JPH0538287A - ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法 - Google Patents
ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法Info
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- JPH0538287A JPH0538287A JP3194984A JP19498491A JPH0538287A JP H0538287 A JPH0538287 A JP H0538287A JP 3194984 A JP3194984 A JP 3194984A JP 19498491 A JP19498491 A JP 19498491A JP H0538287 A JPH0538287 A JP H0538287A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】 ウサギプレプロ血清アルブミンを暗号化する
遺伝子及びそれを用いて遺伝子工学的にウサギ血清アル
ブミンを製造する技術を提供すること。 【構成】 特定構造のアミノ酸配列を有するウサギプレ
プロ血清アルブミン遺伝子を提供し、さらにこれを含む
組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換され
た微生物を提供し、さらにはこれを用いたウサギ血清ア
ルブミンの製造方法を提供した。
遺伝子及びそれを用いて遺伝子工学的にウサギ血清アル
ブミンを製造する技術を提供すること。 【構成】 特定構造のアミノ酸配列を有するウサギプレ
プロ血清アルブミン遺伝子を提供し、さらにこれを含む
組換えプラスミド、該組換えプラスミドで形質転換され
た微生物を提供し、さらにはこれを用いたウサギ血清ア
ルブミンの製造方法を提供した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウサギ血清アルブミン
（ＲＳＡ）の前駆体であるウサギプレプロ血清アルブミ
ンを暗号化する遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミ
ドＤＮＡ、該組換えプラスミドＤＮＡで形質転換された
微生物及び該微生物を培養してウサギ血清アルブミンを
製造する方法に関する。
（ＲＳＡ）の前駆体であるウサギプレプロ血清アルブミ
ンを暗号化する遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミ
ドＤＮＡ、該組換えプラスミドＤＮＡで形質転換された
微生物及び該微生物を培養してウサギ血清アルブミンを
製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】血清アルブミンは動物体内、特に肝臓で
最も大量に合成される血漿蛋白質であり、動物体内では
コロイド浸透圧維持、種々の血液蛋白質あるいは低分子
量物質の運搬等の生理作用に当たっている。ヒトの血清
アルブミン（ＨＳＡ）は、熱傷、ネフローゼ、出血性シ
ョック等に対して静注投与される蛋白製剤であり、その
ヒトに対する投与量は５ないし１０g と他の血漿蛋白質
と比較して極めて多く、需要が極めて大きい。近年、ヒ
ト血漿からのＨＳＡ製造の量的な限界、病原体混入等の
恐れから非血漿由来のＨＳＡの製造が要望され、これに
答えるべく様々の研究開発が成されている。中でも遺伝
子組換え法は、代替血液製剤製造法として最も有望な方
法であり、既に血液凝固因子第VIII因子製造のために実
用化されている。しかしながら、血清アルブミンの製造
に関しては永らく遺伝子組換え法による製造が議論され
ているが、工業的な生産プロセスとして確立されないで
いた。
最も大量に合成される血漿蛋白質であり、動物体内では
コロイド浸透圧維持、種々の血液蛋白質あるいは低分子
量物質の運搬等の生理作用に当たっている。ヒトの血清
アルブミン（ＨＳＡ）は、熱傷、ネフローゼ、出血性シ
ョック等に対して静注投与される蛋白製剤であり、その
ヒトに対する投与量は５ないし１０g と他の血漿蛋白質
と比較して極めて多く、需要が極めて大きい。近年、ヒ
ト血漿からのＨＳＡ製造の量的な限界、病原体混入等の
恐れから非血漿由来のＨＳＡの製造が要望され、これに
答えるべく様々の研究開発が成されている。中でも遺伝
子組換え法は、代替血液製剤製造法として最も有望な方
法であり、既に血液凝固因子第VIII因子製造のために実
用化されている。しかしながら、血清アルブミンの製造
に関しては永らく遺伝子組換え法による製造が議論され
ているが、工業的な生産プロセスとして確立されないで
いた。
【０００３】また、血清アルブミンは上記に記した用途
以外にも種々の薬剤のキャリアとしての需要がある。ま
た、最近精製ウシ血清アルブミンが細胞培養用の血清の
代用品として優れた性能を有することが報告され、商品
化されている（ＡＬＢＵＭＡＸ、ライフテックオリエン
タル社）、最も生体に適合する蛋白質としての性質を生
かした新たな用途開発が見込まれている。
以外にも種々の薬剤のキャリアとしての需要がある。ま
た、最近精製ウシ血清アルブミンが細胞培養用の血清の
代用品として優れた性能を有することが報告され、商品
化されている（ＡＬＢＵＭＡＸ、ライフテックオリエン
タル社）、最も生体に適合する蛋白質としての性質を生
かした新たな用途開発が見込まれている。
【０００４】血清アルブミンの効率的な生産方法として
は、宿主として大腸菌を初めとする原核微生物を用い
る方法、酵母を用いる方法、動物培養細胞を用いる
方法が考えられる。このうち、の方法は多くの試みに
も関わらず成功には至っていない。大腸菌は極く限られ
た場合を除いて菌体外に蛋白質を分泌することができな
い。また、異種蛋白質の大量発現は多くの場合に菌体内
に不溶性の封入体（inclusion body) の生成を導き、生
理的な活性を持つ蛋白質の回収を極めて困難にする。ま
た、の方法は多くの動物由来の分泌蛋白質の生産手段
として用いられているものの、一般に培養可能な細胞濃
度が微生物と比較して低く、蛋白質の生産性も100mg/L
を越えることは殆ど期待できない。の方法は、酵母が
真核生物として動物と類似した細胞の基本構成を有して
おり、しかも安価な培地で高密度培養が可能であること
から血清アルブミンの生産方法として最も優れたもので
あると期待される。
は、宿主として大腸菌を初めとする原核微生物を用い
る方法、酵母を用いる方法、動物培養細胞を用いる
方法が考えられる。このうち、の方法は多くの試みに
も関わらず成功には至っていない。大腸菌は極く限られ
た場合を除いて菌体外に蛋白質を分泌することができな
い。また、異種蛋白質の大量発現は多くの場合に菌体内
に不溶性の封入体（inclusion body) の生成を導き、生
理的な活性を持つ蛋白質の回収を極めて困難にする。ま
た、の方法は多くの動物由来の分泌蛋白質の生産手段
として用いられているものの、一般に培養可能な細胞濃
度が微生物と比較して低く、蛋白質の生産性も100mg/L
を越えることは殆ど期待できない。の方法は、酵母が
真核生物として動物と類似した細胞の基本構成を有して
おり、しかも安価な培地で高密度培養が可能であること
から血清アルブミンの生産方法として最も優れたもので
あると期待される。
【０００５】酵母での蛋白質生産においては生産された
蛋白質に付加された糖鎖が動物由来の場合と構造が異な
っており、そのために本来の活性を示さなかったりある
いは動物に抗原性を与えたりする場合があるが、血清ア
ルブミンはヒト、ラット、ウシで見る限りＮ−グリコシ
ル化サイトを欠いており、そのような問題は生じないと
考えられる。宿主酵母としては、Saccharomyces cerevi
siae、 Kluyveromyces lactis、 Pichis pastoris が良く
知られており、それぞれに独自の宿主−ベクター系が確
立されている。中でも Pichis pastorisは特に分泌発現
に適したものである。こうした背景のもと、酵母を宿主
とした遺伝子組換え手法に改良が重ねられ、経済的なＨ
ＳＡの生産方法が構築されつつある（例えば、特開平2-
117384号、特開平2-276589号、特開平3-83595 号、Slee
p, D. ら、Biotechnology、 8、 42(1990) 等）。
蛋白質に付加された糖鎖が動物由来の場合と構造が異な
っており、そのために本来の活性を示さなかったりある
いは動物に抗原性を与えたりする場合があるが、血清ア
ルブミンはヒト、ラット、ウシで見る限りＮ−グリコシ
ル化サイトを欠いており、そのような問題は生じないと
考えられる。宿主酵母としては、Saccharomyces cerevi
siae、 Kluyveromyces lactis、 Pichis pastoris が良く
知られており、それぞれに独自の宿主−ベクター系が確
立されている。中でも Pichis pastorisは特に分泌発現
に適したものである。こうした背景のもと、酵母を宿主
とした遺伝子組換え手法に改良が重ねられ、経済的なＨ
ＳＡの生産方法が構築されつつある（例えば、特開平2-
117384号、特開平2-276589号、特開平3-83595 号、Slee
p, D. ら、Biotechnology、 8、 42(1990) 等）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】現在までにヒト、ラッ
ト及びウシの血清アルブミンについては、その全アミノ
酸配列が明らかになっているが、有用な実験動物の一つ
であるウサギの血清アルブミンについてはアミノ酸配列
をはじめとして生化学的、生理学的な知見が殆ど得られ
ていないのが実情である。本発明者らはウサギのアルブ
ミンを暗号化する遺伝子（cDNAあるいは相補ＤＮＡ）を
単離することによりウサギ血清アルブミン及びその前駆
体であるウサギプレプロ血清アルブミンの全アミノ酸配
列を明らかにし、その遺伝子を微生物に導入することに
よって生産性の高いウサギ血清アルブミンの効率的な生
産方法を確立することを目的とする。
ト及びウシの血清アルブミンについては、その全アミノ
酸配列が明らかになっているが、有用な実験動物の一つ
であるウサギの血清アルブミンについてはアミノ酸配列
をはじめとして生化学的、生理学的な知見が殆ど得られ
ていないのが実情である。本発明者らはウサギのアルブ
ミンを暗号化する遺伝子（cDNAあるいは相補ＤＮＡ）を
単離することによりウサギ血清アルブミン及びその前駆
体であるウサギプレプロ血清アルブミンの全アミノ酸配
列を明らかにし、その遺伝子を微生物に導入することに
よって生産性の高いウサギ血清アルブミンの効率的な生
産方法を確立することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するためにＨＳＡを暗号化するＤＮＡ断片を化学
的に合成し、これをプローブとしたハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングを行ないウサギプレプロ血清アルブ
ミンを暗号化する遺伝子を単離し、この発明を完成し
た。
を解決するためにＨＳＡを暗号化するＤＮＡ断片を化学
的に合成し、これをプローブとしたハイブリダイゼーシ
ョンスクリーニングを行ないウサギプレプロ血清アルブ
ミンを暗号化する遺伝子を単離し、この発明を完成し
た。
【０００８】すなわち、本発明は、下記式［Ｉ］で示さ
れるポリペプチドを暗号化するウサギプレプロ血清アル
ブミン遺伝子を提供する。 （Ｎ末端） Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Val Gly Glu Glu His Phe Ile Gly Leu Val Leu Ile Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ala Lys Leu Val Lys Glu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Asp Ile Phe Gly Asp Lys Ile Cys Ala Leu Pro Ser Leu Arg Asp Thr Tyr Gly Asp Val Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu His His Lys Asp Asp Lys Pro Asp Leu Pro Pro Phe Ala Arg Pro Glu Ala Asp Val Leu Cys Lys Ala Phe His Asp Asp Glu Lys Ala Phe Phe Gly His Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Lys Tyr Lys Ala Ile Leu Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Leu Lys Glu Lys Ala Leu Ile Ser Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Cys Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Ala Trp Ala Leu Val Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Ile Ser Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu His Gln Glu Thr Ile Ser Ser His Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Ile Leu Glu Lys Ala His Cys Ile Tyr Gly Leu His Asn Asp Glu Thr Pro Ala Gly Leu Pro Ala Val Ala Glu Glu Phe Val Glu Asp Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Glu Glu Ala Lys Asp Leu Phe Leu Gly Lys Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Lys Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu Phe Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Tyr Asn Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asp Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gly Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Thr Glu Arg Lys Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro His Ala Thr Asn Asp Gln Leu Lys Thr Val Val Gly Glu Phe Thr Ala Leu Leu Asp Lys Cys Cys Ser Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly （Ｃ末端） ［Ｉ］
れるポリペプチドを暗号化するウサギプレプロ血清アル
ブミン遺伝子を提供する。 （Ｎ末端） Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Val Gly Glu Glu His Phe Ile Gly Leu Val Leu Ile Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ala Lys Leu Val Lys Glu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Asp Ile Phe Gly Asp Lys Ile Cys Ala Leu Pro Ser Leu Arg Asp Thr Tyr Gly Asp Val Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu His His Lys Asp Asp Lys Pro Asp Leu Pro Pro Phe Ala Arg Pro Glu Ala Asp Val Leu Cys Lys Ala Phe His Asp Asp Glu Lys Ala Phe Phe Gly His Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Lys Tyr Lys Ala Ile Leu Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Leu Lys Glu Lys Ala Leu Ile Ser Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Cys Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Ala Trp Ala Leu Val Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Ile Ser Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu His Gln Glu Thr Ile Ser Ser His Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Ile Leu Glu Lys Ala His Cys Ile Tyr Gly Leu His Asn Asp Glu Thr Pro Ala Gly Leu Pro Ala Val Ala Glu Glu Phe Val Glu Asp Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Glu Glu Ala Lys Asp Leu Phe Leu Gly Lys Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Lys Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu Phe Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Tyr Asn Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asp Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gly Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Thr Glu Arg Lys Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro His Ala Thr Asn Asp Gln Leu Lys Thr Val Val Gly Glu Phe Thr Ala Leu Leu Asp Lys Cys Cys Ser Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly （Ｃ末端） ［Ｉ］
【０００９】さらに、本発明は、下記式で示されるＤＮ
Ａ配列を含むウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子を提
供する。 （５’） ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATC TCC CTT CTT TTC CTC TTC AGC TCT GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CGC CGA GAA GCA CAT AAA AGT GAG ATT GCT CAT CGG TTT AAT GAT GTG GGA GAA GAA CAT TTC ATA GGC CTG GTG CTG ATT ACC TTT TCT CAG TAT CTC CAG AAG TGC CCA TAT GAA GAG CAT GCG AAG TTA GTG AAG GAA GTA ACA GAC TTG GCA AAA GCA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCA GCA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT GAT ATT TTT GGA GAC AAA ATC TGT GCA TTG CCA AGT CTT CGT GAC ACC TAT GGT GAC GTG GCT GAC TGC TGT GAG AAA AAA GAA CCT GAG CGA AAC GAA TGC TTC CTG CAC CAC AAG GAT GAT AAA CCC GAC TTG CCT CCG TTT GCG AGA CCA GAA GCT GAT GTT TTG TGC AAA GCC TTT CAT GAT GAT GAA AAG GCA TTC TTT GGA CAC TAT TTA TAT GAA GTT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCT GAA CTC CTT TAC TAT GCT CAG AAG TAC AAA GCC ATT CTA ACA GAA TGT TGC GAA GCT GCT GAT AAA GGG GCC TGC CTC ACA CCT AAG CTT GAT GCT TTG AAG GAA AAA GCC CTG ATT TCA GCT GCC CAA GAG AGA CTC AGG TGT GCC AGT ATT CAG AAA TTT GGA GAC AGA GCT TAC AAA GCA TGG GCA CTT GTT CGT CTG AGC CAA AGA TTT CCC AAG GCT GAC TTC ACA GAC ATT TCC AAG ATA GTG ACA GAT CTC ACC AAA GTC CAC AAG GAA TGC TGC CAC GGT GAC CTG CTT GAA TGT GCA GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAC ATG TGT GAA CAT CAG GAA ACA ATC TCC AGT CAT CTG AAG GAA TGC TGT GAT AAG CCA ATA TTG GGA AAA GCC CAC TGC ATT TAT GGT TTG CAT AAT GAT GAG ACA CCT GCT GGC TTG CCA GCA GTA GCT GAG GAA TTT GTT GAG GAT AAG GAT GTT TGC AAA AAT TAT GAA GAG GCA AAA GAT CTC TTC TTG GGC AAG TTT TTG TAT GAG TAT TCA AGA AGG CAC CCT GAT TAC TCT GTC GTT CTG CTG CTG AGA CTT GGC AAG GCC TAT GAA GCC ACC CTG AAA AAG TGC TGT GCC ACT GAT GAC CCT CAC GCA TGC TAT GCC AAA GTG CTT GAT GAG TTT CAG CCT CTT GTG GAT GAA CCC AAG AAT TTA GTG AAA CAA AAC TGT GAA CTC TAT GAG CAG CTT GGT GAC TAC AAC TTC CAA AAT GCG CTC CTA GTT CGT TAT ACC AAG AAA GTA CCT CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTC GTG GAA ATA TCA AGA AGC CTA GGA AAA GTG GGC AGC AAG TGC TGT AAG CAT CCT GAA GCA GAA AGA CTG CCT TGT GTT GAA GAT TAT CTG TCC GTG GTC CTG AAC AGG TTG TGC GTG TTG CAT GAG AAG ACA CCA GTG AGT GAG AAA GTC ACC AAA TGC TGC TCA GAG TCA TTG GTC GAC AGA CGA CCA TGC TTT AGC GCC CTG GGC CCC GAT GAA ACA TAC GTC CCC AAA GAA TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCG GAC ATA TGC ACT CTT CCA GAA ACG GAG AGG AAA ATC AAG AAA CAA ACG GCA CTT GTT GAG TTG GTG AAA CAC AAG CCC CAC GCA ACA AAT GAT CAA CTG AAA ACT GTT GTT GGA GAG TTC ACA GCT TTG TTA GAC AAG TGC TGC AGT GCT GAA GAC AAG GAG GCC TGC TTT GCT GTG GAG GGT CCA AAA CTT GTT GAA TCA AGT AAA GCT ACC TTA GGC （３’） ［II］
Ａ配列を含むウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子を提
供する。 （５’） ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATC TCC CTT CTT TTC CTC TTC AGC TCT GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CGC CGA GAA GCA CAT AAA AGT GAG ATT GCT CAT CGG TTT AAT GAT GTG GGA GAA GAA CAT TTC ATA GGC CTG GTG CTG ATT ACC TTT TCT CAG TAT CTC CAG AAG TGC CCA TAT GAA GAG CAT GCG AAG TTA GTG AAG GAA GTA ACA GAC TTG GCA AAA GCA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCA GCA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT GAT ATT TTT GGA GAC AAA ATC TGT GCA TTG CCA AGT CTT CGT GAC ACC TAT GGT GAC GTG GCT GAC TGC TGT GAG AAA AAA GAA CCT GAG CGA AAC GAA TGC TTC CTG CAC CAC AAG GAT GAT AAA CCC GAC TTG CCT CCG TTT GCG AGA CCA GAA GCT GAT GTT TTG TGC AAA GCC TTT CAT GAT GAT GAA AAG GCA TTC TTT GGA CAC TAT TTA TAT GAA GTT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCT GAA CTC CTT TAC TAT GCT CAG AAG TAC AAA GCC ATT CTA ACA GAA TGT TGC GAA GCT GCT GAT AAA GGG GCC TGC CTC ACA CCT AAG CTT GAT GCT TTG AAG GAA AAA GCC CTG ATT TCA GCT GCC CAA GAG AGA CTC AGG TGT GCC AGT ATT CAG AAA TTT GGA GAC AGA GCT TAC AAA GCA TGG GCA CTT GTT CGT CTG AGC CAA AGA TTT CCC AAG GCT GAC TTC ACA GAC ATT TCC AAG ATA GTG ACA GAT CTC ACC AAA GTC CAC AAG GAA TGC TGC CAC GGT GAC CTG CTT GAA TGT GCA GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAC ATG TGT GAA CAT CAG GAA ACA ATC TCC AGT CAT CTG AAG GAA TGC TGT GAT AAG CCA ATA TTG GGA AAA GCC CAC TGC ATT TAT GGT TTG CAT AAT GAT GAG ACA CCT GCT GGC TTG CCA GCA GTA GCT GAG GAA TTT GTT GAG GAT AAG GAT GTT TGC AAA AAT TAT GAA GAG GCA AAA GAT CTC TTC TTG GGC AAG TTT TTG TAT GAG TAT TCA AGA AGG CAC CCT GAT TAC TCT GTC GTT CTG CTG CTG AGA CTT GGC AAG GCC TAT GAA GCC ACC CTG AAA AAG TGC TGT GCC ACT GAT GAC CCT CAC GCA TGC TAT GCC AAA GTG CTT GAT GAG TTT CAG CCT CTT GTG GAT GAA CCC AAG AAT TTA GTG AAA CAA AAC TGT GAA CTC TAT GAG CAG CTT GGT GAC TAC AAC TTC CAA AAT GCG CTC CTA GTT CGT TAT ACC AAG AAA GTA CCT CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTC GTG GAA ATA TCA AGA AGC CTA GGA AAA GTG GGC AGC AAG TGC TGT AAG CAT CCT GAA GCA GAA AGA CTG CCT TGT GTT GAA GAT TAT CTG TCC GTG GTC CTG AAC AGG TTG TGC GTG TTG CAT GAG AAG ACA CCA GTG AGT GAG AAA GTC ACC AAA TGC TGC TCA GAG TCA TTG GTC GAC AGA CGA CCA TGC TTT AGC GCC CTG GGC CCC GAT GAA ACA TAC GTC CCC AAA GAA TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCG GAC ATA TGC ACT CTT CCA GAA ACG GAG AGG AAA ATC AAG AAA CAA ACG GCA CTT GTT GAG TTG GTG AAA CAC AAG CCC CAC GCA ACA AAT GAT CAA CTG AAA ACT GTT GTT GGA GAG TTC ACA GCT TTG TTA GAC AAG TGC TGC AGT GCT GAA GAC AAG GAG GCC TGC TTT GCT GTG GAG GGT CCA AAA CTT GTT GAA TCA AGT AAA GCT ACC TTA GGC （３’） ［II］
【００１０】さらに、本発明は、上記式［Ｉ］あるいは
［II］で表わされる遺伝子が Pichia pastorisのアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子発現調節配列の制御下に連結さ
れたプラスミドＤＮＡを提供する。
［II］で表わされる遺伝子が Pichia pastorisのアルコ
ールオキシダーゼ遺伝子発現調節配列の制御下に連結さ
れたプラスミドＤＮＡを提供する。
【００１１】さらに、上記プラスミドＤＮＡによって形
質転換された微生物を提供する。
質転換された微生物を提供する。
【００１２】さらに、上記微生物を培養し、その培養物
からウサギ血清アルブミンを採取することを特徴とする
ウサギ血清アルブミンの製造方法を提供する。
からウサギ血清アルブミンを採取することを特徴とする
ウサギ血清アルブミンの製造方法を提供する。
【００１３】本発明において、ＨＳＡを暗号化するＤＮ
Ａ断片を化学的に合成し、これをプローブとしたハイブ
リダイゼーションスクリーニングを行ないウサギ血清ア
ルブミンを暗号化する遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離するこ
とができた。この結果、ＲＳＡは５８４アミノ酸残基か
ら成るポリペプチドであり、予想されたようにＮ−グリ
コシル化配列（Asn-X-Ser あるいはAsn-X-Thr)を欠いて
いることが判明した。また、ウサギプレプロ血清アルブ
ミンは６０８アミノ酸残基よりなり、ヒトと全く同じプ
レプロ配列を有することも明らかになった。これより成
熟蛋白質になるためにプロセスされる部位は両者で共通
であることが示唆された。
Ａ断片を化学的に合成し、これをプローブとしたハイブ
リダイゼーションスクリーニングを行ないウサギ血清ア
ルブミンを暗号化する遺伝子（ｃＤＮＡ）を単離するこ
とができた。この結果、ＲＳＡは５８４アミノ酸残基か
ら成るポリペプチドであり、予想されたようにＮ−グリ
コシル化配列（Asn-X-Ser あるいはAsn-X-Thr)を欠いて
いることが判明した。また、ウサギプレプロ血清アルブ
ミンは６０８アミノ酸残基よりなり、ヒトと全く同じプ
レプロ配列を有することも明らかになった。これより成
熟蛋白質になるためにプロセスされる部位は両者で共通
であることが示唆された。
【００１４】単離したＲＳＡ遺伝子を用いて酵母を宿主
とする方法でＲＳＡを製造することができる。本発明に
おいて、ＲＳＡの生産は Pichis pastoris GTS 115株を
宿主とする方法を用いることが好ましい。以下、ＲＳＡ
の製造方法については、Pichia pastoris を宿主とする
方法を例に説明する。この株はＮＲＲＬに受託番号ＮＲ
ＲＬＹ−１５８５１として寄託されており、栄養要求マ
ーカーとしてhis4を有するものである。すなわち、この
株は野生型の遺伝子ＨＩＳ４によって相補され、最小栄
養培地での生育が可能になる。
とする方法でＲＳＡを製造することができる。本発明に
おいて、ＲＳＡの生産は Pichis pastoris GTS 115株を
宿主とする方法を用いることが好ましい。以下、ＲＳＡ
の製造方法については、Pichia pastoris を宿主とする
方法を例に説明する。この株はＮＲＲＬに受託番号ＮＲ
ＲＬＹ−１５８５１として寄託されており、栄養要求マ
ーカーとしてhis4を有するものである。すなわち、この
株は野生型の遺伝子ＨＩＳ４によって相補され、最小栄
養培地での生育が可能になる。
【００１５】ＨＩＳ４遺伝子を有するプラスミドＤＮＡ
はフィリプスペトリアム社により開示されており（特開
昭63-164891 号）、これらを用いて外来遺伝子を菌体に
導入することができる。例えば、 pTHFKΔは自律増殖プ
ラスミドであり、挿入した遺伝子は染色体とは独立して
増殖し、多コピーで存在する。pAO804は染色体組み込み
用プラスミドであり、導入した遺伝子はアルコールオキ
シダーゼ（ＡＯＸ）遺伝子の上流と下流のＤＮＡ配列を
介した相同的組換えにより染色体に組み込まれる。 pTH
FKΔは外来遺伝子を迅速に菌体に導入するのに適してお
り、一方pAO804は安定に外来遺伝子を保持した形質転換
体を得るのに適している。ただし、このとき宿主のＡＯ
Ｘ遺伝子は外来遺伝子によって置き替わるので、宿主は
アルコールオキシダーゼ活性を殆ど完全に失い、メタノ
ールを唯一の炭素源とした培地（メタノール培地）での
増殖は極端に押えられるという特徴を有する。それぞれ
のタイプの形質転換体をメタノール資化性の有無により
Ｍｕｔ+ 、Ｍｕｔ- と略記する。
はフィリプスペトリアム社により開示されており（特開
昭63-164891 号）、これらを用いて外来遺伝子を菌体に
導入することができる。例えば、 pTHFKΔは自律増殖プ
ラスミドであり、挿入した遺伝子は染色体とは独立して
増殖し、多コピーで存在する。pAO804は染色体組み込み
用プラスミドであり、導入した遺伝子はアルコールオキ
シダーゼ（ＡＯＸ）遺伝子の上流と下流のＤＮＡ配列を
介した相同的組換えにより染色体に組み込まれる。 pTH
FKΔは外来遺伝子を迅速に菌体に導入するのに適してお
り、一方pAO804は安定に外来遺伝子を保持した形質転換
体を得るのに適している。ただし、このとき宿主のＡＯ
Ｘ遺伝子は外来遺伝子によって置き替わるので、宿主は
アルコールオキシダーゼ活性を殆ど完全に失い、メタノ
ールを唯一の炭素源とした培地（メタノール培地）での
増殖は極端に押えられるという特徴を有する。それぞれ
のタイプの形質転換体をメタノール資化性の有無により
Ｍｕｔ+ 、Ｍｕｔ- と略記する。
【００１６】酵母の形質転換はスフェロプラスト法（Cr
egg、 J.M.ら、Molec. Cell. Biol.5、 3376 (1985))ある
いはＬｉＣｌを用いた方法（特開平1-128790) に従って
行なうことができる。
egg、 J.M.ら、Molec. Cell. Biol.5、 3376 (1985))ある
いはＬｉＣｌを用いた方法（特開平1-128790) に従って
行なうことができる。
【００１７】また、形質転換された菌は通常の方法で培
養することができる。Pichia pastoris の場合には、酵
母エキスを含んだ富栄養培地以外にも無機塩類とビタミ
ン、炭素源（グリセロールあるいはメタノール）のみか
らなる培地を用いることもでき、培養コストにおいても
極めて有利な条件を提供する。
養することができる。Pichia pastoris の場合には、酵
母エキスを含んだ富栄養培地以外にも無機塩類とビタミ
ン、炭素源（グリセロールあるいはメタノール）のみか
らなる培地を用いることもでき、培養コストにおいても
極めて有利な条件を提供する。
【００１８】外来遺伝子は Pichia pastorisのＡＯＸ遺
伝子の転写制御配列の下流（３’側）に挿入される用に
ベクターがデザインされており、外来遺伝子の転写はメ
タノール非存在下で極めて低く抑えられる。従ってメタ
ノールによる誘導を菌体の増殖期以降に行なうことによ
って宿主にとって不適当な（毒性を示す）蛋白質の製造
も可能となる。ＲＳＡは宿主に毒性を示さないことが本
発明の過程で明らかになったが、非誘導時の低い転写活
性に対応してＲＳＡの分泌生産も非誘導時には全く検出
されなかった。メタノールによる誘導を受けた後、生産
性は著しく増加し菌体の増加とともに４日間以上の培養
期間にわたって持続した。
伝子の転写制御配列の下流（３’側）に挿入される用に
ベクターがデザインされており、外来遺伝子の転写はメ
タノール非存在下で極めて低く抑えられる。従ってメタ
ノールによる誘導を菌体の増殖期以降に行なうことによ
って宿主にとって不適当な（毒性を示す）蛋白質の製造
も可能となる。ＲＳＡは宿主に毒性を示さないことが本
発明の過程で明らかになったが、非誘導時の低い転写活
性に対応してＲＳＡの分泌生産も非誘導時には全く検出
されなかった。メタノールによる誘導を受けた後、生産
性は著しく増加し菌体の増加とともに４日間以上の培養
期間にわたって持続した。
【００１９】培地中に分泌されたＲＳＡは限外濾過膜濃
縮とクロマトグラフィー操作により精製され、ウサギ血
漿から精製されたアルブミンと極めて近い構造を持つ蛋
白質であることが明らかになった。すなわち、両者は同
じＮ末端アミノ酸配列を持つこと、同一の等電点を持つ
こと等が示された。
縮とクロマトグラフィー操作により精製され、ウサギ血
漿から精製されたアルブミンと極めて近い構造を持つ蛋
白質であることが明らかになった。すなわち、両者は同
じＮ末端アミノ酸配列を持つこと、同一の等電点を持つ
こと等が示された。
【００２０】血清アルブミンは１８アミノ酸残基より成
るシグナルペプチドのＣ末端側に６アミノ酸残基より成
るペプチドを持つ。プレペプチドが正しく切断されてい
たということは哺乳動物のプロ蛋白質を成熟蛋白質に変
換する酵素（いわゆるコンバーターゼ）と同等の働きを
持つ酵素（S. cerevisiae のＫＥＸ２遺伝子産物に相
当）が Pichia pastorisにもあることを示唆しており、
広く哺乳動物由来の蛋白質の分泌生産に適した宿主であ
る可能性を開くものである。
るシグナルペプチドのＣ末端側に６アミノ酸残基より成
るペプチドを持つ。プレペプチドが正しく切断されてい
たということは哺乳動物のプロ蛋白質を成熟蛋白質に変
換する酵素（いわゆるコンバーターゼ）と同等の働きを
持つ酵素（S. cerevisiae のＫＥＸ２遺伝子産物に相
当）が Pichia pastorisにもあることを示唆しており、
広く哺乳動物由来の蛋白質の分泌生産に適した宿主であ
る可能性を開くものである。
【００２１】
【発明の効果】本発明により、ウサギプレプロ血清アル
ブミン及びウサギ血清アルブミンの全アミノ酸配列及び
及びこれらを暗号化する遺伝子の全塩基配列が明らかに
され、さらに、遺伝子工学的手法によりウサギ血清アル
ブミンを大量に調製することが可能になった。ウサギ血
清アルブミンは動物細胞培養用培地の成分や薬剤のキャ
リアとして用いることができるので、本発明はこれらの
分野において大いに貢献するものと考えられる。
ブミン及びウサギ血清アルブミンの全アミノ酸配列及び
及びこれらを暗号化する遺伝子の全塩基配列が明らかに
され、さらに、遺伝子工学的手法によりウサギ血清アル
ブミンを大量に調製することが可能になった。ウサギ血
清アルブミンは動物細胞培養用培地の成分や薬剤のキャ
リアとして用いることができるので、本発明はこれらの
分野において大いに貢献するものと考えられる。
【００２２】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
るが、本発明はこれらに限られるものではない。
【００２３】実施例１ ＲＳＡのｃＤＮＡの単離 ＲＳＡを暗号化するｃＤＮＡを単離するための材料とし
てウサギ肝臓ｃＤＮＡライブラリー（clonetech 社製）
を用い、合成オリゴデオキシヌクレオチドをプローブと
するハイブリダイゼーション法によってｃＤＮＡ挿入配
列を持つλgt10ファージからのスクリーニングを行っ
た。 5' ArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGlu 3' AGGGGTGTGTTTCGTCGAGATGCACACAAGAGTGAG ＲＳＡの配列は未知であるので、上記のような３６ヌク
レオチドからなるＤＮＡ、すなわちプレプロＨＳＡのＮ
末端から１９番目から３０番目にかけてのアミノ酸配列
に対応するｃＤＮＡ配列（Lawnら、Nucleic Acids Re
s.、 9、 6103 (1981)) を化学的に合成した。合成は App
lide Biosystems 社製３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置により
行い、同社のオリゴヌクレオチドカートリッジを用いて
精製した。上記オリゴデオキシヌクレオチドを通常の方
法に従って５’末端の32Ｐによる標識を行ない、これを
プローブとしてナイロンメンブレン（Hybond-N+;アマシ
ャム社製）上でのプラークハイブリダイゼーションを行
った。ハイブリダイゼーションには５×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣは0.15M NaCl、 0.015M クエン酸３ナトリウム）、
４２℃の条件で、メンブレンの洗浄は２×ＳＳＣ、３７
℃の条件で行なった。約30、000のファージプラークから
約１００の陽性プラークを検出し、ここからｃＤＮＡ挿
入部分の長い１２クローンを選別した。さらに、この中
の２クローン（λclone13 とλclone19 ）について詳細
な解析を行った。
てウサギ肝臓ｃＤＮＡライブラリー（clonetech 社製）
を用い、合成オリゴデオキシヌクレオチドをプローブと
するハイブリダイゼーション法によってｃＤＮＡ挿入配
列を持つλgt10ファージからのスクリーニングを行っ
た。 5' ArgGlyValPheArgArgAspAlaHisLysSerGlu 3' AGGGGTGTGTTTCGTCGAGATGCACACAAGAGTGAG ＲＳＡの配列は未知であるので、上記のような３６ヌク
レオチドからなるＤＮＡ、すなわちプレプロＨＳＡのＮ
末端から１９番目から３０番目にかけてのアミノ酸配列
に対応するｃＤＮＡ配列（Lawnら、Nucleic Acids Re
s.、 9、 6103 (1981)) を化学的に合成した。合成は App
lide Biosystems 社製３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置により
行い、同社のオリゴヌクレオチドカートリッジを用いて
精製した。上記オリゴデオキシヌクレオチドを通常の方
法に従って５’末端の32Ｐによる標識を行ない、これを
プローブとしてナイロンメンブレン（Hybond-N+;アマシ
ャム社製）上でのプラークハイブリダイゼーションを行
った。ハイブリダイゼーションには５×ＳＳＣ（１×Ｓ
ＳＣは0.15M NaCl、 0.015M クエン酸３ナトリウム）、
４２℃の条件で、メンブレンの洗浄は２×ＳＳＣ、３７
℃の条件で行なった。約30、000のファージプラークから
約１００の陽性プラークを検出し、ここからｃＤＮＡ挿
入部分の長い１２クローンを選別した。さらに、この中
の２クローン（λclone13 とλclone19 ）について詳細
な解析を行った。
【００２４】実施例２ ｃＤＮＡの解析 実施例１で得られた２つのクローンλclone13 とλclon
e19 を種々の制限酵素によるマッピングを行ない、λcl
one13 とλclone19 の関係を決定した。λclone13 とλ
clone19 の制限酵素地図を図１に示す。λclone13 は開
始メチオニンを含む最も５’側のＤＮＡ配列を持ったク
ローンであること、λclone19 は終止コドンを含むクロ
ーンであることが分かった。また、図１中のHind III切
断部位は両者に共通であり、ここより５’側のＤＮＡ配
列はλclone13 を用いて、３’側のＤＮＡ配列はλclon
e19 を用いて決定することとした。先ず、λclone13 か
らEcoRI-Hind III断片を、λclone19 からHind III-Eco
RI断片をそれぞれBluescriptIIプラスミドベクター（St
ratagen 社製）に組み込み、Yanisch-Perron, C.らの方
法（Gene、 33、 103-119 (1985)) に従ってデレーション
シリーズを作製し、それぞれについてジデオキシ法（Sa
nger,F.ら Proc. Natl. Sci. USA、 74、 5463 (1977))
によりＤＮＡ配列の決定を行なった。このようにして決
定されたウサギプレプロ血清アルブミンを暗号化するｃ
ＤＮＡの配列と導かれるアミノ酸配列を図２に示す。Ｎ
末端から２５番目のグルタミン酸残基が成熟ＲＳＡのＮ
末端であることはシグマ社製精製ＲＳＡのＮ末端アミノ
酸配列の決定から裏付けられた（実施例７参照）。導き
出されたアミノ酸配列はウサギプレプロ血清アルブミン
が６０８アミノ酸残基よりなり、成熟蛋白質は５８４ア
ミノ酸残基より成ることを示している。ウサギプレプロ
血清アルブミンは全域にわたってプレプロＨＳＡと高い
相同性（７５％）を示し、特にプレプロ配列２４アミノ
酸残基は全く同一であった。また、成熟蛋白質中にある
３５のシステイン残基についても両者の間で完全に保存
されていた。
e19 を種々の制限酵素によるマッピングを行ない、λcl
one13 とλclone19 の関係を決定した。λclone13 とλ
clone19 の制限酵素地図を図１に示す。λclone13 は開
始メチオニンを含む最も５’側のＤＮＡ配列を持ったク
ローンであること、λclone19 は終止コドンを含むクロ
ーンであることが分かった。また、図１中のHind III切
断部位は両者に共通であり、ここより５’側のＤＮＡ配
列はλclone13 を用いて、３’側のＤＮＡ配列はλclon
e19 を用いて決定することとした。先ず、λclone13 か
らEcoRI-Hind III断片を、λclone19 からHind III-Eco
RI断片をそれぞれBluescriptIIプラスミドベクター（St
ratagen 社製）に組み込み、Yanisch-Perron, C.らの方
法（Gene、 33、 103-119 (1985)) に従ってデレーション
シリーズを作製し、それぞれについてジデオキシ法（Sa
nger,F.ら Proc. Natl. Sci. USA、 74、 5463 (1977))
によりＤＮＡ配列の決定を行なった。このようにして決
定されたウサギプレプロ血清アルブミンを暗号化するｃ
ＤＮＡの配列と導かれるアミノ酸配列を図２に示す。Ｎ
末端から２５番目のグルタミン酸残基が成熟ＲＳＡのＮ
末端であることはシグマ社製精製ＲＳＡのＮ末端アミノ
酸配列の決定から裏付けられた（実施例７参照）。導き
出されたアミノ酸配列はウサギプレプロ血清アルブミン
が６０８アミノ酸残基よりなり、成熟蛋白質は５８４ア
ミノ酸残基より成ることを示している。ウサギプレプロ
血清アルブミンは全域にわたってプレプロＨＳＡと高い
相同性（７５％）を示し、特にプレプロ配列２４アミノ
酸残基は全く同一であった。また、成熟蛋白質中にある
３５のシステイン残基についても両者の間で完全に保存
されていた。
【００２５】実施例３ 発現用プラスミドの構築第１段階 ＲＳＡカセットの作製（図３参照） λclone13 から0.61KbのBamHI-Hind III断片を単離し、
これと化学合成した以下のオリゴヌクレオチドをBluesc
riptII- ＳＫ- ベクターのSalI-Hind III 部位に組み込
みpRN01 とした。 次に、λclone19 から1.4Kb のHind III-EcoRI断片を
単離し、これをpRNO1 のHind III-EcoRI部位に組み込ん
でpRT01 とした。
これと化学合成した以下のオリゴヌクレオチドをBluesc
riptII- ＳＫ- ベクターのSalI-Hind III 部位に組み込
みpRN01 とした。 次に、λclone19 から1.4Kb のHind III-EcoRI断片を
単離し、これをpRNO1 のHind III-EcoRI部位に組み込ん
でpRT01 とした。
【００２６】第２段階 自己増殖ＲＳＡ発現ベクターの
構築（図４参照） pTHFK ΔをNspV-EcoRIで切断し、これにpRT01から切り
出した2.0Kb のNspV-EcoRI断片（ＲＳＡカッセト配列）
を組み込んでpYRSA2とした。
構築（図４参照） pTHFK ΔをNspV-EcoRIで切断し、これにpRT01から切り
出した2.0Kb のNspV-EcoRI断片（ＲＳＡカッセト配列）
を組み込んでpYRSA2とした。
【００２７】第３段階 染色体組み込み型ベクターの構
築（図５参照） pAO804をEcoRI-PstIで切断して5.6Kb 断片を単離し、別
にpAO804をNspV-PstIで切断して1.8Kb 断片を単離し
た。これらと第２段階で調製したＲＳＡカッセト配列を
酵素的に結合させpYRSA1を得た。これをClaIで切断し、
BamHI リンカーを結合させ、次にEcoRI-BamHI で切断し
て3.0kb 断片を単離した。また、pAO804をBgl IIで切断
し、BamHI リンカーを結合させ、次にEcoRI-BamHI で切
断して2.3Kb 断片を単離した。これらをBluescript II
−ＳＫ- ベクターのBamHI 部位に図５で示されるような
方向で挿入し、染色体組み込み型ベクターpYRSA3を構築
した。
築（図５参照） pAO804をEcoRI-PstIで切断して5.6Kb 断片を単離し、別
にpAO804をNspV-PstIで切断して1.8Kb 断片を単離し
た。これらと第２段階で調製したＲＳＡカッセト配列を
酵素的に結合させpYRSA1を得た。これをClaIで切断し、
BamHI リンカーを結合させ、次にEcoRI-BamHI で切断し
て3.0kb 断片を単離した。また、pAO804をBgl IIで切断
し、BamHI リンカーを結合させ、次にEcoRI-BamHI で切
断して2.3Kb 断片を単離した。これらをBluescript II
−ＳＫ- ベクターのBamHI 部位に図５で示されるような
方向で挿入し、染色体組み込み型ベクターpYRSA3を構築
した。
【００２８】実施例４ 形質転換体の作製 Pichis pastoris GTS115株からCregg, J.M. らの方法
（Molec. Cell. Biol.、 5、 3376 (1985)) 及び特開平2-
104290号に開示の方法に従ってスフェロプラストを調製
し、pYRSA2あるいはBamHI によって線状化したpYRSA3で
形質転換した。最小栄養培地で生育したヒスチジン要求
性を失った形質転換菌から単クローン分離を行ない、特
に後者についてはメタノール培地上での生育が殆ど見ら
れない、従って宿主のＡＯＸ遺伝子がＲＳＡ遺伝子配列
によって置き替わっているものを選択した。便宜的にpY
RSA2による形質転換株をＭｕｔ+ 株、pYRSA3による形質
転換株をＭｕｔ- 株と呼ぶ。
（Molec. Cell. Biol.、 5、 3376 (1985)) 及び特開平2-
104290号に開示の方法に従ってスフェロプラストを調製
し、pYRSA2あるいはBamHI によって線状化したpYRSA3で
形質転換した。最小栄養培地で生育したヒスチジン要求
性を失った形質転換菌から単クローン分離を行ない、特
に後者についてはメタノール培地上での生育が殆ど見ら
れない、従って宿主のＡＯＸ遺伝子がＲＳＡ遺伝子配列
によって置き替わっているものを選択した。便宜的にpY
RSA2による形質転換株をＭｕｔ+ 株、pYRSA3による形質
転換株をＭｕｔ- 株と呼ぶ。
【００２９】実施例５ ＲＳＡ発現の確認 実施例４で得られたＭｕｔ+ 株あるいはＭｕｔ+ 株を10
0ml の１％グリセロール含有培地でOD600 が１１ないし
１４となるまで３０℃で振盪培養し、細胞を0.5%メタノ
ール含有培地に移し、引き続き４日間培養を続けた。培
養物を遠心操作により上清と細胞画分に分け、それぞれ
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。さらに同じサンプ
ルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜にブロッ
トし、抗ＲＳＡヤギ血清を用いて免疫反応物を検出し
た。その結果、図６に示すようにＲＳＡの発現が確認さ
れた。また、４日間培養後の培養上清の蛋白質量をBrad
ford法(Anal. Biochem. 72、248 (1976)) によって測定
したところ、Ｍｕｔ+ 株、Ｍｕｔ- 株それぞれについて
ほぼ同じ200mg/L という値が得られた。Pichia pastori
s はこの培養条件下で殆ど蛋白質を分泌しない（10mg/L
未満）ので、得られた値はほぼＲＳＡの蛋白質量を表わ
すと考えられる。
0ml の１％グリセロール含有培地でOD600 が１１ないし
１４となるまで３０℃で振盪培養し、細胞を0.5%メタノ
ール含有培地に移し、引き続き４日間培養を続けた。培
養物を遠心操作により上清と細胞画分に分け、それぞれ
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。さらに同じサンプ
ルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜にブロッ
トし、抗ＲＳＡヤギ血清を用いて免疫反応物を検出し
た。その結果、図６に示すようにＲＳＡの発現が確認さ
れた。また、４日間培養後の培養上清の蛋白質量をBrad
ford法(Anal. Biochem. 72、248 (1976)) によって測定
したところ、Ｍｕｔ+ 株、Ｍｕｔ- 株それぞれについて
ほぼ同じ200mg/L という値が得られた。Pichia pastori
s はこの培養条件下で殆ど蛋白質を分泌しない（10mg/L
未満）ので、得られた値はほぼＲＳＡの蛋白質量を表わ
すと考えられる。
【００３０】実施例６ 実施例４で得られたＭｕｔ- 株を１６リットル容のファ
ーメンターに実液１１リットルで培養し、メタノール誘
導１１０時間後に遠心操作によって培養上清７リットル
を回収した。これをＴＳ−１０膜（東ソー社製）で濾過
して高分子物質を除去した後、ＴＳ−１０膜を用いて濃
縮し、濃縮液４リットルを得た。この一部を２０mM Tri
s-HCl (pH7.0) に対して４℃で一晩透析した後、DEAE-T
OYOPEARL650（東ソー社製）カラムにアプライし、０〜
0.5M NaCl グラジエントによる溶出を行なった。ＲＳＡ
の画分を酢酸亜鉛で平衡化したＺｎ−キレートカラム(C
helating Sepharose Fast Flow；ファルマシア社製）に
アプライし、０〜0.2Mグリシンによる溶出を行なってＲ
ＳＡ画分を分取した。上記精製法と平行して精密精製を
以下のようにして行なった。上記透析物をＤＥＡＥ−５
ＰＷ（東ソー社製）にアプライし、０〜0.5M NaCl グラ
ジエントによる溶出を行なった。ＲＳＡの画分を酢酸亜
鉛で平衡化したキレート５ＰＷ（東ソー社製）にアプラ
イし、０〜0.2Mグリシンによる溶出を行なってＲＳＡ画
分を分取した。さらに、これをG3000SWXL （東ソー社
製）を２本つないだカラムを用いたゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけ最終精製品を得た。
ーメンターに実液１１リットルで培養し、メタノール誘
導１１０時間後に遠心操作によって培養上清７リットル
を回収した。これをＴＳ−１０膜（東ソー社製）で濾過
して高分子物質を除去した後、ＴＳ−１０膜を用いて濃
縮し、濃縮液４リットルを得た。この一部を２０mM Tri
s-HCl (pH7.0) に対して４℃で一晩透析した後、DEAE-T
OYOPEARL650（東ソー社製）カラムにアプライし、０〜
0.5M NaCl グラジエントによる溶出を行なった。ＲＳＡ
の画分を酢酸亜鉛で平衡化したＺｎ−キレートカラム(C
helating Sepharose Fast Flow；ファルマシア社製）に
アプライし、０〜0.2Mグリシンによる溶出を行なってＲ
ＳＡ画分を分取した。上記精製法と平行して精密精製を
以下のようにして行なった。上記透析物をＤＥＡＥ−５
ＰＷ（東ソー社製）にアプライし、０〜0.5M NaCl グラ
ジエントによる溶出を行なった。ＲＳＡの画分を酢酸亜
鉛で平衡化したキレート５ＰＷ（東ソー社製）にアプラ
イし、０〜0.2Mグリシンによる溶出を行なってＲＳＡ画
分を分取した。さらに、これをG3000SWXL （東ソー社
製）を２本つないだカラムを用いたゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけ最終精製品を得た。
【００３１】実施例７ 実施例６で得られた精密精製品とシグマ社製精製ＲＳＡ
標品についてAppliedBiosystems社製の Protein Sequen
cer477A を用いてＮ末端アミノ酸配列を下記のように決
定した。 Ａ：ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列 Ｂ：形質転換ピキア菌の培養上清から精製されたＲＳＡ Ｃ：シグマ社製精製ＲＳＡ
標品についてAppliedBiosystems社製の Protein Sequen
cer477A を用いてＮ末端アミノ酸配列を下記のように決
定した。 Ａ：ｃＤＮＡから予想されるアミノ酸配列 Ｂ：形質転換ピキア菌の培養上清から精製されたＲＳＡ Ｃ：シグマ社製精製ＲＳＡ
【００３２】実施例８ 実施例７で得られた精密精製品とシグマ社製精製ＲＳＡ
標品について直径2.5mm のディスクゲルを用いた等電点
電気泳動法（0'Farell, P.H. 、 J. Biol. Chem. 250、 4
007 (1975)) によって分析した。その結果を図７に示
す。レーン１は等電点マーカー、レーン２はシグマ社製
ＲＳＡ、レーン３は形質転換菌から精製されたサンプル
の分析結果である。これから明らかなように、本発明の
方法で得られたＲＳＡはウサギ血漿から精製されたアル
ブミン標品と極めて近い構造を持つ蛋白質であることが
分かる。
標品について直径2.5mm のディスクゲルを用いた等電点
電気泳動法（0'Farell, P.H. 、 J. Biol. Chem. 250、 4
007 (1975)) によって分析した。その結果を図７に示
す。レーン１は等電点マーカー、レーン２はシグマ社製
ＲＳＡ、レーン３は形質転換菌から精製されたサンプル
の分析結果である。これから明らかなように、本発明の
方法で得られたＲＳＡはウサギ血漿から精製されたアル
ブミン標品と極めて近い構造を持つ蛋白質であることが
分かる。
【図１】ＲＳＡのｃＤＮＡを含む２種類のラムダファー
ジクローンλclone13 及びλclone19 の制限酵素地図を
表わす。図中、太線部分はラムダファージベクターのア
ーム部分を、２つのアームに挟まれた実線部分はｃＤＮ
Ａ配列部分を示す。
ジクローンλclone13 及びλclone19 の制限酵素地図を
表わす。図中、太線部分はラムダファージベクターのア
ーム部分を、２つのアームに挟まれた実線部分はｃＤＮ
Ａ配列部分を示す。
【図２】ＲＳＡを暗号化するｃＤＮＡの塩基配列と導か
れるアミノ酸配列を表わす。
れるアミノ酸配列を表わす。
【図３】ＲＳＡカセットの作製手順を示す。
【図４】自立増殖型ＲＳＡ発現ベクターの構築手順を示
す。
す。
【図５】染色体組み込み型ＲＳＡ発現ベクターの構築手
順を示す。
順を示す。
【図６】pYRSA2で形質転換された Pichia pastoris GTS
115 の培養上清及び細胞画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。
115 の培養上清及び細胞画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す。
【図７】本発明の方法により得られたＲＳＡの等電点電
気泳動の結果を表わす。
気泳動の結果を表わす。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84）
Claims (6)
- 【請求項１】下記式で示されるポリペプチドを暗号化す
るウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子。 （Ｎ末端） Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Phe Asn Asp Val Gly Glu Glu His Phe Ile Gly Leu Val Leu Ile Thr Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Lys Cys Pro Tyr Glu Glu His Ala Lys Leu Val Lys Glu Val Thr Asp Leu Ala Lys Ala Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Asp Ile Phe Gly Asp Lys Ile Cys Ala Leu Pro Ser Leu Arg Asp Thr Tyr Gly Asp Val Ala Asp Cys Cys Glu Lys Lys Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu His His Lys Asp Asp Lys Pro Asp Leu Pro Pro Phe Ala Arg Pro Glu Ala Asp Val Leu Cys Lys Ala Phe His Asp Asp Glu Lys Ala Phe Phe Gly His Tyr Leu Tyr Glu Val Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Gln Lys Tyr Lys Ala Ile Leu Thr Glu Cys Cys Glu Ala Ala Asp Lys Gly Ala Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Ala Leu Lys Glu Lys Ala Leu Ile Ser Ala Ala Gln Glu Arg Leu Arg Cys Ala Ser Ile Gln Lys Phe Gly Asp Arg Ala Tyr Lys Ala Trp Ala Leu Val Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Asp Phe Thr Asp Ile Ser Lys Ile Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu His Gln Glu Thr Ile Ser Ser His Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys Pro Ile Leu Glu Lys Ala His Cys Ile Tyr Gly Leu His Asn Asp Glu Thr Pro Ala Gly Leu Pro Ala Val Ala Glu Glu Phe Val Glu Asp Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Glu Glu Ala Lys Asp Leu Phe Leu Gly Lys Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Gly Lys Ala Tyr Glu Ala Thr Leu Lys Lys Cys Cys Ala Thr Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ala Lys Val Leu Asp Glu Phe Gln Pro Leu Val Asp Glu Pro Lys Asn Leu Val Lys Gln Asn Cys Glu Leu Tyr Glu Gln Leu Gly Asp Tyr Asn Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Glu Arg Leu Pro Cys Val Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val Thr Lys Cys Cys Ser Glu Ser Leu Val Asp Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Gly Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Glu Thr Glu Arg Lys Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro His Ala Thr Asn Asp Gln Leu Lys Thr Val Val Gly Glu Phe Thr Ala Leu Leu Asp Lys Cys Cys Ser Ala Glu Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Glu Ser Ser Lys Ala Thr Leu Gly （Ｃ末端） - 【請求項２】下記式で示されるＤＮＡ配列を含むウサギ
プレプロ血清アルブミン遺伝子。 （５’） ATG AAG TGG GTA ACC TTT ATC TCC CTT CTT TTC CTC TTC AGC TCT GCT TAT TCC AGG GGT GTG TTT CGC CGA GAA GCA CAT AAA AGT GAG ATT GCT CAT CGG TTT AAT GAT GTG GGA GAA GAA CAT TTC ATA GGC CTG GTG CTG ATT ACC TTT TCT CAG TAT CTC CAG AAG TGC CCA TAT GAA GAG CAT GCG AAG TTA GTG AAG GAA GTA ACA GAC TTG GCA AAA GCA TGT GTT GCT GAT GAG TCA GCA GCA AAT TGT GAC AAA TCA CTT CAT GAT ATT TTT GGA GAC AAA ATC TGT GCA TTG CCA AGT CTT CGT GAC ACC TAT GGT GAC GTG GCT GAC TGC TGT GAG AAA AAA GAA CCT GAG CGA AAC GAA TGC TTC CTG CAC CAC AAG GAT GAT AAA CCC GAC TTG CCT CCG TTT GCG AGA CCA GAA GCT GAT GTT TTG TGC AAA GCC TTT CAT GAT GAT GAA AAG GCA TTC TTT GGA CAC TAT TTA TAT GAA GTT GCC AGA AGA CAT CCT TAC TTT TAT GCC CCT GAA CTC CTT TAC TAT GCT CAG AAG TAC AAA GCC ATT CTA ACA GAA TGT TGC GAA GCT GCT GAT AAA GGG GCC TGC CTC ACA CCT AAG CTT GAT GCT TTG AAG GAA AAA GCC CTG ATT TCA GCT GCC CAA GAG AGA CTC AGG TGT GCC AGT ATT CAG AAA TTT GGA GAC AGA GCT TAC AAA GCA TGG GCA CTT GTT CGT CTG AGC CAA AGA TTT CCC AAG GCT GAC TTC ACA GAC ATT TCC AAG ATA GTG ACA GAT CTC ACC AAA GTC CAC AAG GAA TGC TGC CAC GGT GAC CTG CTT GAA TGT GCA GAT GAC AGG GCG GAC CTT GCC AAG TAC ATG TGT GAA CAT CAG GAA ACA ATC TCC AGT CAT CTG AAG GAA TGC TGT GAT AAG CCA ATA TTG GGA AAA GCC CAC TGC ATT TAT GGT TTG CAT AAT GAT GAG ACA CCT GCT GGC TTG CCA GCA GTA GCT GAG GAA TTT GTT GAG GAT AAG GAT GTT TGC AAA AAT TAT GAA GAG GCA AAA GAT CTC TTC TTG GGC AAG TTT TTG TAT GAG TAT TCA AGA AGG CAC CCT GAT TAC TCT GTC GTT CTG CTG CTG AGA CTT GGC AAG GCC TAT GAA GCC ACC CTG AAA AAG TGC TGT GCC ACT GAT GAC CCT CAC GCA TGC TAT GCC AAA GTG CTT GAT GAG TTT CAG CCT CTT GTG GAT GAA CCC AAG AAT TTA GTG AAA CAA AAC TGT GAA CTC TAT GAG CAG CTT GGT GAC TAC AAC TTC CAA AAT GCG CTC CTA GTT CGT TAT ACC AAG AAA GTA CCT CAA GTG TCA ACT CCA ACT CTC GTG GAA ATA TCA AGA AGC CTA GGA AAA GTG GGC AGC AAG TGC TGT AAG CAT CCT GAA GCA GAA AGA CTG CCT TGT GTT GAA GAT TAT CTG TCC GTG GTC CTG AAC AGG TTG TGC GTG TTG CAT GAG AAG ACA CCA GTG AGT GAG AAA GTC ACC AAA TGC TGC TCA GAG TCA TTG GTC GAC AGA CGA CCA TGC TTT AGC GCC CTG GGC CCC GAT GAA ACA TAC GTC CCC AAA GAA TTT AAT GCT GAA ACA TTC ACC TTC CAT GCG GAC ATA TGC ACT CTT CCA GAA ACG GAG AGG AAA ATC AAG AAA CAA ACG GCA CTT GTT GAG TTG GTG AAA CAC AAG CCC CAC GCA ACA AAT GAT CAA CTG AAA ACT GTT GTT GGA GAG TTC ACA GCT TTG TTA GAC AAG TGC TGC AGT GCT GAA GAC AAG GAG GCC TGC TTT GCT GTG GAG GGT CCA AAA CTT GTT GAA TCA AGT AAA GCT ACC TTA GGC （３’） - 【請求項３】 請求項１又は２に記載のウサギプレプロ
血清アルブミン遺伝子が Pichia pastoris のアルコー
ルオキシダーゼ遺伝子発現調節配列の制御下に連結され
たプラスミドＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３記載のプラスミドＤＮＡにより
形質転換された微生物。 - 【請求項５】 前記微生物が Pichia pastorisである請
求項４記載の微生物。 - 【請求項６】 請求項４又は５記載の微生物を培養し、
その培養物からウサギ血清アルブミンを採取することを
特徴とするウサギ血清アルブミンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3194984A JPH0538287A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3194984A JPH0538287A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0538287A true JPH0538287A (ja) | 1993-02-19 |
Family
ID=16333608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3194984A Pending JPH0538287A (ja) | 1991-07-10 | 1991-07-10 | ウサギプレプロ血清アルブミン遺伝子、該遺伝子を含む組換えプラスミドｄｎａ、該組換えプラスミドｄｎａで形質転換された微生物及び該微生物を用いたウサギ血清アルブミンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0538287A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016152150A1 (ja) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | 学校法人中央大学 | 遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン－遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体 |
-
1991
- 1991-07-10 JP JP3194984A patent/JPH0538287A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016152150A1 (ja) * | 2015-03-23 | 2016-09-29 | 学校法人中央大学 | 遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン－遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体 |
| JP2016179951A (ja) * | 2015-03-23 | 2016-10-13 | 学校法人 中央大学 | 遺伝子組換え動物血清アルブミン、ヘモグロビン−遺伝子組換え動物血清アルブミン複合体、人工血漿増量剤及び人工酸素運搬体 |
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