NO314151B1

NO314151B1 - Pichia pastoris sur fosfatasegen

Info

Publication number: NO314151B1
Application number: NO19914935A
Authority: NO
Inventors: Richard G Buckholz
Original assignee: Res Corp Technologies Inc
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1991-12-13
Publication date: 2003-02-03
Also published as: AU8882391A; NO914935D0; FI915893A; CA2055542A1; CA2055542C; AR245218A1; FI19992503A; MX9102546A; CN1062169A; KR0181179B1; JPH0576371A; JP3437850B2; EP0495208B1; NO914935L; IL100363A0; PL292765A1; PT99802A; DE69132812T2; FI113474B; US5268273A

Description

Oppfinnelsen angår fremgangsmåte til fremstilling av et heterologt protein, fremgangsmåte til å styret integrasjon av et heterologt gen ved Pichia pastoris PHOl-lokuset, fremgangsmåter til identifisering av Pichia pastoris transformanter, DNA-fragment, plasmid og ekspresjonsvektor.

Etter hvert som rekombinant-DNA-bioteknologi har utviklet seg i de senere år, er den regulerte produksjon av en rekke forskjellige nyttige polypeptider ved bruk av mikroorganismer blitt mulig. Mange polypeptider som f.eks. human veksthormon, leukocyttinterferoner, human insulin og human proinsulin er allerede blitt produsert ved forskjellige mikroorganismer. Den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes ventes å tillate produksjon av en rekke forskjellige andre nyttige polypeptidprodukter.

De grunnleggende teknikker som anvendes innen området rekombinant-DNA-teknologi er kjent for fagfolk. De elementer som det er ønskelig skal foreligge for utførelse av rekombinant-DNA-teknologi omfatter, men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for ett eller flere ønskete polypeptider og er funksjonelt assosiert med tilstrekkelige styringssekvenser som er nødvendige for ekspresjon av genet i vertsorganismen,

(2) en vektor inn i hvilken genet kan innsettes,

(3) en egnet vertsorganisme inn i hvilken vektoren som bærer genet kan transformeres, (4) dersom sekresjon av det heterologe protein ønskes, en signalsekvens som kan dirigere det heterologe protein inn i vertscellens sekresjonsvei og deretter ut av cellen,

(5) et transformasjonssystem, og

(6) en metode til seleksjon av transformanter.

Rekombinante genkonstruksjoner kan konstrueres slik at det rekombinante protein passerer gjennom vertens sekretoriske vei og sekreteres inn i vekstmediet. Sekresjon er en ønsket modus for rekombinant ekspresjon av en rekke grunner. For det første har noen heterologe proteiner en giftig virkning på vertsorganismen. Når slike heterologe genprodukter sekreteres snarere enn akkumuleres inne i verten, er de mindre tilbøyelige til å virke forstyrrende inn på normale cellefunksjoner. For det andre er enkelte proteiner som er inaktive når de produseres intracellulært aktive når de sekreteres. For det tredje unngår sekresjon inn i mediet nødvendigheten av å bryte opp vertscellene for å utvinne produktet. Produktrensing er mye lettere og mer kostnadseffektivt når produktet foreligger i vekstmediet. Og for det fjerde, fordi det rekombinante produkt foreligger i næringsmediet kan det ønskede produkt fjernes kontinuerlig og mediet kan resirkuleres.

De fleste sekreterte proteiner uttrykkes opprinnelig inne i cellen i en forløper eller en pre-proteinform som inneholder en tilføyet aminoendeforlengelse som kalles et signalpeptid. Signalpeptidet spiller en vesentlig rolle i transporten av det tilføyde polypeptid inn i og/eller gjennom de avgrensende cellemembraner. Dette signalpeptid blir deretter spaltet proteolytisk ved en signalpeptidase under eller etter sekresjonen for å gi et modent proteinprodukt.

Sekresjon av et heterologt eller fremmed protein kan oppnås ved kobling av kodingssekvensen av det heterologe DNA til DNA som koder for et signalpeptid. Det ville være ønskelig å isolere en signalsekvens som koder for dette signalpeptid, hvilket ville lette sekresjonen.

Signalsekvenser er spesielt nyttige for dannelsen av ekspresjonsvektorer. Bruken av slike vektorer vil gjøre det mulig å transformere forenlige vertsceller, slik at de produserer og sekreterer heterologe genprodukter. Eksempler på ledersekvenser som er blitt brukt til vellykket sekretering av rekombinante proteiner fra gjærverter innbefatter sekvenser fra Saccharomyces cerevisiae alfa paringsfaktor, a-paringsfaktor og drepergiftgener. Isolering av en signalsekvens fra en metylotrof gjær såsom Pichia pastoris er ikke blitt beskrevet.

Den promotor som anvendes i slike vektorer for å regulere ekspresjonen av de heterologe genprodukter kan passende være den promotor som er nativt forbundet med signalsekvensen. Det vil være spesielt fordelaktig dersom promotoren som er nativt forbundet med signalsekvensen sørger for et høyt nivå av DNA-transkripsjon og reagerer på eksogene stimuli i miljøet. Et eksempel på en slik promotor er det 5' regulatoriske område av det Pichia pastoris sur-fosfatasegen (PHOl) (SEQ ID nr. 2), som transkriberes på et høyt nivå som reaksjon på fraværet av fosfatase i mediet og undertrykkes ved nærværet av fosfatase i mediet.

Det er ofte ønskelig å transformere en Pichia pastoris-vert med et rekombinant-DNA konstruert stykke som vil integreres i en nøyaktig posisjon i Pichia pastoris-genomet. De 5<*> og 3' sekvenser som flankerer Pichia pastoris PHOl-genet også kjent som henholdsvis første og andre innsettbare DNA-fragmenter, anvendes i ekspresjonsvektorer for å dirigere integrasjonen av de rekombinante sekvenser ved PHOl-Iocuset. Evnen til å integrere rekombinante DNA'er ved PHOl-locuset er fordelaktig av minst to grunner: 1) i utviklingen av Pichia pastoris ekspresjonsstammer som har multiple kopier av de samme eller forskjellige ekspresjonskassetter ved PHOl-locuset eller et annet Pichia-locus eller 2) stabil integrasjon av én eller flere ekspresjonskassetter ved PHOl-locuset kun, i en Pichia pastoris vertsstamme hvor oppbrytning av et viktig gen eller et gen i metanolmetabolismeveien er uønsket.

Celler hvor PHOl-genet er blitt ødelagt oppviser et ledsagende tap av sur fosfatase enzymaktivitet. Pho-fenotypen som er indikativ av PHOl genoppbrytning kan screenes for ved plating av cellene på lavfosfat-indikatorplater og tillate kolonier å vokse over natten. Kolonier hvor PHOl-genet er ødelagt er hvite, mens de kolonier som har et intakt PHOl-gen er grønne. Denne kolorimetriske screening skaffer en hurtig og enkel metode til påvisning av celler som har integrert ekspresjonskassetter korrekt ved PHOl-locuset og således ødelagt det.

Det vil således være et betydelig bidrag til faget å isolere en signalsekvens som vil lette sekresjonen av proteiner fra en vertscelle.

Det vil dessuten være fordelaktig å isolere et 5' regulatorisk område som vil sørge for høye nivåer av DNA-transkripsjon og reagerer på eksogene stimuli i miljøet. For tiden er ikke noe 5' regulatorisk område kjent i faget som transkriberes på et høyt nivå som reaksjon på fraværet av fosfat i mediet og som kan benyttes sammen med den meget produktive fermenteirngsgjær Pichia pastoris.

Det vil dessuten være fordelaktig å isolere det sure fosfatase (AP) strukturelle gen.

Det vil videre være fordelaktig å skaffe nye vektorer som omfatter fragmenter av sur fosfatase-genet.

Det vil dessuten være fordelaktig å isolere en 3' transkripsjonsavslutningssekvens.

Det vil også være fordelaktig å skaffe integrative vektorer som vil dirigere integrasjon i Pichia pastoris PHOl-locuset.

Det vil videre være fordelaktig å skaffe en fremgangsmåte til identifisering av oppbrytningstykker (disruptants).

Det er således en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en signalsekvens som letter sekresjonen av proteiner fra celler.

Det er også en hensikt med oppfinnelsen å skaffe et 5' regulatorisk område som er transkribert som reaksjon på fraværet av fosfat.

En annen hensikt med oppfinnelsen er å skaffe DNA-sekvensen av det Pichia pastoris sur fosfatase strukturelle gen (SEQ ID nr. 4).

Det er en ytterligere hensikt med oppfinnelsen å skaffe nye vektorer som omfatter et regulatorisk område og/eller signalsekvens operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for i det minste ett polypeptid, og midler til indusering av det nevnte regulatoriske område for å lette ekspresjonen av den nevnte heterologe DNA-sekvens.

Det er videre en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en 3' transkripsjonsendesekvens fra sur-fosfatasegenet.

Nok en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe integrative vektorer som vil dirigere integrasjonen i Pichia pastoris PHOl-locuset.

En ytterligere hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en fremgangsmåte til identifisering av oppbrytningsstykker.

Andre sider, hensikter og fordeler med oppfinnelsen vil fremgå fra den følgende beskrivelse, eksemplene og kravene.

Disse hensikter er oppnådd ved foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremkommer av de vedlagte krav.

I henhold til oppfinnelsen er der skaffet et nytt DNA-fragment som omfatter signalsekvensen fra Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 3), som letter sekresjonen av proteiner fra celler.

En annen side ved oppfinnelsen skaffer et nytt DNA-fragment som omfatter det Pichia pastoris sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2).

I henhold til nok en side ved oppfinnelsen er der skaffet et nytt DNA-fragment som omfatter DNA-sekvensen av det Pichia pastoris sur-fosfatase (AP) strukturelle gen (SEQ ID nr. 4).

I henhold til nok en side ved oppfinnelsen er der skaffet nye vektorer som omfatter det regulatoriske område og/eller signalsekvensen som er operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for i det minste ett polypeptid og organer til å innføre det nevnte regulatoriske område for å lette ekspresjonen av den nevnte heterologe DNA-sekvens.

I henhold til en annen side ved oppfinnelsen er der skaffet nye DNA-vektorer som omfatter en 3' transkripsjonsendesekvens fra Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 5).

I henhold til en annen side ved oppfinnelsen er der skaffet integrative vektorer som dirigerer integrasjonen av vektoren i Pichia pastoris PHOl-locuset.

Ytterligere sider ved oppfinnelsen angår å skaffe en fremgangsmåte til identifisering av oppbrytningsstykker.

Fig. 1 viser et restriksjonskart av Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 1).

Oppfinnelsen skaffer et nytt isolert DNA-fragment som innbefatter et surt fosfatasegen omfattende dets promotor (eller 5' regulatoriske område), signal, transkripsjonsterminator og flankerende sekvenser som fås fra Pichia pastoris (SEQ ID nr. 1).

Sur fosfatase (AP) er et ekstracellulært enzym som sekreteres av Pichia pastoris og andre gjærsorter under betingelser av uorganisk fosfathunger. Det sekreterte sur fosfatase katalyserer fjerningen av fosfat fra organiske substrater og gjør således tilgjengelig fosfatet for cellevekst og overlevelse.

Det gen som koder for sur fosfatase er blitt isolert og undersøkt i en rekke forskjellige gjærar ter og den regulerbare beskaffenhet av sur-fosfatase-genekspresjon er blitt lokalisert til sur-fosfatase-promotorelementet. Ved betingelser av lav mediumkonsentrasjon av uorganisk fosfat blir sur-fosfatase-promotoren (eller det 5' regulatoriske område) skrudd "på", sur-fosfatasegenet transkriberes, og blir deretter translatert inn i sur-fosfataseenzymet. Det nylig syntetiserte sur-fosfataseenzym frigjør fosfat fra organiske substrater og gjør fosfatet tilgjengelig for cellen. Den etterfølgende økning i fosfatkonsentrasjon modulerer sur-fosfatase-promotoren, hvilket fører til redusert sur-fosfatasegen-transkripsjon som ledsages av det reduserte behov for sur-fosfatase-protein. Således kan sur-fosfatase-promotoren induseres eller undertrykkes av henholdsvis lave eller høye fosfatkonsentrasjoner. Identifisering og isolering av Pichia pastoris sur-fosfatase-promotoren er viktig. Fordi reguleringen av sur-fosfatase-ekspresjon varierer blant de gjærart er for hvilke denne ekspresjon er blitt analysert, venter man at den strenge regulering som observeres for sur-fosfatase-ekspresjon i Pichia pastoris avhenger av tilgjengeligheten og bruken av de homologe promotorsekvenser.

Identifikasjon og isolering av Pichia pastoris PHOl-gensignalsekvensen (SEQ ID

nr. 3) er viktig, fordi at foruten å være den første signalsekvens som er isolert fra et Pichia pastoris-gen, representerer den den første signalsekvens som er isolert fra en metylotrof gjær. Den er blitt funnet å være ekvivalent med eller overlegen i forhold til native gensignalsekvenser, f.eks. signalsekvensen fra tPA

(vevsplasminogenaktivator) eller invertasegener med hensyn til å dirigere sekresjon av heterologe proteiner fra Pichia pastoris, f.eks. tPA eller invertase.

Det er ofte ønskelig å integrere rekombinante ekspresjonsvektorer inn i vertsgenomet istedenfor å opprettholde dem som autonome replikerende elementer. Integrerte vektorer er betydelig mer stabile enn autonome vektorer og foretrekkes for utførelse av den foreliggende oppfinnelse. Nærmere bestemt foretrekkes lineære sete-spesifikke integrative vektorer som beskrevet i US-PS 4 882 279. Slike vektorer omfatter en i serie arrangert sekvens på minst 1) et første innsettbart DNA-fragment, 2) et selekterbart markørgen og 3) et annet innsettbart DNA-fragment.

De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er hver minst 200 nukleotider lange og har nukleotidsekvenser som er homologe med partier av det genome DNA av de arter som skal transformeres. De forskjellige komponenter av den integrative vektor er arrangert i serie for dannelse av et lineært fragment av DNA slik at ekspresjonskassetten og det selekterbare markørgen er anordnet mellom 3'-enden av det første innsettbare DNA-fragment og 5'-enden av det annet innsettbare DNA-fragment. De første og andre innsettbare DNA-fragmenter er orientert med hensyn til hverandre i det i serie arrangerte lineære fragment på samme måte som de er orientert i utgangsgenomet.

Nukleotidsekvenser som er nyttige som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser som er homologe med separate partier av det native genomiske setet hvor genomisk modifikasjon skal finne sted. Således, hvis f.eks. genomisk modifikasjon skal finne sted ved locuset av sur-fosfatasegenet, må de første og andre innsettbare DNA-fragmenter som anvendes være sekvenser som er homologe med separate partier av sur-fosfatasegen-locuset. For at genomisk modifikasjon skal finne sted, må de to innsettbare DNA-fragmenter være orientert i forhold til hverandre i det lineære fragment med den samme relative orientering som de har i utgangsgenomet. Eksempler på nukleotidsekvenser som kan anvendes som de første og andre innsettbare DNA-fragmenter er nukleotidsekvenser valgt fra gruppen bestående av sur fosfatase PHOl-genet, alkoholoksidase A0X1 -genet, his-tidinoldehydrogenase HIS4-genet og dihydroksyacetonsyntetase DHAS-genet.

Det første innsettbare DNA-fragment kan inneholde et operabelt regulatorisk område som kan omfatte det regulatoriske område som anvendes i ekspresjonskassetten. Bruken av det første innsettbare DNA-fragment som det regulatoriske område for en ekspresjonskassett er en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen. Valgfritt kan et eller flere innsetningsseter og en 3' endesekvens anordnes umiddelbart 3' i forhold til det første innsettbare DNA-fragment. Denne utforming av den lineære setespesifikke integrative vektor har den ytterligere fordel at den skaffer et ferdig sete for innsetting av et strukturelt gen uten at det nødvendiggjør tilføyelse av en forenlig 3' endesekvens.

Det er også nødvendig å inkludere i det minste ett selekterbart markørgen i det DNA som anvendes til å transformere vertsstammen. Dette letter seleksjonen og isoleringen av de organismer som har innlemmet i seg det transformerende DNA. Markørgenet meddeler et fenotypisk trekk til den transformerte organisme som verten ikke hadde, f.eks. gjenopprettelse av evnen til å produsere en spesifikk aminosyre hvor den utransformerte vert har en defekt i den spesifikke aminosyre biosyntetiske vei eller motstand mot antibiotika og liknende. Eksempler på selekterbare markørgener kan velges fra gruppen bestående av HIS4-genet og ARG4-genet fra Pichia pastoris og Saccharomyces cerevisiae, invertasegenet (SUC2) fra Saccharomyces cerevisiae og G418R kanamycin resistensgenet fra E. coli transposable elementer Tn601 eller Tn903.

Dersom det første innsettbare DNA-fragment ikke inneholder et regulatorisk område, vil det bli nødvendig å innsette et egnet regulatorisk område operabelt koblet til det strukturelle gen for å skaffe en operabel ekspresjonskassett. På liknende måte, dersom ingen 3' endesekvens er skaffet ved innsettingssetet for å fullføre ekspresjonskassetten, vil en 3' endesekvens måtte kobles operabelt til det strukturelle gen som skal innsettes.

Det er viktig at integrasjon finner sted ved en posisjon i genomet som ikke vil ha en skadelig virkning for vertscellen. Det var en overraskende oppdagelse at integrasjon av et rekombinant ekspresjonsstykke ved Pichia pastoris sur-fosfatase-genlocuset (PHOl) ikke var skadelig for Pichia-verten og førte til stabil integrering av de rekombinante sekvenser. Dirigert integrasjon ved PHOl-locuset oppnås ved bruk av 5'- og 3'-sekvensene som flankerer Pichia pastoris PHOl-genet (som også er betegnet som første og andre innsettbare DNA-fragmenter) i rekombinante ekspresjonsvektorer.

En videre oppdagelse var en fremgangsmåte til screening av transformerte celler for å identifisere de som integrerte ekspresjonsvektorsekvensene ved oppbrytning av PHOl-locuset. Celler i hvilke PHOl-genet er blitt oppbrutt, viser et ledsagende tap av sur-fosfatase-enzymaktivitet. Pho~fenotypen, indikativ av PHOl-oppbrytning, kan screenes for ved plating av cellene på lavfosfat indikatorplater og tillate kolonier å vokse over natten. Kolonier hvor PHOl-genet er oppbrutt er hvite, mens de kolonier som har et intakt PHOl-gen er grønne. Denne kolorimetriske screening skaffer en hurtig og lett metode til påvisning av celler som har integrert ekspresjonskassetter korrekt ved PHOl-locuset.

Et partielt restriksjonskart av det Pichia pastoris sur-fosfatasegen (SEQ ID nr. 1) er vist på fig. 1. Dette gen er blitt ytterligere karakterisert ved den nukleotidsekvens som er vist i tabell 1.

Videre er der ved den foreliggende oppfinnelse skaffet nye DNA-fragmenter som omfatter det Pichia pastoris sur-fosfatase 5* regulatoriske område (SEQ ID nr. 2), signalsekvens (SEQ ID nr. 3), strukturelt gen (SEQ ID nr. 4) og 3' transkripsjons endesekvens (SEQ ID nr. 5).

De følgende tabeller viser sekvensene av Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 1) og fragmenter derav.

Sur-fosfatasegenet utvinnes fra Pichia pastoris-kulturer, såsom Pichia pastoris NRRL Y-l 1430 ved fremgangsmåter som er angitt i de følgende eksempler. En generell metode for utvinning av Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 1) består av å anvende en sur-fosfatase-probe såsom lavfosfat-prober (LP) beskrevet i de følgende eksempler for å screene et bibliotek av Pichia pastoris DNA. Andre prober kan velges eller syntetiseres basert på den sekvens som er angitt i tabell 1. Hybridisering av probene kan utføres ved en hvilken som helst fremgangsmåte kjent for fagfolk. Pichia pastoris-bibliotek kan fremstilles ved teknikker som er kjent i faget innbefattet, men ikke begrenset til den fremgangsmåte som er beskrevet av Cregg et al. (1985), Mol. Cell. Bio. 5, 3376-3385.

Alternativt kan det sur-fosfatase 5* regulatoriske område (SEQ ID nr. 2), signalsekvens (SEQ ID nr. 3), strukturelt gen (SEQ ID nr. 4) og 3' regulatoriske område (SEQ ID nr. 5) fås ved syntetisering av den passende sekvens som angitt i tabellene 1-5 ved bruk av kjente enzymatiske eller kjemiske metoder. Egnete metoder innbefatter men er ikke begrenset til kjemiske fremgangsmåter basert på fosfotriester-, fosfitt- eller cyanoetylfosforamiditt-kjemi.

Fagfolk vil også innse at det isolerte Pichia pastoris sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2), signalsekvens (SEQ ID nr. 3), strukturelt gen (SEQ ID nr.

4) og 3' transkirpsjonene endesekvens (SEQ ID nr. 5) ifølge oppfinnelsen sammenlignet med etterfølgende isolert Pichia pastoris sur-fosfatase 5' regulatorisk område, signalsekvens, strukturelt gen og 3' transkripsjonene endesekvenser kan inneholde et de minimis antall nukleotidforskjeller på grunn av klonal variasjon eller sekvenseringsfeil som kan oppstå.

Modifikasjon av det Pichia pastoris sur-fosfatase 5' regulatorisk område (SEQ ID nr. 2), signalsekvens (SEQ ID nr. 3), strukturelt gen (SEQ ID nr. 4) og 3' transkripsjonen endesekvens (SEQ ID nr. 5) kan også utføres, såsom tilføyelse av linker-DNA eller utførelse av mutagenese (f.eks. Ml3 mutagenese) for å skaffe eller fjerne restriksjonsseter og liknende.

Når Pichia pastoris sur-fosfatasegenet er fjernet, kan det opprettholdes eller replikeres i eukaryote eller prokaryote plasmid/vert-systemer såsom pBR322 opprettholdt i E. coli, eller i et hvilket som helst annet system som er kjent i faget.

Fagfolk vil også innse at en rekke ytterligere DNA-sekvenser også kan innlemmes i den vektor som anvendes, såsom bakterielt plasmid-DNA, forskjellige markørgener, bakteriofag-DNA, autonome replikerende sekvenser og centromerisk DNA, for å nevne bare noen få representative eksempler.

Sur fosfatase 5' regulatorisk område (SEQ ID nr. 2) inneholdes i det DNA-fragment som strekker seg fra nukleotid -399 til ca. nukleotid 0, som vist på fig. 1 og i tabell 2. Dette fragment kan bevirke transkripsjonen av DNA til RNA når det er operabelt koblet til og anordnet ved 5'-enden av en heterolog DNA-sekvens som koder for i det minste ett polypeptid.

For å benytte det sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2) som her er angitt, kan det fragment som er beskrevet på fig. 1 og i tabell 2 kobles operabelt til heterologe DNA-sekvenser som koder for i det minste ett polypeptid. Hva angår den foreliggende beskrivelse, er heterologe DNA-sekvenser kombinasjoner av DNA-sekvenser som ikke forekommer naturlig i verten eller i forbindelse med det nevnte regulatoriske område. Egnete heterologe DNA-sekvenser som koder for i det minste ett polypeptid som kan kobles operabelt med det sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2) innbefatter, men er ikke begrenset til vevsplasminogenaktivator, human serumalbumin og invertase. Heterologe DNA-sekvenser som anvendes sammen med den foreliggende oppfinnelse bør inneholde et 5' ATG startkodon, et 3' stoppkodon og kan dessuten innbefatte nukleotidsekvenser som tjener til å stabilisere mRNA eller styre polyadenylering.

Kombinasjonen av det sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2) operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens kan innsettes i en egnet vektor. En rekke vektor/vert-kombinasjoner for gjær er mulige og er kjent for fagfolk. Ytterligere sekvenser såsom markørgener eller andre sekvenser som gjør vektoren i stand til vekstamplifikasjon og hurtig formering i bakterier eller gjær kan også foreligge.

Egnete vertsceller som kan transformeres med en vektor inneholdende det sur-fosfatase 5' regulatoriske område innbefatter gjær sort er fra slektene Saccharomyces, Pichia og Hansenula, fortrinnsvis Pichia, og aller helst Pichia pastoris.

Transformasjon av en egnet vertscelle med en vektor inneholdende det sur-fosfatase 5' regulatoriske område (SEQ ID nr. 2) kan oppnås ved en hvilken som helst egnet transformasjonsteknikk som er kjent for fagfolk.

Det sur-fosfatase 51 regulatoriske område (SEQ ID nr. 2) reguleres ved konsentrasjonen av fosfat i mediet. Nærmere bestemt blir dette regulatoriske område de-undertrykket ved lave konsentrasjoner av fosfat. Følgelig blir det 5<* >regulatoriske område regulert ved endring av konsentrasjonen av fosfat som foreligger i mediet.

Sur-fosfatase signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) inneholdes i det DNA-fragment som strekker seg fra nukleotid 1 til ca. nukleotid 66 som vist på fig. 1 og i tabell 3. For å anvende den sur-fosfatase signalsekvens (SEQ ID nr. 3) som her er angitt kan det fragment som er beskrevet på fig. 1 og i tabell 3 kobles operabelt til heterologe DNA-sekvenser som koder for i det minste ett polypeptid. Egnete heterologe DNA-sekvenser omfatter, men er ikke begrenset til, DNA-sekvenser valgt fra gruppen bestående av vevsplasminogenaktivator, human serumalbumin og invertase.

Kombinasjonen av sur-fosfatase signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens kan deretter kobles til en egnet promotor. Det er passende at promotoren som anvendes kan være den promotor som er assosiert med ledersekvensen. Alternativt kan man erstatte den naturlig forekommende PHOl-promotor med andre heterologe promotorer som vil tillate transkripsjonen regulering. Et eksempel på en egnet heterolog promotor vil være Pichia pastoris alkoholoksidase (AOX1) promotoren (eller 5' regulatorisk område) angitt i US-PS 4 808 537.

Egnete vektorer inn i hvilke dette DNA-fragment som inneholder sur-fosfatase signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) kan innsettes, kan oppnås som beskrevet ovenfor. Dessuten kan egnete vertsceller som kan transformeres med den resulterende vektor inneholdende et DNA-fragment som koder for en signalsekvens inneholde gjær såsom fra slektene Saccharomyces, Hansenula og Pichia, idet Pichia pastoris foretrekkes. Transformasjon av disse vertsceller kan oppnås ved en hvilken som helst egnet metode som er kjent for fagfolk. Signalsekvensen som er operabelt koblet til et protein som er blitt produsert ved én av disse vektorer/vert-systemer kan styre sekresjonen av det nevnte protein fra vertscellen.

Det sur-fosfatase strukturelle gen (SEQ ID nr. 4) inneholdes inne i det DNA-fragment som strekker seg fra nukleotid 67 til nukleotid 1407 som vist på fig. 1 og i tabell 4. Det sur-fosfatase strukturelle gen (SEQ ID nr. 4) kan anvendes i rekombinant bioteknologi for en rekke forskjellige formål innbefattet, men ikke begrenset, til: (a) DNA-konstruerte stykker for utførelse av oppbrytende homolog rekombinasjon (en prosess for innsetting av heterologe DNA-sekvenser i Pichia pastoris-genomet ved sur-fosfataselocuset og således forstyrre sur-fosfatasegenaktiviteten) og (b) produksjonen av sur-fosfataseprotein for bruk i en rekke forskjellige bioanalyser.

Sur-fosfatase 3' transkripsjonsendesekvensen (SEQ ID nr. 5) avslutter transkripsjonen av mRNA eller stabiliserer mRNA når den er operabelt koblet til 3'-enden av en DNA-sekvens som koder for produksjonen av et polypeptid. Denne sur-fosfatase 3' transkripsjonsendesekvens (SEQ ID nr. 5) inneholdes i det DNA-fragment som strekker seg fra nukleotid 1408 til ca. nukleotid 1594 som vist på fig. 4 og i tabell 5. Sur-fosfatase 3' transkripsjonsendesekvensen (SEQ ID nr. 5) kan være operabelt koblet til en heterolog DNA-sekvens som koder for et polypeptid og anvendes til å avslutte transkripsjonen av eller stabilisere mRNA i gjær, såsom i gjær fra slektene Saccharomyces, Hansenula og Pichia, men den er spesielt vel egnet til bruk i Pichia pastoris.

Eksempler

Stammer

De følgende stammer er blitt anvendt i disse eksempler:

Pichia pastoris KM 71 (AOX1, his4)

Pichia pastoris GS115 (his 4) NRRL Y-15851

Pichia pastoris GS190 (arg4) NRRL Y-18014

Pichia pastoris GS247 (Ade-)

Pichia pastoris KM71:GS102 (Mut-)

Pichia pastoris GS115:GS102 (Mut<+>)

Pichia pastoris MD 100-20 (his4, Ade-)

Pichia pastoris MB 102-26 (pho-, his4, ade-)

Pichia pastoris MB 102-28

Pichia pastoris MB 102-51

Pichia pastoris KM71:pPSU216 (Mut-)

Pichia pastoris GS115:pPSU216 (Mut<+>)

E. coli JM103 delta (lac pro) thi rpsl

(strA) supE end A sbcB hsdR

Bowes melanoma tPA over-eksprimerende cellelinje ATCC# CRL9607 (human melanoma celler)

Medier, buffere og oppløsninger

De medier, buffere og oppløsninger som anvendes i de følgende eksempler har de sammensetninger som er angitt nedenfor:

LP- medium davfosfat)

TE- buffer SSPE(IX) SSC(IX) Denhardts oppløsning (IX)

REB

PCI

Eksempel I

Konstruksjon av pLP24

For å isolere og karakterisere sur-fosfatasegenet fra Pichia pastoris (SEQ ID nr. 1) ble de følgende eksperimenter utført. Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) ble dyrket i både et miljø med høyt fosfat (HP) [bestående av gjærnitrogenbase minus aminosyrer (DIFCO), 2% dekstrose og 20 mg/l histidin] og i et miljø med lavt fosfat (LP) [bestående av LP-medium, 2% dekstrose og 20 mg/l histidin], hver i et samlet volum på 300 ml. Cellene ble pelletert, vasket én gang med 10 ml REB og resuspendert i 4 ml REB i et 30 ml Corex-rør. 8 g glassperler og 4 ml PCI ble deretter tilsatt. Suspensjonen ble blandet på en virvelblander ved høy hastighet, åtte ganger ved 20 sekunder hver gang med avkjøling på is i 20 sekunder mellom blandinger. Suspensjonen ble deretter sentrifugert ved 10 000 x g i 10 min. Det vandige lag (topplag) ble ekstrahert to ganger med 4 ml PCI og 4 ml CI. RNA ble utfelt fra den vandige fase ved -20°C med 0,1 volum 3M kaliumacetat pH 5,2 og 2,5 volumer etanol. Poly A<+> RNA ble selektert i henhold til Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual), med LiCl substituert for NaCl. Syntese av LP- eller HP- mRNA-merkede cDNA-prober ved anvendelse av 2 ug av hver type av poly A<+ >RNA var også i henhold til Maniatis et al. 60 ng av et renset Pichia pastoris plasmid-bibliotek i YEP13 [Broach et al., Gene: 8121 (1979)] ble anvendt til å transformere E. coli MC 1061 (Mandel og Higa, 1970, J. Mol. Biol. 53:154). Ca. 8000 kolonier ble oppnådd som et resultat. Koloniene ble replikert på nitrocellulosefiltere i duplikat, amplifisert på LB-plater inneholdende 100 ug/ml ampicillin og 170 ug/ml kloramfenikol, lysert ved standard fremgangsmåter (Grunstein og Wallis, 1979, Methods in Enzymology 68, 379-389), bakt ved 80°C i 90 min, og separate filtere ble hybridisert med enten LP- eller HP-cDNA-probene. Hybridisering ble utført ved bruk av 2x SSPE, lx Denhardts oppløsning, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 2,5 x IO<5> cpm-merkede cDNA-prober pr. ml hybridiseringsoppløsning. Hybridiseringen var ved 55°C i 40 timer i et samlet volum på 25 ml. Etter hybridisering ble filtrene vasket to ganger i 2x SSC, 0,1% SDS ved værelsestemperatur og to ganger i 0,2X SSC, 0,1% SDS ved 65°C, deretter tørket og eksponert på røntgenfilm.. 24 genomiske kloner ble identifisert som hybridiserte sterkere med LP-cDNA-proben enn HP-cDNA-proben og derfor var mulige kandidater mth. å inneholde innskudd som kodet for sur-fosfatasegenet. Disse 24 kloner ble screenet på nytt som tidligere med LP- og HP-prober, og 14 av de på nytt screenede kloner hybridiserte igjen sterkere til LP-cDNA-proben. Plasmid-DNA ble isolert fra hver av disse 14 kloner, digirert med EcoRI, separert ved agarosegelelektroforese, blottet på duplikate nitrocellulosefiltre, og hvert filter ble hybridisert med enten LP- eller HP-cDNA under de samme betingelser som tidligere. Genfragmenter fra fire separate kloner hybridiserte kraftig til LP-cDNA-proben og svakt eller ikke i det hele tatt til HP-cDNA-proben. Disse fragmenter ble deretter restriksjonskartlagt ved bruk av EcoRI + Hindlll, EcoRI + Sali og EcoRI + BamHI doble digereringer og igjen hybridisert ved LP-cDNA-proben. Fragmentene kodet for ikke-relaterte fosfatregulerte gensegmenter som bestemt ved forskjellene i deres restriksjonskart. De områder som ble identifisert ved denne fremgangsmåte som kodende for LP-regulerte gener ble subklonet inn i pUC8 eller pUC19 (New England Biolabs). De resulterende plasmider ble merket med <32>P ved nicktranslasjon (Maniatis). De merkede plasmider ble brukt til å probe RNA-blott av LP- og HP-RNA (5 ug/blott). Én av de opprinnelige 24 kloner identifisert som pLP24 ble valgt for videre undersøkelse.

Eksempel II

Konstruksjon av pLP2411

Plasmidet pLP24 generert i eksempel I og antatt å inneholde Pichia pastoris sur-fosfatasegenet (SEQ ID nr. 1) eller et fragment derav ble ytterligere karakterisert på følgende måte. 10 ug av pLP24 ble fordøyd med EcoRI/Sall og 2,1 kb-fragmentet ble gelrenset. 10 ug av pYM25 (NRRL B-18015) ble digerert med Sphl/Sall og 3,1 kb-fragmentet ble gelrenset. 5 ug av pUC19 ble fordøyd med EcoRI/Sall, PCI-ekstrahert, CI-ekstrahert og EtOH-bunnfelt. 100 ng av det EcoRI/SalHineariserte pUC19 ble ligert med 200 ng av 2,1 kb EcoRI/Sall-fragmentet av pLP24 og 450 ng av 3,1 kb Sphl/Sall-fragmentet av pYM25 i en tre delers ligasjon, i 20 ul ligasjonsbuffer + 1 mm ATP + 1U T4 DNA-ligase. E. coli-stamme MC 1061 ble transformert og det riktige plasmid ble identifisert ved nærværet av et 2,1 kb EcoRI/Sall-fragment og et 3,1 kb Sphl/Sall-fragment. Det korrekte plasmid ble kalt pLP2411.

Eksempel III

Konstruksjon av pLP2412 PHOl- oppbrvtningsvektor op utvikling av GS190:-PLP2412

Plasmid pLP2411 oppnådd fra plasmid pLP24 (se eksempel II) ble digerert med Xbal, behandlet med Klenow DNA-polymerase for å generere butte ender og ligert med 2,1 kb Hpal-fragmentet fra plasmid pYM25. Dette fragment inneholdt Saccharomyces cerevisiae ARG4-genet. (Plasmid pYM25 er tilgjengelig som NRRL B-18015). Det resulterende plasmid ble betegnet pLP2412. pLP2412 ble deretter fordøyd med EcoRI og BamHI. 3,3 kb-fragmentet ble isolert og brukt til å transformere Pichia pastoris GS190 (NRRL Y-18014) til Arg<+->prototrofi (transformasjonsmetoden er beskrevet i eksempel IV). Arginin-prototrofer ble identifisert ved deres evne til å vokse i medium som manglet arginin. De ble isolert og screenet på LP-indikatorplater for nærværet av sur fosfatase. Koloniene ble replikaplatet på LP-indikatorplater og tillatt å vokse over natten ved 30°C. Kolonier på LP-indikatorpIatene var enten grønne (PHOl) eller hvite (phol). Hvite kolonier var transformanter inneholdende 3,3 kb-ekspresjonskassetten angitt ovenfor, stabilt integrert ved oppbrytning i PHOl-locuset av Pichia pastoris-genomet.

Genomiske DNA'er fra stabile Arg<+->stamraer ble analysert ved Southern filter-hybridisering for å bestemme plasseringen av ekspresjonskassetten. 3,3 kb EcoRI/BamHI-fragmentet inneholdende Saccharomyces cerevisiae ARG4-genet hadde spesifikt integrert og oppbrutt den genomiske sekvens som var analog med det DNA-fragment som pLP2411 inneholdt, hvilket bekreftet at dette locus kodet for sur fosfatase (PHOl). Denne transformant ble betegnet GS190:pLP2412.

Eksempel IV

Transformasjon av Pichia pastoris

Den følgende fremgangsmåte ble brukt til transformasjon av Pichia pastoris.

Gjærceller ble inokulert inn i ca. 10 ml YPD-medium og rystedyrket ved 30°C i 16-20 timer. Cellene ble deretter fortynnet til en A6oo på 0,01-0,1 og opprettholdt i logaritmisk fase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 timer. 100 ml YPD-medium ble inokulert med 0,5 ml av podekulturen ved en A«jo på ca. 0,1 og rystedyrket ved 30°C i 16-20 timer. Kulturen ble deretter høstet med en A6oo som var 0,2-0,3 (etter 16-20 timer) ved sentrifugering hvor der ble anvendt en DAMON IEC DPR-6000 sentrifuge ved 1500 g i 5 minutter.

For å fremstille sfæroplaster ble cellene vasket én gang i 10 ml sterilt vann (sentrifugering ble utført etter hver vasking som beskrevet ovenfor), én gang i 10 ml nylig fremstilt SED, én gang i 10 ml steril IM sorbitol og resuspendert i 5 ml SCE-buffer. 5 (il av 4 mg/ml Zymolase 60 000 (tilgjengelig fra Miles Laboratories) ble tilsatt og cellene inkubert ved 30°C i ca. 30 minutter.

Sfæroplastdannelse ble målt som følger. 100 ul's porsjoner av celler ble satt til 900 ul av 5% SDS og 900 ul av IM sorbitol før eller like etter tilsetningen av Zymolase og på forskjellige tidspunkter i løpet av inkubasjonsperioden. Inkubasjonen ble stoppet på det punkt hvor cellene lyserte i SDS, men ikke sorbitol. Når de var blitt dannet, ble sfæroplastene vasket én gang i 10 ml steril IM sorbitol ved sentrifugering ved 1000 g i 5-10 minutter, vasket én gang i 10 ml steril CaS ved sentrifugering og resuspendert til 0,6 ml i CaS.

For den egentlige transformasjon ble DNA-prøver i vann eller TE-buffer satt til (inntil 20 ul samlet volum) 12 x 75 mm sterile polypropylenrør. (For små mengder DNA finner maksimal transformasjon sted ved bruk av 1 ul 5 mg/ml lydbehandlet (sonicated) E. coli DNA i hver prøve). 100 ul sfæroplaster ble satt til hver DNA-prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 20 minutter. 1 ml PEG-oppløsning ble satt til hver prøve og inkubert ved værelsetemperatur i ca. 15 minutter. Prøvene ble sentrifugert ved 1000 g i 5-10 minutter, og supernatanten ble kassert. Pell etene ble resuspendert i 150 ul SOS og inkubert ved værelsetemperatur i 30 minutter. 850 ul steril IM sorbitol ble satt til hver, og prøvene ble platet som beskrevet nedenfor. 10 ml regeneringsagar ble helt på hver plate minst 30 minutter før trans-formasjonsprøvene var klargjorte. 10 ml porsjoner av regenereirngsagar ble også fordelt på rør i et bad på 45-50°C i løpet av den periode som trans-formasjonsprøvene var i SOS. Prøver ble deretter satt til rørene, helt på plater inneholdende det faste bunnagarlag og inkubert ved 30°C i 3-5 dager. Sfæroplastkvalitet på forskjellige punkter ble bestemt som følger. 10 ul prøve ble fjernet og fortynnet 100 x ved tilsetning til 990 ul IM sorbitol. 10 ul av fortynningen ble fjernet, og en ytterligere porsjon på 990 (il IM sorbitol ble tilsatt. 100 (il av begge fortynninger ble platet ved utstrykning (spread-plated) på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av hele celler som var blitt tilbake i preparatet og som ikke var dannet til sfæroplaster (unspheroplåsted). 100 ul av hver fortynning ble satt til 10 ml regenereirngsagar som var blitt supplert med 40 ug/ml av alle de aminosyrer som krevdes av verten for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjonseksperiment var 1-3 x 10<7> samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1 x 10<3> hele celler/ml.

Eksempel V

Gjær- DNA- fremstilling

Den følgende fremgangsmåte ble brukt til fremstilling av Pichia pastoris-DNA.

Gjærceller ble dyrket i 100 ml ml YNB-medium pluss 2% dekstrose ved 30°C inntil A6oo var lik 1-2 og deretter pelletert ved bruk av en DAMONIEC DPR-6000 sentrifuge ved 2000 g i 5 minutter. Pelleten ble vasket én gang i dHkO, én gang i SED, én gang i IM sorbitol og deretter resuspendert i 5 ml av en oppløsning av 0,1M Tris-HCl, pH 7,0 og IM sorbitol. Cellene ble blandet med 50-100 ul av en 4 mg/ml oppløsning av Zymolase 60 000 (Miles Laboratories) og inkubert ved 30°C i 1 time. De resulterende sfæroplaster ble deretter sentrifugert ved 1000 g i 5-10 minutter og suspendert i 5 ml lysebuffer [0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 50 mM NaCl]. Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 (ig/ml og oppløsningen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble avproteinisert ved forsiktig blanding av preparatet med et like stort volum CI, og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12 000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble trukket ut inn i et nytt rør og ekstrahert med et like stort volum PCI. Fasene ble separert som tidligere og toppfasen anbragt i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig blandet, og DNA ble samlet opp ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.

Eksempel VI

Isolering av full lengde PHOl- gen

For å isolere et plasmid inneholdende hele Pichia pastoris PHOl-genet (SEQ ID nr.

1) ble det opprinnelige Pichia pastoris genomiske bibliotek i MC 1061 hybridisert under de betingelser som er beskrevet tidligere, med 600 bp BamHI-fragmentet fra pLP24. Denne fremgangsmåte identifiserte fem positive kloner. Plasmid-DNA ble fremstilt fra disse kloner, digerert med BamHI, blottet til nitrocellulosefiltere og hybridisert med den samme 600 bp probe. Hver av de fem kloner hadde 2,0 kb BamHI-fragmentet som inneholdt Pichia pastoris PHOl-genet. Én av klonene ble utvalgt for videre analyse og ble betegnet pLP2420.

2,0 kb BamHI-fragmentet av pLP2420 ble sekvensert ved standard dide-oksysekvensering av restriksjonsenzym-digererte fragmenter subklonet i Ml 3 (tilgjengelig fra New England Biolabs). Analyse av sekvensen viste en åpen leseramme på 468 aminosyrer helt og holdent inneholdt innenfor 2,0 kb BamHI-fragmentet.

Eksempel VII

Utvikling av stammer MP102- 26:pLP2430- T1 og MB102- 26:pLP2430- T3

2,0 kb BamHI-fragmentet av pLP2420 inneholdende PHOl -genet ble ligert inn i BamHI-setet av pYM8, et plasmid som inneholder Saccharomyces cerevisiae HIS4-genet og pBR322-sekvenser. [(pYM8 kan fremstilles som følger: 10 ug pYA2 (NRRL B-15874) ble fordøyd med Sphl/Thal og 3,4 kb fragmentet ble gelrenset. 10 ug pBR322 ble digerert med Sphl/Nrul og 3,95 kb-fragmentet ble gelrenset. 100 mg av 3,95 kb pBR322-rfagmentet ble ligert med 250 ng av 3,4 kb pYA2-fragmentet under standard betingelser. Det riktige plasmid ble identifisert på basis av 3,1 kb XhoI/Sphl-fragmentet og kalt pYM8]. Det resulterende plasmid ble betegnet pLP2430 og var kompetent til å replikere autonomt i Pichia pastoris på grunn av en tilfeldig ARS-funksjon (autonom replikasjonssekvens) som lå i Saccharomyces cerevisiae HIS4 gen-sekvensen.

GS190:pLP2412 (Pho-), en Pichia pastoris-stamme som mangler sur fosfatase aktivitet (se eksempel III) ble paret med Pichia pastoris-stamme MD 100-20 ( his4. Ade-). Paringsmetoden som ble anvendt var den samme som den som er angitt i US-PS 4 812 405. Stamme MD100-20 ble utviklet som følger: celler av Pichia pastoris-stamme GS115 (his4) NRRL Y-15851 ble blandet med celler av stammen GS247 (Ade-) under betingelser som er kjent for å fremme zygotedannelse og . diploidisering (skjema for denne fremgangsmåte finnes i US-PS 4 812 405) og plated på YNB + dekstrose-plater for å selektere for de prototrofe diploider. Diploidestammen ble kalt MD 100. MD 100 ble dyrket under betingelser kjent for å indusere sporulasjon av Pichia pastoris-diploider (også angitt i US-PS 4 812 405), og sporeavkommet ble dyrket på YNB dekstrose + adenin + histidin-plater. Individuelle kolonier ble testet for evnen til å vokse i fravær av adenin- eller histidinsupplementer. En stamme som kunne vokse uten supplert histidin, men ikke kunne vokse uten supplert adenin ble identifisert og kalt MDI00-20.

En diploid stamme fra denne krysning, MB 102 Pho<+>/Pho-, HIS4/his4. AdeVAde-) ble sporulert (US-PS 4 812 405) for å gi haploid avkom. Disse avkom ble screenet på LP-indikatorplater og på YNB-dekstroseplater med eller uten histidin- eller adeninsupplementer for å isolere stamme MB 102-26 (Pho-, his4. Ade-).

Stamme MB 102-26 ble transformert med plasmid pLP2430 som beskrevet i eksempel IV. His<+->transformanter ble selektert og screenet for sur-fosfatase-ekspresjon på LP-indikatorplater (se eksempel III). Fem transformanter var positive for sur-fosfatase-ekspresjon.

To av disse transformanter, MB102-26:pLP2430-Tl og MB102-26:pLP2430-T3 ble analysert for den riktige regulering av sur-fosfatase-ekspresjon. Hver stamme ble dyrket i HP- eller LP-medium i 24 timer til en A6oo på 2,0. Celler fra hver kultur ble analysert for sur-fosfatase-ekspresjon (Bostian et al., 1980, Proe. Nati. Acad. Sei., 77:4504-4508) i parallell med ikke-transformerte HIS4-celler (MB102-28) som bar Pho~fenotypen og HIS4-celler (MB 102-51) som bar Pho<+>, villtype fenotype (tabell I). Nivået av induksjon av pLP2430-rransformantene var praktisk talt identisk med det for den ville type stamme. Følgelig inneholdt det 2,0 kb BamHI-fragment som inneholdt PHOl-genet innskutt i pLP2430 hele det sur-fosfatase-kodingsområdet såvel som de sekvenser som er tilstrekkelige til å meddele passende fosfat-regulert ekspresjon av sur fosfatase.

Eksempel VIII

Sekresjon av invertase

Dette eksempel viser at PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) funksjonerer når den er operabelt koblet til heterologe gener. 2,2 kb Smal-PvuI-fragmentet inneholdende SUC2-genet av Saccharomyces cerevisiae ble isolert fra pSEYC306 [(Johnson et al., Cell 48, 875 (1987)] og klonet inn i Smal-setet av enten pA0810 eller pPSV218 (se eksempler XI og XII for beskrivelse av disse utgangsplasmider). Denne fremgangsmåte genererte plasmider henholdsvis pAPINVl og pAPINV2. Disse anvender Pichia pastoris AOX1-promotoren for å regulere transkripsjon av en åpen leseramme fra PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) inn i det SUC2 strukturelle gen:

PHOl- sekvens linkersekvens fra pSEYC306

SUC2- sekvens

ACA AAC GAA...

10 ug av hvert plasmid, pAPINVl eller pAPINV2, ble digerert med Bglll og brukt til å transformere GS115 som i eksempel IV. Transformanter inneholdende Bglll-fragmentet av pAPINVl betegnet GS115:pAPINVl, ble selektert for histidinprototrofi og screenet for Mut—fenotypen, hvilket angir riktig integrasjon og oppbrytning i AOXl-locuset. Mut-screeningen ble utført ved replikaplating av kolonier fra glukoseholdig medium til metanplholdig medium og evaluering av veksthastigheten på metanol. Langsom vekst på metanol var en indikasjon på Mut~ fenotypen. Transformanter med Bglll-fragmentet av pAPINV2, betegnet GS115:pAPINV2, ble også selektert for histidinprototrofi, men ble screenet for Phol—fenotypen, hvilket angir riktig integrasjon og oppbrytning i PHOl-locuset (se eksempel III).

Transformanter av hver klasse ble identifisert og dyrket i YNB + 2% glycerol i parallell med Pichia pastoris-stammer KM71:GS102(Mut-) og GS115:GS102(Mut<+>) som inneholder integrerte plasmider som er identiske med pAPINVl, bortsett fra at SUC2-genet inneholder dets native signalsekvens og mangler PHOl-signalsekvensen. Disse to stammer er beskrevet i ÉP 256 421. Videre ble der i parallell dyrket stammer KM71:pPSV216(Mut-) og GS115:pPSV216(Mut<+>), som inneholder integrerte plasmider identiske med pAPINV2, bortsett fra at SUC2-sekvenser mangler.

Hver kultur ble dyrket i YNB + 2% glycerol til en A6oo på ca. 3,0. En porsjon av hver ble fjernet, vasket i sterilt vann og resuspendert i 10 ml YNB + 0,5% MeOH. Mut<+->kulturer ble resuspendert ved A^oo = 0,02 og Mut-kulturer ved Asoo = 0,2 og dyrket ved 30°C i 24 timer til ca. A6oo = 0,3-0,4. På dette tidspunkt ble ca. 1,0 mOD6oo målt for invertaseaktivitet. Resultatene er vist i tabell II.

Resultatene viser klart at PHOl-signalsekvensen funksjonerer like effektivt som SUC2-signalsekvensen med hensyn til å fremme invertasesekresjon fra Pichia pastoris.

Eksempel IX

Sekresjon av tPA ( vevsplasminoeenaktovatorl

Dette eksempel viser at PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) funksjonerer når den er operabelt koblet til heterologe gener.

1. Isolering av cDNA som koder for tPA

Bowes melanoma tPA-overeksprimerende cellelinje ATCC# CRL9607 var kilden til RNA som ble brukt til å konstruere et cDNA-bibliotek. Denne cellelinje ble brukt av andre til å klone tPA-sekvenser (Pennica et al., Nature 301: 214, 1983, Edlund et al., PNAS 80:349, 1983, Lemontt et al., DNA 4:419, 1985). Poly A + RNA ble isolert og oligo dT-primet, generelt ved at man fulgte fremgangsmåten i henhold til Maniatis (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). RNA ble brukt til å fremstille cDNA ved bruk av en kommersiell cDNA-kloningskit (tilgjengelig fra Amersham) og innskutt i ngtl 1-kloningsvektoren. ngtl 1-fag inneholdende innskutte stykker ble infisert inn i E. coli-vert Yl 088 ved bruk av en i handelen tilgjengelig pakningsblanding (tilgjengelig fra Stratagene).

Biblioteket ble triplikatplatet og probet med tre forskjellige oligonukleotider konstruert fra den publiserte sekvens av human tPA cDNA (Pennica et al., se ovenfor). Oligonukleotidene svarer til den 5', midterste og 3'-seksjonen av cDNA og hadde de følgende sekvenser:

3'-probe: 5' GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 3'

midterste probe: 5' TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3'

5'-probe: 5' GAG CCC TCT CTT CAT TCG ATC CAT GAT TGC T 3'

Fem plaques ble identifisert, hvilke hybridiserte til alle tre prober. Digererte restriksjonsstykker av innskuddene av disse kloner identifiserte dem som kodende for tPA basert på de publiserte restriksjonsmønstre (Pennica et al., se ovenfor). Klonene var forskjellige bare med hensyn til graden av 5' ikke-kodende sekvens som forelå. Kloner 4 og 5 ble plukket ut for videre karakterisering fordi de inneholdt DNA-innskudd på 0,8 kb (5'-ende), 0,47 kb (midten) og 1,3 kb (3'-ende) ved EcoRI-digerering, hvilket antydet nærværet av tPA-kodingssekvenser i full lengde. Bglll-fragmentet fra klon 4 ble subklonet inn i BamHI-kuttet pUC18, og ligasjonen ble transformert inn i E. coli MC 1061-celler. Positive transformanter ble identifisert ved EcoRI-digerering. En klon som bærer innskuddet i sens-orientering ble identifisert ved et Pstl-restriksjonsmønster på 420 bp, 624 bp, 760 bp og 2,7 kb fragmenter og ble kalt pUC18#3. En klon som bar innskuddet i antisensoirenteringen ble identifisert ved et Pstl-restriksjonsmønster på 420 bp, 624 bp og 3,46 kb og ble kalt pUC18#2. De innskutte stykker koder fra to nukleotider før den første aminosyren av modent tPA til og med 1972 nukleotider av 3' ikke-kodende sekvens.

2. Konstruksjon av vektor pT37 fPHO1 ss- tP A- pUO

tPA-innskuddet fra pUC18#2 ble klonet inn i Pichia pastoris ekspresjonsplasmidet pAO810. Plasmid pAO810 består av Pichia pastoris AOX1-promotoren, Pichia pastoris PHOl-signalsekvensen, AOXl-transkripsjonsterminatoren, Pichia pastoris HIS4-genet for seleksjon, et fl-opprinnelsessted for replikasjon, og sekvenser som er nødvendige for replikasjon og seleksjon i bakterier. Konstruksjonen av pAO810 er beskrevet i eksempel XI.

2 ug av 1600 bp Sall/Smal-rfagmentet av pUC18#2, tidligere renset på en 1% agarosegel, som kodet for 5'-partiet av tPA, ble ligert til 300 ng av Xhol/Smal-digerert pAO810. Ligasjonsreaksjonen ble transformert inn i E. coli MC 1061-celler og ampR-kolonier ble selektert. Positiver ble identifisert ved et mønster på 420 bp, 620 bp, 2 kb og 6,3 kb fragmenter ved digerering med Pstl. Den resulterende vektor ble kalt pTl. Sete-dirigert mutagenese ble utført, ved å følge standard fremgangsmåter for fl-opprinnelsesstedet av replikasjonsvektorer, for å slette de to ekstra nukleotider 5' til den modne tPA-kodingssekvens. Det mutagenerende oligonukleotid hadde sekvensen:

Det riktige plasmid ble identifisert ved screening av Sall/Xbal-digererte minipreparater. Den opprinnelige vektor pTl hadde et restriksjonsmønster på 1,2, 2,3 og 6,6 kb. Det riktig mutagenerte plasmid hadde et mønster på 1,2 og 9,8 kb og ble kalt pT2-3. 50 ug av pUC18#3 ble fordøyd med SmaI/Sau3A. De tre bånd mellom 72 og 118 bp (75, 90, 110 bp) som kodet for 3-partiet av tPA ble renset på en 8% polyakrylamidgel og ble ligert til 0,5 ug av Smal/BamHI-kuttet plasmid pT2-3. Ligasjonen ble transformert inn i E. coli MC 1061-celler og ampR-kolonier ble selektert. Positiver ble identifisert ved PvuII/Apal-fordøyde minipreparater. Det riktige plasmid oppviste et 421 bp fragment (ikke-riktig oppviste et 225 bp fragment). Riktig vektor ble kalt pT37. 5-mutagenesen ble påvist å være av den riktige sekvens, men sekvensering viste at plasmidet inneholdt pUC18-sekvenser som fulgte på enden av den tPA 3<*> ikke-kodende sekvens; plasmid pT37 ble vist å ha Sau3A-fragmentet fira pUC18, posisjon 1894-2004, like etter tPA-sekvensen. 10 ug av plasmid pT37 ble digerert med Stul og brukt til å transformere Pichia pastoris-stammen KM71 (aoxl, his4). Transformanter ble selektert for histidinprototrofi. En transformant, KM71:pT37 ble dyrket i YNB + 2% glycerol i parallell med stamme KM71:pT7 som inneholdt et plasmid (pT7) nesten identisk med pT37, bortsett fra at PHOl-signalsekvensen var erstattet med den native humane tPA-signalsekvens og pUC18-sekvensene ved 3'-enden var fjernet. En beskrivelse av pT7 er gitt nedenfor. 50 mis kulturer av hver stamme som vokste i YNB + 2% glycerol ble podet inn i et 1-liters gjæringskar og dyrket i enten kontinuerlig modus eller et modus med satsvis innmatning. Resultatene av dette eksperiment er vist i tabell III.

Resultatene av dette forsøk viser at uansett fermenteirngsmodus var PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) mer effektiv i å fremme tPA-sekresjon i Pichia pastoris enn den native signalsekvens var.

Dessuten bekreftet mikro-Edman nedbrytningsanalyse at N-terminal-amino-syresekvensen av det rekombinante sekreterte tPA fra stamme KM71:pT3 ved bruk av PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) var identisk med det native tPA renset fra en dyrket human vevskilde (melanoma).

3. Konstruksjon av <p>T7 ( tPAss- tPA- intet- pUO

5 ug av det tilnærmet 100 bp SmaI/Sau3A-fragment fra pUC18#3 ble ligert til 500 ng av Smal/BamHI-kuttet pTl. Ligasjonsreaksjonen ble transformert inn i E. coli MC1061-celler og ampR-kolonier ble selektert. Positiver ble identifisert ved nærværet av et 360-bp bånd snarere enn et 260-bp bånd ved digerering med Apal/PvuII. Den modifiserte 3'-ende ble sekvensert og vist å være av den riktige sekvens med ingen ekstra pUC18-sekvenser. Dette plasmid ble kalt pT49.

Oligonukleotider som koder for den autentiske tPA-signalsekvens ble satt til Xbal-setet av plasmid pT49, og de to mutageneser ble utført for å 1) slette de ekstra 8 nukleotider av sekvensen som var igjen mellom tPA-signalsekvensen og den sekvens som koder for modent tPA og 2) slette PHOl-signalsekvensen. Disse manipulasjoner ble oppnådd som følger.

En oligonukleotid med følgende sekvens ble syntesert (109 nukleotider):

Det komplementære oligonukleotid som var nødvendig for den annen tråd ble syntisert som tre oligonukleotider med lengder på henholdsvis 33, 37 og 39 nukleotider som hadde de følgende sekvenser:

Oligonukleotidet med full lengde og de tre komplementerende oligonukleotider ble kinasert og deretter sammenføyet ved oppvarming i et bad med kokende vann i 3 minutter og deretter langsomt avkjølt til værelsetemperatur. Sammenføyet oligonukleotid ble separert og isolert fra en 5% polyakrylamidgel.

200 ng av delvis Xbal-Iinearisert pT49 ble ligert til 1 ug av det sammenføyde dobbelttrådede oligonukleotid. Ligasjonsreaksjonen ble transformert inn i E. coli MCI061-celler og ampR-kolonier ble selektert. Kloner som inneholdt det riktig endrede plasmid ble identifisert ved et ytterligere 700 bp bånd ved digerering med AsuII. Et riktig plasmid ble kalt pT544.

Den første mutagenese ble utført ved standard fl-basert sete-dirigert mutagenese ved bruk av pT544 DNA (5 ug) og et oligonukleotid (1 ug) med den følgende sekvens:

Det riktige plasmid ble screenet for ved Bglll-fordøying. Det riktige restrik-sjonsmønster (1,1, 2,8 og 5,3 kb) var en indikasjon på riktig plasmid som ble kalt pT64. (Ikke-riktig plasmid oppviste et mønster på 2,8 og 6,3 kb bånd).

Den neste runde med mutagenese ble utført med plasmid pT64 for å slette PHOl-signalsekvensen. Et oligonukleotid med den følgende sekvens ble anvendt: 3 ug av pT64 og 0,4 ug av det ovenfor angitte oligonukleotid ble anvendt i mutagenesen. Minipreparater ble screenet ved fordøyelse med Bglll. Det riktige plasmid ble identifisert ved tre DNA-fragmenter på 1, 2,8 og og 5,3 kb i størrelse (ikke-riktig plasmid viste et minste bånd på 1,1 kb istedet for 1 kb). Mutagenesen ble bekreftet ved sekvensering, og det riktige plasmid ble kalt pT7.

Eksempel X

Konstruksjon av pAPBlOl: PHOl promotor- lacZ ekspresjonsplasmid

Dette eksempel viser at PHOl-promotoren (eller det 5' regulatoriske område) (SEQ ID nr. 2) funksjonerer når det er operabelt koblet til heterologe gener. 1 ug av det lacZ-holdige plasmid pSAOHS (NRRL B-15862) ble digerert med EcoRI og BamHI, og det 10,1 kb vektorfragment ble isolert fra en 0,8% agarosegel. 5 ug av pLP2420 ble fordøyd med EcoRI og Bell, og 1,6 kb-fragmentet inneholdende 375 bp av pBR322 DNA, +1075 bp av PHOl 5' flankerende DNA som innbefattet PHOl-promotoren (SEQ ID nr. 1), og 123 bp av PHOl-kodingssekvensen, ble isolert fra en 1% agarosegel. 100 ng av EcoRI-BamHI-fragmentet av pSAOH5 og 60 ng av 1,6 kb EcoRI-BclI-fragmentet av pLP2420 ble ligert i en 20 ul blanding av Iigasebuffer med 1 mM ATP og 1U av T4 DNA-Iigase (tilgjengelig fra Boehringer Mannheim). Ligasjonsblandingen ble transformert inn i E. col JM103, og de transformerte celler ble platet på LB Amp-plater som inneholdt 40 ug/ml X-gal. Blå-fargede kolonier ble valgt, dyrket i LB Amp og plasmid-DNA ble isolert. DNAet ble fordøyd med EcoRI og Smal, og det riktige plasmid ble identifisert ved frigjøring av et 1450 bp fragment. Det riktige plasmid ble kalt pAPBlOl. En ekspresjonskassett som omfattet E. coli lacZ-genet plassert under styring av Pichia pastoris PHOl-promotorelementet (SEQ ID nr. 2) var inneholdt i pAPBlOl. 10 ug av ikke-kuttet pAPBlOl ble transformert inn i GS115-sfæroplaster og histidinprototrofer ble selektert. 12 His<+->koIonier ble valgt, stammene ble dyrket i flytende HP- og LP-medium og målt for fi-galaktosidaseaktivitet. Positive trans-formantstammer ble identifisert på basis av B-galaktosidaseekspresjon etter dyrking i LP-medium og mangel på 13-galaktosidase etter dyrking i HP-medium. fl-galaktosidase ble målt i henhold til J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY 1972. Blå kolonier kom tilsyne på LP-X-gal-platene og hvite kolonier kom tilsyne på HP-X-gal-platene.

Eksempel XI

De følgende plasmider ble konstruert for bruk i andre eksempler i søknaden.

1. Konstruksjon av plasmid pAQ810

M13mpl94=RI ble konstruert ved fordøyelse av 1 ug av M13mpl9 med EcoRI, utfylling med Klenow og ligering av det utfylte fragment til seg selv. Ligasjonen ble brukt til å transformere E. coli JM103-celler og riktig fag ble identifisert ved isolering av DNA og digerering av dette med EcoRI. Riktig fag ble ikke kuttet med EcoRI og ble kalt M13mpl9^RI. Plasmid pAO804 (konstruksjonen av dette er beskrevet i WO89/04320, som her er inntatt som referanse) ble digerert med Sstl og EcoRV og det ca. 1,2 kb store fragment ble isolert fra en 0,8% agarosegel. (Alle fragmenter i denne konstruksjon var isolert fra 0,8-1,0% agarosegeler.) 100 ng av fragment ble ligert til 500 ng av Sstl- og Smal-digerert M13mpl9=j=RI. Ligasjonen ble brukt til å transformere E. coli MJ103-ceIler, og riktig fag ble identifisert ved isolering av DNA og digerering av dette med Sstl og PvuII. Riktig fag ble identifisert ved nærværet av et 950 bp fragment og ble kalt pPSVlOl.

1 pikomol av pPSVlOl ble underkastet in vitro oligonukleotid-dirigert setespesifikk mutagenese ved bruk av 20 pmol av et oligonukleotid med følgende sekvens:

Reaksjonsblandingen ble brukt til å transformere E. coli JM103-celler. Riktig fag ble identifisert ved fordøyelse av minipreparat-DNA med Bglll og BamHI og avslørte nærværet av 1,4 kb og 0,5 kb DNA-fragmenter. Den riktige fag ble kalt pPSV102.

Plasmid pPSV102 ble fordøyd med EcoRI og 500 ng av 8,5 kb-fragmentet ble ligert til 50 ng av det følgende dobbelttrådede syntetiske DNA-fragment som koder for Pichia pastoris PHOl-signalsekvensen (SEQ ID nr. 3) ved bruk av de følgende optimaliserte Pichia-kodoner:

Ligasjonsblandingen ble transformert inn i E. coli CJ236-celler og det riktige fag-DNA ble identifisert ved plaque-hybridisering med én kodende tråd av gjærsignalsekvensen som var blitt merket med <32>P, og ved fordøyelse av det hybridiserende DNA med Sstl og BamHI, hvilket avslørte et 700 bp-fragment. Plasmidet ble kalt pPSV103.

1 pikomol av pPSV103 ble mutagenisert in vitro med 20 pmol av et oligonukleotid med sekvensen:

Riktig fag-DNA ble identifisert ved plaque-hybirdisering med det samme oligonukleotid som ble anvendt ovenfor. Det riktige plasmid ble kalt pPSV104.

Plasmid pAO810 ble fremstilt ved fordøyelse av 10 ug av pPSV104 med Hindlll og isolering av det 400 bp DNA-fragment fra en 1,2% agarosegel. 50 ng av dette fragment ble ligert med 250 ng av 7,9 kb Hindlll-fordøyelsesprodukt av pAO807 (hvis fremstilling er beskrevet nedenfor) som isolert fra en 0,8% agarosegel. Ligasjonen ble transformert inn i E. coli MCI061-celler og ampR-kolonier ble selektert. Riktig plasmid ble identifisert ved nærværet av et 450 bp bånd ved digerering med BamHI og EcoRV, og ble kalt pAO810.

2. Dannelse av pAO807

a. Fremstilling av fl-ori DNA

fl bakteriofag-DNA (50 ug) ble fodøyd med 50 enheter Rsal og Dral (i henhold til produsentens retningslinjer) for å frigjøre det ca. 458 bp DNA-fragment inneholdende fl-opprinnelsesstedet for replikasjon (ori). Fordøyelsesblandingen ble ekstrahert med et like stort volum av PCI, fulgt av ekstrahering av det vandige lag med et like stort volum CI, og tilslutt ble DNAet i den vandige fase utfelt ved justering av NaCl-konsentrasjonen til 0,2M og tilsetning av 2,5 volumer absolutt etanol. Blandingen ble tillatt å stå på is (4°C) i 10 minutter, og DNA-utfellingen ble samlet opp ved sentrifugering i 30 minutter ved 10 000 x g i en mikrosentrifuge ved 4°C.

DNA-pelleten ble vasket to ganger med 70% vandig etanol. Den vaskede pellet ble vakuumtørket og oppløst i 25 ul til TE-buffer. Dette DNA ble underkastet elektroforese på 1,5% agarosegel og den gelporsjon som inneholdt det ca. 458 bp fl-ori-fragment ble kuttet ut og DNAet i gelen ble elektroeluert på DE81-papir (Whatman) og eluert fra papiret inn i IM NaCl. DNA-oppløsningen ble utfelt som beskrevet i detalj ovenfor, og DNA-utfellingen ble oppløst i 25 ul av TE-buffer (fl-ori fragment).

K Kloning av fl-ori inn i Dral-seter av pBR322:

pBR322 (2 ug) ble delvis digerert med 2 enheter Dral (i henhold til fabrikantens instruksjoner). Reaksjonen ble avsluttet ved PCI-ekstraksjon, fulgt av utfelling av DNA som angitt i detalj i trinn a ovenfor. DNA-pelleten ble oppløst i 20 ul TE-buffer. Ca. 100 ng av dette DNA ble ligert med 100 ng fl-ori fragment (trinn a) i 20 ul ligasjonsbuffer ved inkubering ved 14°C over natten med 1 enhet T4 DNA-ligase. Ligasjonen ble avsluttet ved oppvarming til 70°C i 10 minutter og deretter brukt til å transformere E. coli-stamme JM103 for oppnåelse av pBRfl-ori som inneholder fl-ori klonet inn i Dral-setene (nukleotidposisjoner 3232 og 3251) av pBR322.

c. Dannelse av pAO807:

pBRfl-ori (10 ug) ble fordøyd i 4 timer ved 37°C med 10 enheter hver av Pstl og Ndel. Det fordøyde DNA ble PCI-ekstrahert, utfelt og oppløst i 25 ul TE-buffer som angitt i detalj i trinn 1 ovenfor. Dette materiale ble underkastet elektroforese på en 1,2% agarosegel, og Ndel-Pstl-fragmentet (ca. 0,8 kb) inneholdende fl-ori ble isolert og oppløst i 20 (il TE-buffer som angitt i detalj i trinn a ovenfor. Ca. 100 ng av dette DNA ble blandet med 100 ng pAO804 som var blitt digerert med Pstl og Ndel og fosfatasebehandlet. En beskrivelse av pAO804 er gitt i WO89/04320. Denne blanding ble ligert i 20 ul ligasjonsbuffer ved inkubering over natten ved 14°C med 1 enhet T4 DNA-ligase. Ligasjonsreaksjonen ble avsluttet ved oppvarming ved 70°C i 10 minutter. Dette DNA ble brukt til å transformere E. coli-stamme JM103 for oppnåelse av pAO807.

Eksempel XII

Konstruksjon av pPSV218

200 ng av 1,6 kb EcoRI/BcII-fragmentet av pLP2420, 100 ng av 0,8 kb Bglll/Hindlll-fragmentet av pPG2,5 (se beskrivelsen nedenfor) og 100 ng av det 2,6 kb EcoRI/Hindlll-fragment av pUC8 (New England Biolabs, Inc.) ble ligert i en tre delers ligasjon i et 20 ul volum av ligasjonsbuffer, 1 mm ATP, 1U T4-ligase og transformert inn i E. coli-stamme MC1061 for Amp-resistens. [Plasmid pPG2,5 er 2,5 kb EcoRI/Sall-fragmentet av pPG4,0 (NRRL B-15868) plassert i pBR322, som inneholder alkoholoksidasepromotoren.] Resistente kloner ble analysert for plasmider som inneholdt et 2,4 kb EcoRI + Hindlll fragment, det riktige plasmid ble kalt pPSV201. 50 ng av pPSV201 ble fordøyd med BamHI, defosforylert og ligert med et 50 ganger så stort molart overskudd av et oligonukleotid med den følgende sekvens:

som omdanner BamHI-setet til et Bglll-sete. Positive kloner ble identifisert på dette grunnlag, og plasmidet ble kalt pPSV203. 10 ng av pPSV203 ble delvis digerert med en begrensende mengde Hindlll og forsynt med butte ender med Klenow. Lineære plasmidfragmenter i full lengde ble gelrenset og selv-ligert i et volum på 100 ul. Riktige kloner ble identifisert på grunnlag av plasmid-DNA inneholdende et 1350 bp Bglll/Hindlll-fragment, og riktige plasmider ble kalt pPSV210. 60 ng av 500 bp Bglll/BamHI-fragmentet av pPL2420 ble ligert med 100 ng av BamHI-digerert pUC8. Riktige plasmider ble identifisert på basis av et 422 bp NcoI/BamHI-fragment, det resulterende plasmid ble kalt pPSV202. 50 ng av pPSV202 ble digerert med BamHI, defosforylert og ligert med et 50 ganger så stort molart overskudd av et oligonukleotid med sekvensen: som omdannet BamHI-setet til et Bglll-sete. Det riktige plasmid ble identifisert på grunnlag av et 422 bp NcoI/Bglll-fragment og kalt pPSV204. 10 ug av pPSV210 ble fordøyd med BgUI og SacI, og 700 bp-fragmentet ble gelrenset. 25 ng av dette fragment ble ligert til 100 ng av det gelrensede 8200 bp BglH/SacI-fragment av pAO810. Riktige plasmider ble identifisert ved nærværet av et 700 bp Bglll/SacI-fragment og ble kalt pPSV212. 10 ug av pPSV212 ble digerert med SphI, endene gjort butte med T4 DNA-polymerase (i henhold til Maniatis et al.), delvis digerert med BgUI, og 8000 bp-fragmentet ble gelrenset. 10 ug av pPSV204 ble digerert med Ncol, endene gjort butte med Klenow, digerert med BgUI, og 440 bp-fragmentet ble gelrenset. 100 ng av det ovenfor beskrevne 8 kb-fragment fra pPSV212 ble ligert til 15 ng av 440 bp-fragmentet fra pPSV204. Det riktige plasmid ble identifisert på grunnlag av et 5500 bp Bglll-fragment og ble kalt pPSV218.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av et heterologt protein, karakterisert ved dyrking av en egnet vertscelle som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende det sur fosfatase 5' regulatoriske området (Sekv. id. nr. 2) operabelt koblet til en DNA-sekvens som koder for nevnte heterologe protein og bringe vertscellen i berøring med et medium i hvilket konsentrasjonen av fosfat vil virke inn på ekspresjonen, og produksjon av nevnte heterologe protein.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at nevnte ekspresjonsvektor dessuten inneholder en signalsekvens, fortrinns sur fosfatase signalsekvensen av Pichia pastoris (Sekv. id. nr. 3) operabelt koblet dertil.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at nevnte ekpresjonsvektor dessuten omfatter en 3' transkripsjonsavslutningssekvens, fortrinnsvis Pichia pastoris sur fosfatase 3' transkripsjonsavslutningssekvens (Sekv. id. nr. 5), operabelt koblet dertil.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte vertscelle er en gjærcelle, fortrinnsvis en gjærcelle fra slekten Pichia pastoris.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, 2, 3 eller 4, karakterisert ved at nevnte heterologe protein er en vevsplasminogenaktivator.

6. Fremgangsmåte til å fremstille et heterologt protein, karakterisert ved å dyrke en egnet vertscelle som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor, hvori nevnte ekspresjonsvektor omfatter en 5' regulatorisk region, samt Pichia pastoris sur fosfatase signalsekvens (Sekv. id. nr. 3) operabelt koblet til en DNA-sekvens som koder nevnte heterologe protein, og å bringe vertscellen i kontakt med et medium i hvilke konsentrasjonen av fosfat vil påvirke ekspresjon og produksjon av nevnte heterologe protein.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at nevnte 5' regulatoriske region er sur fosfatase 5' regulatorisk region (Sekv. id. nr. 2) eller Pichia pastoris alkoholoksidase (AOX1) 5' regulatorisk region.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6 eller 7, karakterisert ved nevnte ekspresjonsvektor dessuten omfatter en 3' transkripsjonsavslutningssekvens, fortrinnsvis Pichia pastoris sur fosfatase 3' transkripsjonsavslutningssekvens fra (Sekv. id. nr. 5) operabelt koblet dertil.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, 7 eller 8, karakterisert ved at nevnte vertscelle er en gjærcelle, fortrinnsvis en gjærcelle av slekten Pichia pastoris.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, 7, 8 eller 9, karakterisert ved at nevnte heterologe protein er en vevsplasminogenaktivator.

11. Fremgangsmåte til å styre integrasjonen av et heterologt gen ved Pichia pastoris PHOl-lokuset, karakterisert ved at det anvendes en integrativ vektor, hvor nevnte vektor omfatter nevnte heterologe gen som er operativt koblet til de 5' og 3' flankerende sekvenser av Pichia pastoris PHOl-genet.

12. Fremgangsmåte til identifisering av Pichia pastoris transformanter inneholdende ekspresjonsvektorer integrert ved PHOl locuset, som angitt i krav 11, karakterisert ved at Pichia pastoris som er blitt transformert plates på lavfosfat-indikatorplater, tillates å vokse over natten, og de resulterende kolonier screenes for hvit farge.

13. DNA-fragment, karakterisert ved at det omfatter signalsekvensen (Sekv. id nr. 3) fra Pichia pastoris sur fosfatase genet operabelt koblet til en 5' regulatorisk region, fortrinnsvis den sure fosfatase 5' regulatoriske region (Sekv. id nr. 2) eller Pichia pastoris alkohol oksidase (AOX1) 5' regulatorisk region.

14. DNA- fragment, karakterisert ved at det omfatter fra 5' til 3' i operabel kobling en 5' regulatorisk region, Pichia pastoris sur fosfatase signalsekvens (Sekv. id. nr. 3) og en heterolog DNA-sekvens som koder et polypeptid.

15. Plasmid, karakterisert ved at det er pLP24 eller pT37.

16. Ekspresjonvektor nyttig til produksjon av et heterologt protein, karakterisert ved at det omfatter Pichia pastoris sur fosfatase 5' regulatorisk region (Sekv. id. nr. 2), operabelt koblet til en DNA sekvens som koder for nevnte heterologe protein.

17. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 16, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en Pichia pastoris sur fosfatase signalsekvens (Sekv. id. nr. 3), operabelt plassert mellom nevnte 5' regulatoriske region (Sekv. id. nr. 2), og nevnte DNA sekvens som koder for nevnte heterologe protein.

18. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 16 eller 17, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en Pichia pastoris sur fosfatase 3' transkripsjonsavslutningssekvens (Sekv. id. nr. 5).

19. Ekspresjonsvektor nyttig til fremstilling av et heterologt protein, karakterisert ved at det omfatter en 5'-regulatorisk region, Pichia pastoris sur fosfatase signalsekvens (Sekv. id. nr .3) og en DNA sekvens som koder nevnte heterologe protein.

20. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 19, karakterisert ved at nevnte 5' regulatoriske region er sur fosfatase 5' regulatoriske region (Sekv. id. nr. 2) eller Pichia pastorisk alkohol oksidase (AOX1) 5' regulatorisk region.

21. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 19 eller 20, karakterisert ved at det ytterligere omfatter Pichia pastoris sur fosfatase 3' transkripsjonsavslutningssekvens (Sekv. id. nr 5).