirigir a secreção da referida proteína pela célula hospedeira. 0 gene estrutural da fosfatase ácida (SEQ ID N°;4) está contido no fragmento de ADN que se prolonga do nucleótido 67 até ao nucleótido 1407, como é mostrado na Figura 1 e na Tabela 4. 0 gene estrutural da fosfatase ácida (SEQ XD N:4) pode ser utilizado em biotecnologia recombinante para uma variedade de fins incluindo, mas não lhes estando limitados: (à) construções de ADN para a realização de recombinação homologa disruptiva (um processo para a inserção de sequências de ADN heterólogo no genoma de Pichia pastoris no locus da fosfatase ácida e fazendo, assim, a disrupção da actividade do gene da fosfatase ácida e (b) a produção de proteína fosfatase ácida para utilização em vários bioensaios. A sequência de terminação da transcrição 3# da fosfatase ácida (SEQ ID Na:5) termina a transcrição do ARNm ou estabiliza o ARNm quando ligado operativamente à extremidade 3' de uma sequência de ADN que codifica a produção de um polipéptido. Esta sequência de terminação da transcrição 3' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:5) está contida no fragmento de ADN que se prolonga do nucleótido 1408 até cerca do nucleótido 1549, como é mostrado na Figura 1 e na Tabela 5. A sequência de terminação da transcrição 3' da fosfatase ácida (SEQ ID Na:5) pode ser ligada operativamente a uma sequência de ADN heterólogo que codifica um polipéptido e usada para terminar a transcrição de, ou estabilizar o, ARNm em leveduras como as dos géneros Saccharomvces f Hansenula e Pichia. mas está particularmente bem adequada para utilização em Pichia pastoris.

Os Exemplos não limitantes, seguintes, são proporcionados para ilustração adicional da prática do presente invento. -23- 73 295 32 427-ΡΤ -23- # Λ/'

Exemulos

Estirpes

Utilizaram-se as estirpes seguintes nestes Exemplos:

Pichia pastoris KM 71 (AOX1,his4)

Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851 Pichia pastoris GS190 (arg4) NRRL Y-18014 Pichia pastoris GS247 (Ade-)

Pichia pastoris KM71:GS102 (Mut“)

Pichia pastoris GS115:GS102 (Mut+)

Pichia pastoris MD100-20 fhis4. Ade”)

Pichia pastoris MB102-26 (pho”f his4. ade~)

Pichia pastoris MB102-28 Pichia pastoris ΜΒ102-51 Pichia pastoris KM71:pPSU216 (Mut“)

Pichia pastoris GS115:pPSU216 (Mut“) E. coli JM103 delta (lac pro) thi rpsl (strA) sup E end A sbcB hsdR Linha celular de melanoma de Bowes com sobre-expressão de tPA ATCC# CRL9607 (células de melanoma humano).

Meios, Tampões e Soluções

Os meios, tampões e soluções empregues nos Exemplos seguintes têm as composições indicadas abaixo:

Meios LP (baixo fosfato) biotina 2 Mg/i pantotenato de cálcio 400 Mg/i ácido fólico 2 jLtg/l ácido nicotínico 400 Mg/i ácido p-aminobenzóico 2 ^g/i hidrocloreto de piridoxina 400 Atg/i riboflavina 200 jug/1 tiamina-HCl 400 Mg/l 73 295 32 427-ΡΤ

ácido bórico 500 Mg/l sulfato cúprico 40 μg/l iodeto de potássio 100 /ig/l cloreto férrico 200 Mg/l sulfato de manganês 400 μg/l sulfato de zinco 400 yq/1 inositol 2 mg/1 molibdato de sódio 200 μg/l sulfato de amónio 5 g/1 fosfato de potássio monobásico 30 mg/1 cloreto de potássio 1,5 g/1 cloreto de sódio 1,7 mM cloreto de cálcio 00 «5 «o o sulfato de magnésio 4,2 mM Tamoão TE Tris-HCl, pH 8,0 10 mM EDTA 1 mM sspe nxi NaCl 180 mM Na3P04, pH 7,7 10 mM EDTA 1 mM SSC (IX) NaCl 150 mM Citrato de Na 15 mM Solução de Denhardt (IX) Ficoll 200 mg/1 polivinilpirrolidona 200 mg/1 albumina de soro bovino 200 mg/1

73 295 32 427-ΡΤ REB -25-

LiCl Tris-HCl, pH 7,4 EDTA

íoo mM 100 mM 0,1 mM

PCI 500 ml/1 480 ml/1 20 ml/1 960 ml/1 40 ml/1 fenol clorofórmio álcool isoamílico clorofórmio álcool isoamílico

Placas Indicadoras LP. 1 litro

meios IX LP ácido cítrico 22,5 mM pH 4,8 20 g de dextrose 60 mg de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indo1ilo (Sigma) 25g de ágar Noble (Difco)

Tampão SCE 9,1 g de sorbitol 1,47 g de citrato de sódio 0,168 g de EDTA pH até 5,8 com HC1 em 50 ml dH20 e autoclave 6,75 g de base azotada de levedura sem aminoácidos (Difco) em 11 de água

Meios YNB

73 295 32 427-ΡΤ -26-

Exemplo I

Construção de PLP24

De modo a isolar e caracterizar o gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l) realizaram-se as experiências seguintes. Desenvolveu-se Pichia pastoris GS115 (NKRL-Y-15851) em ambiente de elevado fosfato (HP) [constituído por base azotada de levedura menos os aminoácidos (Difco), 2% de dextrose e 20 mg/1 de histidina] e num ambiente de baixo fosfato (LP) [constituído por meios LP, 2% de dextrose e 20 mg/1 de histidina], cada um dos quais num volume total de 300 ml. Pelotizaram-se as células, lavaram-se uma vez com 10 ml de REB e ressuspenderam-se em 4 ml de REB num tubo Corex de 30 ml. Adicionaram-se, seguidamente, 8 ml de pérolas de vidro e 4 ml de PCI. Misturou-se a suspensão num misturador de vórtex a velocidade elevada, 8 vezes a 20 segundos de cada vez, com arrefecimento em gelo durante 20 segundos entre as misturas. A suspensão foi, depois, centrifugada a lOOOOxg durante 10 minutos. A camada aquosa (topo) foi extractada duas vezes com 4 ml de PCI e 4 ml de Cl. Precipitou-se o ARN da fase aquosa, a -20“C, com 0,1 volume de acetato de potássio 3 M, pH 5,2, e 2,5 volumes de etanol. Seleccionou-se o ARN poli A+ como em Maniatis et al. (Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual], substituindo o NaCl por LiCl. A síntese de sondas de ADNc marcadas com ARNm de LP ou de HP usando 2 /ig de cada tipo de ARN poli A+, foi também feita de acordo com Maniatis et al..

Utilizaram-se 60 ng de uma biblioteca de plasmídeo de Pichia pastoris purificada em YEP13 [Broach et al. . Gene: 8121 (1979)] para a transformação de E. coli MC1061 (Mandei e Higa, 1970, J, Mol. Biol. 53:154). Resultaram aproximadamente 8000 colónias. As colónias foram replicadas em filtros de nitrocelulose em duplicado, amplificadas em placas LB contendo 100 jag/ml de ampicilina e 170 /xg/ml de cloranfenicol, lisadas por protocolos comuns (Grunstein e Wallis, 1979, Methods in Enzvmoloav 68. 379- -389), cozidas a 80°C durante 90 minutos e os filtros separados foram hibridados com as sondas de ADNc de -27- 73 295 32 427-ΡΤ LP ou de ΗΡ. A hibridação foi realizada usando SSPE 2X, solução de Denhardt IX, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,2% e sondas de ADNc marcadas com 2,5xl05 cpm por ml de solução de hibridação. A hibridação ocorreu a 55°C, durante 40 horas, num volume total de 25 ml. A seguir à hibridação, o filtros foram lavados duas vezes em SSC 2X, SDS a 0,1%, à temperatura ambiente e duas vezes em SSC 0,2X, SDS a 0,1% a 65°c, depois secas e expostas a filme de raios-X.

Identificaram-se vinte e quatro clones genómicos que hibridavam mais fortemente com a sonda de ADNc de LP do que com a sonda de ADNc de HP e eram, consequentemente, candidatos para conterem inserções que codificavam o gene da fosfatase ácida. Estes 24 clones foram resseleccionados como anteriormente com sondas de LP e de HP, hibridando, de novo, 14 clones resseleccionados, mais fortemente com a sonda de ADNc de LP. Isolou-se ADN plasmídico de cada um destes 14 clones, digeriu-se com EcoRl. separarou-se por electroforese em gel de agarose, transferiram-se para filtros de nitrocelulose em duplicado e cada filtro foi hibridado com o ADNc de LP ou de HP sob condições iguais às anteriores. Fragmentos de gene de quatro clones separados hibridaram mais fortemente com a sonda de ADNc de LP e fracamente, ou mesmo não hibridaram, com a sonda de ADNc de HP. Estes fragmentos foram, seguidamente, submetidos a mapeamento de restrição usando digestões duplas com EcoRl+Hindlll. EcoRi+sall e EcoRI+BamHI e foram hibridados de novo com a sonda de ADNc de LP. Os fragmentos codificavam segmentos do gene regulado por fosfato, não relacionados, tal como determinado pelas diferenças nos seus mapas de restrição.

As regiões identificadas por este procedimento como as que codificavam genes regulados por LP foram subclonadas em pUC8 ou pUC19 (New England Biolabs). Os plasmídeos resultantes foram marcados com -*2p pQr tradução por corte ("nick translation”) (Maniatis). Os plasmídeos marcados foram usados para sondar transferências de ARN de LP e de HP (5 μg/transferência). Um dos 24 clones originais, identificado como pLP24, foi escolhido para estudo adicional.

73 295 32 427—PT

-28 Exemplo II

Construção de PLP2411 0 plasmídeo pLP24 gerado no Exemplo I e que se pensava conter o gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l) ou um seu fragmento foi caracterizado adicionalmente da seguinte forma. Digeriram-se 10 pq de pLP24 com EcoRI/SalI e o fragmento de 2,1 kb foi purifiçado em gel.

Digeriram-se 10 pg de pYM25 (NKRL B-18015) com Sphl/Sall e o fragmento de 3,1 kb foi purificado em gel. Digeriram-se 5 pg de pUC19 com EcoRI/SalI. extractou-se com PCI, extractou-se com Cl e precipitou-se com EtOH. Ligaram-se 100 ng do pUC19 linearizado com EcoRI/SalI com 200 ng do fragmento de EcoRI/SalI de pLP24, de 2.1 kb, e com 450 ng do fragmento de Sphl/Sall de pYM25, de 3.1 kb, numa ligação em três partes, em 20 μΐ de tampão de ligação+lmM de ATP+1 U de ADN-ligase de T4. Transformou-se a estirpe E. coli MC1061 e identificou-se o plasmídeo correcto pela presença de um fragmento de EcoRl/sall de 2,1 kb e de um fragmento de Sphl/Sall de 3,1 kb. O plasmídeo correcto foi chamado pLP2411.

Exemplo III

Construção do Vector de Disrupcão de PH01 PLP2412 e Desenvolvimento de GS190;pLP24l2 0 plasmídeo pLP2411, derivado do plasmídeo pLP24 (ver Exemplo II), foi digerido com Xbal. tratado com ADN-polimerase de Klenow para gerar extremidades rombas e foi ligado com o fragmento de Hpal do plasmídeo pYM25, de 2,1 kb. Este fragmento continha o gene ARG4 de Sacharomvces cerevisiae. (O plasmídeo pYM25 está disponível por NRRL B-18015). 0 plasmídeo resultante foi designado como pLP2412. 0 pLP2412 foi, seguidamente, digerido com EcoRI e BamHI. 0 fragmento de 3,3 kb foi isolado e usado para transformar Pichia pastoris GS190 (NRRL Y-18014) para prototrofia Arg+ (o procedimento de transformação é descrito no 73 295 32 427-ΡΤ -29-

Exemplo IV). Os prototrofos de arginina foram identificados pela sua capacidade para se desenvolverem em meios que não têm arginina. Eles foram isolados e seleccionados em placas indicadoras de LP quanto à presença de fosfatase ácida. As colónias foram plaquadas para replicação em placas indicadoras de LP e deixadas desenvolver durante a noite, a 30 °C. As colónias nas placas indicadoras de LP eram verdes (PH01) ou brancas (phol). As colónias brancas eram transformantes contendo a cassete de expressão de 3,3 kb anterior, integradas de modo estável por disrupção no locus PHOl do genoma de Pichia pastoris.

Os ADN genómicos de estirpes Arg+ estáveis foram analisados por hibridação em filtro de Southern para a determinação da localização da cassete de expressão. 0 fragmento de EcoRI-BamHI. de 3,3 kb, contendo o gene ARG4 de Saccharomvces cerevisiae. tinha especificamente integrado e provocado a disrupção da sequência genómica que era análoga ao fragmento de ADN contido no pLP2411, confirmando assim que este locus codificava a fosfatase ácida (PH01). Este transformante foi designado por GSl90:pLP24i2.

Exemplo IV

Transformação de Pichia pastoris

Utilizou-se o protocolo seguinte na transformação de Pichia pastoris.

Inocularam-se células de levedura em cerca de 10 ml de meio YPD e cultivaram-se com agitação ("shake cultured") a 30°C, durante 16-20 horas. Diluiriam-se, então, as células até uma A60o de cerca de 0,01 a 0,1 e mantiveram-se na fase log em meio YPD, a 30°C, durante cerca de 6-8 horas. Inocularam-se 100 ml de meio YPD com 0,5 ml da cultura semente a uma A600 de cerca de 0,1 e cultivaram-se com agitação, a 30°C, durante cerca de 16-20 horas. Colheu-se , seguidamente, a cultura com uma A60o Que era de cerca de 0,2 a 0,3 (após aproximadamente 16-20 horas) por centrifugação usando uma centrífuga DAMON IEC DPR-6000 a 1500xg durante 5

73 295 32 427—PT minutos.

Para a preparação de esferoplastos, lavaram-se as células uma vez com 10 ml de água estéril (a centrifugação foi realizada após cada lavagem como descrito anteriormente), uma vez com 10 ml de SED acabado de preparar, uma vez com 10 ml de sorbitol 1 M, estéril, e ressuspenderam-se em 5 ml de tampão SCE. Adicionaram--se 5 μΐ de Zymolyase 60000 a 4 mg/ml (disponível em Miles Laboratories) e incubaram-se as células a 30°C, durante cerca de 30 minutos. A formação de esferoplastos foi monitorizada como se segue. Adicionaram-se aliquotas de 100 μΐ de células a 900 μΐ de SDS a 5% e 900 μΐ de sorbitol 1 M antes, ou imediatamente após, a adição de Zymolyase, e a vários tempos durante o período de incubação. A incubação foi parada no ponto em que as células eram lisadas em SDS mas não em sorbitol. Depois de formados, lavaram-se os esferoplastos uma vez com 10 ml de sorbitol 1M , estéril, por centrifugação a lOOOxg, durante 5-10 minutos, lavaram-se uma vez com 10 ml de CaS por centrifugação e ressuspenderam-se em 0,6 ml de CaS.

Para a transformação real, adicionaram-se amostras de ADN em água ou tampão TE (até 20 μΐ de volume total) a tubos de polipropileno estéreis de 12X75 mm. (Para pequenas quantidades de ADN a transformação máxima ocorre usando cerca de 1 μΐ de ADN de E. coli a 5 mg/ml, sonicado, em cada amostra.) Adicionaram-se 100 μΐ de esferoplastos a cada amostra de ADN e incubaram-se à temperatura ambiente durante cerca de 20 minutos. Adicionou-se 1 ml de solução de PEG a cada amostra e incubou-se à temperatura ambiente, durante cerca de 15 minutos. Centrifugaram-se as amostras a lOOOxg, durante 5-10 minutos e descartou-se o sobrenadante. Ressuspenderam-se as pelotas em 150 μΐ de SDS e incubaram-se à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Adicionaram-se 850 μΐ de sorbitol 1 M, estéril, a cada uma e plaquearam-se as amostras como se descreve abaixo.

Verteram-se 10 ml de Regeneration Agar por placa pelo menos 73 295 32 427-ΡΤ 31-

30 minutos antes das amostras de transformação estarem prontas. Distribuíram-se, também, aliquotas de 10 ml de Regeneration Agar em tubos, num banho de 45-50°C durante o período em que as amostras de transformação estavam em SDS. Adicionam-se, seguidamente, as amostras aos tubos, verteram-se em placas contendo a camada de fundo de ágar sólido e incubaram-se a 30°C, durante 3-5 dias.

Determinou-se a qualidade dos esferoplastos em vários pontos, como se segue. Removeu-se uma amostra de 10 μ e diluiu-se 100 x por adição de 990 μΐ de sorbitol 1 M. Removeram-se 10 μΐ da diluição e adicionou-se uma aliquota adicional de 990 μΐ de sorbitol 1 M. Espalharam-se em placas 100 μΐ de ambas as diluições em meio YPD ágar para a determinação da concentração de células completas que não tinham sido transformadas em esferoplastos que permaneciam na preparação. Adicionaram-se 100 μΐ de cada diluição a 10 ml de Regeneration Agar que tinha sido suplementado com 40 /ig/ml de todos os aminoácidos necessários pelo hospedeiro para a determinação de esferoplastos totalmente regeneráveis. Valores bons para uma experiência de transformação eram l-3xl07 esferoplastos totalmente regeneráveis/ml e cerca de lxlO3 células completas/ml.

Exemplo V

Preparação de ADN de Levedura

Utilizou-se o protocolo seguinte na preparação de ÁDN de Pichia pastoris.

As células de levedura foram desenvolvidas em 100 ml de meio YNB mais 2% de dextrose, a 30°C, até que a A600 igualasse 1-2 e, depois, foram pelotizadas usando uma centrífuga Damon IEC DPR-6000 a 2000xg, durante 5 minutos. Lavou-se a pelota uma vez em dE^O, uma vez em SER, uma vez em sorbitol 1 M e, depois, ressuspenderam-se em 5 ml de uma solução de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0 e sorbitol 1 M. Misturaram-se, depois, as células com 50-100 μΐ de uma solução de Zymolyase 60000 a 4 mg/ml (Miles 73 295 32 427-ΡΤ -32-

Laboratories) e incubaram-se a 30°C, durante 1 hora. Centrifugaram-se, seguidamente, os esferoplastos a lOOOxg durante 5-10 minutos e suspenderam-se em tampão de lise [SDS a 0,1%, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4), EDTA 5 mM e NaCl 50 mM]. Adicionaram-se proteinase K (Boehringer Mannheim) e RNase A (Sigma) cada uma delas até 100 /xg/ml e incubou-se a solução a 37°C durante 30 minutos. Desproteinizou-se o ADN por mistura suave da preparação com um volume igual de Cl e separaram-se as fases por centrifugação a 12000xg, durante 20 minutos. Retirou-se a fase superior (aquosa) para um tubo fresco e extractou-se com um volume igual de PCI. Separaram-se as fases como anteriormente e colocou-se a fase de topo num tubo contendo 2-3 volumes de etanol frio a 100%. Misturou-se a amostra suavemente e o ADN foi recolhido por enrolamento sobre uma vara de plástico. 0 ADN dissolveu-se imediatamente em 1 ml de tampão TE e dializou-se durante a noite a 4°C contra 100 volumes de tampão TE.

Exemplo VI

Isolamento do gene PHOl de Comprimento Total

Para o isolamento de um plasmideo contendo o gene completo PHOl de Pichia pastoris (SEQ ID Na:l), hibridou-se a biblioteca genómica, original, de Pichia pastoris em MC1061, sob as condições descritas anteriormente, com o fragmento de BamHI de pLP24, de 600 pb. Este procedimento identificou cinco clones positivos. Preparou-se ADN plasmídico a partir destes clones, digeriu-se com BamHI. transferiu-se para filtrou de nitrocelulose e hibridou-se com a mesma sonda de 600 pb. Cada um dos cinco clones tinha o fragmente de BamHI de 2,o kb, que continha o gene PHOl de Pichia pastoris. Um dos clones foi escolhido para análise adicional e foi designado por pLP2420. 0 fragmento de BamHI de pLP2420, de 2,0 kb, foi sequenciado por sequenciação didesoxi comum dos fragmentos digeridos com enzima de restrição, subclonados em M13 (disponível em New England Biolabs). A análise da sequência revelou um quadro de leitura aberto de 468 aminoácidos contido inteiramente no -33 73 295 32 427-ΡΤ & / ? * ί:_?* fragmento de BamHl de 2,0 kb.

Exemplo VII

Desenvolvimento das Estirpes MB102»26:pLP2430-T1 e MB102—26:pLP2430—T3

Ligou-se o fragmento de BamHl de pLP2420, de 2,0 kb, contendo o gene PHOl. no local BamHl de pYM8, um plasmídeo que contém o gene HIS4 de Saccharomvces cerevisiae e as sequências pBR322. [o pYM8 pode ser preparado como se segue: digeriram-se dez μg de pYA2 (NRRL B-15874) com Sphl/Thal e purificou-se em gel o fragmento de 3,4 kb. Digeriram-se dez μg de pBR322 com Sphl/NruI e purificou-se em gel o fragmento de 3,95 kb. Ligaram--se cem ng do fragmento de pBR322, de 3,95 kb, com 250 ng do fragmento de pYA2, de 3,4 kb, sob condições padrão. O plasmídeo correcto foi identificado na base de um fragmento de Xhol/Sphl de 3,1 kb e chamado pYM8]. O plasmídeo resultante foi designado por pLP2430 e era competente para se replicar autonomamente em Pichia pastoris devido a uma função ARS (sequência de replicação autónoma) fortuita residente na sequência do gene HIS4 de Saccíiaromvces cerevisiae. A GS190:pLP2412 (Pho"), uma estirpe de Pichia pastoris a que falta a actividade de fosfatase ácida (ver Exemplo III) foi emparelhada ("mated") com uma estirpe MD100-20 (his4, Ade") de Pichia pastoris. 0 protocolo de emparelhamento usado foi igual ao descrito na U.S. 4 812 405, que é aqui incorporado para referência. A estirpe MA100-20 foi desenvolvida como se segue: células da estirpe GS 115 (his4) de Pichia pastoris NRRL Y-15851 foram misturadas com células da estirpe GS247 (Ade") sob condições conhecidas para provocarem a formação de zigoto e diploidização (o protocolo para este procedimento encontra-se em U.S. 4 812 405, que é aqui incorporado para referência) e foram plaqueadas em placas de YNB+dextrose para a selecção dos diploides prototróficos. A estirpe diploide foi chamada MD100. Cultivou-se a MD100 sob condições conhecidas para induzirem a esporulação dos diploides de Pichia pastoris (também descritas na

/;__' ιy/ 73 295 32 427-ΡΤ -34- U.S. 4 812 405) e cultivou-se a progenia de esporos em placas YNB dextrose+adenina+histidina. Testaram-se as colónias individuais quanto à capacidade para se desenvolverem na ausência suplementos de adenina ou de histidina. Identificou-se uma estirpe capaz de se desenvolver sem suplemento de histidina mas incapaz de se desenvolver sem suplemento de adenina e designou-se por MD100-20.

Uma estirpe diploide deste cruzamento, (MB102 Pho+/Pho-, His4/his4.Ade+/Ade~) foi esporulada (U.S. 4 812 405) para originar progenias haploides. Estas progenias foram seleccionadas em placas indicadoras de LP e em placas YNB dextrose, com ou sem suplementos de histidina ou de adenina, para o isolamento da estirpe MB102-26 (Pho~fhis4. Ade”).

Transformou-se a estirpe MB102-26 com o plasmídeo pLP2430 como foi descrito no Exemplo IV. Os transformantes His+ foram seleccionados e separados em termos da expressão da fosfatase ácida em placas indicadoras de LP (ver Exemplo III). Cinco transformantes eram positivos quanto à expressão da fosfatase ácida.

Dois destes transformantes, MB102-26:pLP2430-Tl e MB102-26:pLP2430-T3 foram analisados quanto à regulação adequada da expressão de fosfatase ácida. Desenvolveu-se cada estirpe em meio de HP ou de LP durante 24 horas, até uma A600 de 2,0. Ensaiaram-se as células de cada cultura quanto à expressão de fosfatase ácida (Bostian et al. 1980; Proc. Natl. Acad. Sei. 27:4504-4508), em paralelo com as células HIS4 não transformadas (MB102-28) portadoras do fenótipo Pho~ e células HIS4 (MB102-51) portadoras do fenótipo de tipo selvagem Pho+ (Tabela I). 0 nível de indução de transformantes pLP2430 era virtualmente idêntico ao da estirpe de tipo selvagem. Consequentemente, o fragmento de BamHT de 2,0 kb contendo o gene PHOl inserido em pLP2430 continha toda a região de codificação de fosfatase ácida, bem como todas as sequências suficientes para conferiem a expressão adequada, regulada por fosfato, da fosfatase ácida. 73 295 ;<·φ 32 427-ΡΤ )

(J txt.

35-

Tabela I N2 <le vezes

Estirpe Genótipo Unidades AP/DO600 de Indução MB102-26:pLP2430-Tl ade-, HIS4, PHOl 707 30244 43 MB102-26:pLP2430-T3 ade-, HIS4, PHOl 852 28198 33 MB102-51 ade-, HIS4, PHOl 61,4 1975 32 MB102-28 ade-, HI84, phol 0,02 0,03 1,5

Exemplo VIII

Secrecão de Invertase

Este Exemplo põe em evidência que a sequência de sinal de PH01 (SEQ ID na:3) actua quando ligada operativamente a genes heterólogos. 0 fragmento de Smal-PvuII de 2,2 kb contendo o gene SUC2 de Saccharomvces cerevisiae foi isolado de pSEYC306 [Jonhson et al. . Cell 48. 875 (1987)] e clonado no local Smal de pA0810 ou de pPSV2l8 (ver Exemplos XI e XII para a descrição destes plasmídeos progenitores). Este procedimento gerou os plasmídeos pAPINVl e pAPINV2, respectivamente. Estes empregam o promotor de A0X1 de Pichia pastoris para regular a transcrição de um quadro de leitura aberto da sequência de sinal de PH01 (SEQ ID N2:3) no gene estrutural SUC2:

Sequência PHOl ...GTGTTCGCT

Sequência dos liqadores de PSEYC306 CGA GAA TCC CCC GGG GAT CCG TCG ACC TGC AGC CCA GCT TTG

Sequência de SUC2 ACA AAC GAA...

Digeriram-se dez μg de cada um dos plasmídeos pAPINVl ou pAPINV2 com BglII e usaram-se para transformar GS115 como no Exemplo IV. Os transformantes contendo o fragmento BglII de -y -36- 73 295 32 427-ΡΤ pAPINVl, designados por GSll5:pAPINVl foram seleccionados quanto à prototrofia de histidina e seleccionados em termos do fenótipo Mut“, que denota integração e disrupção adequadas no locus A0X1. A selecção por Mut~ foi realizada por plaqueamento de colónias para réplica de meios contendo glucose para meios contendo metanol e avaliação da taxa de crescimento em metanol. Um crescimento lento em metanol indicava o fenótipo Mut”. Os transformantes com o fragmento BqlII de pAPINV2, designados por GS115:pAPINV2, foram também seleccionadas quanto à prototrofia de histidia, mas foram separadas quanto ao fenótipo Pho”, que denota integração e disrupção adequadas no locus PH01 (ver Exemplo III).

Os transformantes de cada classe foram identificados e cultivados em YNB+glicerol a 2%, em paralelo com estirpes de Pichia pastoris KM71:GS102(Mut_) e GS115:GS102(Mut”) que contêm plasmídeos integrados idênticos a pAPINVl, com a excepção de o gene SUC2 conter a sua sequência de sinal nativa e não ter a sequência de sinal de PH01. Estas duas estirpes são descritas na EP 256 421. Também foram cultivadas em paralelo duas estirpes KM71:pPSV216(Mut”) e GS115 :pPSV216(Mut“), que contêm plasmídeos integrados idênticos a pAPINV2, com a excepção de não existirem as sequências de SUC2.

Cada cultura foi desenvolvida em YNB+glicerol a 2% até uma A®00 aproximadamente 3,0. Removeu-se uma aliquota de cada, lavou-se em água estéril e ressuspendeu-se em 10 ml de YNB+0,5% de MeOH. As culturas Mut+ foram ressuspensas a A600=0,02 e as culturas Mut” a A600=0,2 e desenvolvidas a 30°C, durante 24 horas, até aproximadamente A600=0,3-0,4. Neste momento, aproximadamente a 1,0 mDO®°®, testou-se quanto a actividade de invertase. Os resultados são mostrados na Tabela II. 73 295 32 427-ΡΤ

Tabela II

Cultura MUT Sequência de sinal Invertase Segregadaa Invertase Totalb Eficiência de Secreção0 Gsll5: pAPINVl - PH01 20,3 3,05 0,67 KM71: GS102 - SUC2 12,5 18,9 0,66 KM71: PPSV216 - PH01d 0 0 NA GS115: PAPINV2 + PHOl 6,1 6,7 0,91 GS115: GS102 + SUC2 5,3 5,7 0,93 GS115: PPSV216 + PH01d 0 0 NA a -invertase segregada - medida como por Goldstein e Lampen0. sem Triton, expressa em unidades de invertase/A600 de cultura ensaiada. 1 Unidade=l //mole de glucose libertada/minuto, a 37°C. b -invertase total - medida na presença de Triton X-100 a 2%. c -eficiência de secreção - invertase segregada/invertase total ensaiada. ^ -sinal PH01 presente, sem sequências SUC2. 0 -Goldstein e Lampen, Methods in Enzvmoloqy 42:504-511. 1975.

Os resultados mostram claramente que a sequência de sinal de >T ' fk

73 295 32 427—PT -38- ® é ΡΗ01 actua tão eficientemente quanto a sequência de sinal de SUC2. na promoção da secreção de invertase em Pichia pastoris.

Exemplo IX

Secrecão de tPA (Activador de Plasminoqénio Tissular)

Este Exemplo põe em evidência que a sequência de sinal de PHOl (SEQ ID Nfi:3) actua quando ligada operativamente a genes heterólogos.

l. Isolamento do ADNc codificando tPA A linha celular de melanoma de Bowes, com sobre-expressão de tPA, ATCC# CRL9607, foi a fonte de ARN usado para construir uma biblioteca de ADNc. Esta linha celular foi usada por outros para a clonagem de sequências de tPA (Pennica et al.. Nature 301:214. 1983; Edlund et al.. PNAS 80:349, 1983; Lemontt et al.. DNA 4:419, 1985). Isolou-se ARN poli A+ e iniciou-se por oligo dT, seguido de modo geral o procedimento em Maniatis (Molecular Clonina: A Laboratorv Manual; Cold Spring Harbour Laboratory, 1982). 0 ARN foi usado para fazer ADNc usando um conjunto comercial de clonagem de ADNc (disponível em Amersham) e inseriu--se no vector de clonagem gtll. Os fagos gtll contendo as inserções infectaram o hospedeiro E. coli Y1088, usando uma mistura embalada comercial (disponível em stratagene). A biblioteca foi plaqueada em triplicado e sondada com três oligonucleótidos diferentes concebidos a partir da sequência publicada do ADNc de tPA humano (pennica et al.. supra). Os oligonucleótidos correspondiam às secções 5', d meio e 3' do ADNc e eram as sequências seguintes: sonda 3' :5' GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 3' sonda do meio: 5' TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3' sonda 5': 5' GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T 3' i·^ -39- i·^ -39- /> 73 295 32 427-ΡΤ

Identificaram-se cinco placas que hibridavam com as três sondas. Digestões de restrição das inserções destes clones identificaram-nos como codificando tPA com base nos padrões de restrição publicados (Pennica et al. . supra). Os clones diferiam apenas na extensão da sequência 5' não codificadora presente. Os clones 4 e 5 foram escolhidos para caracterização adicional porque eles continham inserções de ADN de 0,8 kb (extremidade 5'), 0,47 kb (meio) e 1,3 kb (extremidade 3') por digestão com EcoRI. sugerindo a presença de sequências que codificam tPA, de comprimento total. 0 fragmento de BalII do clone 4 foi subclonado em pUC18 cortado com BamHI e a ligação foi transformada em células E. coli MC1061. Os transformantes positivos foram identificados por digestão com EcoRI♦ Um clone que continha uma inserção na orientação com sentido ("sense orientation") foi identificado por um padrão de restrição por PstI de fragmentos de 420 bp, 624 pb, 760 pb e 2,7 kb e foi chamado pUC18#3. Um clone contendo a inserção na orientação anti-sentido ("antisense orientation") foi identificado por um padrão de restrição por PstI de 420 pb, 624 pb e 3,46 kb e foi chamado pUC18#42. A inserção codifica a partir de dois nucleótidos antes do primeiro aminoácido do tPA maduro prolongamdo-se pelos 1972 nucleótidos da sequência não codificadora 3'. 2. Construção do Vector PT37 (PHQlss-tPA-pUC) A inserção de tPA de pUC18#2 foi clonada no plasmídeo de expressão pA0810 de Pichia pastoris. 0 plasmídeo pA0810 é constituído pelo promotor de A0X1 de Pichia pastoris, a sequência de sinal de PH01 de Pichia pastoris, o terminador de transcrição de AOX1. o gene HIS4 de Pichia pastoris para selecção, uma origem fl de replicação e sequências necessárias para a replicação e selecção em bactérias. A construção de pA0810 é descrita no Exemplo XI.

Ligaram-se 2 μg do fragmento de Sall/Smal de pUC18#2, de 1600 pb, purificado previamente num gel de agarose, codificando a porção 57 de tPA, com 300 ng de pA0810 digerido com Xhol/Smal. A reacção de ligação foi transformada em células E.coli MC1061 e

73 295 32 427—PT 4

-40- seleccionaram-se colónias ampR. Identificaram-se as que eram positivas por um padrão de fragmentos de 420 pb, 620 pb, 2 kb e 6,3 kb por digestão com PstI. O vector resultante foi chamado pTl. A mutagénese dirigida a sítio foi realizada, seguindo procedimentos padrão para vectores de replicação de origem fl, para efectuar à delecção de dois nucleótidos 5'extra da sequência de codificação de tPA maduro. O oligonucleótido que provocava a mutagénese tinha sequência: 5' CAA TCT GCT TTC GCT TCT TAC CAA GTG ATC 3' O plasmídeo correcto foi identificado por selecção de mini preparações digeridas com Sall/Xbal. 0 vector original pTl tinha um padrão de restrição de 1,2, 2,3 e 6,6 kb. O plasmídeo correctamente mutagenizado tinha um padrão de 1,2 e 9,8 kb e foi chamado pT2-3.

Digeriram-se 50 μg de pUC18#3 com Smal7Sau3A. Purificaram-se as três bandas entre 72 e 118 pb (75, 90, 110 pb) codificando a porção 3' de tPA, num gel de poliacrilamida a 8% e ligaram-se a 0,5 jug de plasmídeo pT2-3 cortado com Smal/BamHI. A ligação foi transformada em células E.coli MC1061 e seleccionaram-se colónias ampR. As positivas foram identificadas por mini preparações digeridas com PvuII/Aoal. 0 plasmídeo correcto exibia um fragmento de 421 pb (o incorrecto mostrava um fragmento de 225 pb). 0 vector correcto foi chamado pT37. Mostra-se que a mutagénese 5' tinha a sequência correcta, contudo, a sequenciação revelava que o plasmídeo continha as sequências de pUC18 que se seguiam ao fim da sequência não codificadora 3' de tPA; mostrou-se que o plasmídeo pT37 tinha um fragmento Sau3A de pUcl8, posição 1894-2004, imediatamente a seguir à sequência de tPA.

Digeriram-se 10 μg do plasmídeo pT37 com StuI e usou-se para a transformação da estirpe KM71 de Pichia pastoris (aoxl. his4). Seleccionaram-se os transformantes quanto à prototrofia de histidina. Cultivou-se um transformante, KM71:pT37, em YNB+glicerol a 2%, em paralelo com a estirpe KM71:pT7, que continha um plasmídeo (pT7) quase idêntico a pT37, com a excepção

3 73 295 32 427—PT -41- ('Jp ‘ de que a sequência de sinal de PHOl tinha sido substituída pela sequência de sinal de tPA humano, nativa, e as sequências de pUC18 na extremidade 3' tinham sido removidas. A descrição de pT7 é proporcionada a seguir. Semearam-se culturas de 50 ml de cada estirpe em desenvolvimento em YNB+glicerol a 2%, em fermentadores de um litro e desenvolveram-se em modo contínuo ou em modo descontínuo com alimentação. Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela III.

Tabela III *tPA tia/1

Ensaio * Estirpe Sinal Modo Interno Externo Total Eficiência** 1 KM71:pT7 tPA Continuo 255 60 315 0,19 2 KM71:pT7 tPA Descontinuo 651 30 681 0,04 com alimentação 3 KM71:pT37 PHOl Contínuo 840 420 1260 0,33 4 KM71:pT37 PHOl Descontínuo 1856 1200 3056 0,39 com alimentação * tPa ensaiado por ELISA usando tPA humano como padrão. ΨΨ * * «A. · eficiência da secreção de tPA=tPA externo/tPA total produzido

Os resultados desta experiência mostram que independentemente do modo de fermentação a sequência de sinal de PHOl (SEQ ID n2:3) foi mais eficiente na promoção da secreção de tPA em Pichia pastoris do que a sequência de sinal nativa.

Além disso, a análise de degradação de micro-Edman confirmou que a sequência de aminoácidos N-terminal do tPA recombinante, segregado a partir da estirpe KM7l:pT3, usando a sequência de sinal de PHOl (SEQ ID Na:3) era idêntico ao tPa nativo purificado a partir de uma fonte de tecidos humana (melanoma), cultivada. 3. Construção de pT7 C tPAss-tPA-sem pUC)

Ligaram-se 5 μg do fragmento de SmaI/Sau3A de pUC18#3, de 100 pb, com 500 ng de pTl cortado por Smal/BamHI. A reacção de ligação foi transformada em células E. coli MC1061 e

73 295 32 427-ΡΤ -42-seleccionaram-se colónias ampR. Identificaram-se as positivas pelo presença de uma banda de 360 pb, em vez de uma banda de 260 pb, por digestão com Apal/PvulI. A extremidade 3' modificada foi sequenciada e mostrou-se que tinha a sequência correcta, sem sequências de pUC18 extra. Este plasmídeo foi chamado pT49.

Adicionaram-se oligonucleótidos que codificavam a sequência de sinal autêntica de tPA ao locus Xbal do plasmídeo pT49 e, seguidamente realizaram-se duas mutagéneses para 1) realizar a delecção dos 8 nucleótidos extra da sequência que permanecia entre a sequência de sinal de tPA e a sequência que codifica o tPA maduro e 2) realizar a delecção da sequência de sinal de PHOl. Estas manipulações foram conseguidas como se segue.

Sintetizou-se um oligonucleótido com a seguinte sequência (109 nucleótidos): 5' CTA GAT GGA TGC AAT GAA GAG AGG GCT CTG CTG TGT GCT GCT GCT GTG TGG AGC AGT CTT CGT TTC GCC CAG CCA GGA AAT CCA TGC CCG ATT CAG AAG AGG AGC CAG A3' 0 oligonucleótido complementar necessário para a segunda cadeia foi sintetizado como três oligonucleótidos de 33, 37 e 39 nucleótidos de comprimento, respectivamente, que tinham as seguintes sequências: 5' CTG GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3' 5’ CTA GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3' 5' CAG CAG CAC ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3' 0 oligonucleótido de comprimento total e os três oligonucleótidos complementares foram submetidos a cinase e temperados ("annealed") em conjunto por aquecimento num banho de água em ebulição durante 3 minutos e, depois arrefecido lentamente até ã temperatura ambiente. 0 oligonucleótido temperado foi separado e isolado num gel de poliacrilamida a 8%.

73 295 32 427-ΡΤ -43-

Ligaram-se 200 ng de pT49 parcialmente linearizado por Xbal a 1 fig do oligonucleótido temperado de cadeia dupla- A reacção de ligação foi transformada em células E. coli MC1061 e as colónias ampR foram seleccionadas. Os clones contendo o plasmídeo correctamente alterado foram identificados por uma banda adicional de 700 pb por digestão com AsuII. Um plasmídeo correcto foi chamado pT544. A primeira mutagénese foi conseguida por mutagénese dirigida a sítio com base em fl, usando ADN de pT544 (5 Mg) e um oligonucleótido (1 /xg) com a sequência seguinte: 5' GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3' O plasmídeo correcto foi seleccionado por digestão com BglII. O padrão de restrição correcto ( 1,1, 2,8 e 5,3 kb) indicava o plasmídeo correcto, que foi chamado pT64. (O plasmídeo incorrecto mostrava um padrão de bandas de 2,8 e 6,3 kb.) A segunda série de mutagénese foi realizada com o plasmídeo pT64 para efectuar a delecção da sequência de sinal de PHOl. Foi usado um oligonucleótido com a sequência seguinte: 5' ACT AAT TAT TCG AAA CGA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G 3'

Usaram-se na mutagénese 3 βg de pT64 e 0, 4 Mg do oligonucleótido anterior. As mini preparações foram seleccionadas por digestão com BglII. O plasmídeo correcto foi identificado por três fragmentos de ADN de 1, 2,8 e 5,3 kb de tamanho (o plasmídeo incorrecto mostrava uma banda mais pequena de 1,1 kb em vez de 1 kb). A mutagénese foi confirmada por sequenciação e o plasmídeo correcto foi chamado pT7.

Exemnlo X

Construção de pAPBIOI: plasmídeo de expressão promotor PHOl-lacZ

Este Exemplo põe em evidência que o promotor de PHOl (ou -44- 73 295 32 427-ΡΤ região reguladora 5') (SEQ ID Ns:2) actua guando ligado operativamente a genes heterólogos. Digeriu-se 1 μ<£ do plasmídeo pSA0H5 contendo lacZ (NERL B-15862) com EcoRI e BamHIf e isolou--se o fragmento de vector de 10,1 kb de um gel de agarose a 8%. Digeriram-se 5 μg de pLP2420 com EcoRI e Bell e isolou-se o fragmento de 1,6 kb, contendo 375 pb do ADN de pBR322, "1075 pb do ADN flanqueador de PHOl incluindo o promotor de PHOl (SEQ ID Na:2) e 123 pb da sequência de codificação de PHOl, a partir de um gel de agarose a 1%. Ligaram-se 100 ng do fragmento de EcoRI--BamHI de pSA0H5 e 60 ng do fragmento de EcoRI-Bcll de pLP2420 numa mistura de 20 μΐ de tampão de ligase com ATP 1 mM e 1 U de ADN-ligase de T4 (disponível em Boehringer Mannheim). A mistura de ligação foi transformada em E. coli JM103 e as células transformadas foram plaqueadas em placas LB Amp que continham 40 jLig/ml de X-gal. Escolheram-se as colónias de cor azul, desenvolveram-se em LB Amp e isolou-se o ADN plasmídidco. Digeriu-se o ADN com EcoRI e Smal e identificou-se o plasmídeo correcto pela libertação de um fragmento de 1450 pb. O plasmídeo correcto foi chamado pAPBlOl. Uma cassete de expressão constituída pelo gene lacZ de E. coli sob a regulação do elemento promotor de PHOl de Pichia pastoris (SEQ ID Ns:2) estava contida em pAPBlOl.

Transformaram-se 10 ^g de pAPBlOl não cortado em esferoplastos GS115 e seleccionaram-se prototrofos de histidina. Escolheram-se as colónias 12 His+, desenvolveram-se as estirpes em meios de fosfato elevado (HP) e de LP líquidos e ensaiaram-se quanto à actividade de /3-galactosidase. Identificaram-se as estirpes transformantes positivas na base da expressão de β--galactosidase após desenvolvimento em meios de LP e numa falta de 0-galactosidase após desenvolvimento em meios de HP. Ensaiou--se quanto à /8-galactosidase como em J. H: Miller, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY, 1972. Apareceram colónias azuis nas placas LP-X-gal e apareceram colónias brancas nas placas HP-X-gal. -45- -45- > -T A I r iflfiíft

73 295 32 427—PT

Exemnlo XI

Construiram-se os plasmídeos seguintes para utilização nos outros exemplos deste pedido. 1.Construção do plasmídeo PA0810

Construiu-se Ml3mpl9 RI por digestão de 1 yg de M13mpl9 com EcoRI. preenchendo com Klenow e ligando o fragmento preenchido a si próprio; a ligação foi usada para a transformação de células E. coli JM103 e identificou-se o fago correcto isolando o ADN e digerindo-o com EcoRI. 0 fago correcto não foi cortado por EcoRI e foi chamado M13mpl9 RI. 0 plasmídeo pA0804 (cuja construção é descrita em W089/04320, que é aqui incorporado para referência) foi digerido com SstI e EcoRV e isolou-se um fragmento de aproximadamente 1,2 kb a partir de um gel de agarose a 0,8%. (Todos os fragmentos desta construção foram isolados a partir de geles de agarose 0,8-1,0%). Ligaram-se 100 ng do fragmento a 500 ng de M13mpl9 RI, digerido com SstI e Smal. A ligação foi usada para transformar células E. coli JM103 e identificou-se o fago correcto isolando o ADN e digerindo-o com SstI e PvuII. Identificou-se o fago correcto pela presença de um fragmento de 950 pb e foi chamado ppsvioi.

Submeteu-se um picomole de pPSVlOl a mutagénese específica de local, dirigida por oligonucleótidos, in vitro. usando 20 pmol de um oligonucleótido com a seguinte sequência: 5' CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ACA T 3' A mistura reaccional foi usada para transformar células E. coli JM103. Identificou-se o fago correcto por digestão de ADN de mini preparação com BglII e BamHI. revelando a presença de fragmentos de ADN de 1,4 kb e 0,5 kb. 0 fago correcto foi chamado pPSV102.

Digeriu-se o plasmídeo pPSV102 com EcoRI e ligaram-se 500 ng do fragmento de 8,5 kb a 50 ng do fragmento de ADN sintético de cadeia dupla que codifica a sequência de sinal de PH01 de Pichia -46- # 73 295 32 427-ΡΤ

ΤΡ**5® pastoris (SEQ ID N2:3) usando os codões optimizados de Pichia. seguintes:

5’-AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT 3’-G TAC AAG AGA GGT TAA AAC AGG AAC CTT TAA TAA AAT CGA AAC CGA TGA TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3* AAC GTT AGA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5’ A mistura de ligação foi transformada em células E. coli CJ236 e o ADN de fago correcto foi identificado por hibridação em placa com uma cadeia de codificação da sequência de sinal da levedura, que tinha sido marcada com 32P e por digestão do ADN em hibridação com Sstl e BamHI, revelando um fragmento de 700 pb. O plasmídeo foi chamado pPSV103.

Mutagenizou-se in vitro um picomole de pPSV103 com 20 pmoles de um oligonucleótido de sequência : 57 CTAA TTA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 37 O ADN de fago correcto foi identificado por hibridação em placa com o mesmo oligonucleótido usado acima. O plasmídeo correcto foi chamado pPSVl04. 0 plasmídeo pA0810 foi preparado por digestão de 10 μg de pPSV104 com HindII e isolamento do fragmento de ADN de 400 pb a partir de um gel de agarose a 1,2 %. Ligaram-se 50 ng deste fragmento com 250 ng do produto de digestão de HindlII de pA0807, de 7,9 kb (cuj a preparação é descrita seguidamente), tal como isolado a partir de um gel de agarose a 0,8%. A ligação foi transformada em células E. coli MC1061 e seleccionaram-se colónias ampR. 0 plasmídeo correcto foi identificado pela presença de uma banda de 450 pb por digestão com BamHI e EcoRV e foi chamado pA0810. -47- 73 295 32 427-ΡΤ 2. Criação de PAO807 a. Preparação de ADN fl-ori

Digeriu-se ADN de bacteriofago fl (50 μg) com 50 unidades de Rsal e Dral ( de acordo com as instruções do fabricante) para libertar o fragmento de ADN de “458 pb contendo a origem de replicação de fl (ori). A mistura de digestão foi extractada com um volume igual de PCI, seguindo-se a extracção da camada aquosa com um volume igual de Cl e, finalmente, o ADN na fase aquosa foi precipitado por ajuste da concentração de NaCl a 0,2 M e por adição de 2,5 volumes de etanol absoluto. Deixou-se a mistura repousar em gelo (4eC) durante 10 minutos e o ADN precipitado foi recolhido por centrifugação durante 30 minutos a lOOOOxg numa micro-centrifuga a 4°C. A pelota de ADN foi lavada 2 vezes com etanol aquoso a 70%. A pelota lavada foi seca em vácuo e dissolvida em 25 μΐ de tampão TE. Este ADN foi submetido a electroforese em gel de agarose a 1,5% e a porção do gel contendo o fragmento fl-ori de "458 pb foi excisada e o ADN no gel foi submetido a electroeluição em papel DE81 (Whatman) e eluido do papel em NaCl 1 M. Precipitou-se a solução de ADN como se detalhou acima e o precipitado de ADN foi dissolvido em 25 μΐ de tampão TE (fragmento fl-ori). b. Clonagem de fl-ori em locais Dral de pBR322:

Digeriu-se parcialmente pBR322 (2 /xg) com duas unidades de Dral (de acordo com as instruções do fabricante). Terminou-se a reacção por extracção com PCI seguida de precipitação do ADN como foi descrito no passo a anterior. Dissolveu-se a pelota de ADN em 20 μΐ de tampão TE. Ligaram-se cerca de 100 ng deste ADN com 100 ng do fragmento fl-ori (passo a) em 20 μΐ de tampão de ligação por incubação a 14°C, durante a noite, com l unidade de ADN-ligase de T4. A ligação foi terminada por aquecimento a 70 °c durante 10 minutos e, depois, usada para transformar a estirpe JM103 de E. coli para se obter pBRfl-ori que contém fl-ori clonado nos locais Dral (posições de nucleótidos 3232 e 3251) de pBR322. c. Criação de PAQ807

Digeririu-se pBRfl-ori (10 yq) durante 4 horas, a 37°C, com 10 unidades de cada um de PstI e Ndel. Extractou-se o ADN digerido com PCI, precipitou-se e dissolveu-se em 25 μΐ de tampão TE como descrito no passo 1 anterior. Este material foi submetido a electroforese num gel de agarose a 1,2% e o fragmento de Ndel-Pstl (aproximadamente 0,8 kb) contendo fl-ori foi isolado e dissolvido em 20 μΐ de tampão TE como descrito no passo a anterior. Misturaram-se cerca de 100 ng deste ADN com 100 ng de pA0804 que tinha sido digerido com PstI e Ndel e trataram-se com fosfato. Proporciona-se uma descrição de pAO804 em W089/04320. Esta mistura foi ligada em 20 μΐ de tampão de ligação por incubação durante a noite, a 14°C, com 1 unidade de ADN-ligase de T4. A reacção de ligação foi terminada por aquecimento a 70"C, durante 10 minutos. Este ADN foi usado para transformar a estirpe JM103 de E. coli obtendo-se pA0807.

Exemplo XII Construção de PPSV218

Ligaram-se 200 ng do fragmento de EcoRI/Bcll de pLP2420, de 1,6 kb, 100 ng do fragmento de BqlII/HindIII de pPG2.5, de 0,8 kb, (ver descrição abaixo) e 100 ng do fragmento de EcoRI/HindIII de pUC8 (New England Biolabs, Inc.), num a ligação em três partes num volume de 20 μΐ de tampão de ligação, ATP 1 mM, 1 U de ligase de T4 e transformou-se na estirpe MC1061 de E. coli para resistência a Amp. [0 plasmídeo pPG2.5 é o fragmento de EcoRI/SalI de pPG4.0 (NRRL B-15868), de 2,5 kb, colocado em pBR322, que contém o promotor da álcool-oxidase.] Analisaram-se os clones resistentes quanto a plasmídeos que contivessem um fragmento de EcoRI+HindIII de 2,4 kb; o plasmídeo correcto foi chamado pPSV201. Digeriram-se 50 ng de pPSV201 com BamHI. desfosforilou-se e ligou-se com um excesso molar de 50 vezes de um oligonucleótido com a sequência seguinte:

73 295 32 427—PT 5'-GATCAGATCT-3' que converte o local BamHI no local BalII. Identificaram-se clones positivos nesta base e o plasmídeo foi chamado pPsv 203. Digeriram-se parcialmente 10 ng de pPSV203 com uma quantidade limitante de Hindlll e originaram-se extremidades rombas com Klenow. Purificaram-se em gel fragmentos lineares, de comprimento total, de plasmídeo e auto-ligaram-se num volume de 100 μΐ. Identificaram-se os clones correctos com base no ADN plasmídico contendo um fragmento de BalII/Hindlll de 1350 pb e os plasmídeos correctos foram chamados pPSV210.

Ligaram-se 60 ng do fragmento de BalII-BamHI de pLP2420, de 500 pb, com 100 ng de pUC8 digerido com BamHI. Identificaram-se os plasmídeos correctos com base num fragmento de Ncol-BamHI de 422 pb; o plasmídeo resultante foi chamado pPSV202. Digeriram-se 50 ng de pPSV202 com BamHI. desfosforilaram-se e ligaram-se com um excesso molar de 50 vezes de um oligonucleótido de sequência: 5'-GATCAGATCT-3' que converteu o local BamHI no local BalII. Identificou-se o plasmídeo correcto com base num fragmento de Ncol/BalII de 422 pb e foi chamado pPSV204.

Digeriram-se 10 Mg d pPSV210 com BalII e Saci e purificou-se em gel o fragmento de 700 pb. Ligaram-se 25 ng deste fragmento a 100 ng do fragmento de ΒαΙΙΙ/SacI de pA0810, de 8200 pb, purificado em gel. Identificaram-se os plasmídeos correctos pela presença de um fragmento de BalII/saci de 700 pb e chamaram-se pPSV212. Digeriram-se 10 Mg de pPSV212 com Sohl. originaram-se extremidades rombas com ADN-polimerase de T4 (como em Maniatis et al.), digeriram-se parcialmente com BalII e purificou-se em gel o fragmento de 8000 pb. Digeriram-se 10 MÇf de pPSV204 com Ncol. originaram-se extremidades rombas com Klenow, digeriu-se com BalII e purificou-se em gel o fragmento de 440 pb. Ligaram-se 100 ng do fragmento de pPSV212 de 8 kb, descrito acima, com 15 ng do fragmento de 440 pb de pPSV204. Identificou-se o plasmídeo ' ;V"

73 295 32 427-ΡΤ -50-correcto com base num fragmento de Bglll de 5500 pb e foi chamado pPSV218.

Os Exemplos foram proporcionados apenas para ilustrarem a prática do presente invento e não devem ser entendidos de modo a limitarem, de qualquer modo, o âmbito do invento ou das reivindicações em apêndice. Estão contempladas como estando dentro do âmbito desejado e procurado, da protecção da patente, variações e modificações razoáveis, que não se afastem da essência do espírito do invento. -51- 73 295 32 427-ΡΤ

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N®:1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1994 pb (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Na:l: GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT AXTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCÀ TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC ATG TTT TCT CCT ATT CTA 417

Met Phe Ser Pro lie Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG GTT 468

Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala Vai -15 -10 -5 1 GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC ΤΛΤ CCT CAG AGG ACA 519

Glu Leu Gin His Vai Leu Gly Vai Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 15 5 10

73 295 32 427-ΡΤ -52- GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His 20 25 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala 40 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg 55 60 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG Asn Vai Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu 70 75 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT Vai Glu Vai Pro Thr Gly Pro Leu Ser 90 95 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA Vai Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin 105 110 GGG ΤΤΛ AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly 125 CAT TTG ATA AAC AAT AGC GAA GAA GGA His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly 140 145 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA Ser Gin Glu Arg Vai Vai Asp Asn Ala 155 160

Λ—7* CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 570 Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 30 35 GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 621 Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 45 50 CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 672 His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 65 TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 723 Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 80 85 TTC TTT CAA GAC ΤΛΤ GAT TAC TTC 774 Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 100 GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 825 Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 115 120 ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 876 Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 130 135 AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 927 Lys Lys Leu Ser Vai Trp Ala Gly 150 AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 978 Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 165 170 <1' tr <1' tr / 32 427-ΡΤ -53- νψ*1 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 1029 Lys Ser Asn Tyr Thr Vai Met Vai Glu Vai Vai Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 1080 Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 1131 Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 1182 Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 1233 lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Vai Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 1284 Ser Ser Phe Cys Asp Vai Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC AAT GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 1335 Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Vai Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 1386 Lys Thr lie Gly Tyr Vai Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 1437 Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320

73 295 32 427—PT ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1488 Thr Asp Leu Leu Gin Vai Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Vai Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA ΤΤΛ GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1539 Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1590 Vai Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Vai Glu 360 365 370 GGT GAA GAA ΛΑΑ TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1641 Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Vai Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Vai Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1692 Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1743 Vai Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1794 Gly Vai Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAAAAATGGT AAGGAATGTT TTGCATCAGA TACGAGTTCA AAACGATTAA 1853 Asp Leu Ser 445 GAAGAGAATG CTCTTTTTTT TGTTTCTATC CAATTGGACT ATTTTCGTTT ΑΤΤΤΤΑΛΑΤΑ 1913 GCGTACAACT TTAACTAGAT GATATCTTCT TCTTCAAACG ATACCACTTC TCTCATACTA 1973 -55- 73 295 32 427-ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Ns:2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 400 pb (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N“:2: GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAAGCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC 399 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID Na:3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 66 pb (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N“:3: ATG TTT TCT CCT ATT CTA 18 Met Phe Ser Pro lie Leu “20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG 66 Ser Leu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Vai Phe Ala -15 -10 -5 73 295 32 427-ΡΤ «/y/

(2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N“:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1341 pb (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Nfi:4: GTT 3

GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 54 Glu Leu Gin His Vai Leu Gly Vai Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 105 Asp Asp Gin Tyr Asn Ue Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCC TGT ACG 156 Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cys Thr 40 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 207 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 258 Asn Vai Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 309 Vai Glu Vai Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 360 Vai Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 -57-

73 295 32 427-PT

J

GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 411 Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ATA AAC ΛΑΤ AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 462 His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Vai Trp Ala Gly 140 145 150 ' TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 513 Ser Gin Glu Arg Vai Vai Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 564 Lys Ser Asn Tyr Thr Vai Met Vai Glu Vai Vai Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 615 Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG ΛΑΤ GAC ATT GCT CAA AGA GAA 666 Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 717 Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA ΑΛΤ GTA AGA GGT GAG 768 lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Vai Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 819 Ser Ser Phe Cys Asp Vai Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 73 295 32 427-ΡΤ CTT AGA GAT TTG GGA TGG ΤΛΤ TAC ΛΛΤ GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 870 Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Vai Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 921 Lys Thr lie Gly Tyr Vai Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 972 Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1023 Thr Asp Leu Leu Gin Vai Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Vai Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1074 Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1125 Vai Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Vai Glu 360 365 370 GGT GAA GAA ΑΛΑ TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1176 Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Vai Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Vai Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1227 Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1278 Vai Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425

73 295 32 427-ΡΤ -59 CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1329 Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 435 440 GGA GTT CGT ΑΑΛ AAT GCT TCC TAC Gly Vai Pro Lys Asn Ala Ser Tyr 430 GAC TTG TCA TAA 1341 Asp Leu Ser 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N2:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 187 pb (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA : ADN genómico (Xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ns:5: AAATGGTAAG GAATGTTTTG CATCAGATAC GAGTTCAAAA CGATTAAGAA GAGAATGCTC 60 TTTTTTTTGT TTCTATCCAA TTGGACTATT TTCGTTTATT TTAAATAGCG TACAACTTTA 120 ACTAGATGAT ATCTTCTTCT TCAAACGATA CCACTTCTCT CATACTAGGT GGAGGTTCAA 180 TGGATCC 187

Claims (14)

1. 73 295 32 427-ΡΤ -60- REIVINDICACÕES -60- I 1 - Processo de expressão de um gene heterólogo e/ou de secreção de uma proteína caracterizado por a expressão e/ou a secreção serem dirigidas pela presença de um fragmento de ADN compreendendo uma ou mais das seguintes sequências de nucleótidos: gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 1): BamHI -390 -370 -350 GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290 ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230 AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTGAGCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 10 ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT MetPheSerProlleLeuSer 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCAC LeuGlu 11 e 1 leLeuAlaLeuAlaThrLeuG InSerVa lPheA laVa 1G luLeuGlnllis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuG lyVa lAsnAspArgProTyrFroGlnArgThrAspAspGlnTy rAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuG lyG lyLeuG lyPRoTyr 1 Ip.G lyTyrAsnGlyTrpGl yl leAlflAlaGlu 210 230 250 tctgaaattgaatcctgtacgattgatcaggctcatctgttgatgagacaxggagaaaga SerGlul leGluSerCysThrl 1 eAspGInAlaIlisLeuLeUMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACGCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnVa lGlyl.ysGlnLeuG luAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer -61- -61- 32 427-ΡΤ 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 '550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA -SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC G luAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTy rTyrAsnVa1GlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCGTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrG]uAlaAspProArgAspTyrProI.euTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATGTGCTTCAAGTATTGACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGínValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 73 295 32 427-ΡΤ

   -62- ( 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu 1410 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA SerEnd 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BamHI GTTCAATGGATCC região reguladora 5* da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 2): BamHI -390 -370 -350 GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290 ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230 AAATAGTXAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTGTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAAÇGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC •l** 73 295 32 427-ΡΤ -63- . sequência de sinal da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 3): 10 ATGTTTTCTCCTATTGTAAGT PH01 sequência de sinal —> MetPheSerProlleLeuSer 30 50 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG LeuGlu11e11eLeuA1aLeuA1aThrLeuGlnSerValPheAla gene estrutural da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 4): 70 GTTGAGTTGCAGCAC Va1GluLeuGInHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGGTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuMetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu -64- -64- 73 295 32 427-ΡΤ 7Τ 630 650 670 gaggagaaatcccagggactcaactctctaacggctcgaatttcatgtccaaactataac GluGluLysSerGlnGlylieuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHlsl]nTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA L·euAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuG inValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluÀrgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGGAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu TCATAA SerFinal -65- 73 295 32 427-ΡΤ e sequência de terminação de transcrição 3 1 2 de Pichia pastoris (SEQ ID NO 5): 1410 1430 1450 AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BamHI GTTCAATGGATCC
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o fragmento de ADN compreender a sequência de sinal da fosfa-tase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 3) ligada operativamente a uma região reguladora 52, particularmente a região reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 2) ou a região reguladora 52 da álcool-oxidase (AOX1) de Pichia pastoris,
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido fragmento de ADN estar ligado operativamente a uma sequência de ADN heterólogo que codifica pelo menos um polipéptido.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado por o referido ADN heterólogo codificar activador de plasminogénio tissular.
5. 5 - Processo de expressão de um gene heterólogo que codifica pelo menos um polipéptido caracterizado por a expressão do gene ser feita sob o controlo da região reguladora 5' da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 2). 1 - Processo de secreção de uma proteína a partir de uma 2 célula eucariota, caracterizado por a referida secreção ser dirigida pela presença da sequência de sinal do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris (SEQ ID NO 3). -66- -66- .'· i ϊ;< . 73 295 32 427-ΡΤ
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a célula eucariota ser uma célula de levedura do género Pichia pastoris.
7. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida proteína ser activador de plasminogénio tissular.
8. 9 - Processo para a activação da região reguladora da fosfatase ácida, derivada do gene da fosfatase ácida de Pichia pastoris para facilitar a expressão de uma sequência de ADN heterólogo, que codifica pelo menos um polipéptido, caracterizado por compreender o contacto de uma célula hospedeira adequada, que foi transformada com a região reguladora 5' da fosfatase ácida ligada operativamente a uma sequência de ADN heterólogo, com um meio no qual a concentração de fosfato induzirá a expressão.
9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a referida célula hospedeira ser Pichia pastoris.
10. 11 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o referido ADN heterólogo conter adicionalmente uma sequência de sinal, particularmente a sequência de sinal da fosfatase ácida de Pichia pa pastoris (SEQ ID NO 3) ligada operativamente a ele.
11. 12 - Processo para a preparação do plasmídeo pLP24 caracterizado por compreender os passos de: - cultivar uma estirpe de levedura do género Pichia pastoris num meio de fosfato elevado (HP) e num meio de baixo fosfato (LP), - realizar uma selecção subtractiva (mais-menos) de ADNc usando uma biblioteca de Pichia pastoris. - identificar colónias que se hibridam mais fortemente com o ADNc de LP do que com o ADNc de HP, - identificar e isolar o fragmento de ADN que se hibrida mais fortemente com o ADNc de LP do que com o ADNc de HP, e - subclonar o referido fragmento de ADN em pUC8. -67- 73 295 32 427-ΡΤ
12. 13 - Processo para a preparação do vector de expressão do activador de plasminogénio tissular, pT37, caracterizado por compreender os passos de: -inserir a porção 5' do activador de plasminogénio tissular num plasmídeo de expressão de Pichia pastoris, - transformar um hospedeiro adequado com a construção resultante e isolar os clones positivos, - inserir a porção 3 ’ do gene do activador de plasminogénio tissular no clone isolado anteriormente, - transformar um hospedeiro adequado com a construção resultante, e - identificar e isolar uma colónia com o gene completo do activador de plasminogénio tissular.
13. 14 - Processo de integração dirigida no locus PH01 de Pichia pastoris, caracterizado por se utilizar um vector integrativo que compreende as sequências flanqueadoras 5' e 3' do gene PH01 de Pichia pastoris.
14. 15 - Processo para a identificação de transformantes de Pichia pastoris contendo vectores de expressão integrados no locus PH01. caracterizado por a Pichia pastoris. que foi transformada, ser plaqueada em placas indicadoras de baixo fosfato, deixada desenvolver durante a noite e se pesquisarem as colónias resultantes em relação à cor branca. Lisboa, Df/ 1991 Por PHILLIPS PETROLEUM COMPANY ICIAL— =0 agent: