JPS62130689A - ランナウエイ型プラスミド及びそれを利用したヒトｓｏｄの製造方法 - Google Patents
ランナウエイ型プラスミド及びそれを利用したヒトｓｏｄの製造方法Info
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- JPS62130689A JPS62130689A JP60271379A JP27137985A JPS62130689A JP S62130689 A JPS62130689 A JP S62130689A JP 60271379 A JP60271379 A JP 60271379A JP 27137985 A JP27137985 A JP 27137985A JP S62130689 A JPS62130689 A JP S62130689A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は活性酸素依存性炎症（関節リウマチなど）の治
療に有用なヒトスーパーオキシドジスムターゼ（５ｕｐ
ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ 以下ＳＯＤとい
う。）、のポリペプチドをコードするＤＮＡを有するラ
ンナウェイ型発現ベクター及びＳＯＤの製造方法に関す
る。
療に有用なヒトスーパーオキシドジスムターゼ（５ｕｐ
ｅｒｏｘｉｄｅ Ｄｉｓｍｕｔａｓｅ 以下ＳＯＤとい
う。）、のポリペプチドをコードするＤＮＡを有するラ
ンナウェイ型発現ベクター及びＳＯＤの製造方法に関す
る。
ランナウェイ型プラスミドは温度によりその複製制御が
解除されるプラスミドのことである〔エム、ジージー（
ＭＧＧ）１６５巻、１６７−１７１ページ、１９７８年
〕。
解除されるプラスミドのことである〔エム、ジージー（
ＭＧＧ）１６５巻、１６７−１７１ページ、１９７８年
〕。
、このプラスミドを用いてヒトの遺伝子を発現させた例
は知られていない。
は知られていない。
ところで、ヒトＳＯＤを微生物に産生される方法は知ら
れている〔ヌクレイックアシッズリサーチ［Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、：］ １３巻、２０１７−２０
３４ページ、１９８５年〕。
れている〔ヌクレイックアシッズリサーチ［Ｎｕｃｌ、
Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、、：］ １３巻、２０１７−２０
３４ページ、１９８５年〕。
しかし、公知の方法でばＳＯＤの産生が、菌体蛋白の１
０％程度にすぎず、工業化を考えるとＳＯＤの収量のよ
り高い方法の開発が望まれる。
０％程度にすぎず、工業化を考えるとＳＯＤの収量のよ
り高い方法の開発が望まれる。
そこで本発明者らは種々検討した結果ヒトＳＯＤをコー
ドするＤＮＡをランナウェイ型プラスミドに挿入したプ
ラスミドで形質転換した微生物が菌体蛋白の２０％もの
ヒトＳＯＤを産生することを見い出した。
ドするＤＮＡをランナウェイ型プラスミドに挿入したプ
ラスミドで形質転換した微生物が菌体蛋白の２０％もの
ヒトＳＯＤを産生することを見い出した。
本発明は上記知見に基づいて完成されたものである。即
ち、本発明はヒト ＳＯＤをコードするＤＮＡを有する
ランナウェイ型プラスミド及び該プラスミドで形質転換
した微生物を培地中で培養してＳＯＤを生成蓄積せしめ
、次いで生成蓄積したＳＯＤを採取することを特徴とす
るＳＯＤの製造方法に関する。
ち、本発明はヒト ＳＯＤをコードするＤＮＡを有する
ランナウェイ型プラスミド及び該プラスミドで形質転換
した微生物を培地中で培養してＳＯＤを生成蓄積せしめ
、次いで生成蓄積したＳＯＤを採取することを特徴とす
るＳＯＤの製造方法に関する。
本発明において使用するＳＯＤをコードするＤＮＡを挿
入するランナウェイ型プラスミドとしては、例えばｐＭ
ＯＢ４．５（ＡＴＣＣ３７］、０６）があげられる。
入するランナウェイ型プラスミドとしては、例えばｐＭ
ＯＢ４．５（ＡＴＣＣ３７］、０６）があげられる。
又、ヒｌ−８ＯＤをコードするＤＮＡは下記式ｍで表わ
される塩基配列を有するものである。
される塩基配列を有するものである。
］０ １５ＴＴＣ
ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡ、 Ａ、ＧＴ ＡＡ、
Ｔ ＧＧＡ、 ＣＣＡ ＧＴＧＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＧＧＡ Ａ、ＧＣＡ、ＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ
ＣＴＧ ＡＣＴＧＡＡ ＧＧＣＣＴＧ ＣＡＴ ＧＧ
Ａ−ＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＡＧＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＧＡ、Ｔ ＡＡ、Ｔ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣＴ
ＧＴ ＡＣＣＡＧＴなお本明細書及び図面で使用する主
な略称は次の通りである。
ＧＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＧＡＡ、 Ａ、ＧＴ ＡＡ、
Ｔ ＧＧＡ、 ＣＣＡ ＧＴＧＡＡＧ ＧＴＧ ＴＧ
Ｇ ＧＧＡ Ａ、ＧＣＡ、ＴＴ ＡＡＡ ＧＧＡ
ＣＴＧ ＡＣＴＧＡＡ ＧＧＣＣＴＧ ＣＡＴ ＧＧ
Ａ−ＴＴＣＣＡＴ ＧＴＴ ＣＡＴ ＧＡＧＴＴＴ Ｇ
ＧＡ ＧＡ、Ｔ ＡＡ、Ｔ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣＴ
ＧＴ ＡＣＣＡＧＴなお本明細書及び図面で使用する主
な略称は次の通りである。
ＤＮＡ デオキシリボ核酸
Ａ アデニン
Ｔ チミン
Ｇ グアニン
Ｃシトシン
ＲＮＡ リボ核酸
ｄＧ デオキシグアニン
ｄＴ デオキシチミジン
ｄＡＴＰ デオキシアデノシン三リン酸ｄＧＴＰ
デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ デオキシシチ
ジン三リン酸ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 本発明で使用するヒトＳＯＤをコードするＤＮＡを有す
るランチウェイ型プラスミドは例えば次のようにして作
ることができる。即ちｐＭＯＢ４５（ＡＴＣＣ３７１０
６）の複製必須領域を含むＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２（
ＡＴＣＣ３７０１７）のアンピシリン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を酵素的に切り出し、次に、このふたつのＤ
ＮＡ断片及び制限酵素部位を持つ合成リンカ−を混合し
、酵素的にＤＮＡを連結する。両断片が連結し、かつ合
成リンカ−が連結部に挿入されたものを制限酵素解析に
より選別する。次にこのプラスミドを合成リンカ−上の
制限酵素で開裂し、この部位間にヒトＳＯＤ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を挿入する。ただし、このヒトＳＯＤ遺伝
子の５側上流には、後記、参考例（６）の様に、大腸菌
のプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（ファルマ
シア社製）が存在しかつ、開始コドンの数塩基上流には
、リボゾームを認識するＳＤ配列が存在する様にしてお
（。更に、後記参考例（６）の様に３下流には、大腸菌
の転写終結因子、例えば、ｔｒｐ Ａターミネータ−（
ファルマシア社製〕を存在させる。
デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ デオキシシチ
ジン三リン酸ＡＴＰ アデノシン三リン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 本発明で使用するヒトＳＯＤをコードするＤＮＡを有す
るランチウェイ型プラスミドは例えば次のようにして作
ることができる。即ちｐＭＯＢ４５（ＡＴＣＣ３７１０
６）の複製必須領域を含むＤＮＡ断片とｐＢＲ３２２（
ＡＴＣＣ３７０１７）のアンピシリン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を酵素的に切り出し、次に、このふたつのＤ
ＮＡ断片及び制限酵素部位を持つ合成リンカ−を混合し
、酵素的にＤＮＡを連結する。両断片が連結し、かつ合
成リンカ−が連結部に挿入されたものを制限酵素解析に
より選別する。次にこのプラスミドを合成リンカ−上の
制限酵素で開裂し、この部位間にヒトＳＯＤ遺伝子を含
むＤＮＡ断片を挿入する。ただし、このヒトＳＯＤ遺伝
子の５側上流には、後記、参考例（６）の様に、大腸菌
のプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（ファルマ
シア社製）が存在しかつ、開始コドンの数塩基上流には
、リボゾームを認識するＳＤ配列が存在する様にしてお
（。更に、後記参考例（６）の様に３下流には、大腸菌
の転写終結因子、例えば、ｔｒｐ Ａターミネータ−（
ファルマシア社製〕を存在させる。
ｔａｃプロ七−ターは、大腸菌の強力なプロモーターで
あり、ＳＯＤ遺伝子の効率的な転写を促し、又、ｔｒｐ
Ａターミネータ−は効率的な転写終結を促す。これら
は、転写産物上のＳＯＤ遺伝子の発現に有効に働くと考
えられる。こうしてＳＯＤ遺伝子を含むランチウェイ型
プラスミドを作製できる。
あり、ＳＯＤ遺伝子の効率的な転写を促し、又、ｔｒｐ
Ａターミネータ−は効率的な転写終結を促す。これら
は、転写産物上のＳＯＤ遺伝子の発現に有効に働くと考
えられる。こうしてＳＯＤ遺伝子を含むランチウェイ型
プラスミドを作製できる。
ＳＯＤをコードするＤＮＡを有するランナウェイ型プラ
スミドで形質転換された微生物の作製、該微生物の培養
及び産生されたＳＯＤの採取は次のようにすればよい。
スミドで形質転換された微生物の作製、該微生物の培養
及び産生されたＳＯＤの採取は次のようにすればよい。
即ち、ヒトＳＯＤをコードするＤＮＡを有するランナウ
ェイ型プラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７
３２５） へＣａＣｌ２法で形質転換する。出現したコ
ロニーを２０ｇ／ｍ１のアンピシリンとＣｕイオン及び
Ｚｎイオンを含むＬ培地へ接種し、３０℃以下好ましく
は２０〜３０℃で振盪培養する。この温度では、プラス
ミドの複製は制御されており、コピー数は数１０を超え
ない。培養期が対数増殖期前期になったところで、培養
温度を３５〜４２℃、好ましくは３７℃へ上昇させる。
ェイ型プラスミドを大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７
３２５） へＣａＣｌ２法で形質転換する。出現したコ
ロニーを２０ｇ／ｍ１のアンピシリンとＣｕイオン及び
Ｚｎイオンを含むＬ培地へ接種し、３０℃以下好ましく
は２０〜３０℃で振盪培養する。この温度では、プラス
ミドの複製は制御されており、コピー数は数１０を超え
ない。培養期が対数増殖期前期になったところで、培養
温度を３５〜４２℃、好ましくは３７℃へ上昇させる。
これによりプラスミドの複製は爆発的となりコピー数は
３０℃での約１００倍に達する。
３０℃での約１００倍に達する。
プラスミド上のＳＯＤ遺伝子は遺伝子増幅効果により効
果的に発現すると考えられる。温度上昇後、更に、３６
〜４２℃好ましくは３７℃で１５時間以上、好ましくは
２０〜３０時間、振盪した後、培養を終了する。ＳＯＤ
の採取では、まず培養液を遠心分離にかげ集菌する。菌
はＣｕとＺｎイオンを含む緩衝液に懸濁後超音波処理に
より溶菌する。溶菌液は、超遠心分離にかけ、ＳＯＤを
含む上清を回収することができる。
果的に発現すると考えられる。温度上昇後、更に、３６
〜４２℃好ましくは３７℃で１５時間以上、好ましくは
２０〜３０時間、振盪した後、培養を終了する。ＳＯＤ
の採取では、まず培養液を遠心分離にかげ集菌する。菌
はＣｕとＺｎイオンを含む緩衝液に懸濁後超音波処理に
より溶菌する。溶菌液は、超遠心分離にかけ、ＳＯＤを
含む上清を回収することができる。
ここで回収されたＳＯＤを含む溶菌上清液は特開昭５９
−９１８８１号公報記載のダイアイオンＨＰ−２０の充
填されたカラムに、直接か若しくは中性の塩類水溶液で
希釈したのちに同じ塩類水溶液で平衡化した該樹脂に吸
着して溶出することにより部分精興されたＳＯＤ画分を
得ることができる。
−９１８８１号公報記載のダイアイオンＨＰ−２０の充
填されたカラムに、直接か若しくは中性の塩類水溶液で
希釈したのちに同じ塩類水溶液で平衡化した該樹脂に吸
着して溶出することにより部分精興されたＳＯＤ画分を
得ることができる。
即ち、吸着後、カラムをｐｎ ５で緩衝能のある緩衝液
、たとえば、酢酸ソーダ緩衝液でＡ２８０の吸光値゛が
０，０５以下になるまで洗滌する。ついでこのままか或
いはさらにカラム内のｐＨを中性に戻すため中性域の緩
衝液或いは塩類水溶液で洗滌したのち、吸着されている
ＳＯＤを脱離し、溶出する。溶出剤としてはｐｎ ９〜
１１の範囲で緩衝能のある０、０２〜０．２Ｍの濃度の
塩或いはアミノ酸を組成とした緩衝液の３０〜８０％メ
タノール及びアセトン等の水溶性溶媒などが用いられる
。好ましくは、アミノ酸例えばグリシンと苛性ソーダか
らなるｐＨ９，’〜１０．′で０．０５〜０．１５Ｍの
濃度をもつ緩衝液の５０〜７０％メタノール溶液が用い
られる。次に溶出されたＳＯＤを含む両分を集め、希塩
酸若しくは燐酸等の鉱酸でｐｎを中性に調整したのち、
７０℃以下、好ましくは４５℃以下で濃縮或いは乾個を
行った後、少量の水を加え洗滌する。ついで第２のカラ
ムクロマトを陰イオン交換体例えばＤＥＡＦ−トヨパー
ルを担体に用いて行う。即ち、濃縮或いは乾個物を陰イ
オン交換体を平衡化した緩衝液で透析又は限外沖過等に
より完全に置換したＳＯＤの含有溶液を吸着試料液とす
る。陰イオン交換体は特開昭５９−９１８８１で記載し
ているようにＳＯＤを担体に吸着させた後、適当な濃度
の塩類を含む緩衝液で溶出する方法によっても精製は可
能であるが、本発明の遺伝子操作生産物では低濃度の塩
を含有させた緩衝液で平衡化した担体に通導することに
よりさらに効率良（、純度の高いＳＯＤを通過液として
得ることができる。
、たとえば、酢酸ソーダ緩衝液でＡ２８０の吸光値゛が
０，０５以下になるまで洗滌する。ついでこのままか或
いはさらにカラム内のｐＨを中性に戻すため中性域の緩
衝液或いは塩類水溶液で洗滌したのち、吸着されている
ＳＯＤを脱離し、溶出する。溶出剤としてはｐｎ ９〜
１１の範囲で緩衝能のある０、０２〜０．２Ｍの濃度の
塩或いはアミノ酸を組成とした緩衝液の３０〜８０％メ
タノール及びアセトン等の水溶性溶媒などが用いられる
。好ましくは、アミノ酸例えばグリシンと苛性ソーダか
らなるｐＨ９，’〜１０．′で０．０５〜０．１５Ｍの
濃度をもつ緩衝液の５０〜７０％メタノール溶液が用い
られる。次に溶出されたＳＯＤを含む両分を集め、希塩
酸若しくは燐酸等の鉱酸でｐｎを中性に調整したのち、
７０℃以下、好ましくは４５℃以下で濃縮或いは乾個を
行った後、少量の水を加え洗滌する。ついで第２のカラ
ムクロマトを陰イオン交換体例えばＤＥＡＦ−トヨパー
ルを担体に用いて行う。即ち、濃縮或いは乾個物を陰イ
オン交換体を平衡化した緩衝液で透析又は限外沖過等に
より完全に置換したＳＯＤの含有溶液を吸着試料液とす
る。陰イオン交換体は特開昭５９−９１８８１で記載し
ているようにＳＯＤを担体に吸着させた後、適当な濃度
の塩類を含む緩衝液で溶出する方法によっても精製は可
能であるが、本発明の遺伝子操作生産物では低濃度の塩
を含有させた緩衝液で平衡化した担体に通導することに
よりさらに効率良（、純度の高いＳＯＤを通過液として
得ることができる。
平衡化条件としては例えば１０〜２００ ｍＭの中性塩
ならいずれでも良いが、好ましくは３０〜８０ｍＭの食
塩を含んだ中性域の緩衝液例えばｐｒ−ｉ ６〜８の０
．０２Ｍ〜０．０５Ｍの範囲のリン酸緩衝液、好ましく
はｐＨ７±０．５．０．０１士０．００５Ｍの緩衝液が
用いられる。
ならいずれでも良いが、好ましくは３０〜８０ｍＭの食
塩を含んだ中性域の緩衝液例えばｐｒ−ｉ ６〜８の０
．０２Ｍ〜０．０５Ｍの範囲のリン酸緩衝液、好ましく
はｐＨ７±０．５．０．０１士０．００５Ｍの緩衝液が
用いられる。
ＳＯＤを含む両分は吸着後、平衡化と同じ緩衝液で洗滌
することにより通過液として回収される。共存した大部
分の不純物質はこの中性塩の濃度では溶出されず、０．
３Ｍ以上にしたときに溶出される。ついで通過液のＳＯ
Ｄを含む両分は限外沖過等で蛋白質成分のみ濃縮したの
ちゲル諷過により分子量の相異による分離を行うことに
よりさらに精製される。ゲル屏過の担体としてはセファ
デックスＧ−１，ＯＯと同じ排除限界を有するものであ
ればいずれでも良く、これら担体を予め緩衝液で平衡化
するが限外屏過濃縮液のその緩衝液は塩組成と同じで、
吸着液の塩濃度より高げれば特に限定される必要もない
。通常、医薬用に至適な緩衝液が選択される。こうして
ゲル濾過担体に吸着されたＳＯＤは平衡化緩衝液で溶出
することにより（淡）緑色の溶液として回収される。こ
こで得られたＳＯＤ含有画分ははじめに吸着に用いた溶
菌上清液と比較し回収率は７０％以上を示し、純度は３
８倍の上昇を示した。この時の比活性は文献等で記載さ
れたほぼ最高値であり、１００％近い純度であった。
することにより通過液として回収される。共存した大部
分の不純物質はこの中性塩の濃度では溶出されず、０．
３Ｍ以上にしたときに溶出される。ついで通過液のＳＯ
Ｄを含む両分は限外沖過等で蛋白質成分のみ濃縮したの
ちゲル諷過により分子量の相異による分離を行うことに
よりさらに精製される。ゲル屏過の担体としてはセファ
デックスＧ−１，ＯＯと同じ排除限界を有するものであ
ればいずれでも良く、これら担体を予め緩衝液で平衡化
するが限外屏過濃縮液のその緩衝液は塩組成と同じで、
吸着液の塩濃度より高げれば特に限定される必要もない
。通常、医薬用に至適な緩衝液が選択される。こうして
ゲル濾過担体に吸着されたＳＯＤは平衡化緩衝液で溶出
することにより（淡）緑色の溶液として回収される。こ
こで得られたＳＯＤ含有画分ははじめに吸着に用いた溶
菌上清液と比較し回収率は７０％以上を示し、純度は３
８倍の上昇を示した。この時の比活性は文献等で記載さ
れたほぼ最高値であり、１００％近い純度であった。
次に本発明のプラスミドがすぐれた性質を有することを
実験例により説明する。
実験例により説明する。
実験例
後記実験例２）の方法でｐＲＴａｃｓＯＤ ８−１．３
を形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株を培養し、培養温度
を３７°Ｃに上昇させた後の吸光度、総蛋白量及びＳＯ
Ｄ産生量の推移を詳細に調べた（第２図）。この結果、
既報［Ｂ、Ｅ、Ｕｈｌ ｉｎ ｅｔ ａｌ ｌＭｏ１ｅ
ｃ。
を形質転換した大腸菌Ｗ３１１０株を培養し、培養温度
を３７°Ｃに上昇させた後の吸光度、総蛋白量及びＳＯ
Ｄ産生量の推移を詳細に調べた（第２図）。この結果、
既報［Ｂ、Ｅ、Ｕｈｌ ｉｎ ｅｔ ａｌ ｌＭｏ１ｅ
ｃ。
Ｇｅｎ、０ｒｅｎｅｔ−１６５，１６７−１７９（１９
７８）］が温度上昇後、４時間で閑の生育と外米遺伝子
産物の産生が停止する様に記載しであるのに対し、本実
験例では４時間以降も、徐々に菌体量及び外米遺伝子産
物（ＳＯＤ）量が上昇することが判明した。ＳＯＤ産生
量は、温度上昇後、２４時間が最高であり、この時菌体
蛋白の２０％に達した。
７８）］が温度上昇後、４時間で閑の生育と外米遺伝子
産物の産生が停止する様に記載しであるのに対し、本実
験例では４時間以降も、徐々に菌体量及び外米遺伝子産
物（ＳＯＤ）量が上昇することが判明した。ＳＯＤ産生
量は、温度上昇後、２４時間が最高であり、この時菌体
蛋白の２０％に達した。
一方、温度上昇を行う至適培養期について検討した。培
養期は吸光度で表わすことができるので種々の異なる吸
光度を示す培養期で３７℃へ温度上昇し、その際、得ら
れる最高のＳＯＤ生産性を調べた。この結果、吸光度が
０．１０〜０．３０（細胞濃度にして７−５ Ｘ １
ｏ７７コ／１〜１．５×１０８コ／ｍｌ）の時、最高の
ＳＯＤ生産性が得られた。
養期は吸光度で表わすことができるので種々の異なる吸
光度を示す培養期で３７℃へ温度上昇し、その際、得ら
れる最高のＳＯＤ生産性を調べた。この結果、吸光度が
０．１０〜０．３０（細胞濃度にして７−５ Ｘ １
ｏ７７コ／１〜１．５×１０８コ／ｍｌ）の時、最高の
ＳＯＤ生産性が得られた。
本発明によるとＳＯＤが菌体蛋白の２０％割合で産生さ
れるので、本発明のプラスミドは大量生産に適したもの
である。
れるので、本発明のプラスミドは大量生産に適したもの
である。
次に実施例により本発明を説明する。
実施例
１）ランナウェイ型ＳＯＤ発現ベクターの構築ＡＴＣＣ
より購入したランチウェイプラスミドｐＭＯＢ４５ （
ＡＴＣＣ３７１０６） （Ｍ、Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄＤ
、Ｖａｐｎｅｋ、Ｇｅｎｅ １５．３１９−３２９．
（１９８１））をＥｃｏ ＲＩとＨｉｎｄ’ＩＪＪ （
宝酒造、以下すべて同社製品）で切断し、ランナウェイ
複製起点を含む６．７ ＫｂのＤＮＡ断片を切り出した
（第１図）。このＤＮＡを精製し、Ｂａｌ ３１酵素で
処理し、両端各々０．３Ｋｂぐらい消化後、ＤＮＡポリ
メラーゼで処理してＤＮＡ末端を平滑にした。一方、Ａ
ＴＣＣより購入したｐＢＲ３２２をＴｔｈ １１１ ［
で切断しアンピシリン耐性遺伝子を含む１．３ＫｂのＤ
ＮＡを切り出した（第１図）。このＤＮＡも精製後、上
記方法と同様にＢａｌ ３１酵素、ＤＮＡポリメラーゼ
で順次処理した。こうして得られた２本のＤＮＡ断片を
等モルで混合し、更にＨｉｎｄ ｍ ＩＪンカー及びＥ
ｃｏＲＩ ＩＪンカー（宝酒造）を１０倍モル量加えて
から、Ｔ ４． ＤＮＡ ！Ｊガーゼで処理し、ＤＮＡ
を連結した。
より購入したランチウェイプラスミドｐＭＯＢ４５ （
ＡＴＣＣ３７１０６） （Ｍ、Ｂｉｔｔｅｒ ａｎｄＤ
、Ｖａｐｎｅｋ、Ｇｅｎｅ １５．３１９−３２９．
（１９８１））をＥｃｏ ＲＩとＨｉｎｄ’ＩＪＪ （
宝酒造、以下すべて同社製品）で切断し、ランナウェイ
複製起点を含む６．７ ＫｂのＤＮＡ断片を切り出した
（第１図）。このＤＮＡを精製し、Ｂａｌ ３１酵素で
処理し、両端各々０．３Ｋｂぐらい消化後、ＤＮＡポリ
メラーゼで処理してＤＮＡ末端を平滑にした。一方、Ａ
ＴＣＣより購入したｐＢＲ３２２をＴｔｈ １１１ ［
で切断しアンピシリン耐性遺伝子を含む１．３ＫｂのＤ
ＮＡを切り出した（第１図）。このＤＮＡも精製後、上
記方法と同様にＢａｌ ３１酵素、ＤＮＡポリメラーゼ
で順次処理した。こうして得られた２本のＤＮＡ断片を
等モルで混合し、更にＨｉｎｄ ｍ ＩＪンカー及びＥ
ｃｏＲＩ ＩＪンカー（宝酒造）を１０倍モル量加えて
から、Ｔ ４． ＤＮＡ ！Ｊガーゼで処理し、ＤＮＡ
を連結した。
次に、このＤＮＡ試料を大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２
７３２５）株へＭａｎ ｉ ａ ｔｉ ｓらの方法で（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ； ｃｏｌｄ ｓ
ｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ２
５４−２５５（１９８２）、形質転換し、アンピシリン
耐性株を選別した。任意に選んだ１２株について、その
保有するプラスミドの制限酵素解析を行った。
７３２５）株へＭａｎ ｉ ａ ｔｉ ｓらの方法で（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ ； ｃｏｌｄ ｓ
ｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ２
５４−２５５（１９８２）、形質転換し、アンピシリン
耐性株を選別した。任意に選んだ１２株について、その
保有するプラスミドの制限酵素解析を行った。
この結果、上記２本のＤＮＡ断片が連結し、かつひとつ
の連結部にのみ２種のリンカ−（Ｈｉｎｄ ■とＥｃｏ
ＲＩ ）が挿入されたプラスミドｐＲ４が得られた（第
１図）。次にｐＨ４をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｌＴで切
断して開裂し、この部位間にｐ△ＵＣＴ１３ （後記
参考例（６）（５）参照）に由来し、マルチクローニン
グ部位と転写終結因子を含む０．４ ＫｂのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄ ｍ断片を挿入して、ｐＨ３を構築した（第
１図）。更に、このｐＨ３をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切
断開裂し、この部位間にｐＴａｃｓＯＤ８〜１３（後記
参考例（６） （Ｂ）参照〕に由来しｔａｃ プロモー
ターとヒト ＳＯＤ遺伝子を含む約０．７ ＫｂのＥｃ
ｏＲＩ −Ｘｂａ ＪＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲＴａｃ
ＳＯ４８〜１３を構築した（第１図）。
の連結部にのみ２種のリンカ−（Ｈｉｎｄ ■とＥｃｏ
ＲＩ ）が挿入されたプラスミドｐＲ４が得られた（第
１図）。次にｐＨ４をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄｌｌＴで切
断して開裂し、この部位間にｐ△ＵＣＴ１３ （後記
参考例（６）（５）参照）に由来し、マルチクローニン
グ部位と転写終結因子を含む０．４ ＫｂのＥｃｏＲＩ
−Ｈｉｎｄ ｍ断片を挿入して、ｐＨ３を構築した（第
１図）。更に、このｐＨ３をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで切
断開裂し、この部位間にｐＴａｃｓＯＤ８〜１３（後記
参考例（６） （Ｂ）参照〕に由来しｔａｃ プロモー
ターとヒト ＳＯＤ遺伝子を含む約０．７ ＫｂのＥｃ
ｏＲＩ −Ｘｂａ ＪＤＮＡ断片を挿入し、ｐＲＴａｃ
ＳＯ４８〜１３を構築した（第１図）。
２）ランナウェイ型ＳＯＤ発現ベクター保有大腸菌の培
養 ｐＲＴａｃ ＳＯＤ ８〜１３をＨａｎｉａｔｉｓらの
方法（Ｈｏ１ｅｃｕ−Ｉａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ； ｃ
ｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ２５４−２５．５（１９８２））で形質転換し
た大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）を２０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンと０．１ ｍＭ ＣＬ＋ ８０
４及び０．１ ｍＭＺｎ ＳＯ４を含むＬ培地（他に培
地１１中バクトドリプトンＬｏｇ、イースト抽出物５ｇ
、食塩５ｇ含有）に接種し、３０°Ｃで振盪培養し、５
５０ ｎｍにおける吸光度が０，２となったところで、
培養温度を３７℃に上昇した。更に振盪培養を約２４時
間続けた。
養 ｐＲＴａｃ ＳＯＤ ８〜１３をＨａｎｉａｔｉｓらの
方法（Ｈｏ１ｅｃｕ−Ｉａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ； ｃ
ｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ ２５４−２５．５（１９８２））で形質転換し
た大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）を２０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンと０．１ ｍＭ ＣＬ＋ ８０
４及び０．１ ｍＭＺｎ ＳＯ４を含むＬ培地（他に培
地１１中バクトドリプトンＬｏｇ、イースト抽出物５ｇ
、食塩５ｇ含有）に接種し、３０°Ｃで振盪培養し、５
５０ ｎｍにおける吸光度が０，２となったところで、
培養温度を３７℃に上昇した。更に振盪培養を約２４時
間続けた。
３）培養液を６０００ｒｐｍｌＯ分間の遠心沈降にかげ
集菌した。菌は培養液の１／１０容の５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（７，５） １ｍＭＣｕＳ０４−１ｍＭＺｎ
ＳＯ４緩衝液に懸濁した。これを水冷下で超音波処理し
、菌を破砕した。処理液の５５０ ｎｍにおける吸光度
が、処理前の１／１０にまで減少したところで処理を終
了した。
集菌した。菌は培養液の１／１０容の５０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ（７，５） １ｍＭＣｕＳ０４−１ｍＭＺｎ
ＳＯ４緩衝液に懸濁した。これを水冷下で超音波処理し
、菌を破砕した。処理液の５５０ ｎｍにおける吸光度
が、処理前の１／１０にまで減少したところで処理を終
了した。
最後に、この処理液を３０００ Ｏｒｐｍ ３０分間
超遠心沈降し、上滑を得た。この上清には、ＳＯＤが抽
出されている。
超遠心沈降し、上滑を得た。この上清には、ＳＯＤが抽
出されている。
４）得られた溶菌上清液７１５ｍ１（総括性：３０７７
Ｋｕ １比活性９９．６ ｕ／ｍｇ−ｐ）を用いてＳ
ＯＤの精製を行った。
Ｋｕ １比活性９９．６ ｕ／ｍｇ−ｐ）を用いてＳ
ＯＤの精製を行った。
（Ｘ） ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー予め５
０ｍＭの食塩水で平衡化したダイアイオフＨＰ−２０を
５．８ｊ！’Ｘ３９ｃｍＨのカラムに充填し、充分平衡
化する。溶菌上清液７１５ｍ１に５０ｍＭの食塩水５６
０ｍ１を加えこの混合液をカラムに吸着後、直ちに５０
ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液、ｐｎ ５でカラム容量の約９
倍洗滌する。
０ｍＭの食塩水で平衡化したダイアイオフＨＰ−２０を
５．８ｊ！’Ｘ３９ｃｍＨのカラムに充填し、充分平衡
化する。溶菌上清液７１５ｍ１に５０ｍＭの食塩水５６
０ｍ１を加えこの混合液をカラムに吸着後、直ちに５０
ｍＭ酢酸ソーダ緩衝液、ｐｎ ５でカラム容量の約９
倍洗滌する。
ついで０．１Ｍグリシン−苛性ソーダ緩衝液の６０％メ
タノール溶液、ｐＨ１０，０で溶出しＳＯＤ活性を示す
画分を集めた。（画分Ａ、３８２ｍ１） この両分を約０゜５Ｎの塩酸でｐＨ７，０に調節後４０
°Ｃの水浴上でエバボレートにより濃縮乾個する。乾個
物を１００ ｍｌの水に溶解後、４０ ｍＭ食塩を含む
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７，５に対し透析チュ
ーブを用いて透析を行う。
タノール溶液、ｐＨ１０，０で溶出しＳＯＤ活性を示す
画分を集めた。（画分Ａ、３８２ｍ１） この両分を約０゜５Ｎの塩酸でｐＨ７，０に調節後４０
°Ｃの水浴上でエバボレートにより濃縮乾個する。乾個
物を１００ ｍｌの水に溶解後、４０ ｍＭ食塩を含む
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液、ｐＨ７，５に対し透析チュ
ーブを用いて透析を行う。
■ ＤＥＡＥ−）ヨパール力ラムクロマトグラフイー
透析されたＳＯＤを含む溶液を予め４０ｍＭ食塩を含む
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化されたＤ
ＥＡＥ−トヨパールの充填されたカラムダ （３×２８０ｍＨ）に通導する。ついで同じ緩衝液で溶
出させてＳＯＤを吸着させずに通過液として得る。（画
分Ｂ、１７６ｍ１） ■ セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフイー 画分Ｂ１７６ｍ１を限外濾過膜（ＹＭ−５）を用いて８
ｍｌに濃縮した液を予め１％食塩を含んだ５ｍＭＩＪン
酸緩衝液、ｐｎ ７．０で平衡化したセファデックスＧ
１００（２’Ｘ１５９ｃｍＨ）カラムに吸着させ、
平衡化緩衝液で溶出し溶菌上清液 ３０７．７ １０
０ ９９．６画分Ａ ２５５８． ８３．１
１４１８画分Ｂ画分２５０３ ８１．３ ３６１４画分
Ｃ画分２１９６ ７１．４ ３８１１参考例 （１） ヒト胎盤からのｍＲＮＡの分離とＳＯＤｍＲ
ＮＡの同定； 新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約３００ｇをリ
ン酸生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で洗い、グアニジン・チ
オシアネート法［Ｃｈｉｒｇｗｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 １８．５２９４−５２９９ （１９７９）〕によっ
て細胞質の全ＲＮＡを抽出した。この抽出した全ＲＮＡ
を高塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、 ０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む、ｐｉ（７，４，）に溶かし、これをオリゴ（ｄ
Ｔ ）セルロース（ファルマシアｔ［）カラムに通し、
ポＩＪ Ａ ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を吸着させた後、低
塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、 ＮａＣｌを含まず、ｐＨ
７，４）で溶出してエタノール沈澱させた。全Ｒ，ＮＡ
１５０ｍｇより１．７■のｍＲＮＡを得た。沈澱を２０
０μｌの滅菌水に溶かし、８０℃２分間加温後急冷して
、５〜２０％シヨ糖密度勾配遠心法てより分子量の大き
さの順に分離した。
５ ｍＭ ＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平衡化されたＤ
ＥＡＥ−トヨパールの充填されたカラムダ （３×２８０ｍＨ）に通導する。ついで同じ緩衝液で溶
出させてＳＯＤを吸着させずに通過液として得る。（画
分Ｂ、１７６ｍ１） ■ セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフイー 画分Ｂ１７６ｍ１を限外濾過膜（ＹＭ−５）を用いて８
ｍｌに濃縮した液を予め１％食塩を含んだ５ｍＭＩＪン
酸緩衝液、ｐｎ ７．０で平衡化したセファデックスＧ
１００（２’Ｘ１５９ｃｍＨ）カラムに吸着させ、
平衡化緩衝液で溶出し溶菌上清液 ３０７．７ １０
０ ９９．６画分Ａ ２５５８． ８３．１
１４１８画分Ｂ画分２５０３ ８１．３ ３６１４画分
Ｃ画分２１９６ ７１．４ ３８１１参考例 （１） ヒト胎盤からのｍＲＮＡの分離とＳＯＤｍＲ
ＮＡの同定； 新生児誕生より１時間以内の新鮮な胎盤約３００ｇをリ
ン酸生理食塩水（ＰＢＳ溶液）で洗い、グアニジン・チ
オシアネート法［Ｃｈｉｒｇｗｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍ
、 １８．５２９４−５２９９ （１９７９）〕によっ
て細胞質の全ＲＮＡを抽出した。この抽出した全ＲＮＡ
を高塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、 ０．５Ｍ ＮａＣｌ
を含む、ｐｉ（７，４，）に溶かし、これをオリゴ（ｄ
Ｔ ）セルロース（ファルマシアｔ［）カラムに通し、
ポＩＪ Ａ ＲＮＡ （ｍＲＮＡ）を吸着させた後、低
塩濃度の緩衝液（Ｔｒｉｓ、 ＮａＣｌを含まず、ｐＨ
７，４）で溶出してエタノール沈澱させた。全Ｒ，ＮＡ
１５０ｍｇより１．７■のｍＲＮＡを得た。沈澱を２０
０μｌの滅菌水に溶かし、８０℃２分間加温後急冷して
、５〜２０％シヨ糖密度勾配遠心法てより分子量の大き
さの順に分離した。
実際には日立ＲＰＳ ４０ Ｔローターを用い、３５Ｋ
ｒｐｍ、１７時間Ｏ℃で遠心した。
ｒｐｍ、１７時間Ｏ℃で遠心した。
次いで分離した各両分（０，５ｍ１）の一部を、ウサギ
網状赤血球ライセード（アマジャム社製）の系で翻訳さ
せ、合成された蚕白質を免疫学的方法（エンザイム・イ
ムノアッセイ法）（Ｊ。
網状赤血球ライセード（アマジャム社製）の系で翻訳さ
せ、合成された蚕白質を免疫学的方法（エンザイム・イ
ムノアッセイ法）（Ｊ。
Ｐｈａｒｍ、Ｄｙｎ−＋５ ３９４− ４０２（１９８
２） ）で調べた。このようにして、ｍ ＲＮＡの１０
〜１２８画分にＳＯＤ ｍＲ，ＮＡの存在が認められた
。
２） ）で調べた。このようにして、ｍ ＲＮＡの１０
〜１２８画分にＳＯＤ ｍＲ，ＮＡの存在が認められた
。
（２） ｍＲＮＡのアニーリングとｃＤＮＡの合成：
（１）で得られた分画な用い、岡山−Ｂｅｒｇの方法［
Ｍｏｌ 、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ−、２，１６ゴー
１７０（１９８２） ］ に従って以下のように合
成した。
（１）で得られた分画な用い、岡山−Ｂｅｒｇの方法［
Ｍｏｌ 、 Ｃｅ１１． Ｂｉｏｌ−、２，１６ゴー
１７０（１９８２） ］ に従って以下のように合
成した。
あらかじめ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ８，３） 、
３０ｍＭＫＣ。
３０ｍＭＫＣ。
０．３ｍＭジチオスレイトール（Ｄ Ｔ Ｔ ） 、８
ｍＭ ＭｇＣｌ２．４０μｇ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄ、各２ ｍＭのｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、
ＴＴＰ、３０μＣ１［α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ （６０
０Ｃｉ ／ｍｍｏｌ ） （ＮＥＮ社毀）、２８０単位
のりボヌクレアーゼインヒビター（相光純薬社製）、お
よび２．８μｇのプラスミドプライマー〔大腸菌プラス
ミドｐＳＶ７１．８６（ファルマシア社製）を用い、岡
山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したＴ −チー ’）ング
約６０塩基のブライマー〕を含む溶液１０μＩを調製し
、３７℃に保つ。次に１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（１）Ｈ８
） 、］ ｍＭ ＥＤＴＡと３μｇのｍＲＮＡを含む溶
液１０μＩを調製し、６５℃で５分間加温後直ちに３７
℃に移した後、上記溶液１０μＩと混合して、さらに５
分間加温した。つづいて５単位の逆転写酵素（ライフサ
イエンス社製）を加え、３７℃で２０分間加温した。２
μｍの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）と１μ
ｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止させた後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱をそれぞ
れ２回経て次の段階へ進んだ。
ｍＭ ＭｇＣｌ２．４０μｇ／ｍｌアクチノマイシン
Ｄ、各２ ｍＭのｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ、
ＴＴＰ、３０μＣ１［α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ （６０
０Ｃｉ ／ｍｍｏｌ ） （ＮＥＮ社毀）、２８０単位
のりボヌクレアーゼインヒビター（相光純薬社製）、お
よび２．８μｇのプラスミドプライマー〔大腸菌プラス
ミドｐＳＶ７１．８６（ファルマシア社製）を用い、岡
山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したＴ −チー ’）ング
約６０塩基のブライマー〕を含む溶液１０μＩを調製し
、３７℃に保つ。次に１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（１）Ｈ８
） 、］ ｍＭ ＥＤＴＡと３μｇのｍＲＮＡを含む溶
液１０μＩを調製し、６５℃で５分間加温後直ちに３７
℃に移した後、上記溶液１０μＩと混合して、さらに５
分間加温した。つづいて５単位の逆転写酵素（ライフサ
イエンス社製）を加え、３７℃で２０分間加温した。２
μｍの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ８，０）と１μ
ｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えて反応を停止させた後、フ
ェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈澱をそれぞ
れ２回経て次の段階へ進んだ。
（３） 式（■）の塩基配列を含有するプラスミドの
合成：（２）で得られた沈澱物を１４０ ｍＭカコジル
酸ナト リ ウ ム −３０ｍＭ Ｔ’ｒｉｓ （
ｐＨ６，８） 、 １ ｍＭ Ｃｏ Ｃ１２，０、
１ｍＭ ＤＴＴ、１． ｍＭ ｄＣＴＰおよび５０μＣ
Ｉ〔α−３２Ｐ ］ ｄＣＴＰを含む溶液に溶かし、３
７°Ｃで２〜３分間加温後、１８単位のターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ファルマシア
社製）を加え、全体を１５μｍとした。３７℃で３分間
加温した後、逆転写反応と同様な後処理を行ってエタノ
ール沈澱物を得た。
合成：（２）で得られた沈澱物を１４０ ｍＭカコジル
酸ナト リ ウ ム −３０ｍＭ Ｔ’ｒｉｓ （
ｐＨ６，８） 、 １ ｍＭ Ｃｏ Ｃ１２，０、
１ｍＭ ＤＴＴ、１． ｍＭ ｄＣＴＰおよび５０μＣ
Ｉ〔α−３２Ｐ ］ ｄＣＴＰを含む溶液に溶かし、３
７°Ｃで２〜３分間加温後、１８単位のターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ファルマシア
社製）を加え、全体を１５μｍとした。３７℃で３分間
加温した後、逆転写反応と同様な後処理を行ってエタノ
ール沈澱物を得た。
次に該沈澱物を５０ ｍＭ ＮａＣｌ、５０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＴ−Ｉ８．０）、１− ＯｍＭ ＭｇＣｈ、
１００μｇウシ血清アルプミｙ（ＢＳＡ）、および１２
単位のＨｉｎｄｌＴＩにソポンジーン社製〕を含む溶液
に溶かして３７℃、２〜４時間加温した。フェノール・
クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、これを１０μＩ
の１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，３）、］、 ｍＭ
ＥＤＴＡを含む溶液に溶かし、さらに３μＩのエタノ
ールを加えて全体を１３μｍとした。この溶液１μｍに
０、０４ ｐｍｏ＋のオリゴ（ｄＧ）リンカ−〔大腸菌
プラスミドｐｓｖ １９３２ （ファルマシア社製）を
用い、岡山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したｄＧ−テーリ
ング約１２塩基のリンカ−〕、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（
ｐＨ７，５）、０．１ Ｍ Ｎａ Ｃｌ、１ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの１０倍濃縮液１μｍと蒸留水８μＩを加えて全
体を１０μｍとし、該溶液を６５°Ｃ５分間、４２℃３
０分間と経時加温後０°Ｃに保った。これに２０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，５）、４ ｍＭ ＭｇＣｌ２．
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ＭＫＣｌ、５０ μ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ０．１ ｍＭβ−ニコチンアミド
アデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および０６μｇの
大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ（ファルマシア社）を含む濃縮
液を加えて最終的に該濃度溶液１００μｍとし、１２°
Ｃで一夜加温した。次いで、各２０ｍＭを含んだｄＡＴ
Ｐ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰおよびＴＴＰを０．４μｌ
、１．５ ｍＭβ−ＮＡＤを１μｍ、大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼを０．４μｇ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を０３
μｇ、モして大腸菌リボヌクレアーゼＨを１単位それぞ
れ添加して（全体として１０４μｍ）、さらに１２℃で
１時間、２５℃で１時間加温した。
ｒｉｓ（ｐＴ−Ｉ８．０）、１− ＯｍＭ ＭｇＣｈ、
１００μｇウシ血清アルプミｙ（ＢＳＡ）、および１２
単位のＨｉｎｄｌＴＩにソポンジーン社製〕を含む溶液
に溶かして３７℃、２〜４時間加温した。フェノール・
クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、これを１０μＩ
の１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，３）、］、 ｍＭ
ＥＤＴＡを含む溶液に溶かし、さらに３μＩのエタノ
ールを加えて全体を１３μｍとした。この溶液１μｍに
０、０４ ｐｍｏ＋のオリゴ（ｄＧ）リンカ−〔大腸菌
プラスミドｐｓｖ １９３２ （ファルマシア社製）を
用い、岡山−Ｂｅｒｇ法に順じて合成したｄＧ−テーリ
ング約１２塩基のリンカ−〕、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（
ｐＨ７，５）、０．１ Ｍ Ｎａ Ｃｌ、１ ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの１０倍濃縮液１μｍと蒸留水８μＩを加えて全
体を１０μｍとし、該溶液を６５°Ｃ５分間、４２℃３
０分間と経時加温後０°Ｃに保った。これに２０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，５）、４ ｍＭ ＭｇＣｌ２．
１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１ＭＫＣｌ、５０ μ
ｇ／ｍｌ ＢＳＡ、 ０．１ ｍＭβ−ニコチンアミド
アデノシンジヌクレオチド（ＮＡＤ）および０６μｇの
大腸菌ＤＮＡＩＪガーゼ（ファルマシア社）を含む濃縮
液を加えて最終的に該濃度溶液１００μｍとし、１２°
Ｃで一夜加温した。次いで、各２０ｍＭを含んだｄＡＴ
Ｐ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰおよびＴＴＰを０．４μｌ
、１．５ ｍＭβ−ＮＡＤを１μｍ、大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼを０．４μｇ１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１を０３
μｇ、モして大腸菌リボヌクレアーゼＨを１単位それぞ
れ添加して（全体として１０４μｍ）、さらに１２℃で
１時間、２５℃で１時間加温した。
（４）大腸菌への形質転換：
大腸菌としてχ１７７６（ＡＴＣＣ３１２４４，）を使
用した。コンピテントセルはＭａｎｉａｔｉｓらＣＭｏ
１ｅｃＩＩａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 ｃｏｌｄ ｓｐ
ｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ 。
用した。コンピテントセルはＭａｎｉａｔｉｓらＣＭｏ
１ｅｃＩＩａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ 、 ｃｏｌｄ ｓｐ
ｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ ｈａｒｂｏｒ １ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ 。
２５４−２５５（１９８２）］ と全（同様の方法で調
１ 製し、０．２ ｍＪづつ分注した。該ＤＮ
Ａ溶液を２０μｌづつ５本形質転換し、バクトドリブト
ン１０ｇ／Ｉ、イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、ジア
ミノピメリン酸０．０１％、チミジン０．００４％およ
びアンピシリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌを含む１．５％
寒天培地上にコロニー約３万個を得た。
１ 製し、０．２ ｍＪづつ分注した。該ＤＮ
Ａ溶液を２０μｌづつ５本形質転換し、バクトドリブト
ン１０ｇ／Ｉ、イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、ジア
ミノピメリン酸０．０１％、チミジン０．００４％およ
びアンピシリン（Ａｐ）５０μｇ／ｍｌを含む１．５％
寒天培地上にコロニー約３万個を得た。
（５） コロニーハイフリダイゼーションコ得られた
コロニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上に移し換
え（５）２個／ １４ Ｘ １０ ｃｍプレート；２枚
１組とし、１枚をマスタープレートとして保存した。）
、直径約３ｍｍに成長するまで培養した。これにワット
マン５４１０紙をゆっ（つとのせ、コロニーを完全に口
紙に移行させてから、クロラムフェニコール２５０μｇ
／ｍｌを含む同組成寒天培地上に該口紙を密着させ一昼
夜培養した。口紙へのＤＮＡ固定は次のよって行った。
コロニーのうち約１万個を同組成の寒天培地上に移し換
え（５）２個／ １４ Ｘ １０ ｃｍプレート；２枚
１組とし、１枚をマスタープレートとして保存した。）
、直径約３ｍｍに成長するまで培養した。これにワット
マン５４１０紙をゆっ（つとのせ、コロニーを完全に口
紙に移行させてから、クロラムフェニコール２５０μｇ
／ｍｌを含む同組成寒天培地上に該口紙を密着させ一昼
夜培養した。口紙へのＤＮＡ固定は次のよって行った。
培養後の口紙を０．５ Ｍ ＮａＯＨで５分間、２回処
理し、０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）で中性に
もどし、２ＸＳＳＣ（ｐＨ７） （Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０
．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
処理を経、９５％エタノール水溶液で軽（洗浄した後風
乾した。プローブとして（Ａ）１７ヌクレオチド：ＡＡ
（ＴｏｒＣ）ＴＴ（ＴｏｒＣ）ＧＡ（ＡｏｒＧ）ＣＡ（
ＡｏｒＧ）ＡＡ（Ａｏｒ Ｇ ） ＧＡの３２種類（Ｂ
） １４ヌクレオチド：ＧＡ（ＴｏｒＣ）ＣＡ（Ｔｏｒ
Ｃ）ＴＧ（ＴｏｒＣ）ＡＴ（Ｔ、 ＣｏｒＡ）ＡＴの２
４種類をそれぞれトリエステル法で化学合成し、以下に
述べるハイブリダイゼーションに使用した。
理し、０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ （ｐＨ７，４）で中性に
もどし、２ＸＳＳＣ（ｐＨ７） （Ｉ Ｘ５ＳＣ： ０
．１５ＭＮａＣ１，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
処理を経、９５％エタノール水溶液で軽（洗浄した後風
乾した。プローブとして（Ａ）１７ヌクレオチド：ＡＡ
（ＴｏｒＣ）ＴＴ（ＴｏｒＣ）ＧＡ（ＡｏｒＧ）ＣＡ（
ＡｏｒＧ）ＡＡ（Ａｏｒ Ｇ ） ＧＡの３２種類（Ｂ
） １４ヌクレオチド：ＧＡ（ＴｏｒＣ）ＣＡ（Ｔｏｒ
Ｃ）ＴＧ（ＴｏｒＣ）ＡＴ（Ｔ、 ＣｏｒＡ）ＡＴの２
４種類をそれぞれトリエステル法で化学合成し、以下に
述べるハイブリダイゼーションに使用した。
（イ） プレハイブリダイゼーション
口紙を６ Ｘ ＳＥＴ （１ｘＳＥＴ ： ０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５ ＭＴｒｉｓ （ｐＨ７，５）、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ）、０．５％ソニデットＰ４０（
半井化学社裳）および１００μｇ／ｍｌの変性大腸菌Ｄ
ＮＡ（ファルマシア社製の大腸菌ＤＮＡを５分間煮沸後
急冷したもの）を含む溶液で５５℃、２時間加温した。
ＮａＣｌ、０．０１５ ＭＴｒｉｓ （ｐＨ７，５）、
１ ｍＭ ＥＤＴＡ ）、０．５％ソニデットＰ４０（
半井化学社裳）および１００μｇ／ｍｌの変性大腸菌Ｄ
ＮＡ（ファルマシア社製の大腸菌ＤＮＡを５分間煮沸後
急冷したもの）を含む溶液で５５℃、２時間加温した。
（ロ）ハイブリダイゼーション
次に変性大腸菌ＤＮＡの代りに１００μｇ ／ ｍｌを
［３２ｐ ］標識したプローブ０．２ ｎｇ／ｍｌとを
用いて２９℃、２時間ハイブリダイゼーションを行った
。
［３２ｐ ］標識したプローブ０．２ ｎｇ／ｍｌとを
用いて２９℃、２時間ハイブリダイゼーションを行った
。
０−１ 式（ＩＩの塩基配列を含むプラスミドの単離
洗浄は各々（八３９℃で５分間（Ｂ２９℃で２０分間、
続いて室温で１０分間の処理を６ｘ ｓｓｃ溶液を用い
て各段階３回づつ繰返した。
洗浄は各々（八３９℃で５分間（Ｂ２９℃で２０分間、
続いて室温で１０分間の処理を６ｘ ｓｓｃ溶液を用い
て各段階３回づつ繰返した。
口紙な風乾後、Ｘ線フィルム（コダソクＸＡＲｓ ）を
用いてオートラジオグラフィーを行ない、（５）、（Ｂ
）両方にポジティブなコロニーを１個選別し、その菌体
よりプラスミドを取り出し、そのプラスミドをｐＨ８３
２３７と命名した。
用いてオートラジオグラフィーを行ない、（５）、（Ｂ
）両方にポジティブなコロニーを１個選別し、その菌体
よりプラスミドを取り出し、そのプラスミドをｐＨ８３
２３７と命名した。
（６） 発現ベクターの構築
大腸菌プラスミドｐＵＣ＋３（ファルマシア社製）上の
ラクトース・プロモーターに最近接したＨａｅ ＩＩ
部位を切断後、エキソヌクレアーゼＢａｔ３１（ＮＥＢ
社製）で両端を約１００ ｂｐ削除し、Ｔａ ＤＮＡ
！Ｊガーゼ（全酒造社製）で再閉環させたプラスミドｐ
ΔＵＣ□３を調製した（このプラスミドはラクトース・
プロモーターとしての機能を失っている）。次いでこの
プラスミドのＨｉｎｃｌＴ切断部位にＴｒｐＡターミネ
ータ−（ファルマシア社製）を挿入し、プラスミドｐΔ
Ｕ ＣＴ１３を得た。
ラクトース・プロモーターに最近接したＨａｅ ＩＩ
部位を切断後、エキソヌクレアーゼＢａｔ３１（ＮＥＢ
社製）で両端を約１００ ｂｐ削除し、Ｔａ ＤＮＡ
！Ｊガーゼ（全酒造社製）で再閉環させたプラスミドｐ
ΔＵＣ□３を調製した（このプラスミドはラクトース・
プロモーターとしての機能を失っている）。次いでこの
プラスミドのＨｉｎｃｌＴ切断部位にＴｒｐＡターミネ
ータ−（ファルマシア社製）を挿入し、プラスミドｐΔ
Ｕ ＣＴ１３を得た。
２６一
（Ａ） ＳＯＤをコードするＤＮＡの調製前記（５）
の（・うで得られたｐＨ８３２３７をＰｖｕ ＪＪで消
化し、Ｘｂａ Ｔ リンカ−（ＮＥＢ社製）をＴ４Ｄ
ＮＡ、 ！Ｊ−ガーゼで連結してＸｂａＪ部以を設けこ
のプラスミドをｐＨ８Ｘ ３２３７と命名した。
の（・うで得られたｐＨ８３２３７をＰｖｕ ＪＪで消
化し、Ｘｂａ Ｔ リンカ−（ＮＥＢ社製）をＴ４Ｄ
ＮＡ、 ！Ｊ−ガーゼで連結してＸｂａＪ部以を設けこ
のプラスミドをｐＨ８Ｘ ３２３７と命名した。
ｐＩ（ＳＸ ３２３７をＰｓｔ ■で消化し、エキソヌ
クレアーゼＢａ１３１で遂次消化した。さらにＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで末端を平滑にそろえ、ＢａｍＨＩ’Ｊ
ンカー（宝酒造社裳）を連結してＢａｍＨＩ トＸｂａ
Ｔ （いずれもニラポン・ジーン社製）テ消化後約６
３ Ｑ 〜７００ ｂｐノＤＮＡを２−１６％グラジェ
ントポリアクリルアミドゲルで回収した。
クレアーゼＢａ１３１で遂次消化した。さらにＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼで末端を平滑にそろえ、ＢａｍＨＩ’Ｊ
ンカー（宝酒造社裳）を連結してＢａｍＨＩ トＸｂａ
Ｔ （いずれもニラポン・ジーン社製）テ消化後約６
３ Ｑ 〜７００ ｂｐノＤＮＡを２−１６％グラジェ
ントポリアクリルアミドゲルで回収した。
（Ｂ） ＴａｃプロモーターおよびＳＯＤ ＤＮＡを
挿入したプラスミドの調製 プラスミドＩ）ＤＲ５４０（ファルマシア社製〕をＥｃ
ｏＲＴにノボ７−ジー゛ン社製）とＢａｍＨＩで消化し
Ｔａｃプロモーターを含む１２１ ｂｐをポリアクリル
アミドゲルで回収し、ｐΔＵＣＴ１３のＥｃｏＲＩ −
ＢａｍＨＩ間に挿入して得られた約３Ｋｂのプラスミド
をｐＴａｃ Ｊと命名した（第３図）。
挿入したプラスミドの調製 プラスミドＩ）ＤＲ５４０（ファルマシア社製〕をＥｃ
ｏＲＴにノボ７−ジー゛ン社製）とＢａｍＨＩで消化し
Ｔａｃプロモーターを含む１２１ ｂｐをポリアクリル
アミドゲルで回収し、ｐΔＵＣＴ１３のＥｃｏＲＩ −
ＢａｍＨＩ間に挿入して得られた約３Ｋｂのプラスミド
をｐＴａｃ Ｊと命名した（第３図）。
ｐＴａｃ ＪのＢａｍ Ｉ−Ｉ Ｉ −Ｘｂａ Ｔ間に
（７） （Ａ）で得られた約６３０−７００ ｂｐのＤ
ＮＡを挿入して得られたプラスミドを大腸菌ＤＨＩ （
ＡＴＣＣ３３８４，９）に形質転換した。得られた種々
のプラスミドの塩基配列を決定し、ＳＤ配列（Ａ、ＧＧ
Ａ）から開始コドンＡＴＧまでの距離が８〜１３ヌクレ
オチド長のプラスミドをｐＴａｃｓＯＤ８〜１３と命名
した（第３図）。
（７） （Ａ）で得られた約６３０−７００ ｂｐのＤ
ＮＡを挿入して得られたプラスミドを大腸菌ＤＨＩ （
ＡＴＣＣ３３８４，９）に形質転換した。得られた種々
のプラスミドの塩基配列を決定し、ＳＤ配列（Ａ、ＧＧ
Ａ）から開始コドンＡＴＧまでの距離が８〜１３ヌクレ
オチド長のプラスミドをｐＴａｃｓＯＤ８〜１３と命名
した（第３図）。
桑園である。
第２図は温度上昇後の培養特性図である。
図中０時間（矢印で示したうで温度を３０℃から３７℃
へ上昇した。
へ上昇した。
第３図はｐΔＵＣｌ３． ｐ△ＵＣＴ １．３ 、 ｐ
’１．’ａｃ １及びｐＴａｃＳＯＤ８〜１３の構成図
である。
’１．’ａｃ １及びｐＴａｃＳＯＤ８〜１３の構成図
である。
Claims (5)
- （１）ヒトＳＯＤをコードするＤＮＡを有するランナウ
ェイ型プラスミド - （２）ヒトＳＯＤをコードするＤＮＡを有するランナウ
ェイ型プラスミドで形質転換した微生物を培地中で培養
してＳＯＤを生成蓄積せしめ、次いで生成蓄積したＳＯ
Ｄを採取することを特徴とするヒトＳＯＤの製造方法 - （３）培養をまず３０℃以下の温度でおこない、次いで
培養期が対数増殖期前期になったところで培養温度を３
５〜４２℃に上昇させて 培養するクレーム（２）の方法 - （４）対数増殖期前期が吸光度０．１０〜０．３０の時
であるクレーム（３）の方法 - （５）３５〜４２℃での培養時間が１５時間以上である
クレーム（２）の方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271379A JPS62130689A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | ランナウエイ型プラスミド及びそれを利用したヒトｓｏｄの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60271379A JPS62130689A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | ランナウエイ型プラスミド及びそれを利用したヒトｓｏｄの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62130689A true JPS62130689A (ja) | 1987-06-12 |
Family
ID=17499249
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60271379A Pending JPS62130689A (ja) | 1985-12-04 | 1985-12-04 | ランナウエイ型プラスミド及びそれを利用したヒトｓｏｄの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62130689A (ja) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60137286A (ja) * | 1983-10-03 | 1985-07-20 | カイロン コーポレイション | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子 |
-
1985
- 1985-12-04 JP JP60271379A patent/JPS62130689A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60137286A (ja) * | 1983-10-03 | 1985-07-20 | カイロン コーポレイション | ス−パ−オキシドジスムタ−ゼ遺伝子 |
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