JPS63283590A - 組換え細菌を利用するｌ‐フェニルアラニンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ−フェニルアラニンの新たな（ｄｅ　ｎｏｖｅ）合成
における最終段階は、アミノトランスフェラーゼによる
フェニルピルビン酸塩（ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖａｔｅ
）のアミノ化からなる。種々のアミノトランスフェラー
ゼがフェニルピルビン酸塩をアミノ基転移してＬ−フェ
ニルアラニンを生成することができる［Ｂｉｏｃｈｅｍ
、　Ｊ、　ｍ、５９３−６０４　（１９８６）］が、細
胞においてはこの機能は、主に、いわゆる芳香環アミノ
トランスフェラーゼによって行われる。大ｇｉ（Ｅｓｃ
！１ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ　ｉ）の芳香環アミノトラ
ンスフェラーゼの遺伝子の略号は、ｔｙｒＢである［Ｕ
ｍｂａｒｇｅｒ：　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ
Ｉａｉｓｔｒｙ　ｌ：ｌ、５３３−６０６　（１９７８
）］。大腸菌に１２の場合には、この遺伝子の「細菌染
色体」上での位置が正確に知られている。遺伝子産物に
は、ＥＣ番号２．６．１．５が付与されている［Ｂａｃ
ｈｍａｎｎら：　Ｍ＋ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＲｅ
ｖｉｅｗｓ　　生Ａ、　１−５６　　（１９８０）コ。

大腸菌■（１２からのｔｙｒＢ遺伝子の単離は、欧州特
許出願第１１６，８６０号明細書に記述されており、マ
ルチコピープラスミド上でこのアミノトランスフェラー
ゼ遺伝子がクローニングされている。得られる組換えプ
ラスミドは、・この遺伝子を単離した兄妹に戻され、そ
の結果、この株中でのＬ−フェニルアラニンの産生量を
約１１％増加させることができた。

独国特許出願第Ｐ　３６３１８２９．９号明細書は、大
腸菌Ｂ　（ＡＴＣＣ１１３０３）に存在するｔｙｒＢ遺
伝子の単離、およびマルチコピープラスミド上でのこの
クローニングを行い、このブラ、スミドてＬ−フェニル
アラニン産生微生物を形質転換させることによってＬ−
フェニルアラニンの収率を１０倍に増加させる工程が提
案されている。

記述されている工程では、アミノ基供与体としてＬ−ア
スパラギン酸が用いられた。しかし、Ｌ−アスパラギン
酸の代わりに、より経済的なその前駆物質であるフマル
酸およびアンモニウム・イオンを用いることができる。

フマル酸またはフマル酸塩は、微生物中の酵素アスパル
ターゼによって、アンモニウム・イオンまたは尿素の存
在下で、し−アスパラギン酸に変換される。欧州特許出
願第１５１４８８号明ｍｓによると、なかでも、大腸菌
ＡＴＣＣ１１３０３を用いて２：　ｌの割合のフマル酸
アンモニウムとフェニルピルビン酸塩とからＬ−フェニ
ルアラニンが約８０％（フェニルピルビン酸塩を基にし
て）の収率て得られる。アスパルターゼをコードする遺
伝子は既にクローニングされており［Ｇｕｅｓｔら：　
Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＩＭＩ、！２
７１−１２７８　（１９８４）、Ｔａｋａｇ　ｉら：　
Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

じ、２０６３−２０７４（１９８５）、欧州特許第１２
３９０３号明細書］、Ｌ−アスパラギン酸の生産に用い
ることができる（欧州特許第１２３９０３号、欧州特許
第１２９１１９号各明細書）。

芳香環アミノトランスフェラーゼをコードするプラスミ
ドで形質変換させた、独国特許出願第Ｐ３６３１８２９
．９号明細書に記載の方法で調製できる微生物による、
前駆物質であるフェニルピルビン酸塩、フマル酸および
アンモニウム・イオンまたは尿素からのＬ−フェニルア
ラニン合成の収率（ｒａｔｅ）は、遺伝子操作を施され
ていない大腸菌Ｂによるものに比較しても高くないこと
が、いま、明らかになった。しかし、驚いたことには、
アスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）および芳香環アミノ
トランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）の両方をクローニング
した微生物を利用すると、これ以上に合成収率を上げる
ことができることが見出された。

ゆえに、本発明は次のことに関する。

１、次の工程からなる、組換え細菌を利用するＬ−フェ
ニルアラニンの製造法。

ａ）グラム陰性微生物から分離されて、かつ、アミノト
ランスフェラーゼおよびアスパルターゼをコードする遺
伝子を含む、染色体外因子、または、 一方の因子がグラム陰性微生物から分離されたアミノト
ランスフェラーゼ遺伝子を含み、他方の因子がグラム陰
性微生物から分離されたアスパルターゼ遺伝子を含む、
相互に和合する２種の染色体外因子の、 微生物への導入、 ｂ）微生物中での７ミノトランスフエラーゼ遺伝子およ
びアスパルターゼ遺伝子の発現、および活性を有する芳
香環アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼの
合成、および Ｃ）アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼに
よる、アンモニウム・イオンまたは尿素の存在下での、
フマル酸またはその塩およびフェニルピルビン酸塩の、
Ｌ−フェニルアラニンへの生物的形質転換。

２、グラム陰性微生物から分離され、かつ、アミノトラ
ンスフェラーゼおよびアスパルターゼをコードする遺伝
子を含む、複製性染色体外因子。

３、アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼの
合成、および微生物におけるＬ−フェニルアラニンの過
料生産のための、上記２の特徴を有する染色体外因子の
使用。

本発明の詳細は、特に、その好ましい実施態様において
、以下に説明される通りである。また、本発明は、特許
請求の範囲に定義されている。

原理的には、アスパルターゼおよびアミノトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子を含む微生物の全てをこれら
の遺伝子の供給源として使用することが可能である。こ
れらの微生物には、そのゲノム中に両道転子を有するも
ののみならず、二つの遺伝子のうちの一つだけを有する
ものも含まれ、また、その転写が構成性（ｃｏｎｓｔｉ
ｔｕｔｉｖｅ）であるか誘導性（１ｎｄｕｃｉｂｌｅ）
であるかを問わないこと、属の例は、セラチア（Ｓｅｒ
ｒａｔｉａ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エン
テロバクタ−（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネ
ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ）、エルウィニア（）：ｒ
ｙｉｎｉａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔ、ｅｕｓ）、シト
ロバクタ−（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、バラコツカス
（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、アースロバフタ−（Ａｒｔ
ｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕ
ｓ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ）、クレブシェラ（にＩｅｂｓｉｅｌ　Ｉａ
）、ミクロコツカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）または
クルイベラ（にＩｕｙｖｅｒａ）である。好ましくは、
グラム陰性細菌、特に腸内細菌およびシュードモナス菌
属、から分離される遺伝子が用いられる。特に好ましく
は、例えば、大腸菌に１２、大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｗの
ような大腸菌、およびセラチア・マルセッセンスおよび
シュードモナス・フルオレッセンスからの遺伝子が用い
られる。種々のアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｔｙ
ｒＢ、ａｓｐＣ，１ｌｖＥ）の大腸菌からの再現可能な
りローニングは、記述されている（欧州特許第１１６８
６０号明細書、独国特許第３６３１８２９．９号明細書
、Ｆｏｔｈｅｒｉｎｇｈａｍ　ＬＧ、ら：　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　Ｊ、　２．ｉＡ、　５９３−６０４　（１９８
６））。種々の細菌株からのアスパルターゼ遺伝子の分
離についても、既に記述があり、大腸菌Ｉく１２からは
Ｇｕｅｓｔ　Ｊ、　Ｒ，ら：　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ、　ＩＭｉ、　１２７１１２７８　（１９
８４）およびＫｏｍａｔｓｕｂａｒａ　Ｓ、ら：Ｊ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　３．２８１−２９１　（１９
８６）に、大腸菌ＷからはＴａｋａｇ＋　Ｊ、　Ｓ、ら
：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｌ３．２
０６３−２０７４　（１９８５）に、セラチア・マルセ
ッセンスからは欧州特許第１２３９０３号明細書に、シ
ュートモナス・フルオレッセンスからはＴａｋａｇｉ　
Ｊ、　Ｓ。

ら：　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１ＩＩＱ、　６９７−
７０５　（１９８６）に、記述されている。好ましくは
、アスパルターゼの遺伝子としてはａｓｐＡを、アミノ
トランスフェラーゼの遺伝子としてはｔｙｒＢ、１ｌｖ
ＥおよびａｓｐＣを用いる。特に、大腸菌からのｔｙｒ
Ｂ遺伝子が、本発明によるＬ−フェニルアラニン製造に
は好ましい。

遺伝子は、これら遺伝子を含む、予め遺伝子操作された
微生物から、またはプラスミドからも分離できる。既に
記述あるいは提示されているマルチコピープラスミドの
ｐ　Ｇ　Ｓ　７３　［Ｇｕｅｓｔ　Ｊ、　Ｒ。

ら：　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　ＩＸｍ
、１２７１１２７ｊ３（１９８４）コおよびｐ１Ｍｓ６
０５６［独国特許出願第Ｐ　３６３１８２９．９号明細
書］は、プラスミドからのａｓｐＡおよびｔｙｒＢ遺伝
子の分離に好ましく用いられる。アスパルターゼをコー
ドする遺伝子ａｓｐＡは、ｌ）　Ｇ　Ｓ　７３から制限
酵素を用いて分離される。プラスミドは、アスパルター
ゼ遺伝子を２．９ｋｂまたは６．２ｋｂフラグメント上
に得るように、好ましくは、制限酵素ＢｃｌＩ、　　ま
たは酵素Ｓｐｈ　ｉと５ａｌＩとの徒合せによって切断
される。ｔｙｒＢ遺伝子は、酵素５ａｌＩ、または酵素
５ａｉｌとｓｐｈ　Ｉとの組合せによる切断の後、プラ
スミドｐ１Ｍｓ６０５６から得られる。

さらに、プラスミドｐＧＳ７３および ｐ　１ＭＳ６０５６のａｓｐＡおよびｔｙｒＢ遺伝子は
、池の多数の制限酵素による切断によって得られる［Ｇ
ｕｅｓｔ　Ｊ−Ｒｏら：　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ。

山、１２７１−１２７８　（１９８４）、独国特許出願
第Ｐ　３６３１８２９．９号明細書］。

二つの遺伝子を分離した後に、これらは、適当なレプリ
コン、例えば、大腸菌のマルチコピープラスミドｐＢ　
Ｒ３２２［Ｂｏｌｉｖａｒ　Ｆ、ら：　Ｇｅｎｅ　２．
９５−１１３　（１９７７）］またはより広い宿主域を
有することでｐＢＲ３２２と区別されるプラスミドＲ９
Ｆ１０１０　［Ｇｕｅｒｒｙ　Ｐ、ら：　Ｊ、　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、Ｌ１２．６１９−６３０　（１９７４）
コ上、またはこれらプラスミドの誘導体りで、クローニ
ングされる。プロファージＤＮＡ、　　例えば、Ｐ１プ
ロファージゲノム、もレプリコンとして用いることがで
きる。プラスミドでの本発明による複合プラスミドの構
築のために、特に好ましく用いられる。分離された遺伝
子は、次いで、まだこの遺伝子を有していないプラスミ
ドにそれぞれに導入できる。

二つの遺伝子の解読は、各々、関与する染色体ａｓｐＡ
およびｔｙｒＢ遺伝子の上流の２個の異なるプロモータ
ーから開始される。もしくは、二つの遺伝子は、−緒に
または別々に、構成的なまたは調節された活性を有する
、強力な外来性プロモーターを用いて転写することもで
きる。

ａｓｐＡ遺伝子およびｔｙｒＢ遺伝子を、微生物細胞内
に一緒に存在できる二つの異なる和合性プラスミド中で
それぞれクローニングすることも可能である。

一緒にまたは別々にクローニングして得た当該遺伝子を
含む複合プラスミドで、コンピテント微生物細胞を形質
転換する。遺伝子の分［！としても用いられる上記の微
生物が、この目的にも適している。遺伝子の単離源であ
った微生物を形質転換すると有利である。遺伝子をコン
ピテント大腸菌細胞に挿入するのが、特に好ましい。ア
ンピシリン耐性クローンについて、所望の複合プラスミ
ドの存在を制限酵素分析によって調べる。アスパルター
ゼおよび芳香環アミノトランスフェラーゼをコードする
クローンは、特定の複合プラスミドの脱落なしに何度も
移転して用いられて、フェニルピルビン酸塩およびフマ
ル酸アンモニウムまたはフマル酸、またはフマル酸塩（
フマレート）およびアンモニウム・イオンまたは尿素か
らのＬ−フェニルアラニンが製造される。このＬ−フェ
ニルアラニン合成の収率は、遺伝子操作を施さない大腸
菌株、またはクローニングされたａｓｐＡまたはｔｙｒ
Ｂ遺伝子のみを含む大腸菌株の２ないし３１ｇである。

本発明は、次の請訓によってさらに説明される。

特に記載がない限り、パーセント表示は重量パーセント
である。

例１： ［大腸菌からのプラスミドの分離コ ブラスミドｐ　１ＭＳ６０５６は、芳香環アミノトラン
スフェラーゼをコードする大腸菌Ｂ（ＡＴＣＣ１１３０
３）遺伝子（ｔｙｒＢ）を含む、ｐＩＭｓ６０５６を、
独国特許出願第Ｐ　３６３１８２９．９号明細書に提示
されたようにして分離した。アスパルターゼをコードす
るプラスミドｐＧＳ７３をＧｕｅｓｔ　Ｊ、　Ｒ，ら：
　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

」、１２７１−１２７８　（１９８４）の方法で得た。

ｐＧＳ７３は、Ｌ−Ｃ１ａｒｋｅ　ら［Ｃ１ａｒｋｅ　
Ｌ、ら：Ｃｅ１ｌ　ｆｌ、９１−９９　（１９７６）コ
によって分離された大Ｊｌｉ！遺伝子バンクから得られ
た遺伝子であって、大腸菌（Ｃ５５２０）からクローニ
ングされたａｓｐＡ遺伝子を含む。プラスミドｐ　Ｉ　
Ｍ　５６０５６は大腸菌Ｂ　（ＡＴＣＣ１１３０３）か
ら、プラスミドｐＧＳ７３は大勝ｇＫ１２ （０Ｍ２４２）から、ｒｃｌｅａｒｅｄ　１ｙｓａｔｅ
Ｊ法ｒｃｌｅｖｅｌｌ　Ｄ、　Ｂ、、）ｌｅｌｉｎｓｋ
ｉ　Ｄ−Ｒ，：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｖ、１１５９−１１６６　（１
９６９）］によって、アルカリ溶解［ｌｓｈ−Ｈｏｒｏ
ｗｉｃｋ　Ｄ、および３＋Ｊｒｋｅ　Ｊ、：Ｆ、　Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９．２９８５−２９９
８　（１９８１）］によって、または、熱処理の後の溶
解［Ｈｏｌｍｅｓ　Ｄ、Ｓ。

ら：　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌ１２．１９３
　（１９８１）］によって、調製した。染色体ＤＮＡは
、セシウムクロリド／エチジウムプロミド濃度勾配遠心
分離法によって除去した（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：
　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ２．１９８２．９
３−９４頁）。

例２： ［ｉ１！当なりＮＡフラグメントの調製］ａ）突出末端
を有するＤＮＡフラグメント：大１４１１１から分離し
たプラスミドｐＧＳ７３およびｐ１Ｍｓ６０δ６を、二
つの制限酵素５ａｌｌおよびＳ　ｐ　ｔｌＩで、各々、
消化した。すなわち、各々の場合に、２μｇのプラスミ
ドＤＮＡを用°いて、全容量５０μｍの酵素５ａｌｌに
よる初めの完全切断を酵素の製造者（バーリンガー・マ
ンハイム社）の指示に従って行った。

反応をフェノール／クロロフォルムおよびクロロフォル
ム／イソアミルアルコールによる抽出によって終結させ
た。エタノール沈澱および７０％エタノールによる洗浄
の後、乾燥したＤＮＡペレットを５０μｍの５ｐｈｆの
ためのインキュベーション緩衝液に溶解させて、酵素５
ｐｈｌ（バーリンガー・マンハイム社）によって完全に
切断した。

ｂ）平滑末端を有するＤＮＡフラグメント：プラスミド
ｐＧＳ７３を制限酵素ＢｃｌＩで完全に切断し、プラス
ミドｐ　１ＭＳ６０５６を酵素５ａｉｌで完全に切断し
た。その方法は、酵素製造者（バーリンガー・マンハイ
ム）の指示に従った。反応を例２ａ）と同様にして終結
させて、ＤＮＡをエタノールで沈澱させて、７０％エタ
ノールで洗浄した。得られたプラスミドフラグメントの
突出末端を、大ｐａ菌からのＤＮＡポリメラーゼＩ　（
Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）で埋填した。すなわち、乾
燥ＤＮＡベレットを１８μｍの蒸留水に溶解して、２．
５μｍの緩衝液（０−５Ｍ）リス−塩酸、ｐＨ７，２，
０、１Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ、１ｍＭジチオスレイトー
ル、５００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、１７ｚｌ
の２ｍＭ　　ｄＡＴＰ、　　　１＃ｌの２ｍＭｄＴＴＰ
。

１１１１の２ｍＭｄＣＴＰ、１μｌの２ｍＭｄＣ；ＴＰ
および２ユニツトＤＮＡポリメラーゼＩ（にｌｅｎｏｗ
フラグメント）とともに２２℃で３０分間インキュベー
トした。反応を７０℃で５分間加熱して終結させた。

例３： ［プラスミドＤＮＡのアルカリホスファターゼによる処
理コ 例２ａまたは２ｂのようにして調製したプラスミドｐ　
１ＭＳ６θ５６のフラグメントの末端の燐酸基を、２３
ユニツトの仔ウシ腸管アルカリホスファターゼとともに
３７℃で３０分間インキュベートして、除去した。混合
物を、フェノール／クロロフォルムおよびクロロフォル
ム／イソアミルアルコールで抽出処理して、エタノール
沈澱および７０％エタノールでの洗浄を行った。ＤＮＡ
を真空乾燥した後、これを２０μｌのＴＥ緩衡液（１０
１１Ｍトリス・塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）に
溶解した。

例４： ［ＤＮＡフラグメントの分離コ 例２ａまたは２ｂのようにして調製したプラスミドｐＧ
Ｓ７３のＤＮＡフラグメントを、ＴＡＥ［４０ｍＭ）リ
ス、　１０ｍＭ酢酸ナトリウム、　１ｍＭ−ＥＤＴＡ　
（ｐＨ７，８）コを泳動緩衝液とした１％低融点アガ、
ロースのゲル電気泳動によって、各々、分画した。６．
２ｋｂＳａ　ｌ　Ｉ／Ｓｐｈ　Ｉフラグメント（例２ａ
）および平滑末端を有する２、９ｋｂフラグメント（例
２ｂ）を、ゲルをエチジウムプロミドで染色した後に長
波長ＵＶ光（３６６ｎｍ）を照射してバンドとして、各
々、可視化し、ＤＮＡ長標準物（バーリンガー・マンハ
イム社、カタログ番号２３６２５０）を用いて同定し、
切り出し、６５℃で５分間インキュベートして、さらに
、最初はトリス−飽和フェノール（ｐＨ８，０）で、次
いでフェノール／クロロフォルムおよびクロロフォルム
／イソアミルアルコールで、抽出した。各々の場合、Ｄ
ＮＡをエタノールを用いて水層から沈澱させ、７０％エ
タノールで洗浄し、真空乾燥して、さらに、２０μｍの
ＴＥ緩衝液に再懸濁させた。

例５： ［ＤＮＡフラグメントのライゲーション］ａ）突出末端
のライゲーション 例３のようにして得たプラスミドｐ１Ｍｓ６０５６の脱
燐酸化Ｓａ　ｌ　Ｉ／Ｓｐｈ　Ｉフラグメントと、例４
のようにして分離しておいたプラスミドｐＧＳ７３の６
．２ｋｂＳａ　ｌ　Ｉ／Ｓｐｈ　Ｉフラグメントとを、
モル比約３：　１で混合した。この混合物を、１ユニツ
トのＴ４ＤＮＡリガーゼと、製造者（バーリンガー・マ
ンハイム社）の推奨するインキュベーション緩衝液中で
１６℃で１６時間インキュベートした。この混合物の全
容量は５０μｍで、全ＤＮＡ４度は２０μｇ／ｍｌであ
った。

ｂ）平滑末端のライゲーション 例２ｂ（＋）ようニシテ得り８．２ｋｂ　ｐ　ＩＭＳ６
０５６を、例３のようにして脱燐酸化して、これをリガ
ーゼ反応に用いた。すなわち、ｐＩＭｓ６０５６フラグ
メントと、例４のようにして分離したプラスミドｐＧＳ
７３０２．９ｋｂフラグメントとを、約３：　１の比で
混合した。この混合物を、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，６）、１０ｍＭＭｇＣ１２，５％（ｗ／ｖ）ポリエ
チレングリコールｓ　、　ｏｏｏ、１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ
、　　１　ｍＭジチオスレイトール、およびｌユニット
のＴ４ＤＮＡリガーゼと、２５℃で４時間インキュベー
トした。この混合物の全容量は２０．ｕｌで、全ＤＮＡ
濃度はｌ　Ｏｕ　ｇ／　ｍｌテ、ｉった。

プラスミドの構築を、第１図および第２図に示す。第１
図は、芳香環アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）お
よびアスパルターゼ（ａｓｐＡ）をコードするプラスミ
ドの構築（突出末端物のクローニング）を示す。第２図
は、これに対応する平滑末端物のクローニングを示す。

次の略号を用いる。ｂｌａ＝ｌミニアンピシリン伝子（
β−ラクタマーゼ遺伝子）の中実棒線はｐＡＴ　１５３
ＤＮＡに対応し、斜線入り棒線はｐＢＲ３２２ＤＮＡに
対応する。第２図の二つの矢印は、プラスミドｐＧＳ７
３上の２．．９ｋｂＢ　ｃ　１１フラグメントの位置を
示す。

例６： ［大腸菌に１２株の形質転換］ 例５ａ）または５ｂ）のようにして調製したライゲーシ
ョン混合物を３倍に希釈して、Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓらによって記述されている方法（Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　ら：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、１９８２、Ｃ５ＨＬ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、２
５０−２５１頁）で、大腸菌に１２（例えば、ＨＢＩＯ
ＩまたはＷ３１１０）での形質転換に用いた。形質転換
混合物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地（１％トリプ
トン、０．５％酵母抽出物、１％塩化ナトリウム、ｐＨ
７，５，１，８％寒天）上に塗布し、これにオートクレ
ーブ処理した１００μ８／１のアンピシリンを加えた。

例７： ［アスパルターゼおよび芳香環アミノトランスフェラー
ゼをコードするクローンの同定］所望のプラスミドを含
む形質転換株を分離するために、アンピシリン耐性クロ
ーンのプラスミドＤＮＡを分離して［Ｉｓｈ−Ｈｏｒｏ
ｗｉｃｚ　Ｄ、、　８ｕｒｋｅ　ｊ。

Ｆ、　：　　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　Ｌｉ
、２９８９−２９９８　（１９８１）］、制限酵素５ａ
ｌＩおよび５ｐｈｌ（例５ａ）またはＥｃｏＲＩ（例５
ｂ）で完全に消化し、これを０．８％アガロースゲル電
気泳動にて分画した。例５ａからのライゲイジョン混合
物の組換えプラスミドは、ｐｃｓ”；’ａからの６．２
ｋｂＳ　ａ　ｌ　Ｉ　／ｓｐｈ　Ｉフラグメントと、ベ
クタープラスミドｐ　１ＭＳ６０５６の８．１ｋｂＳａ
ｌ　Ｉ／５ｐｈＩフラグメントとをともに有し、それぞ
れ、クローニングされたａｓｐＡおよびｔｙｒＢ遺伝子
を含有した（第１図を参照されたい）。これらの複合プ
ラスミドは、大腸菌中で、アンピシリンの存在しない状
態ででも、安定して得られた。

酵素ＥｃｏＲＩ切断部位を３個有している、例５ｂから
のライゲイジョン混合物の組換えプラスミドは、同様に
、アスパルターゼおよび芳香環アミノトランスフェラー
ゼのためのクローニングされた遺伝子を、それぞれ、含
有した（第２図を参照されたい）。得られたフラグメン
トの大きさの比較によって、ｐＧＳ７３からのアスパル
ターゼをコードする２、９ｋｂＤＮＡフラグメントは、
プラスミドｐＩＭ３６０５Ｂの両位置方向にクローニン
グされて、いたことが明らかになった（第２図を参照さ
れたい）。このようにして単離された二つのプラスミド
は、ｐ　ＩＭＳ６０５６ＤＮＡに間して異なる位置方向
にｐＧＳ７３からの２．９ｋｂフラグメントを含有して
おり、アンピシリンが存在しなくても、大腸菌中で安定
して得られた。

例８： ［大腸菌Ｂ株の形質転換コ アスパルターゼおよび芳香環アミノトランスフェラーゼ
をコードする、例７のようにして単離したプラスミドを
、例１と同様にして大腸菌に１２（例えば、ＨＢ　１０
１またはＷ３１１０）から単離して、例６に記述した方
法で大腸菌Ｂ（ＡＴＣＣ１１３０３，）の形質変換に用
いた。しかし、アンピシリン耐性のクローンの収率は、
大腸菌に１２株に較べて極めて低かった。大腸菌Ｂ（Ａ
ＴＣＣ１１３１３）のアンピシリン耐性形質転換株のプ
ラスミドを単離して、例７と同様にして制限酵素によっ
て再び調べた。

例９： ［アスパルターゼおよび芳香環アミノトランスフェラー
ゼ活性の測定］ アスパルターゼ活性をシグマＡ−８１４７アツセイキツ
トを用いて決定した。芳香環アミノトランスフェラーゼ
活性を、α−ケトグルタル酸の代わりに１２ｍｍｏｌ／
リッ）１１のフェニルピルビン酸塩（ナトリウム塩）を
用いてシグマ００３９０アツセイキツトで測定した。例
７または８と同様にして得られた絹換え大腸菌に１２ま
たはＢ株の抽出物は、同一のプラスミド上にクローニン
グされたａｓｐＡ遺伝子およびｔｙｒＢ遺伝子の両方を
含有しており、対応するプラスミドを含まない株の約５
〜ｌＯ倍のアスパルターゼおよび芳香環アミノトランス
フェラーゼ活性を示した。

例１０： ［フェニルピルビン酸塩、フマル酸およびアンモニウム
・イオンからのＬ−フェニルアラニンの調製工程コ 大腸菌Ｂ　（ＡＴＣＣ１１３０３）を、次の組成の栄養
溶液１０リツトルで３７℃で２０時間培養した。

フマル酸　　　　　　　　　　　　　　　３０　ｇ／リ
クトル肉エキス　　　　　　　　　　　　　　　　２０
　ｇ／リットルＫＩ（２ＰＯ４２ｇ／リットル Ｍｇ　ＳＯ４・　７　　Ｈ２Ｏ０，５ｇ／リットｎＣａ
Ｃ１２Φ　２Ｈ，２００，１ｇ／リブトルＮＨａＣＩ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉｇ／リットルア
ンモニアにてｐＨを７．９に調整した。濾過滅菌してお
いたフェニルピルビン酸塩２４ｇ／リフドルを加えてお
いた。

得られた細胞を、３０ｇ／リブトルフェニルピルビン酸
塩ナトリウム、３０ｇ／リフ目アンモニア中和フマル酸
、３０ｇ／リットル塩化アンモニウム、０．６ｇ／リフ
トＡＭｇＣ１２・６Ｈ２０，０，１％ポリオキシエチレ
ンパソルビタン・モノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０、商
標）および５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，９）からな
る１００１水溶液に懸濁させた。懸濁液を、０　、５　
ＶＶｍで圧縮空気中を通して３７℃で培養した。９時間
後に測定したＬ−フェニルアラニン濃度は、２３ｇ／リ
ットルであった。

例１１： ［Ｌ−フェニルアラニン調製における、屯雛した組換え
細菌の利用］ アスパルターゼおよび芳香環アミノトランスフェラーゼ
をコードする、例７に記述したプラスミドの一つを含む
大腸菌株を、例１Ｏに記載した方法による、フェニルピ
ルビン酸塩からのＬ−フェニルアラニン製造に用いた。

ただし、培地にζ↓、いかなるフェニルピルビン酸塩を
も加えなかった。

わずか３〜５時間の後に、Ｌ−フェニルアラニン濃度２
４ｇ／リグトルが得られた。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の工程を含むことを特徴とする、組換え細菌を利
   用するＬ−フェニルアラニンの製造法。 ａ）グラム陰性微生物から分離され、かつ、アミノトラ
   ンスフェラーゼおよびアスパルターゼをコードする遺伝
   子を含む染色体外因子、 または、 一方の因子がグラム陰性微生物から分離されたアミノト
   ランスフェラーゼ遺伝子を含み、他方の因子がグラム陰
   性微生物から分離されたアスパルターゼ遺伝子を含む、
   相互に和合する２種の染色体外因子の、 微生物への導入、 ｂ）微生物中でのアミノトランスフェラーゼ遺伝子のお
   よびアスパルターゼ遺伝子の発現、および活性を有する
   アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼの合成
   、および ｃ）アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼに
   よる、アンモニウム・イオンまたは尿素の存在下での、
   フマル酸またはその塩およびフェニルピルビン酸塩の、
   Ｌ−フェニルアラニンへの生物的形質転換。 ２、遺伝子を発現させる微生物が腸内細菌またはシュー
   ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌属の細菌である
   、請求項１に記載の製造法。 ３、微生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌ
   ｉ）Ｋ１２株、大腸菌Ｂ株または大腸菌Ｗ株である、請
   求項２に記載の製造法。 ４、アミノトランスフェラーゼおよびアスパルターゼを
   コードする遺伝子を含み、かつ、グラム陰性微生物から
   分離された、複製性染色体外因子。 ５、腸内細菌および／またはシュードモナス菌属の細菌
   からの遺伝子を含有する、請求項４に記載の複製性染色
   体外因子。 ６、大腸菌Ｋ１２株および／または大腸菌Ｂ株および／
   または大腸菌Ｗ株およびセラチア・マルセッセンス（Ｓ
   ｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）および／また
   はシュードモナス・フルオレッセンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）
   からの遺伝子を含有する、請求項５に記載の複製性染色
   体外因子。 ７、大腸菌Ｋ１２からのａｓｐＡ遺伝子および大腸菌Ａ
   ＴＣＣ１１３０３からのｔｙｒＢ遺伝子を含有する、請
   求項６に記載の複製性染色体外因子。 ８、マルチコピープラスミドを含有する、請求項４〜７
   の１項以上に記載の複製性染色体外因子。 ９、請求項４〜８項の１項以上に係る染色体外因子の、
   アミノトランスフェラーゼまたはアスパルターゼの合成
   における使用。 １０、請求項４〜８項の１項以上に係る染色体外因子の
   、微生物でのＬ−フェニルアラニン生産における使用。