PT87305B

PT87305B - Processo para a preparacao de l-fenilalanina por meio de bacterias recombinantes

Info

Publication number: PT87305B
Application number: PT87305A
Authority: PT
Inventors: Rudiger Marquardt; Johann Then; Gerhard Wohner; Paul Prave; Barbara Brau
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-04-24
Filing date: 1988-04-22
Publication date: 1992-08-31
Also published as: FI881870A0; FI881870A; AU1509688A; JPS63283590A; NO881779D0; IL86156A0; EP0289846A1; DE3713755A1; DK223188D0; DK223188A; PT87305A

Description

último passo da síntese de novo da I*-fenilalanina consiste na aminação do piruvato de fenilo por meio de uma transaminase. Embora várias transaminases se encontrem na situação de transaminar piruvato de fenilo em Lrfenilalanina / Biochem. J. 234, 593-604 (1986)-7, esta função é desempenhada na célula principalmente pela chamada transaminase aromática. A abreviatura do gene da transaminase aromática em E. coli é tyrB /“umbarqer, Ann. Rev. Biochemisty 47, 533-606(1978; J. No caso da E. coli K12 conhece-se com exactidêo a posição do gene no cromossoma da bactéria. 0 produto genético recebeu o número E.C. 2.6.1.5 /*~Bachmann et al., Microbiological Reviews 44, 1-56 (1980)__/.

No registo de patente europeia

116 860 descreve-se o isolamento do gene tyrB da E, coli

K12, bem como a clonagem deste gene de aminotransferase num plasmideo multi-cópia. 0 plasmideo recombinante obtido reintroduz-se de novo na estirpe a partir da qual se isolou originalmente o gene, com o resultado de se conseguir aumentar em cerca de 11% a produção de L-fenilalani na nestf estirpe.

: -J.:

No registo de patente alemã P 36 31 829. fí· propõe-se um processo segundo o qual se obtem um aumento de 10 vezes do rendimento de L-fenilalanina, atra vós do isolamento do gene tyrB presente em E.coli.B (ATCC 11 303) a da sua clonagem num plasmideo multi-cópia, após a transformação de microrganismos produtores de L-fenilalanina com este plasmideo.

No processo referido empregou-se ícido L-asparagínico como doador de grupos amino. Em vez do ácido L-asparaginico podem empregar-se contudo os seus precurssores ácido fumárico e iões amónio, mais económicos, 0 ácido fumárico ou os fumaratos transformam-se em ácido L-asparagínico por meio do enzima aspartase existente em microorganismos, na presença de iões amónio ou de ureia. Segundo o registo de patente europeia 151 488, transforma-se por exemplo com E.coli ATCC 11303, fu marato de amónio e piruvato de fenilo, na proporção de 2tl, em L-fenilalanina, com um rendimento de 80% em relação ao piruvato de fenilo. Já se efectuou a clonagem de genes codificantes para a aspartase £~Guest et al., J. Gen. Microbiol. 130, 1271-1278(1984); Takagi et al, Nucl. Acide Res. 13, 2063-2074(1985); EP 123903^ e podem empre gar-se para a produção de ácido L-asparagínico (EP 123 903; EP 129119).

Verificou-se então que um microorganismo transformado com um plasmideo codificante para a transaminase aromática, que se pode preparar de acordo com o registo de patente alemã p 36 31 829.9, não apresen ta qualquer aumento da razão de síntese de L-fenilalanina

a partir dos precurssores piruvato de fenilo, ácido fumárj co e ides amónio, ou ureia, em comparação com a E.coli B não manipulada geneticamente. Descobriu-se contudo surpreendentemente que, por meio de microorganismos que contêm clonados tanto um gene de aspartase (aspA) como um gene codificante para a transaminase aromática (tyr B), se consegue atingir, pelo contrário, um aumento da razSo de síntese.

A invenção refere-se por isso a»

b)

1. Um processo para a preparação de L-fenilalanina por melo de bactérias recomblnantes, caracterizado por

a) se Introduzir num microorganismo um elemento extra-cromossoàal, que contém um gene codificante da aminotrans- ferase e da aspartase, Isolado a partir de um microorganismo gram-negativo, ou que contém dois elementos extra-cromossomais, compatíveis um com o outro, em que um dos elementos é um gene de aminotransferase isolado a partir de um microorganismo gram-negativo a o outro ele mento é um gene de aspartase isolado a partir de um microorganismo gram-negativo, se exprimir o gene da aminotransferase e o gene da aspartase no microorganismo e se sintetizar uma aminotranI feras· e uma aspartase activas, e

c) a aminotransferase e a aspartase promoverem a biotransformação do ácido fumárico ou dos seus sais e do piruva to de fenilo em L-fenilalanina, na presença de iões amó nio ou de ureia.

2, Um elemento extra-cromossomal replicante, que contém um gene codificante para a aminotransferase e para a aspar tase, isolado a partir de um microorganismo gram-negat£ vo.

3. A utilização do elemento extra-cromossomal caracterizado em 2, para a síntese da aminotransferase e da aspartase, bem como para a sobreprodução de L-fenilalanina

- 3 I|,

em microorganismos texto que se segue descreve a invenção em detalhe, em especial no que respeita às suas formas de execução preferenciais. Além disso, défine-se a invenção nas reivindicações da patente.

fontes dos genes codificanaminotransferase podem util^

Como tes para a aspartase e para a zar-se basicamente todos os microorganismos que contêm es ses gene·· Como tal, são de considerar não só os microorganismos que contêm os dois genes no seu genoma, mas tan bém aqueles que apresentam apenas um desses genes, independentemente do facto de esse se transcrever de forma coi.s titutiva ou indutiva. Como microorganismos que contêm ambos os genes referem-se por exemplo bactérias dos géneros Serratia, Escherichia, Pseudomonas, Enterofracter, Saí.

i Erwinla, proteus, Çitrobacter, paracoccus, Arthro / Brevibacterinm, Co^ne^acterium, Flavo- .

Çlebçlella, Mlçrococçug ou -se de preferência genes de bactérias especial de enterobactérias, bem como nero Pseudomonas. utilizam-se muito os genes de E.coli., como por exemplo de B.coli £211 » · 2x£2il *· como de Serratia marcescens 2UBâ25SBM-£J22ESB£22»

Kluyvera, Isolamgram-negativàs, em de bactérias do gépreferencialmente Kl 2, E.

e i_. A clonagem de vários genes de aminotransferase (tyrB, aspC, ilvE) de E.coli, encontra-se descrita (EP 116 860; DP 36 31 829.9; Fotheringham, I. G. et al., Biochem. J. 234, 593-604(1986)). O isolamen to de genes de aspartase a partir de diversas estirpes de bactérias encontram-se também já descrito, a partir de toMi · Guest, J.R. et al., J. Gen. Microbiol. 13oJ

1271-1278(1984) e em Komatsubara S. et al., J. Biotechnol.

281-291(1986) a partir de E.coli W em Takagi, j.s. et al., Nucleic Acids Res. 13, 2063-2o74(1985); a partir de Serratia marcescens na EP 123 903 e a partir de Pseudomonas fluorcescens em Takagi, J.S. et al., J. Biochem.,

100, 697-705(1986). De preferência utiliza-se aspA como gene para a aspartase, bem como tyrB* ilvE e aspC como genea para a aminotransferase, com preferência do “4 gene ÍXO* E.coli* para a produção de L-fenilalanina do acordo com a invenção.

- y ^:Τ'

Os genes podem também isolar-se • partir de microorganismos ou de plSsmídeos geneticamente pré-manipulados, que contenham esses genes· para o isolamento dos genes aspA e tyrB a partir de plasmídeos utilizam-se de preferência os plasmideos multi-cópia já descritos ou propostos* pGS73 /“ouest* J.R. et al.* J. Gen. Microbiol. 130* 1271-1278 (1984)_7 « p!MS6O»6 /-Registo de patente alemS P 36 31 829.9 J. Por meio do enzimas de restrição isola-se* a partir de pGS73* o gene asnA codificante para a aspartase* o plasmideo corta-sede preferência com o enzima de restrição BC1I ou com uma combinação dos enzimas Sphl e Sall, de modo a obter-sê o gene de aspartase na forma de um fragmento coro

2*9 Kb(guilobares) ou com 6*2 Kb te^se uma c mídeo genes 6056, restri

1271-1278(1984); registo de patente alemã p 36 31 829. U ·* 0 gene tyrB pode obp4s cisão com o enzima de restrição Sall ou com Inação dos enzimas Sall e Sphl, a partir do pias 56« Além disso* podem ainda isolar-se os • a partir dos plasmideos pG173 e pIMScisão com uma série de outras endonucleares de /*Guest* J.R. et al., J. Gen. Microbiol, 130,

r

Após o isolamento de ambos os genes clonam-se estes num meio de replicação (replicão) ade quado, por exemplo no plasmideo multi-cópia pBR322 de E, coli /^Bolívar* F. et al.. Gene 2, 95-113(1977) J ou no plasmideo RSF1010 /~Guerry, P. et al·, J. Bacteriol. 117, 619-630(1974)^, que se distingue do pBR 322 por um espec tro hospedeiro mais largo e por um menor número de cópias, bem come em derivados destes. Pode ainda utilizar-se também como replição DNA - profago, por exemplo o genoma PI - profago· Utilizam-se muito preferencialmente, pa~

ra a construção dos plasmídeos híbridos em E.coli , de acordo com a invençSo, os plasmídeos pG573 e pIMS6056. Os genes isolados podem introduzir-se então no plasmideo que não contém ainda o gene.

reconhecimento (leitura) de ambos os genes efectua-se por meio de dois promotores diferentes, ligados aos genes cromossomais correspondentes asjgA * Em alternativa, podem transcrever-se os dois genes quer em conjunto quer isoladamente, por meio de um promotor estranho forte, constitutivo ou com uma actividade regulada.

É ainda possível clonar o gene aspÃ ou tyrB, cada um deles em dois plasmídeos diferentes compatíveis, que serão colocados posteriormente em contacto na célula do microorganismo.

Os plasmídeos híbridos que contém os dois genes mencionados, clonados em conjunto ou si multaneamente, sofrem transformações em células de microorganismos competentes. Peara tal fim são mais uma vez apropriadas os microorganismos anteriormente mencionados, a partir dos quais se podem também isolar os genes. É de toda a vantagem proceder à transformação em microorganismos < partir dos quais se isolaram previamente os genes. Prefere-se em especial a introdução do gene em células do E.coli adequadas.

Os clonos resistentes à ampicilina testam-se, por análise de restrição, quanto à existência do plasmideo híbrido desejado. Os clonos codlfi cantes para a aspartase e para a transaminase aromática podem utilizar-se para a produção de L-fenilalanina, num processo em várias etapas sem perda dos réspectivos plasmídeos híbridos, a partir de piruvato de fenilo e de fuma rato de amónio ou do ácido fumárlco, ou de fumarato e iõen amónio ou ureia. A velocidade de síntese de L-fenilala- 6 -

nina é cerca de 2 a 3 vezes superior à conseguida com estirpes d· E.coli não modificadas geneticamente, por exemplo com aquelas que contêm simplesmente um gene aspA ou tyrB clonado.

Os exemplos seguintes destinam-se a ilustrar a invenção. Salvo indicação em contrário, os dados percentuais referidos são ponderais.

Isolamento de plasmideos a partir de E.coli plasmideo pIMS6056 contém um , de E.co gene'(ty|Bl codificante da transaminasé aromática u B(ATCC 11303). 0 pIMS6056 isolou-se como indicado nol registo de patente alemS p 36 31 829.9. O plasmideo PGS 73 codificante da aspartase obteve-se pelo método de Guest, J.R. et «1., J. Gen. Microbiçl. 130, 1271-1278(1984). o pGS37 contém um gene aspA clonado (CS 520) de E.coli, que se obteve a partir do banco de genes isolados de E.coli per L.Clarke et al. /“ciarke, L. et al., Cell 9, 91-99 (1976)^7* O plasmideo PIMS6O56 preparou-se a partir de <^atcc 11303) e ó plasmideo PGS73 preparou-se a partir de E.coli K12 (GM 242), de acordo' com o método cha mado cleared lysate /~Clewell,D.B., Helinski D.R., Proc. Natl.Acad. Sei. 62, 1159-1166(1969)£7, por lisagem alcal/ na £~Ieh-Horowicz, D., Burcke, J.F., Nucl. Acids Res. 9, 2985-2980(1981) £7 ou por lisagem após tratamento térmico /Holmes, D.S. et al.. Anal. Biochem. 114, 193(1981)£7. A separação do DNA cromossomal efectuou-se por meio de centrifugação de gradiante de densidade com cloreto de césio-brometo de etidio »(T. Maniatis et al, Molecular cloning, 1982, pág. 93-94).

Preparação de fragmentos*de DNA adequados

a) Fragmentos de DNA com extremos agudos:

plasmideos pGS73 com as duas endopara tal empregaDigeriram-se os • pIMS6O56, isolados a partir de E.coli, nucleares de restrição Sall e Sphl. ram-se em cada caso 2 pg de DNA-plasmideo e cindiram-se completamente em seguida com o enzima Sall , de acordo com as indicações do produtor do enzima, Boehringer Mannheim, nu» volume total de 50 Terminou-se a reacção por meio de extracção com fenol/clorofórmio e clorofórmio/alCOOl isoamílico. Após precipitação com etanol e lavagem posterior com etanol a 70%, dissolveu-se o peletizado de DNA seco em 50 jil do tampão de incubação descrito para o Sphl (Boehringer Mannhelm) e cindiu-se completamente com

b) Fragmentos de DNA com extremos planos:

Cindiu-se completamente o plasmideo PGS73 com o enzima de restrição Bcll e o plasmideo PIMS6O56 com o enzima Sall, procedendo-se de acordo com as indicações do fabricante dos enzimas, Boheringer Mannhelm. Terminou-se a reacção como descrito no exemplo 2a), precipitou-se o DNA com etanol e lavou-se com etanol a 70%.

Os extremos agudos dos fragmentos de plasmideo obtidos encheram-se com DNA-pólimerase I de E.coli (fragmento de Klenow). para tal, dissolveu-se o peletizado de DNA seco em 18 yl de água destilada e incubou-se cora 2,5 pl de tampão (0,5 M Tris. HC1, pH 7,2, 0,1 M MgSOj, 1 mM ditiotreite, 500 pg/ml de albumina de soro de vaca), 1 pl de 2ATP 2 mM, 1 |il de dTTP 2mM, 1 |il de dCTP 2mM, 1 jil de dGTP 2 mM e 2 unidades de DNA-polimerase I (fragmento de Klenow), durante 30 minutos a 22°c. Terminou-se a reacção por aquecimento durante 5 minutos a 70°

C.

Tratamento do DNA-plasmideo com fosfatase alcalina

Claims

Os grupos fosfato terminais dos fragmentos do plasmideo pIMS6056 preparados de acordo com os exemplos 2a ou 2b removeram-se por incubação durante 30 minutos a 37°C com 23 unidades de fosfatase alcalina de intestino de vitela. A mistura reaccional extraiu-se com fenol/clorofórmio e cloroférmio/alcool isoamílico, precipitou-se por meio de etanol e lavou-se com etanol a 70%, 6*· secagem sob vácuo dissolveu-se o DNA em 20 J21\

d. tanpto TB (10 mH Tris. HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Isolamento de fragmentos de DNA

Os fragmentos de DNA do plasmídeo pGS73 obtidos de acordo com os exemplos 2a ou 2b sepa raram-se por electroforase num gel de agarose de baixo po:i to de fusão, a 1% (low-meltingtemperature agarose”) com TAB /*40 mM Tris, 10 mM de acetato de sódio, 1 mM EDTA (pH 7,8|^7 como tampão eluente. 0 fragmento Sall/Sphl com 6,2 Kb (quilobares) (exemplo 2a) e o fragmento com
2,9 Kb cõm extremos planos (exemplo 2b) revelaram-se por coloração do gel com brometo de etídio e irradiação com luz ultra-violeta de onda longa (366 nm) na forma de bandas visíveis, identificaram-se através de padrões de comprimento de DIA (Boehringer Mannheim, N^s de catálogo 236250), removeram-se do gel, incubaram-se durante 5 minu tos a 65°C, e extrairam-se primeiro com fenol saturado em Tris, a pH 8,0, e em seguida com fenol/clorofórmio e cloroférmio/alcool isoamílico. A partir da fase aquosa, precipitou-se o DNA com etanol, lavou-se com etanol a 70% e, após secagem sob vácuo, ressuspendeu-se em 20 de tampão BE.

asaeJs-âi

Ligação de fragmentos de DNA

a) Ligação dos extremos agudos

Os framentos desfosforilados do plasmideo pIMS6O56 obtidos de acordo com o exemple 3 misfuraram-se com o fragmento sali/sphi de 6,2 Kb do pgasmide© pGS73, isolado de acordo com o exemplo 4, nuBMt proporção molar de cerca de 3tl, e incubaram-se no templo te incubação aconselhado pelo fabricante, Boehrino ger Mannheim, com uma unidade de ligase T4-DNA, a 16 c durante 16 horas, 0 volume total da mistura reaccional era de 50 jal com uma concentração total de DNA de 20 jig/ /ml.

b) ligação dos extremos planos

0 fragmento pIMS6O56 de 8,2 Kb obtido de acordo com o exemplo 2b utilizou-se para a reac ção de ligase após desfoforilação de acordo com o exemplo 3, Para tal, misturou-se o fragmento pIMS6O56 com o fra gmento de 2,9 Kb do plasmideo pGS73, isolado de acordo com o exemplo 4, numa proporção de cerca de 3»1 e incubaram-se com 50 mH Tris. Cl, a pH 7,6 10 mM Mgci₂, 5% (peso/volume) de polietilenoglicol 8,000, 1 MM ATP, 1 mM ditiotreite, 1 unidade de ligase T4-DNA , a 25°c durante 4 horas* 0 volume total da mistura reaccional era de 20 pl c» uma concentração total de DNA de 10 ^ig/ml.

A construção dos plasmídeos encontra-ae representada nas figuras 1 e 2. A figura 1 mostra a construção de um plasmideo codificante da transa minase aromática (tyr B) e da aspartase (asp A)i clonagem de extremos agudos, A figura 2 mostra a respectiva clonagem dos extremos planos. Utilizam-se as seguintes abreviaturast bla «= gene resistente à ampicilina (gene de P-lactamase); os traços cheios corréspondem ao DNA pAT153 os traços tracejados representam o DNA pBr322, as duas setas na figura 2 indicam a posição do fragmento Bcll de

2,9 Kb ao plasmideo pGS73.

gxemplo 6 >

Transformação de estirpes de E.coli K12

A mistura de ligação preparada de acordo com os exemplos 5a) ou 5b) diluiu-se 3 vezes e utilizou-se para a transformação de E,coli Kl2 (por exemplo HB 101 ou W3110), de acordo com o método descrito por T. ílaniatis et al. (T. Maniatis et al., Molecular cio ning, 1982, CSHL, New York, pag. 250-251). Colocou-se 1 mistura de transformação num meio de Luria-Bertani (1% da Trypton, 0*5% de extracto de levedura, 1% de cloreto de sódio, pH 7,5, agar a 1,8%), à qual, após tratamento em autoclave, se adicionaram 100 Jag/ml de ampicilina.

Identificação dos clonos codificantes para para a transaminase aromática a aspartase e dos transforisolou-se o para o isolamento mantes que continham o plasmideo desejado, DNA plasmideo dos clonos resistentes à ampicilina /~ish-Horowicz, D., Burke, J.F., Nucl. Acids Res. 13, 2989-2998(1981)^7 e, após digestão completa com os enzimas de restriçlo Sall e Sphl (exemplo 5a) ou com EcoRI (exemplo 5b) . num gel de agarose a 0,8%, efectuou-se a separação por electroforese. Os plasmideos recombinantes da mistura de ligação de acordo com o exemplo 5a, que aprese tavam o fragmento Sall/Sphl com 6,2 Kb de pGS73 para do fragmento Sall/Sphl com 8,1 Kb do vector plasmideo piMS6056, continham respectivamente um gene clonado aspA e

Estes plasmideos híbridos obtiveram estável em E.coli na ausência de tyrB (vide Fig. 1). -se também numa forma ampicilina.

Os plasmideos recombinantes da mistura reaccional de ligação de acordo com o exemplo 5b, que possuem três posições de corte para o enzima EcoRI/ continham também um gene clonado para a aspartase e para a transaminase aromática (vide Fig. 2J, Por comparação de tamanhos dos fragmentos obtidos verificou-se que o fra gmento de DNA com 2,9 Kb do pGS73 codificante para a as- 11 - partase se encontrava clonado, em ambas as orientações, no plasmideo pXMS6O56 (vide Fig. 2), Ambos os plasmídeos isolados deste modo continham o fragmento com 2,9 Kb do pOS73 numa orientaçáo aleatória em relaçSo ao DNA PIMS6O56 e obtiveram-se também de uma forma estável em E.coli na ausência de ampicilina.

Transformação de estirpes de E.coli B

Os plasmídeos codificantes para • aspartase e para a transaminase aromática isolados de acordo com o exemplo 7. Obtiveram-se a partir de E.coli K12 (pàt exemplo HB1O1 ou W3110) de acordo com o exemplo 1 e utilizaram-se para a transformaçSo de E.coli B ATCC 11303 de acordo com o método descrito no exemplo 6. o rendimento dos clonos resistentes à ampicilina foi contudo muito baixo em comparaçSo com o das estirpes de E.coli K12. Os plasmídeos resistentes à ampicilina transfortaantes de E.coli B ATCC 11303 isolaram-se e identificaram-se mais uma vez por análise de restriçSo de acordo com o exemplo 7.

Cálculo da actividade da aspartase e da transaminase aromática

A actividade da aspartase determinou-se por meio do sigma Test-Kit A-8147. A medição da actividade da transaminase aromática efectuou-se por meio do sigma Test-Kit GO39O, tendo-se utilizado em vez de ca( -cetoglutarato, 12 mmol/1 de piruvato de fenilo (sal de sódio). Os extractos das estirpes recombinantes de B.çoii K 12 ou E.coli B, obtidos de acordo com os exemplos 7 ôu 8, que continham tanto um gene aspA com um clonados num plasmideo, apresentaram uma activi dade para a aspartase e para a transaminase aromática cer ca de 5 a 10 vezes superior à obtida para a estirpe corres - 12 gene tyrB pondente isente de plasmídeos

Exemplo 101

Processo para a preparação de L-fenilalanina a partir de > fumárico e iões amónio

Cultivou-se E.coli B (ATCC 11303) da seguinte solução nutriente,

30g/1

20g/1

2g/1

0,5 g/1 o»i g/i 1 g/i

Ajustou-se o pH a 7,9 com amónia] co. Adicionaram-se 24 g/1 de piruvato de fenilo filtrado em condições estéreis.

O material celular obtido suspen deu-se em 100 ml de uma solução aquosa de 30 g/1 de sal de sódio de piruvato de fenilo, 30 g/1 de ácido fumárico, neutralizado com amoníaco, 30 g/1 de cloreto de amónio, 0,6 g/1 de MgCl„ . 61^0, 0,1% de monooleato de polioxieti lenosòrbitano (^Tween 80) e 50 mM de Tris . HC1 (pH 7,9 i. A suspensão incubpu-se a 37 C sob gaseificação com ar com primido a 0,5 Wm. Após 9 horas mediu-se uma concentração de I*-fenilalanina de 23 g/1.

Mistura das bactérias recombinantes isoladas para a produ çlo de L-fenilalanina

Utilizaram-se estirpes de E.coli que continham um dos plasmideos codificantes para a aspar tase e para a transaminase aromática descritos no exemplo piruvato de fenilo, durante 20 horas em a 37®C* ácido fumárico extracto de carne

MgSO₄ . 7^0

CaCl₂ · 21^0 mh₄ci

10 1

Ί, para a produção de L-fenilalanina a partir de piruvato de fenilo, de acordo com o método descrito no exemplo

10. Logo após 3 a 5 horas determinou-se uma concentração de L-fenilalanina de 24 g/1.

K· de T.; Ver tradução das Figs. 1 e 2 no final do texto original

-fenilalanina por terizado por

Processo para a preparação meio de bactérias recombinantes,

a) introduzir-se um elemento

-cromossomal, que de Lcaracextracontém um gene codificante da aminotrans ferase « da aspartase, isolado a partir de um microorganismo gram-negativo, ou que contém dois elementos extra-cromossomais, compatíveis um com o outro, em que um dos elementos é um gene de aminotransferase isolado a partir do um microorganismo gram-negativo e o outro elemento é um gene de aspartose isolado a partir de um microorganisato gram-negativo, num microorganismo,

b) exprimir-se o gene de aminotrans feras· · o gene de aspartase no microorganismo e se sinte tizar uma aminotransferase e uma aspartase activas, e

c) a aminotransferase e a aspartase promoverem a biotransformação do ácido fumárico ou dos •eus sais e do piruvato de fenilo em L-fenilalanina, na presença de iões amónio ou de ureia.

Processo de acordo com a reivindi^ cação 1, caracterizado por o microorganismo no qual se ex primem os genes, ser uma entrobactéria ou uma bactéria do género Pseudomonas.

- 3· processo de acordo com a reivindi cação 2, caracterizado por o microorganismo ser uma estir pe de B.coli K 12, uma estirpe de K.coli B ou uma estirpe de E.coli W.

Processo replicaçSo elemento extra-cromossomai de uma ãminotransferase e de uma aspartase activas, numa bactéria, caracterizado por se clonar num plasmideo um gene que codifica a aminotransferase e a aspartase, isola do a partir de um microorganismo gram-negativo.

- 5· Processo de acordo com a reivindi cação 4, caracterizado por se utilizarem genes de enterobacférias e/ou de bactérias do género pseudomonas.

Processo de acordo com a reivindi cagão 5, caracterizado por se utilizarem genes das estirpes de E. coli K 12 e/ou de estirpes de E. coli B e/ou de estirpe* de E» coli W, bem como de Serratia marcescens e/ou de pseudomona* fluorescena,

- 7« -

Processo de acordo com a reivindi cação 6, caracterizado por se utilizar o gene aspA de E. coli K 12 e o gene tyrB de E, coli ATCC 11303.

- 8· -

Processo de acordo com uma ou main das reivindicaçOes 4 a 7, caracterizado por o plasmideo empregue ser um plasmideo multi-Copy (multicópia).

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal