TW201330B - - Google Patents
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Description
01330 A6 B6 五、發明説明(1 ) 搿明筋釀 本發明是有闞利用酵母宿主糸统及表現載熥之重姐8S生 物技術領域。於一方面,本發明是有W含有部份或全部酵 母巴斯德畢赤酵母酸性磷酸_基因(SEQ ID N0:1)之新穎 DHA片段。於另一方面,本發明是有Μ含有衍自巴斯徳畢 赤酵母酸性璘酸_基因(SEQ ID H0:1)DHA片段之新穎載篇 。再一方面本發明是有ΜΜ含衍自巴斯德畢赤酵母酸性播 酸酶DN Α片段之載《轉形的宿主细胞。又另一方面,本發 明是有關使用上述DN A片段Μ促進異質蛋白質於酵母中之 表現及/或分泌之方法。 發明背鲁 由於近年來發展的重姐IIDHA生物技術,烴由微生物控 制各種有用多呔之產製已成為可能。許多多肽•如人類生 長激素,白血球干播素,人類胰島素*及人類胰島素原已 可用各種微生物來產製。技術之繼續應用已在著手研究中 ,Μ預期含各種其他有用的多肽產物可產製。 於重姐體DN Α技術領域中應用的基本技術係精ϋ者热知 的。進行重姐體DN Α技術所需之要件如下,但亦不限於此 ⑴一倨可指導合成一種Μ上欲求多肽之基因,且與基因 於宿主有機體中表現所箱之进當控制序列功能性地相連; ⑵一涸基因可嵌入之載體; ⑶一個適當的宿主有機體,此中搞有基因之載體可將之 轉形; -3- 本紙伕尺度適用中國國家烊译(CNS)甲4則各(2丨0父297公釐) {請先閱讀背曲之注意r項再填寫本頁) 裝· •線· 201330 A6 B6 五、發明説明(2 ) (請先閑請背&-之注意於項再填寫本頁) ⑷若異霣蛋白質之分泌是企求的,則需要訊《序列,μ 指令異霣蛋白質進入宿主细胞之分泌路徑,以及而後的離 開细胞; ⑸一個轉形系统;Μ及 ⑹選擇轉形细胞之方法。 可設計重姐體基因構體,如此重姐蛋白霣穿越宿主之分 泌路徑,且分泌至生長培養基,基於許多理由,分泌是重 姐體表現之欲求棋式。首先,某些異質蛋白質對於宿主有 機應具有毒性作用。當此種異«基因產物分佈而非聚累在 宿主内,其較不致干攫正常的细胞功能。第二,某些蛋白 質當於细胞内產製時係不具活性,而分泌時則具活性。第 三,分泌至培養基可避免為回收產物而打破宿主细胞之必 要。當產物存在於生長培養基,產物的鈍化較為容易且費 用較烴濟。而且第四點,由於重姐產物存在於營養基中, 欲求的產物可連績移出且培養基可再循環。 大多數的經分泌蛋白質,最先都是Μ前驅體或蛋白質原 型式表現於细胞内•且含有附加的胺基末端延伸部份稱為 訊號肽。此訊號肽於埋送附羼的多肽至及/或穿越受限之 细膜膜上扮演一個必要的角色。於分泌中或後,訊號呔再 被訊號肽酶的蛋白水解地解離,Κ生成成熟的蛋白質產物 〇 異質或外來蛋白質之分泌,可由異質DN Α之编碼序列與 煽碼訊號呔之DMA相埋而完成。希望可分離出煸碼此訊號 肽之訊號序列。 -4 -本纸伕尺度適用中國S家標準(CNS)甲4Jgf5(:M0x297公砮) 201330 經濟部巾央標"^打工消^合作^印欠 A6 B6 五、發明説明(3 ) 訊號序列尤其可用於生成表現載艚。此種載體之使用可 轉形缠合的宿主细胞,如此其可產生及分泌異質基因產物 。可用來成功地自酵母宿主中分泌重姐蛋白質之領導子序 列實例包括;釀酒酵母阿爾法K對因子,對因子,以 及殺手毒性基因。自嘈甲基酵母中分離訊號序列·如巴斯 德畢赤酵母,則尚未烴描述。 合宜地,可用於此種載髓中以調控異質*因產物表現之 故動基因,可為與訊號序列先天上即相闞者。若啟動基因 與訊號序列先天地相W,則此尤其有益•即可提供高水平 的DN A轉錄作用,且對外來環境剌激將有所反映。此種啟 動基因之賁例,為巴斯德畢'赤酵母酸性磷酸_(PH01)基因 之5'調控區(SEQ ID H0:2),其反映培養基中轔酸鹽之缺 乏將可以高水平轉錄,且由於培養基中磷酸鹽之存在而被 遏止。 希望可K重姐DNA構體來轉形巴斯德畢赤酵母,其係整 合在巴斯德畢赤酵母基因體之精確位置上。鄰接巴斯德畢 赤酵母基因的5’及3’序列•巳分別稱之為第一及第二可嵌 入DNA片段,用於表現載體中Μ指令重姐序列於ΡΗ01 Κ域 上之整合作用。基於以下至少二個理由,重姐體DNA於 EJLILL區域之整合能力是有益的:1)可發展巴斯德畢赤酵母 表現株,其在ΡΗ01區或另一區具有多套數相同或不同的表 現匣,或者2)於巴斯德畢赤酵母宿主中,只有在ΡΗ01匾中 一個Μ上之表現匣才有安定的整合作用,其中基本基因或 甲酵代謝路徑中之基因瓦解將是不希望的。 -5- 木紙张尺度適用中家烊孕(CNS)甲4規恪(21〇父297公釐) (請先閲讀背缸之注老^項再填駕本頁 .裝· •打· ^01330 A6 B6 五、發明說明(4 ) 其中PH.01基因已瓦解之细胞,顧示酸性磷酸_酵素活性 之^伴《的喪失。顯示PH01基因瓦解的Pho-基因型,其篩選 可藉將細胞塗佈在低磷酸體指示两培養盤上,並令集落生 長一液。其中PH01基因已瓦解之集落呈白色,然而具有完 轚EJLQJJi因之集落則為綠色。此呈色筛埋對偵拥佃胞提供 一個快速且容易的方法,其中表現匣正確地II合在ΡΗΠΊ Bt 域上,因此將之瓦解。 因此分離訊號序列將對技藝極具貢獻,其有肋於蛋白質 自宿主细胞中之分泌。 此外,分離5’調控區將是有益的,其可搮供高水平的 DNA轉錄作用,且可反映外來環境之剌激。目前技蕕中尚 未有已知之5’調控區•可反映培養基中磷酸鹽之缺乏而以 高水平轉錄•且可用於高度產製性醱酵酵母巴斯德畢赤酵 母。 分離酸性磷酸酶(AP)結構基因將是尤其有益的。 提供含有酸性磷酸酶基因片段之新穎載《將也是有益的 0 母 益酵 有赤 外畢 額德 將斯 列巴 序於 結可。 終其的 用-益 作體有 錄載是 轉合將 5'整也 離供用 分提作 合 整 令 指 中 區 Μ/τΐ部屮夾標;ιι-^5Η工消^合作:^卬货 分 中 胞 细 自 質 白 。蛋 益於 有肋 極有 將出 也提 法是 方面 之方 胞一 细的 解明 瓦發 定本 鑑, 供此 提因 區 控 調 5 之 錄 轉 而 乏 缺 鼸 酸 0 映 反 〇 可 列是 序面 號方 訊一 之另 泌 本纸伕尺度適用中Η國家炫準(CNS) τ 4規fs(210 X 297公釐) A6 B6 201330 五、發明説明(5 ) 本發明另一方面是巴斯德畢赤酵母酸性磷酸_结構基因 之 DNA 序列(SEQ ID N0:4)。 本發明再一方面在於新類的載《 *其中包括一鎇調控區 及/或訊號序列•操作性連接至一僑異質DNA序列,其緬 磚至少一 fi多肽*以及誘導該調控區Μ促進該異霣DH A序 列表現之工具。 另一方面包括來自酸性磷酸_基因之3’轉錄作用终结序 列;可指令於巴斯德畢赤酵母PH01B域中轚合之整合性載 拥;Μ及鑑定瓦解细胞之方法。 其他方面,主埋,及本發明優點,由以下銳明*實例及 申謫專利範園將可更加明白。 窃明蓼贴 依據本發明,提出一段新穎的DNA片段,其中含有來自 巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID Η0:3)之訊號序 列,有肋於蛋白質自細胞中之分泌。 本發明再一方面是提出一段新穎的DNA片段,其含有來 自巴斯德畢赤酵母酸性磷酸_5’調控區域(SEQ ID Ν0:2) Ο Μ濟郎屮央標·;ιι-Α=:工消兑合作杜卬製 本發明另一方面是提出一段新穎的DNA片段,其含有來 自巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶(AP)结構基因之DHA序列 (SEQ ID Ν0:4)。 再一方面提出新穎的載體*含有調控S及/或訊號序列 而操作性鏈结至埔碼至少一涸多肽之異質DNA序列,Μ及 誘導該調控區Μ促進該異質DHA序列表現之工具。 -7-夂纸张尺度適用中國國家榫孕(CNS)甲4規格(2丨0X297公笼) ^01330 A6 _ B6 五、發明説明(6 ) 又一方面是提出新穎的DNA載體,其中含有來自巴斯德 畢赤酵母酸性磷酸酶基因之3'轉錄作用终结序列(SEQ ID N0:5)。 另一方面是提出整合性載體*其可指令載體於巴斯德畢 赤酵母EJULL區域上之轚合作用。 又一方面是提出鑑定瓦解佃胞之方法。 附圖銳明 圖1提出巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID H 0 : 1)之限制興圖。 註钿說明 本發明提出一段新穎的經分離DNA片段,含有一届酸性 磷酸酶基因,包括其啟動基因(或5'調控區),訊號,轉錄 終结子,及鄰接序列,衍生自巴斯德畢赤酵母(SEQ ID N0:1)。 酸性璘酸梅UP)為巴斯德畢赤酵母及其他的酵母於無機 磷酸鹽斷絕條件下所分泌之细胞外酵素。分泌出之酸性磷 酸酶可催化磷酸鹽自有機受霣中之移去,因此可益於磷酸 鹽為细胞生長及存活之用。 經濟郎屮*標·Ηι-Α5=工消';;'合<>'^卬災 指導合成酸性磷酸梅之基因已被分離,且於許多酵母棰 類中研究,且酸性磷酸酶基因表現之可調控本質已定位在 酸性隣酸酶之啟動基因要件上。於低無機磷酸鹽培養基浪 度條件下,酸性磷酸酶啟動基因(或5’調控區)被”啟動·’, 酸性磷酸梅基因被轉錄•接下來轉錄成酸性磷酸酶酵素。 新合成之酸性磷酸海可自有桷受質中釋出磷酸鹽,且使磷 本纸伕疋度遄用中8 3家梂準(CNS)甲4規恪(210X297公釐) ^01330 A6 B6 五、發明説明(7 ) 酸鹽可為细胞浬用、磷酸鹽濃度接下來的增加•可調控酸 性磷酸酶啟動基因,造成降低的酸性磷酸酶基因轉錄作用 ,伴隨對酸性璘酸酶蛋白質需要之減低。因此,由於低或 高的磷酸蘧湄度,酸性磷酸酶啟動基因可分別被誘生或遏 止。巴斯德畢赤酵母酸性璘酸酶敢動基因之鑑知及分離是 重要的。由於酸性磷酸酶表現之調控在不同酵母種類中有 異,因此分析此表現,預期酸性磷酸酶於巴斯德畢赤酵母 中嚴密的調控,依據同質啟動基因序列之利用性及使用而 定。 巴斯德畢赤酵母PH01基因訊號序列(SEQ ID N0:3)之鑑 定及分離是重要的,因為除了是第一個分離自巴斯德畢赤 酵母基因之訊號序列*其也代表分離自唯甲基酵母的第一 個訊號序列。已發規,於指令異質蛋白質自巴斯德畢赤酵 母中分泌(如tP A或轉化酶)方面,較天然的基因訊號序列 ,如來自tPA (姐嫌血嫌維蛋白酶原活化劑)或轉化_基因 為佳或相當。 常希望可整合重姐表現載體至宿主基因體中,而非將其 以自動複製要件般維持。烴整合的載體,較自動載«來得 經濟部屮央標ill-ri0工消';'合作(1卬欠 更為安定,且於實行本發明時更佳。特言之,Μ線型位置 特異之整合性載體為較佳,如美画專利案第4,88 2,279號 中所述,在此列為參考文辭。此種載艏包括依序排列的至 少下列:1) 一個第一可嵌入的DNA片段,2)—個可篩埋I的 標誌基因;及3)—個第二可嵌入的DNA片段。 第一及第二可嵌入的DN Α片段*各自長度至少約200個 -9-本纸伎尺度违用中H S家樣準(C N S)甲4規格(210 X 2 9 7公ft) ^01330 A6 B6 五、發明説明(8 ) 核苷酸*且有與欲轉形之基因體DN A部份同霣之核苷酸序 列。整合載體的各種姐份依序排列形成一俚線型的DN A片 段,如此表現匣及可篩選播誌基因,位於第一可嵌入DH A 片段3’端及第二可嵌入DNA片段5’端之間。第一及第二可 嵌入DNA片段互相排列於依序安置之線型片段上,就如同 其於親代基因體中排列一般。 可充作第一及第二可嵌入DN A片段之核兑酸序列,是與 欲發生基因體處理修飾之天然基因Η位置各別部份具同質 之核苷酸序列。因此,若欲於酸性磷酸_基因區域上發生 基因體處理修飾,則應用的第一及第二可廉入DHA片段必 須是與酸性磷酸W基因區各別位置同質之序列。欲發生基 因體處理修飾,二®可嵌入DNA片段必須互相排列於埭型 片段中,與其於親代基因體中存在的有相同的相對位置。 可充作第一及第二可嵌入DN Α片段之核苷酸序列霣例包括 選自下列之核苷酸序列:酸性磷酸酶PHf)l某因,乙酵氧化 梅AQ-X.lg因,姐嫌胺酵去氫_ HIS4某因•及二羥丙嗣合成 酶DHAS基因。 第一可嵌入DNA片段可含一涸可操作之讕控區,其可含 有可用於表現匣中之調控區。第一可嵌入DNA片段充作表 現匣中之調控區使用,是本發明一個較佳的具體實例。任 意地*嵌入位置及3’終结序列可緊排在第一可嵌入DN A片 段之3’端。此線型位置特異的整合載體構型,具有提供结 檐基因即可嵌入之頫外優點,而勿需再加可相容的3,终结 序列。 -10- 本紙张尺度適用中HS家浮準(CNS.)甲Ί梘fS(210x297公釐) ^01330 A6 B6 五、發明説明(9 ) 於DN A中包括至少一個可篩選棵誌基因用以轉形宿主菌 株也是必要的。此有助於已纳有轉形DH A之有櫬體選擇及 分離之用。標誌基因提供一®表現型特徴,此侏宿主未有 的•如恢復產生特異胺基酸之能力,而未轉形宿主於特異 胺基酸生合成路徑中有缺陷或對抗生素之耐性等。可選用 之可選擇的標誌基因實例包括:HIS4基因及ARG4某因,來 自巴斯德畢赤酵母及釀酒酵母,來自釀酒酵母的轉化_基 因(SUC2),及來自大腸桿菌可置換單元Τη60Ί或Τη903之 G418康徽素抗性基因。 若第一可嵌入DN Α片段不含有可調控匾,則一個缠當的 調控區必須操作性鍵结地嵌'入结構基因,以提供一個可操 作之表現匣。類似地•若在嵌人位置無3’终结序列以完全 表現匣,則3’終结序列必須操作性鏈结至欲嵌入之结構基 因上。 十分重要的一點是於基因體上發生整合之位置,對於宿 主细胞不可有有害作用◊十分驚訝地發現,重姐體表現構 體於巴斯德畢赤酵母酸性磷酸P基因區域中(PH01)之整合 對畢赤酵母宿主並無害,且使重姐體序列有穩定的整合作 用。於PJLQ1區域上之直接整合,可使用重组體表現載體中 鄰接巴斯德畢赤酵母PH01某因之5’及3’序列(也稱之為第 一及第二可嵌入之DNAH段)來完成。 進一步的發琨是篩選經轉形细胞之方法,K利用瓦解 P..H.Q. 1區來鑑定整合有表現載體序列之细胞。其?M1M因巳 瓦解之细胞,顯示酸性磷酸酶酵素活性附随之喪失。顧示 -11- 本紙值尺度遠用中KS家準(CNS)f4境fS(21〇x297公货) ^01330Α6Β6 五、發明説明(10 ) EJULL瓦解之Pho-基因型,其篩選可先將细胞塗佈在低磷酸 鹽指示盤上,令集落生長一夜。其PH01基因瓦解之集落為 白色•而具完整PHQ1基因者$綠色。此呈色篩選提供一個 偵测细胞之快速且容易的方法•其中轚合的表現匣正確地 使在PH01區域中。 巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID H0:1)之部份 限制輿圆示於圖1。此基因已由表1所提供之核苷酸序列進 一步特性化。 本發明也提出含有巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶5’調控匾 (SEQ ID N0:2),訊號序列(SEQ ID N0:3),结構基因 (5已(110 1<0:4)及3’轉錄終1^序列(5£(110»«0:5)之新穎 DNA片段。 下表示出巴斯德畢赤酵母酸性璘酸酶基因(SEQ ID N0:1)之序列及其片段。 衣 1 請 先 Μ讀 背 之 注意 事〜 項 再 寫 本 頁 装 SEQ TD ΚΟ:1:
濟郎小央標工消'►,=合作ft.M'-l.'lK Ββ»ΗΙ ·390 -370 -350 OGATCCCTArrOTTACmTOCrrAACATTCCAATATTCrrCAACGOTTAATTGATTAAC -330 -310 -290 ACTOTAACCTCTGCCCATaTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCrnCTArnCTCCCA -270 -250 -230 AAATAGTTAATCTATGAOACATGTCCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 ^ -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCrTTATTCACCTCTTCCTCCATTCGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTCTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 " -70 -50 TGGCCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10 IQ ACrrcTACAACCACCAATAAGTCTTrCAACGCATCAGACATGrrTTCTCCTATTCTAAGT HttiPh^^erTrolleLeuSer -12 夂紙怅尺度通用中BS家你孕(CNS)甲4規格(210乂297公釐) 線 201330 A6B6 五、發明説明(11 ) 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCAC LeuGlul lcl leLeuAlaLeuAlaThrLeuGInSerValPheAlaVe 1GluLouGlniiis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHlaLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGly1leAlaAlaG lu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuHetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrProSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysI^uLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AapValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGInAspTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACr»AGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGInG luThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla A50 470 490 TTCGAmTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspPheG lyThrThrLeuArgGluArgTyrG lulllsLeu l leAsnAsnSerGluG lu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpA laGlySerGlnGluArgValValAspAanAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGA^TCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaG InGlyPheMetLysSerAsnTy rThrVa lHetValG luValValAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAanTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHla 1 leTyrLysAspG lyAspLeuG lyAsnAspl leAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAanThrLeuS^rProGlyPheAanlleThrAlaAapAsplleProThrlleAlaLeu -13- 本纸伕又度这用中HS家樣iMCNS)T4規格(210\297公梦) (請先£"背&-之注音"項再塡寫本頁) •装· .線. 1:01330
五、發明説明(12 ) 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTG^TCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyP;; ^w ^uLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsa 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrHeGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTrAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC 'AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG G in 11eG inPheGinTh rSerPheLysSerThrGlu1leVaIProMetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LauThrGluAcgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAapLeu 1M0 1430 1450 TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA SerEnd
1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BamHI GTTCAATGGATCC -14- 本纸張尺度適用中a S家橒芈(CNS >甲4規格(210 X 297公釐) 請 先 聞 讀 背 Si - 之 注 意事, 項 再 填 本 页 装 訂 線 ^01330 ^01330
五、發明說明(13 ) 衣 2 _5 t tijj j j: la»_ SEQ ID NO:2:
BamHI -390 -370 -350
GGATCCCTATTGTTACTTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290
ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230
AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGAAGTCTTC -210 <1.90 -170
fTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGfTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110
TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG -90 -70 -50
TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA -30 -10
ACtTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGAC a 3 SEQ ID NO:3: 10 ATGTTTTCTCCTATTCTAAGT PHOl 序列 ι HetPheSerProIleLeuSer 30 50 CTGGAAATTATTCTCGCTTTqpCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCG LttuGlu1 leileLeuAleLeuAlAThrLeuGInSerValPheAla -15- 201330 A6B6 五、發明説明(14 ) 表 4 妝性磷的!·韵 沾梢I,tw SEQ ID NO:4: Μ濟部十央標;ιι-^Η.τ-;Λ·ίί·合作代印災 GTTGAGTTGCAGCAC ValGluLeuGlnHis 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG YalLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAapAapGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATCGGGAATTGCTGCTGAG ArgHieLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAanGlyTrpGlyHeAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlulleGluSecCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeuHetArgHisGlyGluArg 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATGCT TyrFroSerThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysLeuLeuAspAla 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTAqAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspVe IGluValProThrG lyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAapTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACCGCT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAACAATAGCGAAGAA PheAspFheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluGlu 510 〜 530 550 GGAAAGAAACTTTCTCTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAAGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAleLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTTGCTCTAGAA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValYalAlaLeuGlu 630 650 670 GAGGAGAAATCCCAGGGACTCAACTCTCTAACGGCTCGAATTTCATGTCCAAACTATAAC GluG luLysSerGlnGlyLeuAanSerLeuThrAlaArglleSerCyaProAanTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGCTCAAAGAGAAGCTGACAGA SerHls HeTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGlnArgGluAleAspArg 16- 木紙?矢尺度適用中S S家HMDS)甲4規fS(W〇x297公踅) 請 先 閱 讀 背 之 注 竞 幸* 項 再 填 寫 本 頁 裝 線 201330 A6B6 五、發明説明(15 ) 經濟郎屮央標肀场Ηχ>νί'ίτ·合作ft卬·ι,·ικ 750 770 790 TTGAACACTCTTrCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAACAATTGCCCTA LeuAsnlhrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlloAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCjsGlyPheGluLeuAsnValArsGlyGluSerSerPheCyBAspValLeuSerArg 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATrACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCAGAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleQlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLeu • 990 1010 1030 GAAAACACAGAAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC OluAenThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPh^SerPheSerHiaAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTtCACTCGGTCTTTTCAACOTGACAGATCTGCCATTAGAC AepLeuLeuG inVa lPheThrSerLeuG lyLeuPheAsnVa IThrAspLeuProLeuAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCAAATCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProHetGlyAlaArgLeu 1170 1190 1210 CTTACCGAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCyaThrValGluGlyGluGluLyaTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAanAapAlaVelPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCyaPro 1290 1310 1330 rrGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAanAspTyrValSdrAr^euG luAlaLeuAsnGluAepSerAspPheAlaGluAan 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG CysGlyValProLysAenAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAepAspLeu TCATAA SerEnd -17- 表纸張尺度適用中因S家烊準(CNS)甲4規t5(210x297公釐) {請先Μ讀背*.之注意f頊再瑱寫本页) _裝· •訂· •線. :01330A6B6 Mί'ίΐ部小央標Hl-¾H工消'i'合作it.^,^災 五、發明說明(16 ) 表 5飞,^ \Η· η ^Ί',-^ΙΙ SEP ID NO;5: 1410 1430 1450 AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGAAGAGA 1470 1490 1510 ATGCTCX1Γ1Ί i'lTGTITCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTrATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATQATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAQ BaoHI GTTCAATGGATCC 酸性磷酸酶基因,採用如下實例之方法回收自巴斯德畢 赤酵母培養•如巴斯德畢赤酵母HRRL Y-1 1 430。(巴斯德 畢赤酵母HRRL Y-1 1430於1979年1月30日,貯置在美國雇 業部北方研究室中•且自其中取用)。回收巴斯德畢赤酵 母酸性磷酸_基因(SEQ ID N0:1)大體方法是使用酸性磷 酸梅探針,如下實例中所述之低磷酸鹽(LP)探針,以篩選 巴斯德畢赤酵母DNA基因庫。可依據表1所揭示之序列篩 選或合成其他探針。探針之雜交可採用精藝者熟知之任何 適當的策略。巴斯德畢赤酵母基因庫可採用技藝中已知之 技術製備,包含 Gregg et al (1985), Mol. Cell Bio.5 , 3376 - 3385中所述之方法,但亦不限於此。 此外,可如表1-5中所定義的,藉合成適當的序列以獲 得酸性磷酸酶5’調控區(SEQ ID N0:2),訊號序列(SEQ 10^:3),结構基因(5£0 10»<0:4)及3’調控區($£(3 10- 1 8 _ (請先閲請计面之注素事項再填寫本頁) •裝· •訂· •線· 本纸伕尺度適用中S®家桴準(CNS)甲4規格(210x297公釐) ^01330 A6 B6 五、發明説明(17 ) NO :5),可使用巳知之酵素或化學方法。逋當的方法包括 下列但亦不限於此:即以瞵酸三酯,亞》(酸酯,或氰基乙 基胺基磷酸酯化學為基礎之化學步驟。 精藝者應也可確認,本發明分離的巴斯德畢赤酵母酸性 璘酸_5'調控區(SEQ ID K0:2),訊號序列(SEQ ID N0:3),结構基因(SEQ ID N0:4)及3’轉錄終結序列(SEQ ID H0:5),與接下來分離之巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶 5’調控區,訊號序列,结構基因*及3’轉錄終结序列比較 •可含有一偭極微小之核苷酸差異,係由於可能發生的選 殖變異或定序誤差所致。 也可進行巴斯德畢赤酵i酸性磷酸酶5’調控匾(SEQ ID N0:2),訊號序列(SEQ ID N0:3>*结構基因(SEQ ID N0:4)及3’轉錄終结序列(SEQ ID N0:5)之處理修飾,如添 加連接子DNA ·或進行突變作用(如M13突變作用)Μ提供 或除去限制位置等。 一旦回收巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶基因,其可於真核 或原核的質體一宿主系統中保持或複製,如PBR 32 2保持於 大腸桿菌中,或於技β中已知之任何其他迪當的系统中。 精S者可確認,許多額外的DNA序列也可纳入所應用之 載體中,如细菌之質體DNA,各種標誌基因,噬菌體DNA, 自動複製序列,及中心fiSDNA ,只指出一些代表性實例。 酸性磷酸海5·調控區(SEQ ID N0:2)含於DNA片段中*其 如圖1及表2所示的,由一 399核苷酸伸展至0核苷酸。此片 段當操作性鏈结且定位在異質DN A序列(其指導合成至少一 -19- 木纸張尺度適用中SS家樣iMCNS)f 4規fS(210x297公;S·) (請先閱讀背态之注竞事項再填寫本頁) 幺· .打· .線· A6 B6 201330 五、發明説明< 18) (請先閱讀卄&-之注意麥項再填寫本頁) 個多肽 > 之5·嫌I時,可達成DNA至RNA之轉錄作用。 欲利用此處所掲示之酸性磷酸酶5’調控區(SEQ ID N0:2),圖1及表2所述之片段可搡作性鏈结至縝碼至少一 個多肽之異質DNA序列上。針對本案目的•異霣DHA序列為 不會於宿主中自然生成之DHA序列的姐合,或與該調控區 有闞者。編碣至少一涸多肽,且可與酸性磷酸梅5’調控區 (SEQ ID N0 :2>操作性鐽结;逋當的異質DNA序列包括姐 嫌血纖維蛋白酶原活化劑,人類血清白蛋白,及轉化酶等 *但亦不限於此。本案所使用之異質DN A序列可含一儷5 · ATG起始密碼子,一個3’停止密碼子,且可額外地包括可 作用穩定mRHA*或指令聚腺V化作用之核苷酸序列。 .訂. 酸性磷酸酶5'調控區(SEQ ID N0:2)操作性鏈结至異霣 DNA序列之姐合,可嵌入班當的載體中。許多酵母載體一 宿主姐合是可能的,且精蕤者已知的。也可存在有額外的 序列,如標誌基因或其他使載«可擴大生長且於佃菌或酵 母中快速增殖之序列。 可Μ含有酸性磷酸酶5’調控區之載艄所轉形之逋當的宿 主细胞包括酵母,如來自酵母軀、舉赤酵母羼及漢遜酵母 屬者,較好是畢赤酵母靥,更好是巴斯德畢赤酵母。 含有酸性璘酸_5’調控區(SEQ ID Η0:2)之載體•對逋 當宿主妞胞之轉形作用,可採用精藝者已知之任何轉形技 術° 酸性磷酸醐5'調控區(SEQ ID Ν0:2)可由培餐基中磷酸 鹽之濃度來控制。特言之,此調控區因低的矽隣酸鹽濃度 才、纸烺又度過用中SS家沣毕(CNS)甲4規格Γ2丨0父297公釐) 01330 01330 經濟部屮央標个ΑΗ工消';'合作代印" A6 B6 五、發明説明(19) 而遏止。因此· 5’調控區由變化培養基中所存在之磷酸馥 濃度而調控。 酸性磷酸酶訊號序列(5£(310»0:3)含於0“片段中,如 围1及表3所示,由1號核苷酸伸展至約66號核苷酸。為利 用此處所揭示之酸性瞵酸酶訊號序列(SEQ ID N0: 3),圓 1及表3所述之片段可搡作性鍵结至煽碼至少一個多肽之異 質DN A序列上。適當的異質DN A序列包括下列但亦不限於此 :姐嫌血嫌維蛋白梅原活化劑,人類血清白蛋白,及轉化 酶。 酸性磷酸酶訊號序列(SEQ ID N0:3)操作性鍵结至異質 DHA序列之姐合,可再鏈结至逋當的啟動基因。合宜地, 所應用的啟動基因可為與領導序列有鼷者。此外*可Μ其 他異質啟動基因*其可用於轉錄之調控者·來取代自然生 成之EJLILL放動基因。適當的異質放動基因實例有巴斯德畢 赤酵母乙酵氧化酶(Α0Χ1)啟動基因(或5’調控區),其揭示 於美國專利案第4,808,537 ,其在此列為參考文辭。 適當的載體,其中可嵌入含有酸性璘酸酶訊號序列 (SEQ ID Ν0 : 3>之DNA序列,可如上述般獲得。此外* Μ含 有指導合成訊號序列之DN Α片段之所生成的載賭可轉形之 適當宿主细胞包括酵母,如得自酵母羼、畢赤酵母屬,漢 遜酵母屬者* Μ巴斯德畢赤酵母為最佳。埴些宿主细胞之 轉形作用可Μ精S者热知之任何逋當方法完成。操作性鐽 结至蛋白質之訊號序列,其為這些載體1宿主系之一所產 生,可指令該蛋白質自宿主细胞中之分泌。 -21 - 木紙張尺度適用中阀阈家烊iMCNS)f4境格(210x297公*) (請先閱讀背V®-之注意麥項再填寫本頁) •装· .綠. ^01330 A6 B6 五、發明説明< 20 ) 酸性璘酸_结構基因(SEQ ID N0:4)含於DNA片段中,由 67號核苷酸伸展至1407號核苷酸,如圖1及表4所示。酸性 磷酸酶结檐基因(SEQ ID H0:4)可利用於重姐體生物技術 中·係基於以下各種目的包括:用Μ進行瓦解的同質重 姐作用之DN Α構體(嵌入異質DNA序列至巴斯梅畢赤酵母基 因體之酸性磷酸酶區,因此瓦解酸性磷酸酶基因活性), 及(b)產製該磷酸_蛋白質* Μ用於各種生物分析。 酸性磷酸酶3’轉錄终结序列(SEQ ID Ν0:5)當操作性鍵 结至DNA序列(其可指導合成多肽之產製)之3’嫌|,可终結 nRNA之轉錄作用,或穗定bRNA。此酸性磷酸_3’轉錄终結 序列(5£0 10»10:5)含於0“>|段中,如圖1及表5所示的由 140 8號核苷酸伸展至約1594號核苷酸。酸性磷酸_3’轉錄 终结序列(SEQ ID N0:5)可操作性鐽结至一段異質DNA序列 (其指導合成一段多肽)·且用來終结酵母中之·|{ Η A轉錄作 用或穩定之,如得自酵母鼷,漢埵酵母羼及畢赤酵母羼, 但Μ巴斯德畢赤酵母尤為逋合。 提供Κ下非限制性實例,Μ進一步說明本發明之實行。 實例 菌株 Μ下菌株已用於這些實例中: 巴斯德畢赤酵母ΚΜ71 (Α0Χ1 . his4) 巴斯德畢赤酵母 GS115 (his4) NRRL Y-15851 巴斯德畢赤酵母 GS190 (a「g4> NRRL Y-18014 巴斯德畢赤酵母GS247 (Ade-) -22- (請先閲讀背畆之注竞事項再填寫本頁) _装· .線. ^01330 A6 B6 五、發明説明(21 ) 巴斯德畢赤酵母KM71:GS102 (Mut_) 巴斯德畢赤酵母GS115:GS102 (Mut*) 巴斯德畢赤酵母MD100-20 (h is4. Ade~) 巴斯德畢赤酵母 MB102-26 (pho_, h i s 4 . ade-) 巴斯德畢赤酵母MB102-28 巴斯德畢赤酵母MB102-51 巴斯德畢赤酵母KM71:pPSU216 (Muf) 巴斯德畢赤酵母GS115:pPSU216 (Hut*)
大腸桿菌 JM103 δ (lac pro) thi rpsl (strA) supE end A sbcB hsdR 蝴嫌黑色素瘤tPA遇度表現细胞株,ATCC# CRL9607 (人 類黑色素痼细胞)可得自美鼷檷準菌種收集所。巴斯德畢 赤酵母 GS115及 GS190, MNRRL Y-15851及 Y-18014 名稱分 別於1984年8月31日及1985年10月17日貯置於美國雇業部 北方研究賁驗室。其可由其中取得。 培巷基•摁渐液及浓麻 應用於Μ下實例中之培養基,媛街液及溶液具有下示之 姐成: 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事* 再 瑱 寫 本 頁 装 Μ濟部屮央標工消^合作代印欠 lp掊蕃某(飪atifeaM 生物素 泛酸鈣 葉酸 菸鹼酸 對位胺基苯甲酸 2微克/升 400微克/升 2微克/升 400微克/升 2微克/升 -23- 線 201330 A6 B6
五、發明説明(22 ) 吡哆酵鹽酸鹽 400微克/升 核黃素 200微克/升 硫胺素-HC1 400撤克/升 硼酸 500微克/升 碕酸铜 40微克/升 碘化鉀 100微克/升 氛化鐵 200微克/升 硫酸鎂 400微克/升 硫酸鋅 400微克/升 肌醇 2奄克/升 鉬酸納 200微克/升 硫酸銨 5 克/升 磷酸鉀 300奄克/升 氯化鉀 1 . 5克/升 氛化納 1.7 mH 氛化鈣 0.68nM 硫酸鎂 4.2 mM TR偁渐液 Tris-HCl « cH 8.0 10 mM EDTA 1 mH SSPK Π X) NaC 1 180 mM Na3P〇4 * [M 7.7 10 mM EDTA 1 bH (請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁) .蛑· *訂. .線. -24-本纸張尺度边用中H a家榡準(cNS)甲4規格(210X297公釐) ,01330 五、發明説明(23) SSC (IX) NaC 1 檸樺酸納 锊眙瓦溶液ΠΧ) F i c ο 1 1 聚乙烯吡咯啶酮 牛血清白蛋白 150 bM 15 mM 200麾克/升 200毫克/升 200亳克/升 A6 B6
LiCl Tris-HCl EDTA EilL 酚 氛仿 異戊酵 QJL 氯仿 異戊酵 I. P指乐艇 1升 Μ;ίΐ部屮央桴';11^9工消';'合作代卬^ 100 ·Μ 出 7.4 100 ·Μ 0.1 bM 500奄升/升 480奄升/升 20奄升/升 960毫升/升 40奄升/升 1 X L P培養基 22.5mM擰樺酸出 4 . 8 20克右旋糖 60毫克5 -溴,4 -氯,-3 (Sigma) 25 克 Noble瓊脂(Difco) 吲哚基磷酸發 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .裴· .訂. •線· 25- 木纸伕尺度適/?;中國Η家樣準(CNS)甲4規烙(210 X297公贷) ,01330 A6 B6 五、發明説明(24 ) SCK級渐液 9.1克山梨酵 1.47克檸檬酸納 0.168 克 EDTA 以 HC1/50 b1 至出 5.8 dH20並高壓滅菌 YNR怯着某 6.75克酵母氮基無胺基酸 (DIFC0)於1升永中
奮例T D|.P24之嫌箱 為了分離及鑑定巴斯德畢赤酵母之酸性磷酸酶基因 (SEQ ID N0:1),進行以下食驗。巴斯德畢赤酵母GS115 URRL Y-1 5851)培養於高磷酸鹽(HP)環境[含無胺基酸之 酵母氮基(DIFC0)* 2%右旋糖,及20毫克/升姐胺酸]及低 璘酸鹽(LP)環埦[含LP培養基,2%右旋糖,及20奄克/升 姐胺酸],各自有300«升總«積。细胞使成圏塊* M10奄 升REB洗一次,並再懸浮於4«升REB並置30奄升Corex試 管中。再加8克玻璃珠及4奄升PCI 。懸浮液於渦旋混合器 中Μ高速混合,8次各20秒*在各混合之間於冰中冷卻20 秒。懸浮液再KlO.OOOXg離心10分鐘。水(上)層Κ4奄 升PCI及4毫升CI萃取二次。RNAK0.1倍«積的3M醋酸鉀· 出 5.2及2.5倍體積的乙醇於-20*C沈澱自水相。如 Haniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual)所述,JWLiCl 取代 HaCl篩堪出 Poly A* RNA。也依 Maniatis所述,利用2微克各型式poly A* RNA合成LP或 -26- 本纸张尺度適用中SS家樣準(CNS)甲4規f5(2ll)x297公釐) (請先Μ讀背**之注意Ϋ-項再瑱寫本贾) .装· •訂· •線· 1 201330 A6 B6 五、發明説明(25) HP «RNA-經標記之cDNA探針。 Μ 60奄微克於YEP13之烴純化的巴斯德畢赤酵母質《匣 [Broach et al., Gene: 8121 (1979)]來轉形大腸桿菌 MC1061 (Mandel and Higa, 1970, J. Hoi. Biol. 53:154)。可生成約8,000儸集落。集落複製於雙重的硝化 纖維»膜上,於含有100微克/毫升氨苄甯撇素及170微克 /奄升氛嫌素的LB盤上擴大,Μ檷準第略溶解 (Grunstein and Wallis, 1979, Methods in Enzynology 68, 379 - 389),於 80*C 下烘乾 90 分鐘,且各 別的·滅膜與LP或HP cDNA探針雜交。雜交之進行可使用 2X SSPE,IX登哈瓦溶液,0.2 %硫酸十二酯納(SDS)及 2.5xlOB cpB/奄升雜交溶液之經檷記cDNA探針。雑交於 55 υ,25奄升總體積中進行40小時。雑交後,《膜於2X SSC,0.1%SDS室溫下 2次;0.2Χ SSC、0.1%SDS,65 t: 下2次·再乾煉及曝於x射堞底片下。 鑑定出24個基因體純系,其與LP cDNA探針雜交強於與 HP cDNA探針,且因此是含有可煽碼酸性磷酸_基因之嵌 入子之可能的候選者。這24個純糸如前般M LP及HP探針再 篩選,其中有14個纯系與LP cDHA探針之雑交更強烈。自 這14個純系中分別分離出質體DNA,以EcoRI水解,以瓊脂 糖凝膠電泳分離,吸瀆於雙重的硝化纖維濾膜上,各個滤 膜再與LP或HP cDN A於如前之相同條件下雜交。4次分別鈍 系中之基因片段,可強烈地與LP cDNA探針雜交,而極弱 或幾乎不與HP cDNA探針雜交。這些片段再MEocRI + 木紙張尺度適用中a S家烊準(CNS)甲4規格(210 X 297公鳌) (請先Μ讀背面"之注意表邛再填寫本页) •装· •打· •線· A6 B6 201330 五、發明説明(26 )
Hindi 'EocRI +SalI * 及 EcoRI +BamHI 雙重水解定 出限制興困,並與LP cDN A探針再次雑交。編碼未相關磷 酸蘧一調控基因片段之片段,以其限制興醑上之差異來決 定0 K此步软鑑定,為編碼LP-調控基因之匾域再姐代堪殖 至 PUC8或 PUC19中(Hew England Biolabs>。生成之質體 Μ 缺口位移法標上32P (Man i at is)。烴標記之探針可用來探 测LP及HP RHA之RHA吸憒物(5微克/吸潰物)。在原先24個 纯系中有1俚鑑知為PLP24,被選出以進一步研究。 富俐1Γ DIP2411之饞箱 由實例I產生的質體PLP24 *且被認為含有巴斯德畢赤 酵母酸性磷酸酶基因(SEQ ID N0:1)或其片段,以下列方 式進一步鑑定。10微克的pLP24 MEcoRI /Sail水解,再 凝膠純化2. 1 kb之片段。 10微克的 PYM25 (NRRL B-18015) MSphI /Sail 水解, 且凝膠鈍化3.1 kb之片段。NRRL B-18015係貯置於美國雇 業部北方研究實驗室,於198 5年10月17日,且可自其中取 用。5微克的 pUC19,MEcoRI /Sail 水解,PCI 萃取,CI 萃取,再EtOH沈澱。100奄微克EcoRI /Ball 線化的 PUC19,與 200奄微克 pLP24的 2.1 kb EcoRI/Sall Η 段及 450毫微克ρΥΜ25 3.1 kb SphI /Sail片段,W3份連接法 連接於20微升的連接煖衝液+1 mM ATP + 1單位T4 DNA連接 酶中。轉形於大腸桿菌MC1061,再以2.1 kb EcoRI / -28- (請先聞靖背私之注意条項再瑱寫本頁) •裝· 經濟部屮央櫺:11-而Μ工消';'合(>:汰卬% ^01330 五、發明説明(27) A6 B6 經濟部屮央標;|1-勾,-=:工消'^合作^卬'|,|&
Sail片段及3.1 kb SphI /Sail片段之存在鑑定正確的 質體。正確的質體命名為PLP2411。 窗俐H PLP2412 ΡΗΠ1— 瓦解戧 «之雄箱,及 Π5Π90:ι>1.Ρ2/Π?.夕琎 I 衍生自質體PLP24之質體pLP2 411(見實例I ),WXbal水 解,Μ克林諾DNA聚合IS處理Μ產生平齊端,再與來自 ΡΥΜ2 5的2.1 kb Hpal片段連接。此片段含有釀酒酵母 ARG4基因(質體pYM25可MNRRL B-18015取得)。生成的質 體命名為PLP2412。PLP2412再MEcoRI及BanHI水解。分 雛出3.3 kb片段*用來轉形於巴斯德畢赤酵母GS190 (MRRL Y-18014)以生成Ar*g +原質營養性(轉形步驟述於實 例IV)。精胺酸原質營養性以其於不具精胺酸培養基中之 生長能力來鑑知。其分離並於LP指示培養盤上篩選Μ證實 酸性磷酸_之存在。集落重覆塗佈至LP指示培餐盤,並令 其於30 υ下培養一夜。生長於LP指示培養盤上之集落可為 綠色印1101)或白色&^1)。白色集落為含有3.3 1(1)來自上 述表現匣之轉形细胞,其於巴斯德畢赤酵母基因賭之 ΡΗ0—1區域上瓦解而潘定地整合。 來自穗定Arg +菌株之基因賴DNA ,以菌子吸瀆濾膜雜交 法分析,Κ決定表規匣之位置。含有釀酒酵母ARG 4基因的 3.3 kb EcoRI -BamHI片段,已特具地整合及瓦解基因體 序列,其類<WpLP2411中所含之DNA片段,證實此區域指導 合成酸性磷酸I® (PH01)。此轉形细胞命名為GS190: 29- 木纸》尺度適用中园S家焓;MCNS) f ·)規ts(2丨0 X 297公釐) 請 先 閱 讀 背 面- i 事· 再 寫 页 装 打 線 ^01330 A6 B6 五、發明説明(28 ) PLP2412 ° 請 先 聞 a I i 事· 項 再 填 寫 本 頁
苷俐IV R浙檐軎嵌強&之麵形作用 使用Μ下策略於巴斯德畢赤酵母之轉形作用。 酵母细胞接種於約10奄升YPD培養基•並於30t:下震通 培養16 - 20小時。细胞再稀釋ΜΑβ〇〇約0.01-0.1,且於 30C之YPD培養基中保持於對數期。100毫升YPD培養基中 接種Μ 0. 5奄升Αβ〇〇約0· 1之種子培養物,並於301C下震 盪培養約16 - 20小時。於培養物Αβοο約0.2-0.3(約16-20小時後)Μ離心回收,利用DAMON IEC DPR-6000於 1500 g下離心5分鐘。 訂 欲製備原生質球狀體,畑胞M10毫升無菌水洗一次(於 每次洗後如上述地離心〉· Μ 10毫升新鲜製備的SE0洗一次 ,Κ10奄升無菌下1Μ山梨酵洗一次,再懸浮於5奄升SCE緩 衝溶液,加入5微升4毫克/奪升Zyaolyase 60,000 (可得 自Miles Laboratories),且细胞於30TC!培育約30分。 *1汧郎屮.*:桴-;11-局行工消^合作汰印災 線 球狀體之形成偵測如下。一份1〇〇撖升的细胞加至900微 升5% SDS及900微升1M山梨酵中•此於Zyuolyase加入之 前或之後,及於培育中各個不同時間。於细胞可於SDS中 溶解但非於山梨酵之時間點時停止培育。一巨形成,球狀 SfMlO毫升無菌的山梨酵洗一次,係於1,00〇 s下離心δ-ίΟ 分鐘 ,以 10 奄升 無菌的 CaS 洗一次 (離心 ), 再 懸浮於 0.6奄升 CaS。 為確實的轉形作用,加於水或TE煖衝液中之DNA樣品( 30- 本纸帒尺度適/»!中Η國家样準(CNS)甲4規格(210x297公釐) £、 01330 A6 B6 五、發明説明(29 ) 多至20微升之總體稹)至12x75«米的_菌聚丙烯試管中 。(於少量DHA時,利用1微升5毫克/奄升音波霣盪的大腸 桿菌於每一樣品中可發生最大的轉形作用)。100撖升球狀 體加至每一 DNA樣品,並於室溫下培甭約20分。1毫升PEG 溶液加至每一樣品,並於室溫下培育約15分。樣品以 l,〇〇〇g離心5-10分•上清液丟棄。團塊懸浮於150微升 SDS中,並於室溫下培育30分,。加850微升無菌的1M山梨 酵至各涸,樣品再如下述地塗佈。 於轉形樣品準備好前至少30分鐘,毎培着盤上倒入10奄 升再生瓊脂(Regenerate on Agar)。毎份10奄升之再生壤 脂也分E於管中再置45 - 501C浴中,此係轉形樣品於SDS 中之期間。有加樣品至管中,倒入有固體瓊脂底雇之培養 盤上,再於30 υ下培菏3 - 5天。 如下般,於各儸點上決定球狀體之量。移出10微升樣品 ,並加9 90微升1Μ山梨酵Μ稀釋100Χ。移出1〇微升稀釋液 ,再加9 90微升1Μ山梨酵。二種稀釋液均取1〇〇微升塗在 YPD瓊脂培養基以決定留於製備中成球狀體之全细胞濃度 。各種稀釋液取100微升加至10奄升再生瓊脂•其已添加 有40微克/毫升宿主所需的全部的胺基酸,Κ決定全部可 再生之球狀體。轉形實驗之數值為毎毫升1-3χ107總可再 生球狀體體,及約lx 103全细胞/毫升。 窨例V 酵扭DNA脚借 W下策略用來製備巴斯德畢赤酵母DNA。 _ 3 1 _ 本纸伕尺度適用中國國家H'MCNS)甲·!規格(210X297公釐) {請先«請背面之注意事\?再填寫本頁) •裝· • J^:: ·< •線· A6 B6 ‘二 01330 五、發明説明(30 ) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
酵母细胞培養於100毫升加有2%右旋糖之YNB培養基中 ,於301下直到Αβοο為1 - 2,再利用Damon DPR-6000離心 機於2,000 g,5分鐘下離心使成團塊。團塊於dH20中洗一 次,SED中洗一次,1M山梨酵中一次,再懇浮於5奄升 0.1M Tris-Cl pH 7.0及1M山梨酵之溶液中。细胞再與 50-100微升 4毫克 /毫升 Zyuolyase 60,000(Miles Lab.)溶 液混合,並共置301下1小畤。生成之球狀體再M l,000g 離心5-10分鐘,並懸浮於5奄升溶解嫒衝液中[0.1%SDS ,10·Μ Tris - Cl (pH 7.4),5·Μ EDTA及 50inM NaCl]。蛋 白_【(Boehringer Mannhei臟)及 RNase A (Sigaa)各自加 至100微克/毫升,且溶液於37t:下共置30分鐘。DHA之去 蛋白質是將製劑與等體稹的CI緩和地混合*再Μ 12,000g 離心20分Μ分相。上(水層)吸出置於新管中並K等體積 PCI萃取。如前述地分相,且上曆置於含有2-3倍體積冷 的100 %乙酵之管中。樣品緩緩混合,且DN Α以纗鏡在塑 膠棒上來加K收集。DHA立即溶於1奄升TE緩衝液中,並於 4t:透析100倍體積的TE煖衝液歷一夜。 g例VI
分雜命苒的ΡΗΠ1某W 欲分雔含有完整巴斯德畢赤酵母LMJJI因(SEQ ID H0:1)之質體,雜交原先於MC 1061中之巴斯德畢赤酵母基 因髁DNA庫,條件如先前所述,利用PLP24中600bp的 BamHI片段。此步驟可鑑定5個陽性鈍系。製備自這些純 系之質體DHA ,K BainH I水解,吸潰於硝化孅維滹膜上· -32- 本纸張尺度边用中阀囷家蜞孕(CNS)甲*1規格(2丨0x297公釐) A6 B6 :〇V挪 五、發明説明(31 ) 再Μ相同的600 bp探針雜交。5儸纯糸中每一®均具有 2.0 kb之BaaHI片段,其中含巴斯德畢赤酵母PH01基因。 選出其中一個純系進一步分析,且命名為PLP2420。
PLP2420 2.0 kb之BanHI片段的·定序,係將限制_水解 之片段坩代選殖至M13中(可得自New England Biolabs)再 Μ標準的二去氧法定序。序列的分析顯示在2.0 kb之 BamHI片段中完全含有468涸胺基酸之開放讀譯架構。 當例W MB102-26:d1.PP4 3 0-T1» HR102-PR:dI.P24 3Q-T.1> S8S PLP2420含EJULUS因之2.0 kb之BamH I片段*連接至 PYM8之BamH I位置,pYM8是含有醸酒酵母HIS4基因及 PBR322序列之質體。[pYM8之製備如下:10微克的pYA2 (”1^8-15874)以5口》11/1^31水解,且3.4|{1)之片段再 凝膠純化之。10微克的pBR322MSphI / Nrul水解,且 3.95 kb Η段Μ凝膠純化。NRRL B-15874貯置於美國雇業 部北方研究實驗室,於1984年8月31日,可自其中取得。 100毫微克3.95 kb的PBR322片段與250奄微克3.4 kb的 PYA2片段於標準條件下連接。在3.1 kb Xhol /SphI片段 基礎上鑑定正確的質體,並稱之為pYM8]。生成的質體命 名為PLP2430 ,且可勝任於巴斯德畢赤酵母中自動地複製 ,此係由於存在於釀酒酵母HIS4基因序列中存在的意外 ARS功能(自動複製序列)所致。 一種不具酸性磷酸酶活性之巴斯德畢赤酵母菌株(見實 例IK )-GS190:pLP2412(ph〇-),與巴斯德畢赤酵母株 木纸伐尺;1適用中a S家桴iMCNS) f 4規格(210Χ297公釐) (請先閱讀背面之注意t項再填艿本頁) •装· 經濟部t央標Η工消';'合作汰印災 •線· A6 B6 五、發明説明(32 ) MD1 00-20 (h i s 4 . Ade_)交配。交配策略與美國專利案第 4,812,405中所掲示的相同·其已列為本案參考。 MD100-20株之發展如下:巴斯德畢赤酵母株GS115 <h_Ls_4) NRRL Y-15851佃胞與 GS247 (Ade-)细胞混合,所 採用之條件係巳知可促進分子形成及二倍體化之條件(此 策略見於美國専利案第4,812,405號,且巳列本案參考) ’並塗佈在YNB +右旋糖培養盤上以選擇原質營養的二倍體 。二倍體株稱之為MD100。MD100培養條件已知為可誘使巴 斯德畢赤酵母二倍體芽胞形成(也揭示於美_專利案第 4,812,405號),且穿胞子代培養在YNB右旋糖+腺苷+ 姐胺酸培養盤上。俚別集落於無腺苷或姐肢酸添加之下試 驗其生長能力。將在無姐胺酸添加下可生長,但無腺苷下 無法生長之菌株鑑定出來,且稱為MD100-20。 由此交配中之二倍體株一 MB102 (PhoVPho' HTS4 / hJ_s4, Ade VAdi勹長出穿胞(美國專利第4,8 12,405號) 生成單倍體子代。這些子代於LP指示培餐盤及YNB右旋糖 培養盤上篩選,加或不加姐胺酸或腺苷,K分離出 HB102-26 (Pho-, h i s 4 , A d e _)。 MB 102-26株W質體PLP2430轉形,如實例IV中所述。
His +轉形细胞於LP指示培養盤上選擇並篩壤酸性磷酸酶之 表現(見實例1B)。對酸性磷酸酶表現而言,有5個轉形佃 胞為陽性。 這些轉形细胞中2個,MB102-26:pLP2430-T1及 MB 102-26:pLP2430-T3 ,分析藺於酸性磷酸酶表現之逋當 -34- 本纸伕尺度適用中西S家沣準(CNS)甲4.t|fS(2l0x297公釐) 請先聞讀计面之注意事Jfi再填寫本頁) ί •裝· .線. ^01330 A6 B6 五、發明説明(33) 調控。每一株培養於HP或LP培養基中歷24小時,至Αβββ為 2.0 。每一培養中之细胞分析其酸性磷酸酶活性 (Bostian et al. 1980; Proc. Natl. Acad. Sci. 77:4504-4508)與帶有Pho_表現型之未纆轉形的HIS4油胞 (MB102-28),及帶有Pho*野生型表現型之ULSJJffl胞 (MB102-51)比較(表I )。PLP2430轉形细胞誘導之水平實 質上與野生型菌株相同。因此*含有PH01基因嵌入 PLP2430之2.0 kb BaaiHI片段,含有完整的酸性磷酸K编 碼區,Μ及足供酸性磷酸_遘當的磷酸鹽調控表現之序列
表· I Μ 株_ 站因型 iyi \>l Al'ιΐΐ \:Γ (ij 1½ KB102-26:pLP2430-Tl Ade t HIS4f PH01 707 30»244 43 HB102-26:pLP2430-T3 ade t HIS4· PH01 852 28,198 33 H3102-51 Ad« , UIS4f PH01 61.4 1,975 32 仙102-28 HISAf phol 0.02 0.03 1·
奮例VB 鏞化瞄之分泌 {t濟郎屮央標f^H工消"合作^·''" (請先聞讀计面之注意^-項再填寫本頁) 此實例說明EJiiUL訊號序列(SEQ ID H0:3)當操作性鏈结 至異質基因時之功能。含有釀酒酵母S(JC2基因之2.2 kb SBal-PvuI 之片段分離自 PSEYC306 [Johnson et al., Cell 48, 875 (1987)]並選殖至 PA0810或 PPSV218 之 ajml位置上(見實例XI及XI ,瞄於這些親代質體之描述 木% 尺度適用中國S家榫準(a S)甲4規格(2丨0 X 2 9 7公#) ^01330 A6 B6 經濟部屮央標';11-砀52:工消.>,=合作汰卬^ 五、發明説明(34) )。此步應分別生成質MpAPINVI及PAPINV2。這些應用巴 斯德畢赤酵母A0X1故動基因來調控PH01訊號序列中_放$ 譯架構<SEQ ID H0:3)至ΙΙϋΙϋέ構基因上之轉錄作用: ΡΗΠ1序抓 …GTGTTCGCT 变白DSP.Yf:30fi:^ _结;库羽I CGA GAA TCC CCC GGG GAT CCG TCG ACC TGC AGC CCA GCT TTG SHf!2席利 ACA AAC GAA… 各10微克的質體PAPINV1或PAPINV2· KBgll 水解•並 如實例IV般轉形於G S115。含有p A P IN V1 片段之轉形 细胞*命名為GS115:pAPINV1 ,進行姐胺酸原質營養性之 選擇*有篩選Mut_表現型,其說明於mjjs域上正確的整 合作用及瓦解。Mu t睇選係將含有葡萄糖培養基上之集落 重覆塗佈至含甲酵之培養基,再於甲酵上評估生長速率。 於甲酵上之緩慢生長顯示出Mut_表現型。具有pAPIN V2 B_g_LI片段之轉形细胞命名為GS115:pAPINV2,也進行姐胺 酸原質營養之篩選,但求Phol-表現型,其表示於PH01區 域中正確的整合作用及瓦解(見寊例11 )。 鑑定出各種類之轉形细胞,並培養於YNB+ 2%甘油中, 與巴斯德畢赤酵母株KM71:GS102(Mut_>及GS115:GS102 (Mut,比較,其含有與pAPIN VI相同的經整合之質體,除 了 SiLi:2基因含其天然的訊號序列•而不具有PH01訊號序列 -36- 本纸任尺度適用中國Η家焓準(CNS)甲)規格(210x297公釐) (請先聞讀背面•之注意參項再瑱寫本页) •裝· 訂· -線. ^〇133〇 A6 B6 五、發明説明(35 ) ,此二株述於EP 256 ,421號中。同時培養的有 KM71:pPSV216(Mut_)及 GS115:pPSV216 二株,其含 有與PAPIHV2相同之經整合的霣體,除了不具有SHC2序列 之外。 每一培養物培養於YNB + 2%甘油中•直到Αβ °。約3.0為 Μ濟部屮央標':1,-而9χ"·'ίτ·合作汴印災
止。除去各樣 中一份 ,以無菌水洗滌, 再懸浮於10奄升 YHB + 0. 596 ΗβΟΗψ 。 Mut +培養物於Αβ°° =0.02時懸浮,J 培養至A 000 =〇 .2,於3〇υ下生長24小時至Αβ〜約為0.3- 0.4。於 此時* 取約1 .0 mODe 分析其轉化_活性。结果 示於表B 〇 訊號 分泌之 全部 分泌 培養物 HUT 序列 轉化_ • 轉化_ *> 效率。 G S 11 5 : - ΡΗ01 20.3 3.05 0.67 PAPIHV1 KM71 : - SUC2 12.5 18.9 0.66 GS102 KM71 : - PH01d 0 0 NA PPSV216 GS115 : + PH01 6.1 6.7 0.91 PAPINV2 GS115 : + SUC2 5.3 5.7 0.93 GS102 GS115 : ♦ PH01d 0 0 NA -37- 衣贫張尺度適用中國Η家焓準(CNS)甲很格(2丨以观公梦) (請先W讀背如之注意_項再填艿本頁) •装· •線. ^01330 ^01330 經浒郎屮央標工-νί',τ·合仃ί.ί,Μ'ΐ A6 B6 五、發明説明(36 ) PPSV216 a -分泌之轉化酶一 Μ每Goldstein and Lanpen。來偵測 ,無Triton,Μ所分析培養物之Αβ<><>下轉化梅的單位 表示。1單位=每分鐘,30 下釋出之1微莫耳葡萄 糖。 b -全部轉K_-M0.2%Triton X-100存在下偵测。 c-分泌效率一所分析之全部轉化酶下分泌之轉化梅。 d -存在有PH01序列,無SUC2序列 0 - Goldstein and Lanpen, Methods in Enzymolology 42 : 504-51 1 , 1975 〇 结果明白地顯示,PHOI訊號序列功能效率如SCU2訊號序 列*可促進转化酶自巴斯德畢赤酵母中之分泌。
窗例IX tPA (姐嫌咖嫌雒番白睢鹿法仆割)之分泌 此實例說明EJULL訊號序列(SEQ ID N0:3)當揲作性鍵结 至異質基因時之作用。 1 . tP A-塭碥 分》
Bowes黑色素tPA-過表現细胞株,ATCC# CRL9607 ,為 構築cDN A庫所用之RNA來源。此细胞株為他人用來選殖 tPA序列(Pennica et al., Nature 301:214 1983;
Ed1und et a 1. , PNAS 80:349, 1983; Lemontt et al·. DNA 4:419, 1985)。分離 Poly A+ RNA ,並 M 寡 dT指引, 通常是依循Maniatis之方法(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ; Cold Spring Harbor Laboratry. (請先聞請背分之注意矿項再填寫本页) .¾. •打. 經濟部屮央ίέ';(1-^工消介合作^印匁 〇01330 五、發明説明(3*7) 1982)»RNA利用商品化之cDNA選殖套姐(可購自 Anershan)來製成cDHA·並嵌人Agtll堪殖載8S中。含有 嵌入子之Agtll噬菌體•利用商品化的包裝琨合物(可購 自Stratagene)感染至大腸桿菌宿主Y1088。 基因匣重覆二次塗佈,並Μ三棰不同的寡核苷酸探測之 ,此三種寡核苷酸設計自已發表的人類tP A cDN Α序列 (Pennica et al.,上文)。相當於cDNA5·段,中段及3·段 之寡核苷酸具如下的序列。 3,探針:5’ GAC TGG ATT CGT GAC AAC ATG CGA CCG TGA 3’中段探針:5’ TCA CAG TAC TCC CAC GTC AGC CTG CGG TTC 3' 5'探針:5· GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT GAT TGC T 3 ' 鑑定出可與三個探針均雜交的5個噬菌斑。這些純系嵌 入子之限制_水解物,Μ已發表的限制_型式為基礎鑑知 其編碼有tPA (Pennica et al.,上文 >。純糸相異只在於 5’未编碼序列存在之程度。4及5號纯系挑出Μ進一步特性 化,因其經EcoR I水解後含有0.8 kb (5’端)· 0.47 kb (中 段)及1.3 kb(3’端)之DH A嵌入子,推测存在有全長的 t-PA编碼序列。純糸4之Bgl I片段再堪代選殖至烴Ba»H I 切割之PUC18中*且連接物轉形至大腸桿菌MC1061细胞中 。KEcoRI水解鑑定陽性轉形细胞。以420 bp、624 bp、 760 bp及2.7 kb片段之PstI 限制型式鑑定出於有意識方 位上帶有嵌人子之純系,並稱之為PUC18# 3。M420 bp、 6 24 bp及3.46 kb之PstI限制型式鑑定出於抗意識方位上 -39- 表纸ft尺度適用中Η因家槔爭(CNS)甲4規格(21 〇 X 297公釐) (請先閲請背面之注老事項再填寫本頁) _裝· -線· -01330 A6 B6 五、發明説明(38 ) f請先聞讀背釕之注意事項再填商本頁) 帶有嵌人子之纯系,並稱之為PUC18# 2。褲入子由成热 tPA第一儸胺基酸前2届核苷酸處編碥·至3’未編碼序列 的第1972位核苷酸。 齡腰澧貉(PHOlss-tPA-pUC) PUC18*2中之tPA嵌入子選殖至巴斯德畢赤酵母表現霣 體PA0810中。質體PA0810含有巴斯德畢赤酵母A0X1放動基 因,巴斯德畢赤酵母PH0JLM號序列* AQX1轉錄作用終结子 ,巴斯德畢赤HIS4基因(供篩選用),fl之複製源,及於細 菌中複製及篩選所必要的序列。PA0810之構築述於實例 XI ° 2微克pUC18# 2的1600 bpSall /Seal片段,先前已於 1 %瓊脂糖凝膠上純化,編碣tP A之5 ’部份,連接至300奄 微克經Xhol / Smal水解的PA0 810。連接混合物轉形至大 腸桿菌MC1061畑胞,並選出ampR集落。M Pst I 水解後的 420 bp、620 bp、2 kb及6.3 kb型式鑑定陽性者。生成之 戧體稱為pTI 。進行位置指令之突變作用,依循載體的升 複製源標準步驟* Μ刪去热tPA绲碼序列5’之額外核苷酸 。突變作用之寡核苷酸序列如下: 5' CAA TCT GTC TTC GCT TCT TAC CAA GTG ATC 3 ' 正確質體由Sail / Sbal水解少量製劑而篩選鑑定。原先 的載SIpTI具有1.2,2.3及616 kb之限制型式。經正確突 變的質體具1.2及9.8kb之型式,且稱之為pT2-3。 50 微克的 pUC18# 3MSnaI /Sau3A 水解。介於 72 及 118 bp間的三個帶<75* 90及110 bp)編碼tPA之3'部份,其於 -40- 木纸伕尺度適用中Η闻家桴準(C N S >甲4規烙(210父297公釐) A6 B6 c〇l*33〇 五、發明説明(39 ) 8 %聚丙烯醃胺凝膠上純化,並連接至0.5微克經Smal / BamH I切割之質體PT2 - 3上。連接產物轉形至大腰桿菌 MC1061细胞,並選出ampR集落。MPvuE / Apal水解少量 製劑來鑑知皤性者。正確的質體呈現421 bp片段(不正確 者呈現225 bp片段)。正確的霣載«稱之為pT37。由5’突 變作用顯示為正確的序列,然而定序顧示質體於tPA 3’未 煸碼序列末端接有pUC 18序列;霣體PT37示出具有來自 口11(:18的53113冉片段*位置在1894- 2004處,緊接以卜?冉序 列。 10微克的質體PT37 MS tul水解,並用來轉形於巴斯德 畢赤酵母株KM71 (aoxl,h i S:4)。M姐胺酸原«營養性來選 出轉形细胞。一個轉形细胞,ΚΜ71 : ρΤ37,培養於ΥΝΒ + 2%甘油上,與之相比的是ΚΜ71:ρΤ7,其含有一個質體 (ΡΤ7)幾乎與ρΤ37相同,除了 ΡΗ01訊號序列更換以天然的 人類tPA訊號序列,且移出3 ’端之pUC18序列。ρΤ7之說明 示於下。50奄升的各株培養物生長於ΥΝΒ + 2%甘油中,再 接種至1升醱酵槽內並以連續方式或批次方式生長。此實 驗之结果示於表Β中。 一請先聞讀背^之注意穸邛再填寫本頁) •裝· •訂· 表 微克/孙 行次ff 菌株 訊號 方式 內部 外脚 全部 效率* 1 KM71 :pT7 tPA 連續 255 60 315 .19 2 KM71:pT7 tPA 批次 651 30 681 • 04 3 ΚΜ71:ρΤ37 FH01 埋續 840 420 1260 .33 •線. -41 - 本竦诀尺度適用中國國家«孕(CNS) f 4境格(·210X297公梦) Α6 Β6 i〇l33〇 五 經濟郎屮央桴Ηι-ί? H工消';'合,l·:it^,^ 發明説明(4〇 ) (請先Μ讀背面之注意r項再琪寫本頁) 4 KM71 :pT37 PH01 批次 1856 1200 3056 .39
* 以ELISA進行tPA分析,M人類tPA為檷準品 M tPA分泌效率二外側tPA/埋tPA 此實驗结果顧示,不論醱酵方式,P101訊號序列(SEQ ID N0: 3)於促進巴斯德畢赤酵母tPA分泌上較天然的訊 號序列更有效率。 此外,微最一愛德曼降解分析證實利用PH01訊號序列 (SEQ ID K0:3)分泌自KM71:pT3之重姐«tPA之胺基末端 胺基酸序列,與得自培養的人類姐嫌(黑色索®)來源之天 然的經純化tPA相同。 3 . dT7之澧结(t.PAqs-t.PA-fe pUC) ’訂· 來自pUC18# 3,5微克約100 bp的Snal /Sau3A片段·與 500毫微克經Smal /BamHI切割的PTI連接。連接反應轉形 至大腸桿菌MCI 061细胞*並選出ampR集落。由36 0 bp帶之 存在鑑知陽性者•而非760 bp帶,此係MApal / Pvul水 解後所得。定序烴修飾的3’端,顯示是正確的序列,並無 多餘的PUC18序列。此質體稱之為PT49。 將編碼真正t-PA訊號序列之寡核苷酸加至質jB ρΤ49之 Xbal位置上,再進行2個突變反應:1)刪除留於t-PA訊號 序列及指導合成成热t-P A序列間,8個額外的核苷酸:及 2 )刪除PH01訊號序列。這些操作完成如下。 合成以下序列之寡核苷酸(109個核苷酸):
5' CTA GAT GGA TGC AAT GAA GAG AGG GCT CTG CTG TGT GCT GCT GCT GTG TGG AGC AGT CTT CGT TTC GCC -42- 本《•张尺度適用中HS家俘iMCiiS)甲4規恪(210父297公釐) Α6 Β6 五、發明説明(41) CAG CCA GGA AAT CCA TGC CCG ATT CAG AAG AGG AGC CAG A3' 合成第二胺所需的互補寡核苷酸,分別為長33,37及39個 核苷酸之寡核苷酸*其具下列序列·· 5,CTG GCT GGG CGA AAC GAA GAC TGC TCC ACA CAG 3 * 5' CTA GTC TGG CTC CTC TTC TGA ATC GGG CAT GGA TTT C 3' 5' CAG CAG CCA ACA GCA GAG CCC TCT CTT CAT TGC ATC CAT 3' 全長的寡核苷酸及三涸互補寡核聲酸激酶化•再於沸水浴 中加熱3分鐘,之後緩慢冷 '卻至室溫。自5 %聚丙烯醣胺 凝膠上分離出經回冷之寡核《酸。 200奄微克MXbal部份水解而線化的pT49 »與1微克烴 回冷的雙股寡核苷酸埋接。連接反應轉形至大臈桿菌 MC 1061细胞,再選擇amp R集落。含有正確變化之質體的纯 系M Asu I水解後額外的700 bp帶而鑑知。正確的質體稱 為 PT544 ° Μ標準的fl為基礎之位置指令突變作用完成第一次突變 作用,利用pT544 DNA (5微克)及具下序列之寡核苷酸( 1微克)·· Μ濟部屮央!ιέ';ι1-^Π工消竹合作沐印災 (請先Μ讀背*-之注意r項再填駕本頁) 5’ GA TTC AGA GGA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3 * M Bgin水解來篩選正確的質體。正確的限制型式(1.1, 2.8及5.3 kb)顯示正確的質體,其稱為pT6 4 (不正確的質 -43-本纸伕尺度迖用中S S家烊準(CNS)甲4規格(210x297公#) A6 B6 五、發明説明(42 ) 賭則具有2.8及6.3 kb帶之型式)。 第二輪的突變作用以質體PT64來進行,Μ刪去PHQ1.訊號 序列。使用具以下序列之寡核苷酸: 5, GA TTC AGA GA GCC AGA TCT TAC CAA GTG ATC TGC AG 3 '
3微克的ρΤ6 4及0.4微克上述寡核苷酸用於突變中。Κ Bgin水解來篩選微量製劑。正確的質體Μ三段1,2.8及 5.3 kb之DNA片段來鑑知(不正確的質體具1.1 kb最小帶取 代1 kb)。以定序來證實突變,且正確的質體稱為PT7。 g ffll X DAPR101:PHH1故勖某W-laSZ宪琨S腰夕纔箱 此實例說明EJULL啟動基因(或5’調控區)(SEQ ID H0:2> 當揲作性鐽结至異質基因之功能。1微克含有lacZ之質艏 PSA0H5 (NRRL B-15862) WEcoRI 及 BamHI 水解,並自 0.8%瓊脂糖凝膠中分離10.1 kb之載體片段。5微克的 PLP2420以EcoR I及Bell水解,並自1 %瓊脂糖凝膠上分 離 1.6 kb 之片段,其含有 375 bp 的 PBR322 DNA· -1075 kb之已HiLL 5 ·鄰接DNA (包含LULiLL放動基因,即SEQ ID N0:2)及 123 bP 的 PH01 姐碼序列。1 0 0 微克 P S A 0 Η 5 之 Eco R I - B c 1 I 片段,及 6 0 奄微克 1 . 6 k b 的 p L P 2 4 2 0 E c o R I -Bell片段,連接於20微升之連接酶緩衝溶液混合物中, 内含有IbM ATP及1單位的T4 DNA連接_ (可得自
Boehringer Mannhein)。連接混合物轉形至大腸桿菌 JH103,經轉形的细胞再塗佈於LB Αβρ培餐盤上,其中並 -44- 本紙iS:尺度迖用中Η國家浮準(CNS)甲.1境烙(2丨0 X 297公釐)
(請先Μ讀背*-之注意t項再瑱寫本育) A6 B6 五、發明説明(43 ) 含有40微克/毫升的X-gal。選出藍色集落,生長於LB Amp上,再分離質體DNA。DNAJWEcoRI及Snal水解,正確 的質體M1450 kb片段之釋出而鑑知。正確旳霣體稱為 pAPBIOI。一铒表現匣,其包括大腸桿菌lacl基因並於巴 斯德畢赤酵母EJJLL啟動基因要件(SEQ ID N0:3)之調控之 下,係含於pAPBIOI中。 10微克未切割之pAPBIOI轉形至GS115球形體中*再選出 \ 姐胺酸原質營養株。選擇12涸His +集落*菌株培養於液體 高磷酸鹽(HP)及LP培養基中,並分析/9 -半乳糖苷_活性 。以於LP培養基中生長後/3 -半乳糖苷_表現,以及HP培 養基中生長後/8 -半乳糖之缺乏為基礎,鑑定出陽性 轉形畑胞株。如 J . Η . Μ Π 1 e r , E X p e r i e n t s i η Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Labs, Cold Spring Harbor, NY 1972所述來分析/9-半乳糖苷酶。藍 色集落出現在LP-X-gal盤上,且白色集落出現在 HP-X-ga 1盤上。
啻例XT 構築以下質體,用於本案其他實例中。 1.曾之權箱 經濟部屮央標^而肖工消^合作杜印% (請先閱讀背*之注老事項再瑱寫本页) 線· M13mpl9ARI之構築是以EcoRI水解1微克的M13mpl9, Μ克林諾(Klenow)充填且經充填的片段本身互相連接,連 接產物轉形於大腸桿菌JM103细胞,正確的噬菌賭由分雜 出之DNA K EcoR I水解而鑑知。正確的噬菌體不以EcoR I 分割,並稱為M13bp19ARI。質SlpA0810(其構築述於W0 -45- 本紙伕尺度这用中as家桴準(CNS)T4規β(210χ297公釐) ^,01330 A6 B6 五、發明説明(44) 89/04320,在此列為參考文辭)以SstI及EcoRV水解,且 逋當的1.2 kb片段自0.8%瓊脂糖凝膠中分離(此構體中的 所有片段均分離自0.8-1. 0%瓊脂糖凝膠)。1〇〇奄微克片 段與500奄微克經SstI及Snal水解之M13mP19ARI連接 。連接產物轉形於大腸桿菌JH103细胞•且正確的噬菌體 由分離出的DNA MSstI及Pvul水解而鑑知。正確的噬菌 體有950 bp片段之存在,且稱為pPSVIOl。 1微微莫耳PPSV101接受活體外寡核苷酸指令之位置特異 的突變作用,使用20微微莫耳具下序列之寡核苷酸: 5' CGA GGA ATT CCC CGG GAT CCT TAG ACT T 3 ' 反應混合物用來轉形大腸桿菌JM103佃胞。正確的噬菌體 由撤量製備的DNA烴Bgll及BaaHI水解而鑑知,顯示有 1.4 kb及0.5 kb DNA片段之存在。正確的噬菌體稱為 PPSV102 〇 質體pPSV102MEcoRI水解,且500 奄撤克的8.5kb片 段再與50毫微克Μ下的雙股合成DN A片段連接,此段指導 合成巴斯德畢赤酵母PH01訊號序列(SEQ ID N0:3) *並採 用K最佳的巴斯德畢赤酵母密碼子:
5'-AATTC ATG TTC TCT CCA ATT TTG TCC TTG GAA ATT ATT TTA GCT TTG GCT ACT 3'-G TAC AAG AGA GGT TAA AAC AGG AAC CTT TAA TAA AAT CGA AAC CGA TGA TTG CAA TCT GTC TTC GCT CGA G-3' AAC GTT AGA CAG AAG CGA GCT C TTAA-5' -46- 本纸伕尺度逍用中HS家蜞本(CNS)甲·U3JS(21〇x297公釐) (請先閑讀背面之注意举項再瑱寫本頁) .裝· .訂. .線. A6 B6 五、發明説明) 連接棍合物轉形至大腸桿菌CJ236细胞,且正確的噬菌體 DN A由噬菌斑與酵母訊號序列的一儸纗碼股雜交而鑑知, 後者已用32P標記,並MSstI及BanHI水解已雑交之DHA 可顯示一個700 bp片段。此質體稱為PPSV103。 1微微莫耳PPSV103以20微微奠耳具下序列之寡核苷酸衍 活體外突變作用: 5' CTAA TTA TTC GAA ACG ATG TTC TCT CCA ATT 3 ' 正確的噬菌9IDNA K噬菌斑與上示之相同寡核苷酸雜交而 鑑知。正確的質體稱為pPSV 104。 質體PA0810之製備是10微克的PPSV104以Hindi水解, 再自1.2 %瓊脂糖凝膠上分離出400 bp DNA片段。50奄微 克此片段與250毫微克PA0807 7.9 kb之Hindi水解產物連 接,(其製備述於下,且分鐮自0.8 %瓊脂糖凝膠)。連接 混合物轉形至大腸桿菌MCI 061细胞,並選出aapR第落。正 確的質經BamHI及EcoRV水解後,45 0 bp帶之存在而 鑑知,且稱為PA0810。 ? . DAn«07,牛成 k f1-ori DNA之製備 經濟部t央標';11-局:0:工消"合作,1卬災 {請先閲讀背面之注老家項再填寫本頁) f 1噬菌體D N A (5 0微克)W 5 0單位的R s a I及D r a I水解( 依廠商之指示>以釋出〜45 8 59,含有£1複製源(0「1)之 DNA片段。水解混合物K等體積的PCI萃取*水相再M等 體積的CI萃取,最後水相中的DNA調整NaCl塘度至0.2Μ且 加2.5倍體積的絕對乙酵Μ沈溅出來。含混合物靜置於冰 中(4C)10分鐘,DNA沈溅物再以10,00 xg於微量離心機中 -47- 本紙張尺度適用中H S家桴爭(C N S)甲4規f 3 (LM 0 X 29 7公:¾) ^01330 A6 B6 五、發明説明(47) (請先閱讀背、面之注专7事項再填寫本頁) (4TC )離心30分鐘而收集。 DN A團塊以70%乙酵水浴液洗2次。經洗過之團塊真空乾 堍,並浴於25微升TE煖衝液中。此DNA於1.5%瓊脂糖凝腰 上電泳,且含有〜4 58 bp fl-ori片段的凝膠部份切出,凝 膠中之DNA«泳溶離至DE81(VhatBan)M上,再自膜溶離至 1M NaCl中。DNA溶液如上述般沈澱,且DNA沈澱物溶於25 微升TE緩衝液中(f Ι-or ί片段)。 殖 f 1 - 〇 r i 至 ρ B R 3 2 2 的 Uni 位置: PBR322(2微克)以2單位的Hnl部份水解(依廠商的指示 )。反應MPCI萃取而中止,再如上驟詳述地沈澱DNA 。DHA圑塊溶於20微升TE煖备液中。約〗00奄微克此DNA 與100奄微克fl-ori片段U步驟)於20微升連接媛衝液中 連接,係加1單位T4 DNA連接酶於141C下共置一夜。連接 作用藉70¾下加熱10分鐘而中止。再用來轉形於大腸桿菌 株JM103中,Μ得含有fl-〇ri選殖至PBR322 DjuI位置 (3232號及3251號之核苷酸)之pBRfl-ori。 PA0807之生成: pBRi^-oriUO微克)於37¾下,W各10單位的PstI及 Ndel水解4小時。經水解的DNA以PCI萃取,沈澱且再溶於 25微升TE緩衝液中,如上1步驟中所詳述的。此物質於 1.2 %瓊脂糖凝膠上電泳,再分離出含有fl-〇ri的Hie_I -PstI片段(約0.8 kb),並如上_^步驟詳述地溶於20微 升TE媛衝液中。此DNA約100毫微克與100毫微克的PA0804 混合,後者已先用Pst I及Nde I水解並經磷酸_處理過。 -48- 本紙張尺度適用中S因家樣準(CNS)甲4規格(210x297公釐) A6 B6 〇〇V33〇 五、發明説明(47 ) (請先閲讀背面之注音$項再填寫本页) PA0804之說明可見W089/04320。此混合物埋接於20微升連 接緩衝液中,係與1單位的T4 DNA連接_於14X3下共置一 夜。連接反應藉於70 υ下加熱10分鐘而中止。此DNA用來 轉形於大腸桿菌JM103 * Μ得到ΡΑ0807。 g例X ff dPSV21 8夕嫌箱 200毫微克的 pLP2420 1.6kb EcoRI/BclI 片段,100毫 微克0.8 kb的pPG2.5 Bgll/Hind丨片段(見下文說明), 以及 100奄微克 2.6 kb的 pUC8 EcoR I /HindJI 片段(New England Biolabs, Inc)。以三部份連接於20微升連接缓 衝液中,並加入IbM ATP及ί單位T4 DNA連接_,再轉形至 大腸桿菌 MC1061,Μ 篩選 AmpR 株。[質 ISpPG2.5 及 PPG4.0 (MRR1 B-15868) 2.5kb的 EcoRI -Sail 片段;置於 PBR322中,其含有乙酵氧化酶啟動基因]。分析抗性株中 之質體,其含2.4 1{1)的£<;〇卩1+114(1111片段;正確的質體 稱為PPSV201。50毫微克pPSV201MBanHI水解*去磷酸化 •再與50倍莫耳濃度過量的下序列寡核脊酸連接。 5'-GATCAGATCT-3 ' .線 其轉換BjuilH I位置至Bgll 位置。在此基礎上鑑定陽性鈍 糸,且質體稱為PPSV203。10奄微克的PPSV203以有限量的 Hindi部份水解,再以克林諾平端化。線狀全長之質體片 段以凝膠純化,再於100微升賭積中自我連接。正確的純 糸在質體DNA含有1350 kb的Bg丨E /Hindi片段之基礎上鑑 知,且稱為PPSV210。 -49- 冬紙55:尺_度边用中as家揉準(CNS)iM規怙(210x297公釐) ^,01330 ^,01330 Μ濟部t央標^:工消^合作杜印^ A6 B6 五、發明説明(48 ) 60 奄傲克 PLP2420 500 bp 的 Bgll-BamHI 片段,與 100 奄微克經BamHI水解之pUC8逋接。正確的質體在422 kb Ncol -BamHI片段基礎上鑑知;生成的質體稱為PPSV202 。50奄微克的pPS»202 MBanHI水解*去》酸化,再與 50倍舆耳澹度遇Μ之下序列寡核苷酸埋接: 5,-GATCAGATCT-3, 其轉換BamHI位置至Bgll位置。正確的質體在422 bp Ncol /BglE片段基礎上鑑知,且稱為PPSV204。 10微克的PPSV210以BglE及SacI水解,再將700 bp之 片段凝膠純化。此片段取25奄微克與100毫微克經凝膠純 化的PA0810,8200 bp Bglfi / SacI片段連接。正確的霣 體由700 bp之Bgll/Sacl片段之存在而鑑知,且稱為 PPSV212。10 微克 PPSV212WSphI 水解· MT4 DNA 聚合 _ (如Maniatis et al>平端化,KBglll部份水解,再將 8 000 bp片段予Μ凝膠純化。10微克的PPSV204 MNcoI水 解| Μ克林諾平端化,MBg II水解,再凝膠純化出400 bp之片段。100奄微克上述PPSV212之8 kb片段,與15奄微 克來自PPSV204的44 0 bp片段連接。正確的質體M5500 bp之Bgll片段基礎而鑑知,並稱為pPSV218。 上文提出之賁例僅供說明本發明之實行,並不因此而限 制本發明範圍或其所附之申請專利範圍。只要不偏離本發 明本質及精神,合理的變化及修飾均是專利欲保護且應保 護之範圍內的。 序列表 -50- 水紙?尺度遄用中西S家樣準(CNS)甲4¾格(210><297公货) (請先M讀背-面之注f項再瑱寫本頁) -装· .線. ^01330 五、發明説明(49 ) ⑴一般資料 A6 B6 Μ濟部屮央標';1,-场朽工消';'合作:^印災 (i )申請人·· Richard G. Buckholz (ii)標題:巴斯德畢赤酵母酸性璘酸酶基因 (iii )序列數目:5 (iv )相闞地址: (A)地址:RICHMOND, PHILLIPS, HITCHC00K & UMPHLETT ©街:P. 0. Box 2443 Ο市:Bartlesville O 州:OK . (E) 國家:美國 (F) ZIP : 74005 (v )電腦可判譲型式: (A)介質型式:diskette ⑭電腦:IBM PC 〇 操作系统:PL-D0S/MS-D0S O 1¾ ϋ : Display Write 4 (vi )目前申請資料: (A)申請媚號:07/627,539 (0立檔日期:1 9 9 0年1 2月1 4日 〇分類 (vfii )律師/事務所資料 (A)名稱:Jack E. Phillips ©註冊號:19 , 903 51 - 木纸张尺度適用中Η國家梂準(CNS) f 4規格(210 X297公釐) (請先閱讀卄_面之注奋?事邛再瑱寫本頁) •裝· .訂. ^01330 A6 B6 五、發明説明< 5〇 ) Ο參考/編輯數目:32427 (ix )®訊資料 (A)霣話:1-918-661-0520 々)SEQ ID H0:1之資料 (i )序列特性 ㈧長度:1994 bp ©型式:核酸 Ο股性:單股 Ο拓摸學:線型 (ii.)分子型式:基因M DNA (χί)序列說明:SEQ ID Ν0:1 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT CCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATCTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC ΙβΟ TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTO 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTCCAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TCGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 300 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC ATG TTT TCT CCT ATT CTA 417
Mat Phe Ser Pro lie Leu -20 ACT CTC GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG GTT 468
Ser Leu Clu lie 11a Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser V&l Phe Ala Vdl •15 -10 -5 \ GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC CAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 519
Glu Leu Gin Hia Vdl Leu Gly Val Asn Aap Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 -52 (請先閲讀背•面之注意事項再瑱窵本頁) •装· ^•01330A6B6 五、發明説明(51) (請先M讀背·面之注兔?項再俱寫本頁) GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT C 3 GGA GGC TTG GGC CCC TAC ATC 570 Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg His Leu Gly Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA.ATT GAA TCC TGT ACG 621
Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser 61u lie Glu Ser Cys Thr
AO 4S SO ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 672 lie Aap Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GGT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 723 Asn Val Gly Lys Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 774 Val Glu Val Pro Thr Gly Pro Leu Ser Phe Fhe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 • J_iT:: GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 825 Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lys Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 876 Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ATA AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 927 His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 1A0 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAC TTT GCT CAA GGA TTT ATG 978 Ser Gin Glu Arg Val Va1 Aap Aan Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170 -53- 本紙後尺度適m中a S家桴iM c N S)甲4規恪(210 X 2 9 7公楚) A6B6 五、發明説明(52 ) (請先閲讀背·面之注意事項再填商本頁) ΛΑΑ TCT AAC TAG ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 1029 Lys Ser Asn Tyr Thr Val Het Val Glu Val ;1 ^ Leu Glu Glu Glu Ly3 175 180 185 TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 1080 Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Aan Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 1131 Ser His lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Aan Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 1182 Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 1233 lie Pro Thr lie Ala.Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 • J^:: TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 1284 Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC AAT GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 1335 Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Aan Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT^CC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 1386 Lya Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 1437 Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 本纸张尺度適用中SH家浮準(CNS)f 4規格(2丨0x297公釐) 一 五、發明説明(53) A6B6 經濟部屮央標;|,-^^工消';'合作^卬" ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT K88 Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Aan Val Thr Asp 325 330 335 ' 340 . · . » . CTG CCA TTA GAC CAG ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTG ;AAA TCT ACC GAA ATA 1539 Leu Pro Leu Aap Gin lie Gin Phe Gin Thr S,er Phe Lys Ser Thr Glu lie 345 350 355, GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1590 Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cya Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 1641 Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Aap Ala Val Phe Pro 375 380 。 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1692 Leu Ser Asp Cya Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Aap Tyr 395 A00 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1743 Val Ser Arg Leu Glu Ala Lou Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cys 410 415 420 425 GGA GTT CCT AAA AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 179A Gly Val Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 A35 440 GAC TTG TCA TAAAAATGGT AAGGAATGTT TTGCATCAGA TACGAGTTCA AAACGATTAA 1853 Asp Lea Ser 445 GAAGAGAATG CTCTTTTTTT TGTTTCTATC CAATTGGACT ATTTTCGTTT ATTTTAAATA 1913 GCGTACAACT TTAACTAGAT GATATCTTCT TCTTCAAACG ATACCACTTC TCTCATACTA 1973 -5 5 本纸張尺度適用中國國家拎準(CNS)甲4tttS(210x297公釐) (請先閱讀背面之注童事項再填寫本頁) .裝· •訂· .¾. A6 B6 枚濟部屮央標';'1-^0工消-;''合作^/,'災 五、發明説明(54 ) GGTGGAGGTT CAATGGATCC 1993 ⑵SEQ ID HO : 2之資料 (i )序列特性 (A> 長度:400 bp ©型式:核酸 Ο股性:單股 〇拓撰學:線型 (ii )分子型式:基因體DNA (xi)序列說明:SEQ ID H0:2 GGATCCCTAT TGTTACTTTT GCTTAACATT CCAATATTCT TCAACGGTTA ATTGATTAAC 60 ACTGTAACCT CTGCCCATGT GCTTCATCCA AATCTGGTAA TCTGCTTTCT ATTTCTGCCA 120 AAATAGTTAA TCTATGAGAC ATGTGCCCTC AATTGCGCAG TAGATCGAGT GGAAGTCTTC 180 TTTGCGTAAC ACTCAAAGTA TATCCCTGTT AGTCTTTATT CACCTGTTGC TGCATTGGTG 240 TCAGTTACCA TTATTGTTTC CACTTGGAAA AGCTTGTTTT TTTTTGATAG CACAGAAACG 300 TGGGCTCCGA TAAGCTAAAC TTCAACGAGA ATATAAAAGC TGAAAAGATT CTTGTCAAGA 360 ACTTGTACAA CGACCAATAA GTCTTTCAAG GCATCAGAC 399 ⑵SEQ ID H0:3之資料 (i )序列特性(A)長度:66 bp - -56- (請先聞讀背必之注^^項再填寫本頁) •裝· •訂· .線 木紙伕尺度適用中西阈家你準(CNS)甲4規格(2丨〇乂297公發) 201330 A6 B6 五、發明説明(55) ©>型式:核酸 Ο股性:單股 〇拓捵學:線型 (ii )分子型式:基因體DNA (xi)序列說明:SEQ ID N0:3 ATG TTT TCT CCT ATT CTA 18 Met Pha Ser Pro lie Leu -20 AGT CTG GAA ATT ATT CTC GCT TTG GCT ACT CTC CAA TCA GTC TTT GCG 66 Ser teu Glu lie lie Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gin Ser Val Phe Ala -15 -10 -5 ⑵SEQ ID NO :4之資料 (i )序列特性 (A)長度:1341 bp ©型式:核酸 〇股性:單股 Ο拓撲學:線型 (ii )分子型式:基因β DNA (xi)序列說明:SEQ ID Ν0:4 -57- 表紙it尺度逋用中ΗΒ家樣準(CNS>甲4規格(210x297公釐) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) .装. A6B6 五、發明説明(56 ) (請先閱讀^面之注意事項再填寫本頁) GTT 3 Val
GAG TTG CAG CAC GTT CTT GGA GTC AAC GAC AGA CCC TAT CCT CAG AGG ACA 5A
Glu Leu Gin Hia Val Leu Gly Val Asn Asp Arg Pro Tyr Pro Gin Arg Thr 5 10 15 GAT GAT CAG TAC AAC ATT CTG AGA CAT CTG GGA GGC TTG GGC CCC TAG ATC 105
Asp Asp Gin Tyr Asn lie Leu Arg Hia Leu Giy Gly Leu Gly Pro Tyr lie 20 25 30 35 GGT TAC AAT GGA TGG GGA ATT GCT GCT GAG TCT GAA ATT GAA TCO TGT ACG 156
Gly Tyr Asn Gly Trp Gly lie Ala Ala Glu Ser Glu lie Glu Ser Cya Thr AO. 45 50 ATT GAT CAG GCT CAT CTG TTG ATG AGA CAT GGA GAA AGA TAC CCA AGT ACC 207 lie Asp Gin Ala His Leu Leu Met Arg His Gly Glu Arg Tyr Pro Ser Thr 55 60 65 AAT GTG GGG AAA CAA CTA GAA GCT TTG TAC CAG AAA CTA CTA GAT GCT GAT 258
Asn Val Gly Lya Gin Leu Glu Ala Leu Tyr Gin Lys Leu Leu Asp Ala Asp 70 75 80 85 GTG GAA GTC CCT ACA GGA CCA TTG TCT TTC TTT CAA GAC TAT GAT TAC TTC 309
Val Glu Val Pro Thr Gly Prd;Leu Ser Phe Phe Gin Asp Tyr Asp Tyr Phe 90 95 100 GTC TCT GAC GCC GCT TGG TAC GAG CAA GAA ACA ACT AAG GGT TTC TAC TCG 360
Val Ser Asp Ala Ala Trp Tyr Glu Gin Glu Thr Thr Lya Gly Phe Tyr Ser 105 110 115 120 -5 8-表纸铁尺度適用中HS家樣準(CNS)甲4規格(210x297公赘) A6B6 五、發明説明(57 ) (請先閱讀背•面之注意事項再填寫本页) GGG TTA AAC ACC GCT TTC GAT TTT GGT ACC ACT TTG AGA GAA CGA TAT GAA 411
Gly Leu Asn Thr Ala Phe Asp Phe Gly Thr Thr Leu Arg Glu Arg Tyr Glu 125 130 135 CAT TTG ATA AAC AAT AGC GAA GAA GGA AAG AAA CTT TCT GTT TGG GCT GGC 462
His Leu lie Asn Asn Ser Glu Glu Gly Lys Lys Leu Ser Val Trp Ala Gly 1A0 145 150 TCT CAA GAA AGA GTT GTT GAC AAC GCA AAG TAG TTT GCT CAA GGA TTT ATG 513
Ser Gin Glu Arg Val Val Asp Asn Ala Lys Tyr Phe Ala Gin Gly Phe Met 155 160 165 170
AAA TCT AAC TAC ACC GTT ATG GTC GAA GTC GTT GCT CTA GAA GAG GAG AAA 56A
Lys Ser Asn Tyr Thr Val Met Val Glu Val Val Ala Leu Glu Glu Glu Lys 175 180 185 t TCC CAG GGA CTC AAC TCT CTA ACG GCT CGA ATT TCA TGT CCA AAC TAT AAC 615
Ser Gin Gly Leu Asn Ser Leu Thr Ala Arg lie Ser Cys Pro Asn Tyr Asn 190 195 200 205 AGC CAT ATC TAC AAA GAT GGC GAC TTG GGG AAT GAC ATT GCT CAA AGA GAA 660
Ser Hia lie Tyr Lys Asp Gly Asp Leu Gly Asn Asp lie Ala Gin Arg Glu 210 215 220 GCT GAC AGA TTG AAC ACT CTT TCT CCA GGA TTT AAC ATT ACT GCA GAT GAT 717
Ala Asp Arg Leu Asn Thr Leu Ser Pro Gly Phe Asn lie Thr Ala Asp Asp 225 230 235 •線· ATT CCA ACA ATT GCC CTA TAC TGT GGC TTT GAA CTA AAT GTA AGA GGT GAG 766 lie Pro Thr lie Ala Leu Tyr Cys Gly Phe Glu Leu Asn Val Arg Gly Glu 240 245 250 255 TCA TCC TTC TGT GAC GTC TTG TCA AGA GAG GCT CTA CTG TAC ACT GCT TAT 819
Ser Ser Phe Cys Asp Val Leu Ser Arg Glu Ala Leu Leu Tyr Thr Ala Tyr 260 265 270 -59- 本纸張尺度適用中S S家桴準(CNS)甲4規格(2丨0χ297&:?ή A6B6 五、發明説明(58 ) (請先聞讀t面之注淹事項再填寫本頁) CTT AGA GAT TTG GGA TGG TAT TAC AAT GTT GGA AAC GGG AAC CCA CTT GGA 370
Leu Arg Asp Leu Gly Trp Tyr Tyr Asn Val Gly Asn Gly Asn Pro Leu Gly 275 280 285 290 AAG ACA ATC GGC TAC GTC TAT GCC AAC GCC ACA AGA CAG CTG TTG GAA AAC 921
Lys Thr lie Gly Tyr Val Tyr Ala Asn Ala Thr Arg Gin Leu Leu Glu Asn 295 300 305 ACA GAA GCT GAT CCT AGA GAT TAT CCT TTG TAC TTT TCC TTT AGT CAT GAT 972
Thr Glu Ala Asp Pro Arg Asp Tyr Pro Leu Tyr Phe Ser Phe Ser His Asp 310 315 320 ACC GAT CTG CTT CAA GTA TTC ACT TCA CTC GGT CTT TTC AAC GTG ACA GAT 1023
Thr Asp Leu Leu Gin Val Phe Thr Ser Leu Gly Leu Phe Asn Val Thr Asp 325 330 335 340 CTG CCA TTA GAC CAG. ATT CAA TTC CAG ACC TCT TTC AAA TCT ACC GAA ATA 1074
Leu Pro Leu Asp Gin lie Gin Phe Gin Thr Ser Phe Lya Ser Thr Glu lie 345 350 355 GTT CCC ATG GGA GCA AGA TTG CTT ACC GAG AGA TTA TTG TGT ACT GTT GAA 1125
Val Pro Met Gly Ala Arg Leu Leu Thr Glu Arg Leu Leu Cys Thr Val Glu 360 365 370 GGT GAA GAA AAA TAC TAC GTT AGA ACT ATC CTC AAC GAT GCA GTC TTC CCA 117(3
Gly Glu Glu Lys Tyr Tyr Val Arg Thr lie Leu Asn Asp Ala Val Phe Pro 375 380 385 390 CTG AGT GAC TGT TCC TCT GGC CCT GGA TTC TCT TGT CCG TTG AAC GAT TAT 1227
Leu Ser Asp Cys Ser Ser Gly Pro Gly Phe Ser Cys Pro Leu Asn Asp Tyr 395 400 405 GTT TCT AGA CTT GAG GCA TTG AAC GAG GAC AGT GAC TTT GCG GAA AAC TGT 1278
Val Ser Arg Leu Glu Ala Leu Asn Glu Asp Ser Asp Phe Ala Glu Asn Cy3 410 415 A20 425 -60- 本纸張尺度適用中國國家烊準(CN'S)f 4規格(210x297公釐) 01330 A6 B6 五、發明説明(59 ) GGA GTT CCT ΑΑΛ AAT GCT TCC TAC CCA CTT GAA CTA TCA TTC TTC TGG GAT 1329 Gly Vel Pro Lys Asn Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Leu Ser Phe Phe Trp Asp 430 435 440 GAC TTG TCA TAA 1341 Asp Leu Ser 445 ⑵SEQ ID H0:5之資料 (i )序列特性 ㊇長度:187 bp (B型式:核酸 O股性:單股 Ο拓撲學:線型 (ii )分子型式:基因體DNA (X i)序列說明:SEQ ID NO : 5 AAATGGTAAG GAATCTTTTG CATCAGATAC GAGTTCAAAA CGATTAAGAA GAGAATGCTC 60 TTTTTTTTGT TTCTATCCAA TTGGACTATT TTCGTTTATT TTAAATAGCG TACAACTTTA 120 ACTAGATGAT ATCTTCTTCT TCAAACGATA CCACTTCTCT CATACTAGGT GGAGGTTCAA 130 TGGATCC 187 -61- 本纸怯尺度適用中H S家樣準(CNS)甲·!規格(2丨0 X297公釐) (請先閲讀"·面之注會事項再填寫本頁) •裝·
Claims (1)
- λ. 衣 中 六、申請專利範® 修tT柚充 A7B7C7D7 1. 一種經分離之DNA片段•其包括巴斯德畢赤酵母pastiLrls)酸性璘酸W核#酸序列,其具有如 下序列(SEQ ID NO: 1): BamHI -390 -390 -350 GGATCCCTATTGTTACTTTGCTTAACATTCCAATATTCTTCAACGGTTAATTGATTAAC -330 -310 -290 ACXGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTA^TCTGCTTTCTATTTCTGCCA: -270 -250 -230 A^^TAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCXATTGCGCAGTAGATGGAGTGGAAGTCTTC -210 -190 -170 TTTGCGTAACACTCAAAGTATATCCCTGTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCArrATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAGAAACG —90 —70 —50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGAATATAAAAGCTGAAAAGATTCTTGTCAAGA 10 STTTTCI -30 -10 ACTTGTACAACGACCAATAAGTCTTTCAAGGCATCAGACATGTTTTCTCCTATTCTAAGT MetPheSerProlleLeuSer 30 50 70 CTGGAAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCTTTGCGGTTGAGTTGCAGCAC LeuGlullelleLeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlaValGluLeuGlnHis ...................................< ..............装{請先閑讀背面之注意事項再填宵本頁) 經濟部中央搮準局印装 90 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTG ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProOlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTCGGAGGCrrGGGCCCCTACATCGGTTACAATGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHisLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGlu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAGAAAGA SerGlul leGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeu3JeuMetArgHisGlyGluArg 210 290 310 TACCCAACTACCAATC丁CCCGAAACAAC丁ACAACCTTTCTACCAGAAACTACTACATCCn TyrProSei-ThrAr;nVaaGlyLy^Clnl^?uC) uAl a^uTyrClnLysLouLcuA^pAl j 330 3S0 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTOJvGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValCluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAcpTyrAspTyrPheValSer 390 410 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTA>^CACCGCT AspAla-A.laTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGlyLeuAsnThrAla 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGAACGATATGAACATTTGATAAAC^J-.TAGCG^GA^. PheAspPheGlyl'hrThrl^uArgGluArgTyrGluKlsLeul leAsnAsnSerGluGlu 打 線 f 4(210X297 公廣) 0 8 s01 7 7 7 7 A B c D 六、申請專利範ffl 510 530 550 GGX>^GAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAG>AAGAGTTGTTGACAACGCX\AGTAC GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGlu-^rgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTC^GCATTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGXAGTCGTTGCTCTAGX?-, PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValHetValGluValValAlal^auGlu 630 650 670 GAGGAG^JkTCCCAGGGACrrOACTCTCTAACGGCTCG^TTTCATGTCC.^.CrAT^C GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAlaArglleSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGAATGACATTGtTCAAAGAG^GCTGACAGA SerHlslleTyrLysAspGlyAspLeuGlyAsnAsplleAlaGinArgGluAlaAspArg 750 770 790 TTG>^CACTCTTTCTCCAGGATTT^CATTACTGCAGATGXTATTCCA>.CX.\TTGCCCTA LeuAsnThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrlleAlaLau 經 濟 邡 中 央 搮 準 局ip 810 S30 850 TACTGTGGCTTTGXACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA S70 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspI^euGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 S50 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValT>,rAlaAsnAlaThrArgGinLeuI>eu 990 1010 1030 Gr^^CACACXAGCTGATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPhcSerPheSerHisAspThr 1050 1070 1090 GATCTGCTTCAAGTATTCACTTCACTCGGTCTTTTCAACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeuAsp X110 1130 Ncol cagattcaattccaga. jtctttcaaatctaccgaaatagttcccatgggagcaagattc GinlleCinPheGinTnrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaAr9Lau 1170 1190 1210 CTTACCCAGAGATTATTGTGTACTGTTGAAG.GTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTATC LeuThrGluArgLeuLeuCysThrValGluGlyGluGluLysTyrTyrValArgThrlle 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGiyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACTTTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPheAlaGlar.sn .1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATCACTTG CysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu K10 1430 1450 * TCATAAAAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAGXAGAGA SerEnd 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTrrTTGTTTCTATCCAAlT?GGACrrATTTTCGTTTATrrrAA-\TAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCrrCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BamHI GTTCAATGGATCC ......................................ί...............St..............................*r...........--—s..............#!. (請先KI讀背面之注意事項再滇寫本頁) 甲 4(210X297 公瀠) ,01330 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範® 2. —種經分讎之DHA片段*其包括巴斯德畢赤酵母酸性销 酸酶5,辋控區,其具有如下序列(SEQ ID 2): -390 -370 一350 CCATCCCrArrGTrACl'TTTGCrrTAACAlTCCAATATl'CnTCAACCGITAAlTCATTAAC -330 -310 -290 ACTGTAACCTCTGCCCATGTGCTTCATCCAAATCTGGTAATCTGCTTTCTATTTCTGCCA -270 -250 -230 AAATAGTTAATCTATGAGACATGTGCCCTCAATTGCGCAGTAGATCGAGTGGXAGTCITC -210 -190 -170 TTTGCGT^CACTCAAAGTATATCCCTCTTAGTCTTTATTCACCTGTTGCTGCATTGGTG -150 -130 -110 TCAGTTACCATTATTGTTTCCACTTGGAAAAGCTTGTTTTTTTTTGATAGCACAG.^.CG. -90 -70 -50 TGGGCTCCGATAAGCTAAACTTCAACGAGA>.TAT.^.J^AGCTG^AAAGATTCTTGTC;^GA -30 -10 ACTTGTACAJVCGACCAATAAGTCTTTC^GGCATCAGAC 3. 根據申請專利範園第2項之DNA片段,其中該DNA 段 烴操作連接至編碼一個多胜肽之異源DNA序列。 4. 根據申請専利範画第3項之DNA片段,其中該異源DHA 序列钃碼姐嫌血纖維蛋白溶_原(plasninogeir)活化劑 〇 5. 一種經分離之DHA片段’其包括巴斯德異赤酵母酸性 酸_訊號序列,其具有如下序列(SEQ ID N0 : 3): (請先聞讀背面之注意事項再填寫本页) 經濟部中央搮準局印¾ 甲 4(210X297 公廣) -3 - ,01330 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範® 10 ATGTT,rrcTccrAT,rcTA.*\CT PHOl signal sequence -- > MetPt'icSerProlleL^uSer 30 50 CTGGXAATTATTCTCGCTTTGGCTACTCTCCAATCAGTCT1*TGCG LeuGluXlel lebeuAlaLeuAlaThrLeuGlnSerValPheAlii 6· 根據申請專利範画第5項之DHA H段,其中該DHA片段 經揀作連接至編碣一僩多胜肽之異源DNA序列。 7. 根據申請専利範園第6項之DHA片段,其中該異源DHA 序列編碼姐嫌血繼維蛋白溶酶原活化劑。 8. —種自巴斯德畢赤酵母中分泌蛋白質之方法*其包括將 一適當宿主细胞與一通合蛋白質表現之培養基接觴,該 宿主细胞已被如申請專利範園第7項之DN A片段中之巴 斯德畢赤酵母酸性磷酸_訊號序列(SEQ ID NO : 3) ·其 經操作連接至異源蛋白質編號序列,所轉形。 9. 根據申謫專利範圏第8項之方法,其中該蛋白®是血姐 熾纖維蛋白溶酶原活化劑。 10. —種經分離之DHA片段,其包括巴斯德畢赤酵母酸性磷 酸_结構性核苷酸序列,其具有如下序列(SEQ ID NO ·· 4): ..................................-................«...............................^.......:>.....................^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本瓦) 經濟部中央橾準局印裝 甲 4(210X297 公廣) 4 7 7 7 7 A B c D 六、申請專利範明 70 GTTGAGTTGCAGCAC ValGluLeuGlnH:£ SO 110 Bell 130 GTTCTTGGAGTCAACGACAGACCCTATCCTCAGAGGACAGATGATCAGTACAACATTCTC ValLeuGlyValAsnAspArgProTyrProGlnArgThrAspAspGlnTyrAsnlleLeu 150 170 190 AGACATCTGGGAGGCTTGGGCCCCTACATCGGTTAO^TGGATGGGGAATTGCTGCTGAG ArgHi.sLeuGlyGlyLeuGlyPRoTyrlleGlyTyrAsnGlyTrpGlylleAlaAlaGLu 210 230 250 TCTGAAATTGAATCCTGTACGATTGATCAGGCTCATCTGTTGATGAGACATGGAG>^.:A SerGlulleGluSerCysThrlleAspGlnAlaHisLeuLeu>ietArgKisGlyGlu^_rc 270 290 310 TACCCAAGTACCAATGTGGGGAAACAACTAGAAGCTTTGTACCAGAAACTACTAGATC-rT TyrProSerJThrAsnValGlyLysGlnLeuGluAlaLeuTyrGlnLysI^euLeu.Asp.-J.a 330 350 370 GATGTGGAAGTCCCTACAGGACCATTGTCTTTCTTTCAAGACTATGATTACTTCGTCTCT AspValGluValProThrGlyProLeuSerPhePheGlnAspTyrAspTyirPheValuer 390 410 ~ 430 GACGCCGCTTGGTACGAGCAAGAAACAACTAAGGGTTTCTACTCGGGGTTAAACACC:-CT AspAlaAlaTrpTyrGluGlnGluThrThrLysGlyPheTyrSerGly LeuAsnThr.-.ii 450 470 490 TTCGATTTTGGTACCACTTTGAGAGXACGATATGAACATTTGATXAACAATAGCG^.:.---. PheAspPheGlyThrThrLeuArgGluArgTyrGluHlsLeulleAsnAsnSerGluC-lu 510 530 550 GGAAAGAAACTTTCTGTTTGGGCTGGCTCTCAAGAAAGAGTTGTTGACAACGCAAJ^GTAG GlyLysLysLeuSerValTrpAlaGlySerGlnGluArgValValAspAsnAlaLysTyr 570 590 610 TTTGCTCAAGGXTTTATGAAATCTAACTACACCGTTATGGTCGAAGTCGTT-GCTCTAGXA PheAlaGlnGlyPheMetLysSerAsnTyrThrValMetValGluValValAlaLeuGlu 630 650 670 gagcagaaatcccagggactcaactctctaacggctcgaatttcatgtccaaactatxac GluGluLysSerGlnGlyLeuAsnSerLeuThrAl ciArgl1eSerCysProAsnTyrAsn 690 710 730 AGCCATATCTACAAAGATGGCGACTTGGGGXATGACXTTGCTCAAAGAGAACCTGACAGA SerHl£lleTyrLysAspGlyAspLeuGlyA£nA£plleAlaGinArgGluAlaAspArg m 750 770 790 TTGAACACTCTTTCTCCAGGATTTAACATTACTGCAGATGATATTCCAAO-^ITGCCCTA Leor.snThrLeuSerProGlyPheAsnlleThrAlaAspAsplleProThrll eAlaLeu 810 830 850 TACTGTGGCTTTGAACTAAATGTAAGAGGTGAGTCATCCTTCTGTGACGTCTTGTCAAGA TyrCysGlyPheGluLeuAsnValArgGlyGluSerSerPheCysAspValLeuSerArg 經濟邡中央搮準扃印裝 {請先閱讀背面之注竞事項再瑱寫本页) •打· •綠· 870 890 910 GAGGCTCTACTGTACACTGCTTATCTTAGAGATTTGGGATGGTATTACAATGTTGGAAAC GluAlaLeuLeuTyrThrAlaTyrLeuArgAspLeuGlyTrpTyrTyrAsnValGlyAsn 930 950 970 GGGAACCCACTTGGAAAGACAATCGGCTACGTCTATGCCAACGCCACAAGACAGCTGTTG GlyAsnProLeuGlyLysThrlleGlyTyrValTyrAlaAsnAlaThrArgGinLeuLau f 4(210X297 公着) ,01330 A7 B7 C7 D7 六、申犄專利範面 990 1010 X030 GAAAACACAGAAGCTCATCCTAGAGATTATCCTTTGTACTTTTCCTTTAGTCATGATACC GluAsnThrGluAlaAspProArgAspTyrProLeuTyrPheSerPheSerHisXspThr 1050 1070 i〇s〇 GATCTGCTTCAAGTATTCACrTCACTCGGTCTTTTCXACGTGACAGATCTGCCATTAGAC AspLeuLeuGinValPheThrSerLeuGlyLeuPheAsnValThrAspLeuProLeLiAsp 1110 1130 Ncol CAGATTCAATTCCAGACCTCTTTCA^JkTCTACCGAAATAGTTCCCATGGGAGCAAGATTG GinlleGinPheGinThrSerPheLysSerThrGlulleValProMetGlyAlaArgLeu 1170 11S0 1210 CTTACCGAGAGATTATiGTGTACTGTTGAAGGTGAAGAAAAATACTACGTTAGAACTAl'C ] 1230 1250 1270 CTCAACGATGCAGTCTTCCCACTGAGTGACTGTTCCTCTGGCCCTGGATTCTCTTGTCCG LeuAsnAspAlaValPheProLeuSerAspCysSerSerGlyProGlyPheSerCysPro 1290 1310 1330 TTGAACGATTATGTTTCTAGACTTGAGGCATTGAACGAGGACAGTGACnTGCGGAAAAC LeuAsnAspTyrValSerArgLeuGluAlaLeuAsnGluAspSerAspPhaAlaGluAsn 1350 1370 1390 TGTGGAGTTCCTAAAAATGCTTCCTACCCACTTGAACTATCATTCTTCTGGGATGACTTG GysGlyValProLysAsnAlaSerTyrProLeuGluLeuSerPhePheTrpAspAspLeu TCATXA SerEnd 11 12 經濟部中央樣準Λ印製 (請先閑讀背面之注意事項再填茸本頁) 一段經分離之DNA片段,其包栝巴斯德畢赤酵母酸性磷 酸酶3*轉錄终结子序列•其具有如下序列(SEQ ID H0: 5): 1410 1430 1450 AAATGGTAAGGAATGTTTTGCATCAGATACGAGTTCAAAACGATTAAG^XGAGA 1470 1490 1510 ATGCTCTTTTTTTTGTTTCTATCCAATTGGACTATTTTCGTTTATTTTAAATAGCGTACA 1530 1550 1570 ACTTTAACTAGATGATATCTTCTTCTTCAAACGATACCACTTCTCTCATACTAGGTGGAG BanHI GTTCAATGGATCC 一種自巴斯德畢赤酵母中表現多胜肽之方法•其包括將 一班當宿主畑胞與一磷酸籩濃度可造成表現之培養基接 觸,該宿主细胞已被衍自或如同巴斯德畢赤酵母酸性磷 -6 f 4 (210X297公灃) 01330 Α7 Β7 C7 D7 〜、申請專利範® 酸_5’調控區,其經搡作連结至編碼異源多胜肽之DN A 序列•所轉形。 根據申謫專利範面第12項之方法,其中該異源DNA另含 有一段經操作與之連接的如申請專利範圔第5項之DN A 片段中之巴斯德畢赤酵母酸性磷酸酶訊號序列(SEQ ID NO : 3) 〇 14. 一種經分離之DN Α片段,其包括如申謫專利範圓第5項 之DH A片段中之巴斯德畢赤酵母酸性磷酸胸訊號序列 (SEQ ID NO : 3),和一 5 ·調控區。 15. 根據申請専利範圃第14項之DNA片段·其中該5’調控區 是如申請專利範团第2項之DNA片段中之巴斯德畢赤酵 母酸性磷酸酶5’調控區(SEQ ID NO : 2)。 16. 根據申請專利範園第14項之DHA片段,其中該5'調控區 是巴斯德畢赤酵母酵氧化_(A0 XI)之5’調控區。 17. 根據申請專利範圃第14、15或16項之DHA片段,其中該 DNA Η段經操作速接至一個編碼多胜肽之異源DNA序列 Ο 18. 根據申謫專利範_第17項之DNA片段,其中該異源DNA 編碼組雄血纖維蛋白溶_原活化劑。 19. 根據申請專利範圏第14項之DNA Η段,其中該訊號序列 經操作連接至該5’調控匾。 (請先聞讀背面之注意事項再填窩本资) •裝. •打. •綠. 經濟部中央搮準扃印裝 7 f 4 (210X297 公潘)
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GB9307371D0 (en) * | 1993-04-08 | 1993-06-02 | Walls Alan J | Fusion proteins |
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IT1266740B1 (it) * | 1994-07-01 | 1997-01-14 | Maria Paola Landini | Materiale proteico ricombinante legante anticorpi contro il citomegalovirus umano, reagenti diagnostici derivati da tale |
US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
DE69535317T2 (de) * | 1994-10-18 | 2007-06-21 | Dendreon Corp., Seattle | Aus nematoden extrahierte serinprotease-inhibitoren und die koagulation hemmende proteine |
US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
EP0877816A1 (en) * | 1996-02-01 | 1998-11-18 | North American Vaccine, Inc. | Expression of group b neisseria meningitidis outer membrane (mb3) protein from yeast and vaccines |
MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
WO1999007862A1 (en) * | 1997-08-05 | 1999-02-18 | Chiron Corporation | Novel pichia pastoris gene sequences and methods for their use |
US6451572B1 (en) | 1998-06-25 | 2002-09-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Overexpression of phytase genes in yeast systems |
EP1144438A3 (en) | 1999-01-14 | 2002-02-27 | Novozymes Biotech, Inc. | Polypeptides having acid phosphatase activity and nucleic acids encoding same |
ATE301198T1 (de) * | 1999-03-31 | 2005-08-15 | Cornell Res Foundation Inc | Phospahatasen mit verbesserter phytase-aktivität |
US6841370B1 (en) * | 1999-11-18 | 2005-01-11 | Cornell Research Foundation, Inc. | Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase |
CN1320699A (zh) * | 2000-04-27 | 2001-11-07 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人磷脂酶9和编码这种多肽的多核苷酸 |
CN1324948A (zh) * | 2000-05-24 | 2001-12-05 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——酸性磷酸酶14和编码这种多肽的多核苷酸 |
AU2002210126A1 (en) | 2000-05-25 | 2001-12-03 | Chiron Corporation | Iron regulation of the ppsec10 transcriptional regulatory region of pichia pastoris and methods of use |
CN1329020A (zh) * | 2000-06-21 | 2002-01-02 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——酸性磷酸酶家族蛋白11和编码这种多肽的多核苷酸 |
US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
EP2335501B8 (en) | 2001-10-31 | 2016-09-21 | Huvepharma Eood | Phytase-containing animal food and method |
CA2925807C (en) * | 2002-09-13 | 2020-09-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Using mutations to improve aspergillus phytases |
JP2007519392A (ja) | 2003-07-30 | 2007-07-19 | ザイモジェネティクス, インコーポレイテッド | ピキアメタノリカ分泌シグナル |
US7919297B2 (en) | 2006-02-21 | 2011-04-05 | Cornell Research Foundation, Inc. | Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase |
WO2007137300A2 (en) | 2006-05-23 | 2007-11-29 | Bellicum Pharmaceuticals, Inc. | Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods |
EP2069486A2 (en) | 2006-08-03 | 2009-06-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Phytases with improved thermal stability |
US8097422B2 (en) | 2007-06-20 | 2012-01-17 | Salk Institute For Biological Studies | Kir channel modulators |
US8192734B2 (en) | 2007-07-09 | 2012-06-05 | Cornell University | Compositions and methods for bone strengthening |
TWI449788B (zh) | 2008-03-03 | 2014-08-21 | Abbvie Inc | 轉型酵母菌之方法 |
US20090280103A1 (en) * | 2008-04-04 | 2009-11-12 | Martin Flueck | Regulation of muscle repair |
US20120156761A1 (en) | 2009-07-02 | 2012-06-21 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing adipic acid |
WO2011006126A2 (en) * | 2009-07-09 | 2011-01-13 | Verdezyne, Inc | Engineered microorganisms with enhanced fermentation activity |
US8889394B2 (en) * | 2009-09-07 | 2014-11-18 | Empire Technology Development Llc | Multiple domain proteins |
US8728798B2 (en) | 2011-05-03 | 2014-05-20 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing adipic acid |
US8343752B2 (en) | 2011-05-03 | 2013-01-01 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing adipic acid |
MY166952A (en) | 2011-07-06 | 2018-07-25 | Verdezyne Inc | Biological methods for preparing a fatty dicarboxylic acid |
HUE033282T2 (en) | 2012-10-29 | 2017-11-28 | Lonza Ag | Expression sequences |
CA2895130A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-26 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing a fatty dicarboxylic acid |
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TWI638047B (zh) | 2014-04-09 | 2018-10-11 | 史基普研究協會 | 藉由核酸三磷酸酯轉運子將非天然或經修飾的核苷三磷酸酯輸入至細胞中 |
CN104195059B (zh) * | 2014-08-15 | 2016-08-24 | 陕西科技大学 | 多形汉逊酵母突变菌株及多形汉逊酵母生产d-阿拉伯糖醇的方法 |
WO2016154046A2 (en) | 2015-03-20 | 2016-09-29 | Verdezyne, Inc. | Biological methods for preparing 3-hydroxypropionic acid |
EP3568408A4 (en) * | 2017-01-13 | 2020-12-16 | Bolt Threads, Inc. | ELASTOMER PROTEINS |
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WO2019014309A1 (en) | 2017-07-13 | 2019-01-17 | Verdezyne (Abc), Llc | BIOLOGICAL METHODS FOR MODIFYING A CELL CARBON FLOW |
BR112020002271A2 (pt) | 2017-08-03 | 2020-07-28 | Synthorx, Inc. | conjugados de citocina para o tratamento de doenças proliferativas e infecciosas |
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JPS5974988A (ja) * | 1982-10-20 | 1984-04-27 | Suntory Ltd | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
US4876197A (en) * | 1983-02-22 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Eukaryotic regulatable transcription |
US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
FI89723C (fi) * | 1984-10-01 | 1993-11-10 | Genzyme Corp | Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell |
US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
US4808537A (en) * | 1984-10-30 | 1989-02-28 | Phillips Petroleum Company | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use |
US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
JPH0655146B2 (ja) * | 1985-12-27 | 1994-07-27 | 財団法人化学及血清療法研究所 | シヤトルベクタ− |
IL82935A0 (en) * | 1986-08-12 | 1987-12-20 | Phillips Petroleum Co | Secretion of heterologous proteins from yeast |
US5002876A (en) * | 1986-09-22 | 1991-03-26 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of human tumor necrosis factor |
MY103358A (en) * | 1987-04-15 | 1993-06-30 | Novartis Ag | Process for the production of protiens. |
US5102789A (en) * | 1989-03-15 | 1992-04-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells |
CA2000101A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-06-22 | Mary E. Digan | Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene |
JPH0671434B2 (ja) * | 1989-09-18 | 1994-09-14 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
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