JPS5974988A - 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 - Google Patents
酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法Info
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- JPS5974988A JPS5974988A JP57184293A JP18429382A JPS5974988A JP S5974988 A JPS5974988 A JP S5974988A JP 57184293 A JP57184293 A JP 57184293A JP 18429382 A JP18429382 A JP 18429382A JP S5974988 A JPS5974988 A JP S5974988A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は酵ＩＪ迎制型酸性フォスファターゼを支装置−
でいる或信子であるＰＩｉ０５遺伝子のフロモーターを
利用し、有用、ｔペプチドをＰ Ｉｆ Ｏ５遺に子の：
１ｉｌｌ ｌｌ１ｌＩ下に生産するための酵母菌ベクタ
ー、およびそのベクターにより形質転換した酵母を培漣
−することにより高収率で有用な目的ペプチドを生産す
る方法に関する。
でいる或信子であるＰＩｉ０５遺伝子のフロモーターを
利用し、有用、ｔペプチドをＰ Ｉｆ Ｏ５遺に子の：
１ｉｌｌ ｌｌ１ｌＩ下に生産するための酵母菌ベクタ
ー、およびそのベクターにより形質転換した酵母を培漣
−することにより高収率で有用な目的ペプチドを生産す
る方法に関する。
酵母の抑制型酸性フォスファターゼはリン酸の濃度によ
って制御を受ける酵素であり、リン酸イ農度を低くする
ことによりこの酵素の生産を誘導することが可能である
。酵母の抑制型酸性フォスファターゼは少くとも２種項
あることが報告されており、本発明ではその１つをコー
ドしているＰＨ０５遺伝子のプロモーターを利用し、Ｐ
Ｈ０５遺伝子の制御下に有用なペプチド遺伝子を発現さ
せることに成功したものである。
って制御を受ける酵素であり、リン酸イ農度を低くする
ことによりこの酵素の生産を誘導することが可能である
。酵母の抑制型酸性フォスファターゼは少くとも２種項
あることが報告されており、本発明ではその１つをコー
ドしているＰＨ０５遺伝子のプロモーターを利用し、Ｐ
Ｈ０５遺伝子の制御下に有用なペプチド遺伝子を発現さ
せることに成功したものである。
これまで遺伝子操作技術を用いて医薬−ヒ有用、なペプ
チド類、例えばソマスクチン、インク）ノン、成長ホル
モン ！、ｆＪインターフェロン、インクルエンリ“ウ
ィルス並びに肝炎ウィルス蛋白、ザイモンンα１、β−
エンドルフィン、α−イ・オエン１゛ルフィン、セクレ
チン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など
多くの物質が倣生物′または動物細胞で作られるように
なっている。
チド類、例えばソマスクチン、インク）ノン、成長ホル
モン ！、ｆＪインターフェロン、インクルエンリ“ウ
ィルス並びに肝炎ウィルス蛋白、ザイモンンα１、β−
エンドルフィン、α−イ・オエン１゛ルフィン、セクレ
チン、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化物質など
多くの物質が倣生物′または動物細胞で作られるように
なっている。
これらの多くは宿主として原核＋ｔ′ｌＨ胞である大腸
閑を用いているが、近年有核訓胞である酵１ユを宿主と
して利用することが注目されてし・る。酵母は培養条件
が１．’ｉｌ学びあり、分裂速度か速く、安全性が高く
、更に竹にザソカロマイセス酵母では遺伝生化学的解析
が多くなされているなどの理由による。
閑を用いているが、近年有核訓胞である酵１ユを宿主と
して利用することが注目されてし・る。酵母は培養条件
が１．’ｉｌ学びあり、分裂速度か速く、安全性が高く
、更に竹にザソカロマイセス酵母では遺伝生化学的解析
が多くなされているなどの理由による。
有用なペプチド遺伝子（外来性異種ペプチド遺伝子およ
び酸１！Ｊ内に存在１〜でいるが生産畢の少い同種ペプ
チドをコードしている遺伝子を含む）を発［見させるた
めには用いる宿主に適したプロモーター領域の存在が必
須である。プロモーターの艮訂が目的とするペプチド遺
伝子の発現に大きな影２岸を掬えるため、これまでλ重
々のプロモーターを用いた発現プラスミドベクターの開
発が行われてきた。
び酸１！Ｊ内に存在１〜でいるが生産畢の少い同種ペプ
チドをコードしている遺伝子を含む）を発［見させるた
めには用いる宿主に適したプロモーター領域の存在が必
須である。プロモーターの艮訂が目的とするペプチド遺
伝子の発現に大きな影２岸を掬えるため、これまでλ重
々のプロモーターを用いた発現プラスミドベクターの開
発が行われてきた。
しかじな、）；ら、報告さノ圭でいる酵母を宿主とする
外来遺伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクタ
ーに比軸して、目的ペプチド遺伝子の発現は十分ではな
い。
外来遺伝子の発現ベクターは大腸菌を宿主とするベクタ
ーに比軸して、目的ペプチド遺伝子の発現は十分ではな
い。
発明者ら（・」１、酸１〃仰制型酸性フォ７ファタ−ゼ
（Ｐｉ−１０５）をコートしてし・るオペロンのプロモ
ーターに着目し、研究を進め／也。この結果、このプロ
モーターが酵母での異種寸たは同種ペプチドの生産に非
常に有用であることを見出し、このフロモーターの下流
に目［Ｊタペブチト遺伝子を結ばし／こ１７ｐ 、１−
Ｕ閑のベクターを作製し、これを用いて酵１υの形質転
換を行い、形質転換体を分肉１ｆ解・ｖｌすることによ
り本発明を完成した。
（Ｐｉ−１０５）をコートしてし・るオペロンのプロモ
ーターに着目し、研究を進め／也。この結果、このプロ
モーターが酵母での異種寸たは同種ペプチドの生産に非
常に有用であることを見出し、このフロモーターの下流
に目［Ｊタペブチト遺伝子を結ばし／こ１７ｐ 、１−
Ｕ閑のベクターを作製し、これを用いて酵１υの形質転
換を行い、形質転換体を分肉１ｆ解・ｖｌすることによ
り本発明を完成した。
本発明で用いる目的ペプチド遺信子シＪ、ｆに学的に合
成したｊを嵌子、ｔｒｔ Ｒ７Ｖ Ａ から逆転写酵素
の作用によって得らＩＬる相補的Ｄ Ｎ Ａ （ｃ Ｄ
ＩＶ Ａ ）遺伝子、あるいは染色体から適切な処ｊ
１１！によって得たｊム云子を含む１） 、Ｖ Ａ断片
等のいずれでも団い。
成したｊを嵌子、ｔｒｔ Ｒ７Ｖ Ａ から逆転写酵素
の作用によって得らＩＬる相補的Ｄ Ｎ Ａ （ｃ Ｄ
ＩＶ Ａ ）遺伝子、あるいは染色体から適切な処ｊ
１１！によって得たｊム云子を含む１） 、Ｖ Ａ断片
等のいずれでも団い。
本発明のＰｉ１０５遺伝子を訝む酵母へフタ−の作製方
法は欠の通りである。
法は欠の通りである。
本発明で使用するＰＨ０５遺云子はザツカロマイセス酵
１ユの染色体ＤＮＡを辿］限醇素ＢａｍＨ７でり断して
）Ｓた断片のうち約３ｋｂの長さを持つＤ ＮＡ断片上
にある。このＰ）１０５遺伝子は、精製酵素のＮ末端の
アミノ酸配列より１７個のアミノ酸残基から成る７グナ
ルペプチドを何する４５０個のアミノ酸残基からなる蛋
白質をコードしている。このＩ）１１０５遺伝子を含む
Ｂ ａ、ｍｌｉ Ｉ断片の制限酵素による切μノｒ地図
を第１図に示す。図中の各記創はそれぞれｉ欠のｊ開眼
１孝素を意１未するものである。
１ユの染色体ＤＮＡを辿］限醇素ＢａｍＨ７でり断して
）Ｓた断片のうち約３ｋｂの長さを持つＤ ＮＡ断片上
にある。このＰ）１０５遺伝子は、精製酵素のＮ末端の
アミノ酸配列より１７個のアミノ酸残基から成る７グナ
ルペプチドを何する４５０個のアミノ酸残基からなる蛋
白質をコードしている。このＩ）１１０５遺伝子を含む
Ｂ ａ、ｍｌｉ Ｉ断片の制限酵素による切μノｒ地図
を第１図に示す。図中の各記創はそれぞれｉ欠のｊ開眼
１孝素を意１未するものである。
Ｂ ａ ： Ｂ ａ？ｎ、 ／ｉ ｌ、Ｈｆ：ｌｌ１ｎ
ｆＩ、Ｋｐ：Ｋｐｎｌ。
ｆＩ、Ｋｐ：Ｋｐｎｌ。
Ａｃ：Ａｃｃ（、Ｓａ：Ｓａ、ｌｌ、ＩＩ■： ｌ１ｐ
ａ Ｉｌ 。
ａ Ｉｌ 。
１１ＶＪＪｐσ■
寸だ、ＰＪ１０５遺云子を含む上流、下流の全塩基配列
を懇２図に示す。この断片をレプリコンおよび選択マー
カーを含む適当な酵母ベタター、例えｋｌｐＹＥ２０７
（２１ｔｎ＋レフリコンおよびＬｅｕ’２”遺伝子をｐ
Ｂｌ［！３２２に結合さぜたプラスミド）に挿入し、更
に得られたフラスミドのＰＨ０５遺伝子プロモーターの
下流に目的ペプチド遺伝子を挿入してＪ’ＨＯ５フロモ
ー ター、目的ペプチド遺伝子、選択マーカー等を含む
酵ＩＢベクターを作製した。［ｔ・１、目的ペプチドの
分７−量が小さい場合、例えに、プルファネオエンドル
フィン（αＨＥ）ｉどではＰＨ０５溝遣遺伝子中の適当
な位Ｉｉ！、に挿入してＰＩ−１０５−αＮＥ雑種蛋白
質として目的物質（αＮＥ）を生産することが必要であ
る。しかしながら、インターフェロンのような比ｉ咬的
分子景の大きいペプチドでは、ＰＩｉ０５プロモーター
の位置から適当な塩基配列をおいてその目的ペプチドを
コ−ｙ・′する遺伝子を（＝Ｊ’ ７Ｊ［］ Ｉｌて目
的ペプチドを直接生産４−ることもできる５、−のよう
に、ＰＨ０５フロモーターは同種′−または異種ペプチ
ド遺伝子を誘導的に発現さぜ、目的ペプチドを生産する
のＱて広く活用できるものである。
を懇２図に示す。この断片をレプリコンおよび選択マー
カーを含む適当な酵母ベタター、例えｋｌｐＹＥ２０７
（２１ｔｎ＋レフリコンおよびＬｅｕ’２”遺伝子をｐ
Ｂｌ［！３２２に結合さぜたプラスミド）に挿入し、更
に得られたフラスミドのＰＨ０５遺伝子プロモーターの
下流に目的ペプチド遺伝子を挿入してＪ’ＨＯ５フロモ
ー ター、目的ペプチド遺伝子、選択マーカー等を含む
酵ＩＢベクターを作製した。［ｔ・１、目的ペプチドの
分７−量が小さい場合、例えに、プルファネオエンドル
フィン（αＨＥ）ｉどではＰＨ０５溝遣遺伝子中の適当
な位Ｉｉ！、に挿入してＰＩ−１０５−αＮＥ雑種蛋白
質として目的物質（αＮＥ）を生産することが必要であ
る。しかしながら、インターフェロンのような比ｉ咬的
分子景の大きいペプチドでは、ＰＩｉ０５プロモーター
の位置から適当な塩基配列をおいてその目的ペプチドを
コ−ｙ・′する遺伝子を（＝Ｊ’ ７Ｊ［］ Ｉｌて目
的ペプチドを直接生産４−ることもできる５、−のよう
に、ＰＨ０５フロモーターは同種′−または異種ペプチ
ド遺伝子を誘導的に発現さぜ、目的ペプチドを生産する
のＱて広く活用できるものである。
本発明のベクターにおいて、αＮＥ遺伝子を用いてＰｉ
ｉ０５−αＨＥ ２？ａ ；Ｔｆｆｉ蛋白口綴として発
現させ、得られた雑種蛋白を臭化シアンの所用等の常法
によって開裂させてαＨＥ分子を取出すことができる。
ｉ０５−αＨＥ ２？ａ ；Ｔｆｆｉ蛋白口綴として発
現させ、得られた雑種蛋白を臭化シアンの所用等の常法
によって開裂させてαＨＥ分子を取出すことができる。
この方法によって生産されたαＮＥ分子をラジオイムノ
アッセイ（１１Ｉ Ａ、 ）で測定Ｉ−たところ、細胞
当り約１０６分子の生産性が認められた。
アッセイ（１１Ｉ Ａ、 ）で測定Ｉ−たところ、細胞
当り約１０６分子の生産性が認められた。
本発明を以下の実施げ１により更に詳細に説明する。
尚、実施列中でなよ目的ペプチド遺伝子としてαＮＥ遺
伝子を（史用１〜でいるが、本発明はこのαＮＥの生産
に１ＩＩＮ定さＪしるもので＆；ｊ：ない。
伝子を（史用１〜でいるが、本発明はこのαＮＥの生産
に１ＩＩＮ定さＪしるもので＆；ｊ：ない。
実施例
■、ＰＨ０５造例子を汁む酵−プラスミドｐＹＥ］］０
１の作製（第８図参照） 酵母抑ｉ！ｉｌｌ型ｌν性フォスファターゼ（ＰＪｉ（
Ｊ）５）遺伝子は？１ｉｌｌ限ｆｊｔ素Ｂ ａ ｍｌｉ
Ｉ切断により得られる約３／６ ｂの染色体Ｄ ＮＡ
断片上にある。この１断片をＹノｌｐ７の７３ ａ ｍ
、、ＩＩ ｌサイ１−にクローニングした７）ＰＩｉ０
５を７Ｊ／１．Ｃ５−の酵母宿主に形質転換゛ｒるとＰ
１１０ ’−の表現型を示す。ｐｐＨ０５■は染色体
レプリコンに」二るプラスミツドであり、酵母Ａｌ１１
１胞中では不′ゲ定でめつ７【。そこでこのｐＰＩｉ０
５ヲＢ ａ、ｎＪＩ Ｉで切断し約３ｋｂのＰＨ０５遺
伝子を含むＤ Ｎ、Ａ断片をｐＹＥ２Ｑ ７ （２１ｉ
ｍ レプリコン及びＬｅｕ”ｒ２ 遺伝子、ｐＢＲ３
２２を結付さぜたブラスミ７ Ｍ ） （１） Ｂａｍ
１ｉ １部位に挿入したｐＹＥｌ−１０１を１！ｆ７λ
。このプラスミツドは酵母細胞中で安定に・１１１ユ侍
され、低１ｉｊＪ １隻のリン酸下で１浚４生フオスフ
アターゼの生産性が認められた。
１の作製（第８図参照） 酵母抑ｉ！ｉｌｌ型ｌν性フォスファターゼ（ＰＪｉ（
Ｊ）５）遺伝子は？１ｉｌｌ限ｆｊｔ素Ｂ ａ ｍｌｉ
Ｉ切断により得られる約３／６ ｂの染色体Ｄ ＮＡ
断片上にある。この１断片をＹノｌｐ７の７３ ａ ｍ
、、ＩＩ ｌサイ１−にクローニングした７）ＰＩｉ０
５を７Ｊ／１．Ｃ５−の酵母宿主に形質転換゛ｒるとＰ
１１０ ’−の表現型を示す。ｐｐＨ０５■は染色体
レプリコンに」二るプラスミツドであり、酵母Ａｌ１１
１胞中では不′ゲ定でめつ７【。そこでこのｐＰＩｉ０
５ヲＢ ａ、ｎＪＩ Ｉで切断し約３ｋｂのＰＨ０５遺
伝子を含むＤ Ｎ、Ａ断片をｐＹＥ２Ｑ ７ （２１ｉ
ｍ レプリコン及びＬｅｕ”ｒ２ 遺伝子、ｐＢＲ３
２２を結付さぜたブラスミ７ Ｍ ） （１） Ｂａｍ
１ｉ １部位に挿入したｐＹＥｌ−１０１を１！ｆ７λ
。このプラスミツドは酵母細胞中で安定に・１１１ユ侍
され、低１ｉｊＪ １隻のリン酸下で１浚４生フオスフ
アターゼの生産性が認められた。
結果を表１に示す。この結果から、ｐＹＥｌｌｏｌはＰ
ＩＩ０５遺云子を含みかつ酵母中仁の遺伝子が発現して
いることを示し−Ｃいる。
ＩＩ０５遺云子を含みかつ酵母中仁の遺伝子が発現して
いることを示し−Ｃいる。
−ゼの生産性
−１６，５０，００５ｏ、ｏｏｏａ
十ｐ ？
７＋）’Ｅｌ１０１ １４．２ ０’、４５０
０．０３２１十Ｐ；非誘導培地 ０−Ｐ；誘導培地 尚、ｐＹＥ１１０１７ラスミドでＳａ、ｃｃｈａｒｏｍ
、ｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＸＰ−７Ａ株酵母を
形質転換したものをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ５ｅ
ｒｅｖｉｓｉａ、ｅ ＳＢＭ ３１１と品名し、工業技
術院微生物工業研究所（機工研）に寄託１〜だ（寄託酢
号ＦＥｌｌｔＷ Ｐ −６７６４）。
０．０３２１十Ｐ；非誘導培地 ０−Ｐ；誘導培地 尚、ｐＹＥ１１０１７ラスミドでＳａ、ｃｃｈａｒｏｍ
、ｙｃｅｓｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＸＰ−７Ａ株酵母を
形質転換したものをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ５ｅ
ｒｅｖｉｓｉａ、ｅ ＳＢＭ ３１１と品名し、工業技
術院微生物工業研究所（機工研）に寄託１〜だ（寄託酢
号ＦＥｌｌｔＷ Ｐ −６７６４）。
２、 目的ペソチド遺云子発現用ＰＩｉ０５ ベクター
の作製（第４図参照） １０μ７のｐＹＥｌｌｏｌ（１１ｋｂ’）をＴＡ援衝ｏ
、（３３ｍＡ４ ｌ・リス酢酸、ｐｈｉ ７．９．６６
＋ＪＬ Ａ／ ｌ’Ｆ酸カリウム、ｌ Ｏｚ＋＋、Ａ
４酢［浚マグネシウム、０．５ｍＡ４ Ｄ ７’ ７’
） 中で３０単位の１１’ｐａｌを用いて、３７’Ｃ
１，５時間反応させた。一方ＥｃｏＲ１リンカ−（５′
−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）５μ２をポリヌクレオチト
キナーセ緩衝液中（５０ｍＡ／ｌ・リス塩酸、７ｙｌ−
１７，５、］、 Ｏｒ７＋、Ｍ ＭｇＣＩＪ） 、
２ ５ ｎ ｍｏｌ のＡ、ＴＰ。
の作製（第４図参照） １０μ７のｐＹＥｌｌｏｌ（１１ｋｂ’）をＴＡ援衝ｏ
、（３３ｍＡ４ ｌ・リス酢酸、ｐｈｉ ７．９．６６
＋ＪＬ Ａ／ ｌ’Ｆ酸カリウム、ｌ Ｏｚ＋＋、Ａ
４酢［浚マグネシウム、０．５ｍＡ４ Ｄ ７’ ７’
） 中で３０単位の１１’ｐａｌを用いて、３７’Ｃ
１，５時間反応させた。一方ＥｃｏＲ１リンカ−（５′
−ＧＧＡＡＴＴＣＣ−３′）５μ２をポリヌクレオチト
キナーセ緩衝液中（５０ｍＡ／ｌ・リス塩酸、７ｙｌ−
１７，５、］、 Ｏｒ７＋、Ｍ ＭｇＣＩＪ） 、
２ ５ ｎ ｍｏｌ のＡ、ＴＰ。
１０弔位のポリヌクレオチドキーゼを用いて８７Ｔ：、
４５分間反ｉ芯させ、５′末端をリン酸化した。
４５分間反ｉ芯させ、５′末端をリン酸化した。
次ＶＣ７） ＹＥ ］、 １．０１のＨ７フσ１分解
１勿（７，９ｋｂ、３．１ｋｂ）５μ７とリン酸化した
Ｅｃｏｌン■リンカ−１μ２を２０μｌのリカーピ援衝
液に溶解し、５単位の１’５ＤＮＡリガーゼを加え１５
℃で１８時間反応さぜた。この反ｊ７６液１０ｔｔｌＪ
を０．３ｍｌの（：ａＣ１２処即（ッた。Ｅ、 ｃｏｉ
ｉ Ｊ 、４２２１に加え形質転換を行った。アンピシ
リン耐性形質転換体から常法に従いプラスミドＤＮＡを
分離解析し、ｐＹＥｌ−１０１の７゜９ｋｂ断片のＨｐ
ａ’ｉ部位にＥｃｏＲｌ リンカ−が挿入されたｐＹＥ
１１７０を得ンで。次に５μｇのｐＹＥ１１７Ｑを３０
単位のＥｃｏｌｌｌを用いてＴＡ緩衝液中３７°Ｃ１時
間反）７６さぜ、６．５ｋＯ及び１．４ｋｂの２断片に
した。６５’Ｃで５分間加熱することによりＥ ｃ ｏ
Ｒｌを失活させた後、２容のエタノールでＤＮＡを沈
殿させた。この１）ＨＡを２０ｍＭ ｉリス塩酸（７）
Ｉｉ ８．１ ’） ｌ ００ ｍＭ ＮａＣ１゜１２
ｍＡ４ＣａＣｌ２溶液５０７Ｊに溶解し、０．５単位
のヌクレアーゼＢＡＬ−３１を用いて３０°Ｃ３分間反
応させた。この条件下で２００−４００ｂｐのＤ 、Ｎ
Ａが分解された。６５ ”Ｃで加熱することによりＢ
Ａ Ｌ −３１を失活させた後、２容のエタノールで
Ｉ）ＮＡを沈殿させた。この沈殿物を２０μｌのＴ４リ
ガーゼ緩衝液に溶）ｉｊイし、］μグのリン酸化したＥ
ｃｏｌｌｌリンカ−を７Ｊ１１え、５単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い１５℃、１８１４￥、間反応させた。こ
の反応液１０ μ１３を帆８ ｍｅＯ） ＣａＣ１２処
理したＬ′、ｃｏｌｉ ＪＡ２２１にＲ０えて形質転換
を１丁つン′こ〇 アンピノリン面ｊ性形質転換体から常法に従いプラスミ
ドＤ ＪＶ Ａを分ｌ’４）＃解析し約６．２ｋｂの大
きさを持ち、Ｅ′ｃｏ １１ Ｊの切断部位が１ケ所の
１ラスミドｐＹＥ１１．７０△］〜Δ４を得た。
１勿（７，９ｋｂ、３．１ｋｂ）５μ７とリン酸化した
Ｅｃｏｌン■リンカ−１μ２を２０μｌのリカーピ援衝
液に溶解し、５単位の１’５ＤＮＡリガーゼを加え１５
℃で１８時間反応さぜた。この反ｊ７６液１０ｔｔｌＪ
を０．３ｍｌの（：ａＣ１２処即（ッた。Ｅ、 ｃｏｉ
ｉ Ｊ 、４２２１に加え形質転換を行った。アンピシ
リン耐性形質転換体から常法に従いプラスミドＤＮＡを
分離解析し、ｐＹＥｌ−１０１の７゜９ｋｂ断片のＨｐ
ａ’ｉ部位にＥｃｏＲｌ リンカ−が挿入されたｐＹＥ
１１７０を得ンで。次に５μｇのｐＹＥ１１７Ｑを３０
単位のＥｃｏｌｌｌを用いてＴＡ緩衝液中３７°Ｃ１時
間反）７６さぜ、６．５ｋＯ及び１．４ｋｂの２断片に
した。６５’Ｃで５分間加熱することによりＥ ｃ ｏ
Ｒｌを失活させた後、２容のエタノールでＤＮＡを沈
殿させた。この１）ＨＡを２０ｍＭ ｉリス塩酸（７）
Ｉｉ ８．１ ’） ｌ ００ ｍＭ ＮａＣ１゜１２
ｍＡ４ＣａＣｌ２溶液５０７Ｊに溶解し、０．５単位
のヌクレアーゼＢＡＬ−３１を用いて３０°Ｃ３分間反
応させた。この条件下で２００−４００ｂｐのＤ 、Ｎ
Ａが分解された。６５ ”Ｃで加熱することによりＢ
Ａ Ｌ −３１を失活させた後、２容のエタノールで
Ｉ）ＮＡを沈殿させた。この沈殿物を２０μｌのＴ４リ
ガーゼ緩衝液に溶）ｉｊイし、］μグのリン酸化したＥ
ｃｏｌｌｌリンカ−を７Ｊ１１え、５単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼを用い１５℃、１８１４￥、間反応させた。こ
の反応液１０ μ１３を帆８ ｍｅＯ） ＣａＣ１２処
理したＬ′、ｃｏｌｉ ＪＡ２２１にＲ０えて形質転換
を１丁つン′こ〇 アンピノリン面ｊ性形質転換体から常法に従いプラスミ
ドＤ ＪＶ Ａを分ｌ’４）＃解析し約６．２ｋｂの大
きさを持ち、Ｅ′ｃｏ １１ Ｊの切断部位が１ケ所の
１ラスミドｐＹＥ１１．７０△］〜Δ４を得た。
３、 ｐ’ｊｔｏ５ベクターへのαＮＥ遺云子の挿入
（第５図参照） αＮＥ ］Ｌ伝子はｐαＮＥ２（Ｎａｃｌｅｉｃ ＡＣ
↑ｄＳＲｅｓ、］Ｑ：１．７４１〜１７５４．１９８２
）及び７） ＣＸＮＥ５’ （７） Ｌ）ＮＥ’２のα
ＮＥ遺伝子のメチオニンコドンより」二流が５’−ＡＡ
ＴＴＣＴＡ ＡＴＧ（Ｍｅ ｔ、 ）−−−−３’の塩
基配列を持っておりｐａＮＥ２のｌ’ｉ ｃ ｏ ＲＪ
切断部位まで２塩基対長くなったもの。つ丑り、２）α
ＮＥ２と比べＥｃｏｌｌＪ部位で糸吉汁した。ｉ弱含読
みわくが２つずれたもの））より寿だ。ＰＨ０５ベクタ
ーへのαＮＥ遺伝子信子法のＭ略を第５図に示した。５
μｆ ｃＤｐＹＥ１１１０△ｌ−４，を１Ｑ単位のＢ
ａ ｍｌｌ ｊ、ＩＯ年単位ＥｃｏＲｌを用し・ｉ’Ａ
暖衝液中、８７’Ｃ１時間反応させ／ｊｏ５μ７のｐＹ
ｌｃ；１０７をそれぞれ１０単泣のＰｓｔｌ、Ｂ ａ、
ｒｎ、Ｊｉ ｌを用いて７’ ＡＨ衝液中、３７℃１時
間反応さビた。ｐａＮＥ２及びｐαＮＥ ５ ’をそノ
Ｌそれ１Ｑ単位のＰｓｔｌ、ｆｊＪ ｃ ｏ Ｒ１でそ
、１１．ぞハフ’Ａ緩１新液中、８７℃１時間反応さぜ
た２、王妃の各々の反応物からＩ）ＮＡ断片をマガロー
ス覗気泳動で分離し７＋ＹＥｌ］、７Ｑ△１〜４＋から
はＩ”１１０５遺伝子を含む断片、ｐＹＥ２０’７から
はＬ ｅ ？ｊ Ｚ道１尺子を含む１号１片、ｐαＮＥ
２及びｐαＮＥ ５ ’からはαＮＥ１貴伝子を含む断
片を、電気泳動法で分１５前後爾製しグζ。各断片Ｊ）
ＮＡ分２０μｅのＴ４ＤＮＡリガーセ緩請液に溶解し
２単位の’Ｊ’＋ＪＪＮＡ’）ガーセで１５℃１８時間
反応させ７で。例えはｐＰαＮ１）３］はｐＹＥＬ］
７０△１からの断片、ｐＹＥ’２０’ｊからの断片、ｐ
αＮＥ２からの断片を混舒して（得られるプラスミド、
又ｐ ｌ）αＮＥ４”＋はｐＹＥｌｌ ７０△１からの
断片、ｐＹＥ？、０１からの断片、ｐαＮＥ５ ’から
の断片を混汗して得られるフラスミドである。
（第５図参照） αＮＥ ］Ｌ伝子はｐαＮＥ２（Ｎａｃｌｅｉｃ ＡＣ
↑ｄＳＲｅｓ、］Ｑ：１．７４１〜１７５４．１９８２
）及び７） ＣＸＮＥ５’ （７） Ｌ）ＮＥ’２のα
ＮＥ遺伝子のメチオニンコドンより」二流が５’−ＡＡ
ＴＴＣＴＡ ＡＴＧ（Ｍｅ ｔ、 ）−−−−３’の塩
基配列を持っておりｐａＮＥ２のｌ’ｉ ｃ ｏ ＲＪ
切断部位まで２塩基対長くなったもの。つ丑り、２）α
ＮＥ２と比べＥｃｏｌｌＪ部位で糸吉汁した。ｉ弱含読
みわくが２つずれたもの））より寿だ。ＰＨ０５ベクタ
ーへのαＮＥ遺伝子信子法のＭ略を第５図に示した。５
μｆ ｃＤｐＹＥ１１１０△ｌ−４，を１Ｑ単位のＢ
ａ ｍｌｌ ｊ、ＩＯ年単位ＥｃｏＲｌを用し・ｉ’Ａ
暖衝液中、８７’Ｃ１時間反応させ／ｊｏ５μ７のｐＹ
ｌｃ；１０７をそれぞれ１０単泣のＰｓｔｌ、Ｂ ａ、
ｒｎ、Ｊｉ ｌを用いて７’ ＡＨ衝液中、３７℃１時
間反応さビた。ｐａＮＥ２及びｐαＮＥ ５ ’をそノ
Ｌそれ１Ｑ単位のＰｓｔｌ、ｆｊＪ ｃ ｏ Ｒ１でそ
、１１．ぞハフ’Ａ緩１新液中、８７℃１時間反応さぜ
た２、王妃の各々の反応物からＩ）ＮＡ断片をマガロー
ス覗気泳動で分離し７＋ＹＥｌ］、７Ｑ△１〜４＋から
はＩ”１１０５遺伝子を含む断片、ｐＹＥ２０’７から
はＬ ｅ ？ｊ Ｚ道１尺子を含む１号１片、ｐαＮＥ
２及びｐαＮＥ ５ ’からはαＮＥ１貴伝子を含む断
片を、電気泳動法で分１５前後爾製しグζ。各断片Ｊ）
ＮＡ分２０μｅのＴ４ＤＮＡリガーセ緩請液に溶解し
２単位の’Ｊ’＋ＪＪＮＡ’）ガーセで１５℃１８時間
反応させ７で。例えはｐＰαＮ１）３］はｐＹＥＬ］
７０△１からの断片、ｐＹＥ’２０’ｊからの断片、ｐ
αＮＥ２からの断片を混舒して（得られるプラスミド、
又ｐ ｌ）αＮＥ４”＋はｐＹＥｌｌ ７０△１からの
断片、ｐＹＥ？、０１からの断片、ｐαＮＥ５ ’から
の断片を混汗して得られるフラスミドである。
これらの混ａ反応液１０１ｔ（ｌを０．３ ｍ１．）
ＣａＣｌ２処理したｆｉｒ”、 ｃｏｌｉ ＪＡ２２
］−に訓え形質転換を行つた０ アンピッリン耐性形質転換体から常法に従いブラスミ＋
−ＤＮＡを分離解析し、Ｐｌｉ’０５遺伝子にαＮＥ遺
伝子が結けさノｔたｐＰαＨＥ ３１．８２．３３Ｆ３
．３４１１及びｐｉ）αＮＥ４１．４２．４３．４！４
を’＋％た。（国手）次にこれら８種のプラスミドをザ
ノカロマイセス酵母ＸＰ８−７，４． （ａ １ｅｕ
２ｈｉｓ４ｚ ｔｒｐ１ｐｌｂｏ５）に形質転換した
。このうちプラスミドｐＰαＮＥ ４２ Ｋよって形質
転換されたＭ”１．７Ｊ をＳａ、ｃｃｈａ、ｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＢＭ８ １
’Ｌと命名し、機工研（て寄託した（寄託番号Ｆ’ Ｅ
ＩＩ ＭＰ −６７６５）。次に形質転換１本を−Ｐ
ｉ ＹＰＤ（］、 ００ Ｏｍｌの１％イース１−エ
キス、２％ボリペブトンヲ含む溶液に］、Ｏｍｌのｌ
Ｍ Ｍ ｇ Ｓ ０４．２８％アンモ二つ′水１０７＋
ｌを川１え、生じた沈殿物を口過１〜た後２ン０となる
ようにグルコースを力１］ ＝ ｆｃ 低すン酸培」［
Ｌ）及び＋ＰｉＹＰＩ）培地（−ＰｉＹＰＤ培地に０．
２％のム：／Ｉ２１）Ｏ，を加えた高リン酸培地）でそ
Ｊしそれ８０℃２４時間振と９培養後、遠−Ｃｒ分離に
より菌体を回収した。ｌ ｍｌの培養液から得られた菌
体に帆５ｍｌのｈアセトンを加え一２０℃で１〜２４時
間放置した後、凍結乾燥した。これらの乾燥菌体を５
ｒｎｙ ／ ｒｎｌの臭化ンアンを含む７０％ギ酸溶液
にＪ漣濁し、２４時間暗所で反応させた。この低利を凍
結乾燥後、０，１ｍｆの０．ＩＮ酢酸でαＨＥを溶出さ
せ、０．１ ｍ１Ｑ） １．３ Ｍ ｌリス塩Ｎ’１（
ｐｉＩ８．０）で中和後ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ ）の試別とした。ＲＩＡは／Ｖ、 Ｍｉｎ、ａ、ｍ
１ｎｏ ｅｔ ａ、ｌ 。
ＣａＣｌ２処理したｆｉｒ”、 ｃｏｌｉ ＪＡ２２
］−に訓え形質転換を行つた０ アンピッリン耐性形質転換体から常法に従いブラスミ＋
−ＤＮＡを分離解析し、Ｐｌｉ’０５遺伝子にαＮＥ遺
伝子が結けさノｔたｐＰαＨＥ ３１．８２．３３Ｆ３
．３４１１及びｐｉ）αＮＥ４１．４２．４３．４！４
を’＋％た。（国手）次にこれら８種のプラスミドをザ
ノカロマイセス酵母ＸＰ８−７，４． （ａ １ｅｕ
２ｈｉｓ４ｚ ｔｒｐ１ｐｌｂｏ５）に形質転換した
。このうちプラスミドｐＰαＮＥ ４２ Ｋよって形質
転換されたＭ”１．７Ｊ をＳａ、ｃｃｈａ、ｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＢＭ８ １
’Ｌと命名し、機工研（て寄託した（寄託番号Ｆ’ Ｅ
ＩＩ ＭＰ −６７６５）。次に形質転換１本を−Ｐ
ｉ ＹＰＤ（］、 ００ Ｏｍｌの１％イース１−エ
キス、２％ボリペブトンヲ含む溶液に］、Ｏｍｌのｌ
Ｍ Ｍ ｇ Ｓ ０４．２８％アンモ二つ′水１０７＋
ｌを川１え、生じた沈殿物を口過１〜た後２ン０となる
ようにグルコースを力１］ ＝ ｆｃ 低すン酸培」［
Ｌ）及び＋ＰｉＹＰＩ）培地（−ＰｉＹＰＤ培地に０．
２％のム：／Ｉ２１）Ｏ，を加えた高リン酸培地）でそ
Ｊしそれ８０℃２４時間振と９培養後、遠−Ｃｒ分離に
より菌体を回収した。ｌ ｍｌの培養液から得られた菌
体に帆５ｍｌのｈアセトンを加え一２０℃で１〜２４時
間放置した後、凍結乾燥した。これらの乾燥菌体を５
ｒｎｙ ／ ｒｎｌの臭化ンアンを含む７０％ギ酸溶液
にＪ漣濁し、２４時間暗所で反応させた。この低利を凍
結乾燥後、０，１ｍｆの０．ＩＮ酢酸でαＨＥを溶出さ
せ、０．１ ｍ１Ｑ） １．３ Ｍ ｌリス塩Ｎ’１（
ｐｉＩ８．０）で中和後ラジオイムノアッセイ（ＲＩ
Ａ ）の試別とした。ＲＩＡは／Ｖ、 Ｍｉｎ、ａ、ｍ
１ｎｏ ｅｔ ａ、ｌ 。
ＪＪＢＲＣｖｏｌ、 １０２ ２２６ （１９８］−）
Ｋ％ｅさいの方法に準じて行った。その結果ｐＰαＮＩ
Ｌ’ ４１、ｐｐαＮＥ４２．ｐＰαＮＥ４８のプラス
ミツドを持つ酵１すについてαＮＥ活性が見られた。池
の７）ＰαＮＥ’ｉ！、１〜８４、ｐＰαＨＥ ４４は
αＮＥ遺伝子の結１引は読みわくが合わないような結合
をＬ−意のであろう。７ｙＰＩ７Ｎｇ４Ｅ、ｐｐαＮＥ
４．２、ｐｐαＮＥ４３のプラスミツドを持つ酵母の−
Ｐｉ、ＹＰＤ。
Ｋ％ｅさいの方法に準じて行った。その結果ｐＰαＮＩ
Ｌ’ ４１、ｐｐαＮＥ４２．ｐＰαＮＥ４８のプラス
ミツドを持つ酵１すについてαＮＥ活性が見られた。池
の７）ＰαＮＥ’ｉ！、１〜８４、ｐＰαＨＥ ４４は
αＮＥ遺伝子の結１引は読みわくが合わないような結合
をＬ−意のであろう。７ｙＰＩ７Ｎｇ４Ｅ、ｐｐαＮＥ
４．２、ｐｐαＮＥ４３のプラスミツドを持つ酵母の−
Ｐｉ、ＹＰＤ。
十ＰｉＹＰＤ培地でそれぞれ培養したときのαＨＥ生産
量を７＞ＹＥｌｌｏｌと比較して表２に示した。
量を７＞ＹＥｌｌｏｌと比較して表２に示した。
αＮＥの生産鼠は培地中のリン酸濃度により大きく影響
を受けＰＩｉ０５ 遺伝子の迎１１卸下にあることが示
された。
を受けＰＩｉ０５ 遺伝子の迎１１卸下にあることが示
された。
低リン酸培地におけるａＮＥの生産量は高リン酸培地の
約２００培あり、ＰＩＩ０５ プロモーターを利用する
ことにより−ＰｉＹＰＤ培養条件下で細胞当り約１００
万ひ子のαＮＥ生産性が認められた。まｌｃ、不発明で
作製したプラスミドを持っ酵１υの酸性ノオスファター
セ活性はこのグラスミド・２Ｊ乃たない白γ〜と１司じ
レベルであった。
約２００培あり、ＰＩＩ０５ プロモーターを利用する
ことにより−ＰｉＹＰＤ培養条件下で細胞当り約１００
万ひ子のαＮＥ生産性が認められた。まｌｃ、不発明で
作製したプラスミドを持っ酵１υの酸性ノオスファター
セ活性はこのグラスミド・２Ｊ乃たない白γ〜と１司じ
レベルであった。
表２ ＰＩＩ０５ プロモーターによるａＮＥの
生産・１＋ ホｌｌｉ胞数 ａＮＥ 」：Ｈ’、 ＪｌｌＬ フラスミッド ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ ｎ！Ａｎｌ 分子数／にＩＩＩ胞ｐ）’Ｅｉ１０
１ ５．２ｘ１０７０ −７）ｌ’ａＮＪ’３３
４．８ｘ１０７０．５ ５．２ｘ］、Ｑ３ｐ、ｌ’／
ｉｌ’１１０１ ３．０ｘ１０７＜０．１８ −−Ｐ
ｉ ｐＰａＮＥＩＬ’Ｊ、 ２．ＱＸｌｏ
７ ４６．８ １．２ｘ１００２）ＰａＮＥ４＋
２２．２ｘ１０７５（１，０１，１ｘ１０６ｐＰ（ｘＮ
Ｅ４Ｉ３１．９ｘｌＯ７７０，０１，８ｘ１０６伺、Ｐ
ＩＩ０５遺伝子とａＮＥ・貞云子との結合部位について
険討するため、７）７）αＮＥ４．］、ｐ７−）ａＮＥ
４・２、およびｐｐαＮＥ４３のプラスミドＤＮＡをＥ
ｃ ｏ ｌｅ Ｉで分解後、Ｍａｘａｍ ａｎｔｉ Ｇ
１１ｂｅｒｔの方法（ｌ？Ｃ従ってＤ Ｎ Ａ塩基配列
を決定しグζ。この結果、ｐｐαＮＥ４＋１は８８７番
目のフロリン、７） ＰａＮＥ４２は４２３ ？＋♀目
（））バリン、ｐｐαＮＥ ４３ｉま３７４Ｈ♀目のア
スパラギン酸の直置（こリンカ一部分（９ＤＮＡ塩基対
）を介してαＮＥ遺伝子とそれそノ１結合していること
が確認された。
生産・１＋ ホｌｌｉ胞数 ａＮＥ 」：Ｈ’、 ＪｌｌＬ フラスミッド ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ ｎ！Ａｎｌ 分子数／にＩＩＩ胞ｐ）’Ｅｉ１０
１ ５．２ｘ１０７０ −７）ｌ’ａＮＪ’３３
４．８ｘ１０７０．５ ５．２ｘ］、Ｑ３ｐ、ｌ’／
ｉｌ’１１０１ ３．０ｘ１０７＜０．１８ −−Ｐ
ｉ ｐＰａＮＥＩＬ’Ｊ、 ２．ＱＸｌｏ
７ ４６．８ １．２ｘ１００２）ＰａＮＥ４＋
２２．２ｘ１０７５（１，０１，１ｘ１０６ｐＰ（ｘＮ
Ｅ４Ｉ３１．９ｘｌＯ７７０，０１，８ｘ１０６伺、Ｐ
ＩＩ０５遺伝子とａＮＥ・貞云子との結合部位について
険討するため、７）７）αＮＥ４．］、ｐ７−）ａＮＥ
４・２、およびｐｐαＮＥ４３のプラスミドＤＮＡをＥ
ｃ ｏ ｌｅ Ｉで分解後、Ｍａｘａｍ ａｎｔｉ Ｇ
１１ｂｅｒｔの方法（ｌ？Ｃ従ってＤ Ｎ Ａ塩基配列
を決定しグζ。この結果、ｐｐαＮＥ４＋１は８８７番
目のフロリン、７） ＰａＮＥ４２は４２３ ？＋♀目
（））バリン、ｐｐαＮＥ ４３ｉま３７４Ｈ♀目のア
スパラギン酸の直置（こリンカ一部分（９ＤＮＡ塩基対
）を介してαＮＥ遺伝子とそれそノ１結合していること
が確認された。
耶１図はＰＩＩ０５ 遺伝子２含むＢａｍＪＩ Ｉ 断
ノ１の第８図はＰＨ０５遺伝子を含む酵母菌ベクターの
構成法を示す。 第４図はＰｌｉ０５遺伝子を含む目的ペプチド遺伝子発
現用酵母菌ベクターの構成法を示す。 第５図はαＮＥ遺伝子・を組込んたＰＪｉ０５ヘクター
の構成法を示す。 第２へ凹 ３′−ＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴ
ＣＴＡＧＣＧＴＧＴＡ ＣＧＧＴＴＴＡＡＴＡＣＣＴ
Ａ丁丁ＣＣＣＡ ＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡ ＣＴＡＡ
ＣＡＧＣＴ丁 ＴＡＣＴＴＴ丁ＧＣＡＡＡＧＴＡＧＡＧ
ＡＧ 丁ＡＣ丁ＣＴＴＡＴＴ ＣＴＴＧＴＴＧＴ丁
Ｇ ＴＴＴＡＴＣＴＣＧＴＴｙｒ Ｓｅｒ ｒｌｅ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｉａ ５ｅｒ ｌｅｕ Ａｌａ Ａ
ｓｎ ＡｈａＡｓｐ Ｌｙｓ ｌｉｅ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ ＧＩＴＩ ＬＹＳ Ｔｙｒ Ｔｉｅ
Ｐｈｅ Ｐｒ。 １１ｊｓ Ｇｌｙ Ａ−ｓｐ Ｔ）ｒ Ｇｌｙ
：［１ｅ ５ｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅ
ｕ Ｐｒ。 Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｇａｙ Ｇｌｕ
Ａｒｇ Ｔｙｚ Ｐｒｏ 丁ｈｒ Ｖａｌ
５ｅｔＪ−ａｕ ５ｅｒ Ａｃ＋ｎ Ｔｙｒ
丁ｈｒ Ａｒｇ Ｇ１１１ Ｐｈｅ Ａｓｊ）
Ｇｌｙ Ｓｅｒ訂丁ＴＡＡＣＣＡＧ ＴＧＧＡＡ
ＴＧＡＡＣＣＧＴＴＣＣＧＴＡＴ ＡＴＧＧＧ丁ＡＡ
ＡＣ丁ＡＴＡＴＣＧＣＧＡ ＣＴＡＣＡＡ△△ＣＧ
ＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣ△△工ＣＡＴＡＣＣＧＴＣＧＴ
ＴＴＡＡＧＣＴＣＴＡ△ＴＧＧ丁 Ｍｅｔ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ ５ｅｒ Ｖａｌ ＶａｌＧｌｙ Ｔ
ｈｒ ｒｌｅ Ｐｒｏ Ｊ、ｅｕ Ｇｌｙ
Ｌｙｓ Ｌｅｕ Δ］、ａ Ａｓｐ ＶａＩＰ
ｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｈａ Ｇｌｙ Ｐｒ
ｏ Ｔｙｒ Ｔｙｒ ５ｅｒ ＰｈｅＣ；ｌｕ Ｇ］、
ｙ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｌｙ、ｓ Ｇｉｎ Ｌｅ
ｕ Ｇｉｎ Ｍｅｔ ＶａＩＬｅｕ Ａｒａ Ｌｙ
ｓ 丁ｈｒ 丁ｈｅ ＬｙＳ Ｓｅｒ Ｔｈ
ｒ 丁ｒｐ 丁ｙｒ ＬｙｓＴＴＧ 丁ＣＡ
ＴＴＣＴＴＧ ＡΔＣＧＡＴ ＧＡＴ ＴＡＣ
ＧＡＧ ＴＴＴ ＴＴＣＬｅｕ Ｓｅｒ Ｐ］＋ｅ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｇｌｕ
Ｐｈｅｐｈｅ尾。 丁１ｅ 八ｒｇ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｓ
ｐ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ １Ｔｙｒ ’ｌＴ
＋ｒ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｍｅｔ ＡｓｎΔ１゜ａ Ｌｙ
ｓ Ａｒｇ ］Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｉｎ Ｔｈｒ Ｓｅ
ｒ Ｐｈｅ Ａ１５ Ｖａｌ Ｐｈｅ ’ＴＴＣΔＴ
Ｔ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＴＡ ［１，ＧＴ
ＧＡＣＣＡＡ ＴＴＣ。 Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｐｈｅ 。 Ｇ”Ｊ Ａｌａ ＡＳｎ 丁ｈｒ Ｊ、ｅｕ
Ｓｅｒ： Ａｌａ Ｃｙｓ Ａ９］ＩＶａｌ
Ａ、ｓｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ ＡＳｐ Ｔｈｒ
丁ｈｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ 。 Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ ５ｅｒ Ｔ’ｈｒ
Ａｓｐ Ａｌａ ３ｅｒ ’Ｇｌｙ 丁ｙｒ ｓｅ
ｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｉｌ
ｅ Ｔｈｅ ’２４図 Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓ
ｅｒ ＡＳＰ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｅ、ｕΔＳｎ Ｐｒ
。 Ｉｒ１ｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｉｎ 丁ｙｒ Ｇｌｙ
丁’）’Ｔ Ｍｅｔ ＶａｉｌｌｌＴ Ｓｅｒ Ａ
ｓｈ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｃｒｙ５Ｈｉｓ Ａｓ
ｐ ｌ’ｂｒ Ａｌａ Ｇｉｎ Ｔｙｒ７５ へＡＣＡＴＣ へｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｇｌｎ
丁ｈＴ Ｖａｌ Ｓｅｘ Ｇｌｕ Ａｌａ ＧＬ
ｕ Ｓｅｆ Ａ１．ａＳｅｔ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ａｈａ Ｔｒｐ ＡＳｐ 丁ｙ−，Ａｓｐ
Ａ１．ａ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａ、ｓｐ １１．
ｅへｓｐ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｉｒ５
ＡＴｇ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ、Ａ
ｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｙｒｈｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ
Ｓｅｒ 丁ｒｐ （、ｙｓ Ａ−１ａ Ｐ
ｈｅ Ｇｌｕ Ｖａｌ 人５ｎＡ１δ Ｌｙｓｒ
ｈｒ Ｌｙｓ ＡＬＰ ＧＬｕ Ｌｅｕ Ｖａ
ｌ Ｈ４５Ｔｙ−ｒ Ｓｅｒ Ｔ＞＋ｒ Ｔｙ
−ｒ Ｇｉｎ Ａｓｐ第＞２ｃ閏 崎 ＴＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣＴＡＴ ＴＡＣＣＡＴ
ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＧＴ ＴＡＣＧ
へ］Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｔｙｒ
Ｈｌｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｔｙｒ ＡＳＴＡＡＴ ＧＣＣＴＣＡ ＧＴ
ＣＡＡＡ ｎＡ ＴＴＡ ＡＡＧ ＣＡＡ
ＡＧＴ ＧＡＧ ＡＴＩＡ−ｓｎ Ａ］、ａ
Ｓｅｘ Ｖａ’ｌ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｔｃ
Ｌｙｓ Ｇｉｎ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｉコ（２
０ ＣＡＣＧＡＴ ＡＣＣＧＡＴ ＡＴＣＣＴＡ ＡＡＣＴ
ＴＴ ｒＴＧ ＡＣＣＡＣＣＧｌｊＩ０５Ａｓｐ Ｔｈ
ｒ Ａｓｐ Ｔｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｂｅ ］＋ｅ
ｕ Ｔｈｒ Ｔｈｒ ＡｌｇＡｈａ Ｇｌｔｔ Ｔｙ
ｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｆｒｅｔ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｐｈｅ 月１６５ ＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＣＣＡＡ
ＴＧＴ ＴＣＴ ＡＡＣＧＡＣＡＣ（Ｖａｌ Ｔ
ｙｒ Ｔｈｒ Ｇｌｕ ｉｙｓ Ｐｈｅ Ｇ
Ｉｎ Ｃｙｓ Ｓｅｔ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｔ１
〕コＧＴＴ ＣＣＡ ＡｒＴ ＧＡＡ ＡＣＣ
ＴＧＴ ＴＣＣＡＣＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＧＧ
Ｇ ＴＴ［Ｖｂ３ Ｐｒｏ Ｔｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｂｒ Ｃｙｓ ５ｅｒ Ｔｌｎ Ｇｌｙ
ＰＴＯＧａｙ Ｐｈ（Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｌａ ｃｌｌｙ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ １ｙ！Ｔｈｒ Ｇ
］、ｕ Ｌｅｕ 丁ｈｒ Ｐｈｅ 丁ｙｒ
Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｔｒｐ ＡＳｎ Ｔｈｒ
丁ｈ〕ＡＴＴ ＡＴ（”、ＡＡＧ ＴＣＴ ＧＴＣ
ＧＣＴ ＴＣＣＡＡＣＴＴＧ ＴＴＣｌｌｅ Ｉｌ
ｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅ
ｒ ＡＳｎ Ｌｅｕ Ｐ’ｈｅ１０ ＣＡＡ ＧＡＣＣＡＡ ＡＡＧ ＧＴＴ ＴＧ
Ｇ ＴＴＧ ＡＧＴ ＴＴＴ ＡＣＣＧｌｎ
Ａｓｐ Ｇｉｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｓ
ｅｒ ＰｈｅＴｈｒＧＧＴ ＡＴΔ ＡＴＴ ＧＡ
ＣＧＡＣＡＡＡ ＡＡＣＡＡＣＴＴＡ ＡＣ丁Ｇｌ
ｙ Ｉｃｅ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙ
ｓ ＡＳｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ・ Ａ、
ｒｇ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｐ
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Ｇ Ａ丁Ａ丁ＡＡＣＧＡＣ＃３図 簗、ｊｉ 口 ↓ＥｃｖＥＪ ↓Ｂａ１３１ 手 続 補 正 書 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９６ 号 ２、発明の名称 酸１号の誘導発現型プラスミドベクターおよびその利用
方法 ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書の記載を下記の通りｄｆ正ずろ。 頁 行 補正前 補正後８
下２ ＸＰ−７Ａ ＸＰ３−７Ａ８ 下Ｉ
８８Ｍ５１１ ３８Ｍ３１ｉ９ 下３
Ｔ５ＤＮＡ Ｔ４ＤＮＡ１２ ６ マガロー
ス アガロース１ろ １０ ＳＢＭ、１）
１４ ＳＢＭろ１４以 上 秦３図 １′″”−）８ａｍＨＩ
ノ１の第８図はＰＨ０５遺伝子を含む酵母菌ベクターの
構成法を示す。 第４図はＰｌｉ０５遺伝子を含む目的ペプチド遺伝子発
現用酵母菌ベクターの構成法を示す。 第５図はαＮＥ遺伝子・を組込んたＰＪｉ０５ヘクター
の構成法を示す。 第２へ凹 ３′−ＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＡＡＧＣＴＴＣＴ
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ｓ ＡＳｎ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ・ Ａ、
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高ｒ孔ｉ図 ＴＡＡＣＡＴＡＴＴＴ Ａ丁ＴＴＡＴＴＡＴＡ Ａ
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ＴＩ ＧＴＣＧＴＴＴＣＡＡ ＣＴＡＡＣＡＴＣＧ
Ｇ Ａ丁Ａ丁ＡＡＣＧＡＣ＃３図 簗、ｊｉ 口 ↓ＥｃｖＥＪ ↓Ｂａ１３１ 手 続 補 正 書 １．事件の表示 昭和５７年特許願第１８４２９６ 号 ２、発明の名称 酸１号の誘導発現型プラスミドベクターおよびその利用
方法 ６、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名称（１９０）サントリー株式会社 ４、代理人 ６、補正の内容 （１）明細書の記載を下記の通りｄｆ正ずろ。 頁 行 補正前 補正後８
下２ ＸＰ−７Ａ ＸＰ３−７Ａ８ 下Ｉ
８８Ｍ５１１ ３８Ｍ３１ｉ９ 下３
Ｔ５ＤＮＡ Ｔ４ＤＮＡ１２ ６ マガロー
ス アガロース１ろ １０ ＳＢＭ、１）
１４ ＳＢＭろ１４以 上 秦３図 １′″”−）８ａｍＨＩ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 ■）酵１υ°の抑制型酸性フォスファターゼを支配して
いる遺伝子のプロモーターを含み、目的ペプチド遺伝子
を酵Ｉυ中で誘導的に発現させるプラスミド。 ２） 酵１ｉ：ｌの１ｌｔｌ制型ノオスファタ−ゼを
支装置〜ている遺伝子のプロモーターと目的ペプチド遺
伝子とを含むプラスミドを作製し、このプラスミドによ
り形′、Ｓ、帆換された酵母を誘導条件下で培養するこ
とにより目的ペプチドを生産する方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184293A JPS5974988A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
| EP83110472A EP0109560A3 (en) | 1982-10-20 | 1983-10-20 | Yeast plasmid vector capable of induced expressing and method of using said plasmid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57184293A JPS5974988A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974988A true JPS5974988A (ja) | 1984-04-27 |
Family
ID=16150790
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57184293A Pending JPS5974988A (ja) | 1982-10-20 | 1982-10-20 | 酵母の誘導発現型プラスミドベクタ−およびその利用方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0109560A3 (ja) |
| JP (1) | JPS5974988A (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61158793A (ja) * | 1984-11-14 | 1986-07-18 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト・リゾチ−ムの合成遺伝子 |
| CA1280080C (en) * | 1984-12-06 | 1991-02-12 | Jacques Oberto | Promoters for the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising them, and uses thereof for the production of polypeptides |
| JPS61141890A (ja) * | 1984-12-15 | 1986-06-28 | Suntory Ltd | アルコ−ルの製造法 |
| US4751180A (en) * | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| US5342921A (en) * | 1985-03-28 | 1994-08-30 | Chiron Corporation | Superoxide dismutase fusion polypeptides for expression of mammalian proteins |
| DE3685985T2 (de) * | 1985-04-09 | 1992-12-17 | Collaborative Res Inc | Mutanten von saccharomyces cerevisiae mit stark vermehrter sekretion. |
| EP0216117A3 (en) * | 1985-08-20 | 1988-06-15 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel dna and use thereof |
| US5013652A (en) * | 1986-10-14 | 1991-05-07 | Genex Corporation | Composite yeast vectors |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2125047B (en) * | 1982-08-09 | 1986-02-19 | Ciba Geigy Ag | Yeast hybrid vectors and their use for the production of polypeptides |
| EP0103201B1 (en) * | 1982-08-16 | 1990-05-30 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Shuttle vector |
-
1982
- 1982-10-20 JP JP57184293A patent/JPS5974988A/ja active Pending
-
1983
- 1983-10-20 EP EP83110472A patent/EP0109560A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0109560A3 (en) | 1985-11-27 |
| EP0109560A2 (en) | 1984-05-30 |
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