JPH05244956A - 組換大腸菌によるｌ−フェニルアラニンの製造方法 - Google Patents

組換大腸菌によるｌ−フェニルアラニンの製造方法

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JPH05244956A
JPH05244956A JP4241745A JP24174592A JPH05244956A JP H05244956 A JPH05244956 A JP H05244956A JP 4241745 A JP4241745 A JP 4241745A JP 24174592 A JP24174592 A JP 24174592A JP H05244956 A JPH05244956 A JP H05244956A
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phenylalanine
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escherichia coli
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Hong Rhym
リム ホン
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ジューン リー ドン
Chan Hee Won
ヒー ウォン チャン
Byung Lak Lim
ラク リム ビュン
Hong Kyu Choi
キュー チョイ ホン
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｌ−フェニルアラニンを高収率にて製造する
ことを可能とする。 【構成】 高収率でＬ−フェニルアラニンを製造できる
新規大腸菌（ＫＣＣＭ １０，０１３）、並びにコリス
メート ムターゼ ｐ−プレフェネート デヒドラター
ゼをコードしているｐｈｅＡ遺伝子及び３−デオキシ−
Ｄ−アラビノヘプツロソネート・７−フォスフェート
シンターゼをコードしているａｒｏＦ遺伝子を発現させ
るための２つのプロモーター及び温度感受性リプレッサ
ーを含有する新規プラスミドｐＭＷ１６により形質転換
され得る組換大腸菌によるＬ−フェニルアラニンの製造
方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換大腸菌(recombina
nt Escherichia coli)（以下、単に大腸菌と称する）に
よるＬ−フェニルアラニンの製造方法に関する。さらに
詳しくは、本発明は、Ｌ−フェニルアラニンを製造する
プラスミドを含有する新規大腸菌及び該新規微生物を使
用してＬ−フェニルアラニンを製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の
一種で、甘味料であるアスパルテーム（ASPARTAME:登録
商標名）の合成製造に使用できる。微生物を利用したＬ
−フェニルアラニンの多くの合成方法が公知である。例
えば、特開昭３７−６３４５及び特開昭６０−１６０８
９０は、チロシンを要求するブレヴィバクテリウム又は
コリネバクテリウム 種(Brevibacterium or Corynebac
terium sp.) を使用したＬ−フェニルアラニンの製造方
法を開示している。特開昭５５−１６５７９７は、チロ
シンを要求しかつトリプトファン類似化合物に対して耐
性のある大腸菌を使用する、同様の方法を開示してい
る。韓国特開８８−１１３３１及び韓国特開８８−１１
３３２は、チロシン及びトリプトファン栄養素要求体(a
uxotroph) からの復帰突然変異体(revertant) であり、
かつフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン類似
化合物に対して耐性のある大腸菌を使用する、同様の方
法を開示している。韓国特開８９−３６８２及び韓国特
開８９−３７１４は、律速酵素(rate-limiting enzyme)
をコードしている遺伝子のコピー数を増幅した組換大腸
菌による、Ｌ−フェニルアラニンの製造方法を開示して
いる。
【０００３】
【発明の開示】本発明は、Ｌ−フェニルアラニンを高収
率にて製造できる新規大腸菌（ＫＣＣＭ １０，０１
３）を提供することを目的とする。
【０００４】本発明の他の目的は、ｐｈｅＡ遺伝子とａ
ｒｏＦ遺伝子を発現させるための２つのプロモーターと
温度感受性リプレッサーを含む新規プラスミドｐＭＷ１
６で形質転換され得る組換大腸菌を用いて、Ｌ−フェニ
ルアラニンを製造する方法を提供することである。コリ
スメート ムターゼ ｐ−プレフェネート デヒドラタ
ーゼ(chorismate mutase p-prephenate dehydratase)は
ｐｈｅＡ遺伝子に、そして３−デオキシ−Ｄ−アラビノ
ヘプツロソネート・７−フォスフェート シンターゼ(
3-deoxy-D-arabinoheptulosonate・7-phosphate syntha
se )はａｒｏＦ遺伝子に、それぞれコードされている。
【０００５】本発明のさらなる目的は、高収率にてＬ−
フェニルアラニンを製造できる形質転換された大腸菌を
製造できる、複製可能な組換プラスミドｐＭＷ１６を提
供することにある。
【０００６】本発明はさらに、本発明の大腸菌を培地中
で培養することからなる、Ｌ−フェニルアラニンを高収
率にて製造する方法を提供することを目的とする。
【０００７】本発明の他の目的及びさらなる適用範囲
は、以下に述べる本発明の詳細な記載より明らかにされ
る。しかしながら、本発明の真意及び範囲内における変
化や変更は以下の詳細な記載から当業者には明らかであ
るので、本発明の好ましい実施態様を示した詳細な記載
及び特定の実施例は、単に実例として示したものと理解
されるべきである。
【０００８】本発明は、以下に記載する詳細な説明及び
単に実例として示したに過ぎない図面によりさらに良く
理解されるものであるが、本発明がこれらに限定されな
いことはいうまでもない。
【０００９】Ｌ−フェニルアラニンの製造に使用するた
めのａｒｏＦ遺伝子及びｐｈｅＡ遺伝子は、大腸菌ＭＷ
ＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ １０，０１３）に由来して
いる。
【００１０】Ｆｉｇ．１の様な本発明の説明のために作
成された図面を詳細に参照すると、組換プラスミドを使
用したＬ−フェニルアラニンの製造方法は、大腸菌細胞
内の酵素作用により制御されている。反応を制御する酵
素の１つにコリスメート ムターゼ ｐ−プレフェネー
ト デヒドラターゼがある。反応を制御する他の酵素の
１つには、３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネー
ト・７−フォスフェート シンターゼ（以下、“ＤＡＨ
Ｐ シンターゼ”と略す）がある。ＤＡＨＰシンターゼ
は、ａｒｏＦ遺伝子、ａｒｏＧ遺伝子及びａｒｏＨ遺伝
子にそれぞれコードされている３つのアイソエンザイム
(isoenzyme) として存在している。本発明では、ｐｈｅ
Ａ遺伝子及びａｒｏＦ遺伝子の発現を極度に増大させる
ためにλファージのＰL プロモーターを各遺伝子に結合
させ、該遺伝子の発現を制御するために温度感受性リプ
レッサーが使用される。
【００１１】Ｆｉｇ．２に示した様なプラスミドｐＭＷ
１６の調製方法は、Recombinant DNA Methodology 及び
Molecular Cloningに記載されている。プラスミドｐＭ
Ｗ１６調製のための組換え方法は、 Molecular Clonin
g、A Laboratory Manual ( T.Mariatis et al.) 及び C
urrent Protocols in Molecular Biology ( Frederick
M. Ausubel et al.)に記載されている。
【００１２】この様にして、Ｌ−フェニルアラニンの製
造に使用するための新規株ＭＷＰＷＪ ３０４が得られ
る。該新規株ＭＷＰＷＪ ３０４は、ブダペスト条約の
規定に従い、１９９１年１２月２０日にコレアン カル
チャー センター オヴ マイクロオルガニスムス( Ko
rean Culture Collection of Microorganisms ) に寄託
され、受託番号ＫＣＣＭ １０，０１３が与えられた。
【００１３】本発明は以下の実施例との関連においてさ
らに詳しく記載されるが、実施例は一具体例に過ぎず、
本発明がこれに限定されないことはいうまでもない。
【００１４】
【実施例】実施例１ プラスミドｐＭＷ１６の調製 （１）ｐＭＷ１２ ＤＮＡの単離 ｐｈｅＡ遺伝子とａｒｏＦ遺伝子を含む組換プラスミド
であるｐＭＷ１２（米国特許第５，００８，１９０号及
び第５，０３０，５６７号参照）は、３７℃にて１６時
間、培地塩制限酵素緩衝液( medium salt restriction
enzyme buffer) （５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍ
Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、１０ｍＭの塩化
マグネシウム及び１ｍＭのジチオスレイトール）中に
て、ＥｃｏＲＶを用いて切断される。切断されたＤＮＡ
はフェノール−クロロホルム混合物で処理され、エタノ
ールで沈殿させて線状のプラスミドＤＮＡ( linearized
plasmid DNA )を得た。該プラスミドＤＮＡを子ウシ腸
アルカリフォスファターゼ(calf intestinal alkaline
phosphatase )（以下、“ＣＩＰ”と略す）で処理し、
線状のプラスミドＤＮＡの自己連結( self-ligating )
を防いだ。
【００１５】（２）ＰL プロモーター断片の調製 プラスミドｐＰＬC２８３３を制限酵素ＨａｅＩＩ及び
ＢａｍＨＩで切断し、０．２６ＫｂのＰL 断片を低融点
のアガロースゲルから回収して精製した。付着末端を有
する０．２６ＫｂのＰL 断片を、１１℃にて２０分間反
応緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ８．
０）、５ｍＭの塩化マグネシウム、５ｍＭのジチオスレ
イトール、５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、１００μＭのｄＡＴＰ、１００μＭのｄＧＴＰ、
１００μＭのｄＣＴＰ、及び１００μＭのｄＴＴＰ）中
でＴ4 ＤＮＡポリメラーゼで処理し、平滑末端を形成し
た。
【００１６】（３）プラスミドｐＭＷ１４の調製 上述した工程（１）においてフォスファターゼ処理した
線状プラスミドｐＭＷ１２を、両端に平滑末端を有する
上記工程（２）において得られたＰL プロモーター断片
と１：３の割合にて混合し、１６℃にて１６時間Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼで処理して、断片を連結させた。連結され
た組換プラスミドは、常法の塩化カルシウム法に従っ
て、増殖にＬ−フェニルアラニンを要求する大腸菌ＭＷ
ＥＣ２０３−７に形質転換された。該形質転換された株
を、抗生物質であるカナマイシンを５０μｇ／ｍｌ含む
ＭＭ培地（グルコース１０ｇ、硫酸アンモニウム４ｇ、
一塩基リン酸カリウム( monobasic potassium phosphat
e ) ２ｇ、チアミン−ＨＣｌ１ｍｇ、フマル酸０．５
ｇ、寒天２０ｇ、蒸留水１ 、ｐＨ７．４）中で培養し
た。組換プラスミドｐＭＷ１４を、カナマイシンを５０
μｇ／ｍｌ含むＭＭ培地中で増殖した培養株から分離し
た。
【００１７】（４）ｐＭＷ１５の調製 温度感受性リプレッサーＣＩ857 を含むプラスミドｐＭ
Ｋ５を制限酵素ＢｇｌＩＩで処理した後、０．９Ｋｂの
ＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲルから回収し、Ｔ4
ＤＮＡポリメラーゼで処理をして平滑末端を形成させ
る。ａｒｏＦ遺伝子の前端にＰL プロモーターが連結し
た上記工程（３）で得たプラスミドｐＭＷ１４をＤｒａ
ＩＩＩで切断し、ＣＩＰで処理をして５´−リン酸基を
除去する。その後処理されたプラスミドｐＭＷ１４を、
両端に平滑末端を有するＣＩ857 断片と混合し、Ｔ4 Ｄ
ＮＡリガーゼで結合させた。該組換プラスミドを大腸菌
ＨＢ１０１に組み込み、ｐＭＷ１５を得た。
【００１８】（５）ｐＭＷ１６の調製 単離されたｐＭＷ１５組換プラスミドをＢａｍＨＩ及び
ＢｇｌＩＩで切断し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼで処理をして
ｐＭＷ１６を得た。ｐＭＷ１５プラスミドは全ｔｙｒＡ
遺伝子を含んでいる。ｐＭＷ１６中では、ｔｙｒＡ遺伝
子の０．７Ｋｂの断片が除去されていた。該ｐＭＷ１６
組換プラスミドを温度感受性チロシン漏出株( tyrosine
-leaky strain ) 、すなわち大腸菌ＭＷＷＪ ３０４
（ＫＦＣＣ１０７３７、１９９１年８月３０日にコレア
ン フェデレーション オヴ カルチャー コレクショ
ンに寄託）に組み込み、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌ
含む培地中で２４時間３７℃にて培養した。ｐＭＷ１６
が組み込まれた株の中でも、最も良くＬ−フェニルアラ
ニンを生産する株ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ１０，
０１３、１９９１年１２月２０日にコレアン カルチャ
ー コレクションオヴ マイクロオルガニスムスに寄
託）を単離した。該新規株ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣ
Ｍ １０，０１３）の生物化学的性質は、宿主株ＭＷＷ
Ｊ ３０４（ＫＦＣＣ １０，７３７）と同じである。
しかしながら、宿主株ＭＷＷＪ ３０４に比べると、該
新規株ＭＷＰＷＪ ３０４は増殖のためにより多くのチ
ロシンを要求し、より多くのＬ−フェニルアラニンを生
産する。そして、該新規株ＭＷＰＷＪ ３０４のＬ−フ
ェニルアラニン生産量及びＤＡＨＰシンターゼ活性は増
大した。
【００１９】実験例１ 現存株に比べると、該新規株ＭＷＰＷＪ ３０４の酵素
活性及びＬ−フェニルアラニン生産量は、以下に示すよ
うに増大する（表１、表２）： 表１ ＤＡＨＰシンターゼの酵素活性 株 培養温度 酵素活性単位 ＭＷＰＥＣ １３−６０ ３２℃ １．０ （ＫＣＴＣ ８３３７Ｐ） ＭＷＷＪ ３０４ ３７℃ ０．９ （ＫＦＣＣ １０，７３７） ＭＷＰＷＪ ３０４ ３７℃ ３．１ （ＫＣＣＭ １０，０１３） 上記のデータはアイ．シーオら( I. Shiio et al )の方
法（ジャーナル オヴバイオケミストリー(Journal of
Biochemistry )、７５、９８７−９９７、１９７４）に
従って得られた。ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ １
０，０１３）の酵素活性は、ＭＷＰＥＣ １３−６０
（ＫＣＴＣ ８３３７Ｐ）の酵素活性に基づいている。
ＭＷＷＪ ３０４（ＫＦＣＣ １０，７３７）及びＭＷ
ＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ １０，０１３）の培地に
は、ＭＷＰＥＣ １３−６０の培地と比較すると、１０
０ｍｇ／ｌのＬ−チロシンが余分に含まれていた。
【００２０】実施例２ Ｌ−フェニルアラニンの調製（Ａ）株 ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ １０，０１３）。
【００２１】 （Ｂ）培地 グルコース ３％ トリプトン １％ バクトイースト( bactoyeast )抽出物 １％ 塩化ナトリウム ０．１％ カナマイシン １０ｍｇ／ｌ ｐＨ ７．０。
【００２２】（Ｃ）発酵培地 グルコース ６％ 硫酸カリウム ０．０４％ 硫酸アンモニウム ２％ クエン酸ナトリウム ０．０５％ フマル酸 ０．０５％ 塩化マグネシウム ０．０８％ 一塩基リン酸カリウム ０．１％ 二塩基リン酸カリウム ０．１％ バクトイースト抽出物 ０．１％ グルタミン酸一ナトリウム ０．０５％ 塩化コバルト ０．１ｍｇ／ｌ 硫酸亜鉛 １ｍｇ／ｌ 塩化マンガン ２ｍｇ／ｌ 塩化カルシウム ５ｍｇ／ｌ 塩化第二鉄 ２０ｍｇ／ｌ Ｌ−チロシン ３００ｍｇ／ｌ チアミン塩酸塩 １０ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １０ｍｇ／ｌ ｐＨ ７．０。
【００２３】（Ｄ）発酵方法 ４０ｍｌの培地を５００ｍｌ容試験フラスコにいれ、１
２０℃にて２０分間オートクレーヴ処理した。滅菌後、
新規大腸菌株ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ１０，０１
３）をフラスコに接種し、３７℃にて１６時間振とう培
養を行った。発酵培地は上述の処方に従い調製した。そ
の後、別途オートクレーヴ処理した３．５％の炭酸カル
シウムを発酵培地に添加し、さらに２ｍｌのシードブロ
ス( seed broth )を添加した後、培地を激しく攪拌して
３７℃にて３６時間発酵させた。発酵終了後、蓄積した
Ｌ−フェニルアラニンの量は１６．２ｇ／ｌであった。
【００２４】実施例３ Ｌ−フェニルアラニンの調製 （Ｃ）発酵培地中Ｌ−チロシンが４００ｍｇ／ｌである
以外は、（Ａ）株、（Ｂ）培地、及び（Ｃ）発酵培地
は、実施例１及び２で使用したものと同様のものを用い
た。
【００２５】（Ｄ）発酵方法 １ｌの発酵培地を２ｌの発酵槽に入れ、１２０℃にて１
５分間オートクレーヴ処理した。新規株ＭＷＰＷＪ ３
０４（ＫＣＣＭ １０，０１３）を５００ｍｌ容フラス
コ中の５０ｍｌの培地に添加し、３７℃にて１６時間振
とう培養を行った。５０ｍｌの培養ブロス( cultured b
roth )を発酵槽に添加し、１，０００ｒｐｍ及び１．０
ｖｖｍ（酸素比）条件下、３７℃にて４８時間発酵させ
た。発酵中、ｐＨの値７．０は水酸化アンモニウムを添
加することにより維持し、グルコース濃度が１％を下回
ったときに６０％のグルコース溶液を発酵槽に３回添加
した。
【００２６】発酵中に使用したグルコースの総量は１８
５ｇ／ｌであった。Ｌ−フェニルアラニンは５０．８ｇ
／ｌの濃度で得られた。１ｌの発酵溶液を、イオン交換
樹脂に吸着させ、水酸化アンモニウムを用いて単離する
ような常法に従って精製し、粗結晶として４５．７ｇ／
ｌのＬ−フェニルアラニンを得た。
【００２７】 表２ Ｌ−フェニルアラニンの収量（ｇ／ｌ） 株 培養温度 ＭＷＷＪ ３０４ ＭＷＰＷＪ ３０４ （℃） （ＫＦＣＣ １０，７３７） （ＫＣＣＭ １０，０１３） ３１ １４．９ １３．７ ３４ ２０．６ ２１．２ ３７ ３１．５ ５０．８ ３９ １５．５ ２２．８ ＊ＭＷＷＪ ３０４（ＫＦＣＣ １０，７３７）の発酵
培地には２００ｍｇ／ｌのＬ−チロシンを添加した。
【００２８】実施例４ 培養液の２７ｌを５０ｌ容発酵容器に入れ、１．３ｌの
培養ブロスを４５０ｒｐｍかつ１．０ｖｖｍ条件にて発
酵容器に入れる以外は、実施例３の操作を繰り返した。
得られたＬ−フェニルアラニンの量は４９．１ｇ／ｌで
あった。
【００２９】本発明に関して以上のように記載したが、
種々の変更があり得ることはいうまでもない。これらの
変更は本発明の精神と範囲を逸脱するものとは見なされ
ず、当業者にとって自明であるこれらのあらゆる変更は
特許請求の範囲に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｆｉｇ．１は、大腸菌中の芳香族アミノ酸類の
生合成代謝経路を示す図である。図中、フィードバック
阻害は酵素活性の阻害を意味し、フィードバック抑制は
ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写レベルで作用する酵素の合
成を抑制するものである。
【図２】Ｆｉｇ．２は、組換プラスミドｐＭＷ１６の調
製工程及びその制限地図を示す図である。
【符号の説明】
１ ａｒｏＦ遺伝子にコードされたＤＡＨＰシンターゼ
（チロシン抑制） ２ ａｒｏＦ遺伝子にコードされたＤＡＨＰシンターゼ
（フェニルアラニン抑制） ３ ａｒｏＦ遺伝子にコードされたＤＡＨＰシンターゼ
（トリプトファン抑制） ４ ｐｈｅＡ遺伝子にコードされたコリスメート ムタ
ーゼ ｐ−プレフェネート デヒドラターゼ ５ ｔｙｒＡ遺伝子にコードされたコリスメート ムタ
ーゼ ｐ−プレフェネート デヒドラターゼ ６ ｔｒｐＥ遺伝子にコードされたアントラニレート
シンターゼ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ドン ジューン リー 大韓民国 ソウル セオダエムン−ク ナ ムガジワ−ドン 353−20 (72)発明者 チャン ヒー ウォン 大韓民国 ソウル スングブク−ク ジュ ングレウン−２−ドン 559−29 (72)発明者 ビュン ラク リム 大韓民国 ソウル ノウォン−ク ジュー ンギェ−ドングンヤン ２−チャ アパー ト 106−1507 (72)発明者 ホン キュー チョイ 大韓民国 ソウル ドンダエムン−ク チ ュングリアングリ−ドン ヒュンダイ ア パート ３−405

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 コリスメート ムターゼ ｐ−プレフェ
    ネート デヒドラターゼをコードしているｐｈｅＡ遺伝
    子及び３−デオキシ−Ｄ−アラビノヘプツロソネート・
    ７−フォスフェート シンターゼをコードしているａｒ
    ｏＦ遺伝子を発現させるための２つのプロモーター及び
    温度感受性リプレッサーを含有するプラスミドＤＮＡか
    らなる複製可能な組換プラスミドであって、大腸菌を形
    質転換して最適Ｌ−フェニルアラニン生産能を有する形
    質転換大腸菌を得ることが可能である、大腸菌ＭＷＰＷ
    Ｊ ３０４（ＫＣＣＭ １０，０１３）に含まれるプラ
    スミドｐＭＷ１６と同定された組換プラスミド。
  2. 【請求項２】 プロモーターがλＰL プロモーターであ
    る請求項１に記載の複製可能な組換プラスミド。
  3. 【請求項３】 温度感受性リプレッサーがＣＩ857 リプ
    レッサーである請求項１に記載の複製可能な組換プラス
    ミド。
  4. 【請求項４】 ｐｈｅＡ遺伝子及びａｒｏＦ遺伝子を有
    しているために最適Ｌ−フェニルアラニン生産能を有す
    る大腸菌ＭＷＰＷＪ ３０４（ＫＣＣＭ １０，０１
    ３）。
  5. 【請求項５】 ＫＣＣＭ １０，０１３からのプラスミ
    ドを有する大腸菌株を培地中で培養することからなる、
    Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
  6. 【請求項６】 培養が糖の存在下で行われる請求項５に
    記載のＬ−フェニルアラニンの製造方法。
  7. 【請求項７】 糖がグルコースである請求項６に記載の
    Ｌ−フェニルアラニンの製造方法。
  8. 【請求項８】 培養が３７℃で実施される請求項６に記
    載のＬ−フェニルアラニンの製造方法。
JP4241745A 1991-09-12 1992-09-10 組換大腸菌によるｌ−フェニルアラニンの製造方法 Pending JPH05244956A (ja)

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