JPH0116156B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規制限酵素及びその製造法に関し、
更に詳細にはアセトバクター（Acetobacter）属
の細菌の生産する新規制限酵素ApaL及びその
製造法に関する。

〔従来の技術〕

制限酵素とはデオキシリボ核酸（DNA）上の
ある特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断する
エンド型ヌクレアーゼである。分子遺伝学や生化
学等の発達により、DNAが遺伝をつかさどる本
体であることが明らかになつて以来、制限酵素は
遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作による遺
伝物質の大量生産への利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。制限酵素は種々の微生物
より単離されており、その認識する塩基配列、切
断様式により現在までに約100種類が知られてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

遺伝子操作においては、その作用において多様
な制限酵素を必要とする。しかしながら本発明者
等の知る限りにおいては二本鎖デオキシリボ核酸
中の塩基配列 （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔは
チミジン、Ｃはシチジンを示す）を認識し、かつ
これを矢印の位置で切断する制限酵素は見出され
ていない。

従つて本発明の目的は上記二本鎖デオキシリボ
核酸中の塩基配列を認識し、かつこれを上記矢印
の位置で切断する従来知られていなかつた新規制
限酵素を提供することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下
記の理化学的性質を有する新規制限酵素ApaL
にある。

(イ) 作用及び基質特異性 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。

（式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔ
はチミジン、Ｃはシチジンを示す。） (ロ) 至適PH：7.5〜8.5 (ハ) 安定PH：7.0〜9.0 (ニ) 至適温度：約37℃ (ホ) 分子量：26000±8000（測定法：ゲル過法） なお本発明による上記ApaLは二本鎖デオキ
シリボ核酸λ―DNAを４箇所、φX174RF DNA
を１箇所、pBR322 DNAを３箇所で切断する。

また本発明の第２の発明は新規制限酵素ApaL
の製造法に関し、アセトバクター属に属する制
限酵素ApaL生産菌を栄養培地で培養し、培養
物より制限酵素ApaLを採取することにある。

本発明者らは酢酸菌の分類学、生理学、生化
学、遺伝学の研究を行なつているが、それら研究
の一環として制限酵素に注目し、アセトバクター
属に属する細菌より新規型制限酵素を見出し、
本発明を完成した。

すなわち本発明はアセトバクター属に属する細
菌を培養し、その菌体中より新規型制限酵素
ApaLを採取することを特徴とする制限酵素の
製造法を提供することにある。

本発明で使用する微生物はアセトバクターに属
するApaL生産菌は全て使用できるが、一例と
して財団法人発酵研究所保存菌アセトバクター・
パステリアヌス（Acetobacter pasteurianus）
IFO 13753がある。本菌株は工業技術院微生物工
業技術研究所に微工研条寄第877号（FERM BP
―877）として寄託されている。

本発明によるApaLの製造方法についてさら
に詳細に説明する。まず培養の際、培地に加える
栄養源は使用する菌株が利用し、ApaLを生産
するものであればよく、炭素源としては例えばグ
ルコース、シユクロース、マルトース、ラクトー
ス、グリセロース、エタノール、乳酸塩、油脂類
などが利用でき、窒素源としては酵母エキス、ペ
プトン、脱脂大豆、コーンスチープリカー、肉エ
キスなどが適当である。その他にリン酸塩、カリ
ウム塩、マグネシウム塩などの無機質および金属
塩類を加えてもよく、更にはビタミン類、生長促
進因子を加えてもよい。

ApaLの生産量は培養条件により大きく変動
するが、一般に培養温度は20〜35℃、培地のPH３
〜８が良く、１〜３日間の通気撹拌培養でApaL
の生産は最高に達する。培養条件は使用する菌
株、培地組成などに応じ、ApaLの生産量が最
大になるように設定するのは当然である。本発明
の菌株によつて生成されたApaLは主に菌体内
に存在する。

培養液からの菌体の分離はたとえば遠心分離に
より行なうことができる。

本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に
従つた方法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液
に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内酵素
の抽出を行なう。次に細胞残渣を超遠心分離によ
り除去後、抽出液を硫酸アンモニウムで塩析す
る。沈殿物をリン酸カリウム緩衝液（PH7.5）に
溶解し、同緩衝液にて透析を行なう。得られる透
析内液をイオン交換クロマト法、分子ふるいクロ
マト法及びアフイニテイクロマト法を用いた精製
法で本制限酵素を得る。一例を挙げると、透析内
液をDEAE―セルロースDE52（ワツトマン社製）
カラムに吸着させて、次いで０〜1.0Mの塩化カ
リウムで溶出する。活性画分をアフイゲルブルー
アガロース（バイオラツド社製）カラムに吸着さ
せて、次いで０〜1.0M塩化カリウムで溶出する。
活性画分をさらにヘパリン―セフアロースCL―
6B（フアルマシア社製）カラムに吸着させて、次
いで０〜1.0Mの塩化カリウムで溶出することに
よりApaL標品を得ることができる。

ApaLの活性測定方法を示す。下記表１に示
す組成の反応液50μを予め37℃で予熱した後、
本酵素を加え酵素反応を進める。10分後に酵素反
応停止液（１％SDS、50％グリセロール、0.02％
ブロムフエノールブルー）を5μ添加して反応
を停止させる。

表 １ 10mM トリス―HCl、PH7.5 7mM MgCl₂ 7mM ２―メルカプトエタノール 50mM NaCl 0.01％ 牛血清アルブミン 1.0μl λ―DNA 反応液を１％アガローススラブゲルに重層し、
10V／cmの定電圧下で約１時間から２時間、電気
泳動を行なう。電気泳動用緩衝液は90mMトリス
―ほう酸緩衝液（PH8.3）2.5mM EDTAを用い
る。

ゲルに前もつて0.5μg／mlのエチジウムブロマ
イドを含ませておくことにより、UV照射で
DNAのバンドが検出可能である。DNAフラグメ
ントのバンドの数と量が変化しなくなつた時を終
点とする。

活性の定義は37℃で１時間に1μgのλ―DNA
を完全に分解する酵素活性を１単位とする。

本発明により得られた制限酵素ApaLは以下
のような理化学的性質を持つている。

(1) 作用及び基質特異性 本酵素は二本鎖デオキシリボ核酸中の を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する酵素
である。

本発明の制限酵素ApaLの認識部位の決定は
以下のように行なつた。

制限酵素ApaLはφX174RF DNA，pBR322
DNAをそれぞれ１箇所、３箇所で切断した。し
かしSV40 DNAは分解しなかつた。この結果よ
り、この酵素はDNAの5′―GTGCAC―3′または
5′―TPyCGPuA―3′（Pyはチミジンまたはシチジ
ン、Puはアデノシンまたはグアノシンを示す。）
のどちらかを認識して切断していることが明らか
であつた。φX174RF DNAをApaLとBbeの
両酵素で分解するとBbeで分解された大きい方
のフラグメント（3429bp）のほぼ中央の位置を
分解した。得られた二つのフラグメントは
φX174RF DNAのBbe分解フラグメント
（1957bp）より小さかつた。

この結果よりApaLはφX174RF DNAの
4483から4933の間を切断していることが判明し
た。5′―GTGCAC―3′の配列がφX174RF DNA
の4779から4784に実際に存在し、実験結果と一致
した。

一方、pBR322 DNA中にはその配列が３箇所
（2291，2789，4035）存在する。ApaLは
pBR322を３箇所で切断し、３本のフラグメント
を生成する（498bp，1246bp，2619bp）、この３
本のフラグメントをHindで切断すると、二つ
の小さなフラグメント（498bp，1246bp）は切断
されず、2619bpの大きいフラグメントが切断さ
れ、357bpと2262bpの二つのフラグメントが生成
した。

これらの結果よりApaLはpBR322 DNAを
φX174RF DNAに対すると同様、 5′―GTGCAC―3′を認識し切断することが明
らかとなつた。もう一つの可能性のあつた配列
5′―TPyCGPuA―3′は上記の結果よりApaLに
より認識されていないことも明らかになつた。

次に本発明の制限酵素ApaLの切断部位の決
定は以下のように行なつた。

まず、φX174RF DNAをApaLにて分解、
DNAフラグメントの3′―末端を2′，3′―ジデオキ
シアデノシン―5′〔α―³²P〕三リン酸とターミナ
ルトランスフエラーゼにて³²Pで標識した。その
後、制限酵素Xmnで分解し、338bpと636bpの
二つの標識されたDNAフラグメントを得、マキ
サム・ギルバート法にて塩基配列の決定を行なつ
た。その結果、338bpのフラグメントの3′―末端
よりの配列は3′―GAAATACGCであり、また
636bpのフラグメントの3′―末端よりの配列は
3′―GGCGTACCTであることが明らかとなつ
た。この結果をφX174RF DNAの配列と比較す
ると以下のようになり φX174RF DNAを矢印の位置で切断しているこ
とが明らかとなつた。

以上のことから本酵素は を認識し矢印の位置で切断していると結論され
た。

(2) 至適酵素活性条件 至適温度 ApaLの至適温度は約37℃であつた。

至適PH ApaLの至適PHはPH7.5〜8.5の範囲にある。

塩濃度 ApaLの至適塩濃度はNaClで40〜50mMであ
つた。0mMで75％、100mM NaClで50％の相対
活性を示した。

安定PH ApaLの安定PHは7.0〜9.0である。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。

実施例 １ アセトバクター・パステリアヌスIFO 13753を
下記表２に示す組成の培地160で26℃にて19時
間通気撹拌培養を行ない、その後冷却遠心機を用
いて菌体を得る。培養液160から湿重量にして
約280ｇの菌体が得られた。

表 ２ ポリペプトン ５ｇ イーストエキス ５ｇ グルコース ５ｇ グリセロール 15ｇ 脱イオン水 １ PH 6.8 得られた菌体の内100ｇの菌体を200mlの抽出緩
衝液（50mMトリス―HCl、PH7.5、10mM2―メ
ルカプトエタノール、1mM EDTA）に懸濁し、
超音波破砕機を用いて破砕後、100000×ｇで１時
間遠心分離を行ない、残渣を除去、抽出液を得
た。

得られた抽出液に終濃度２％になるように20％
ストレプトマイシン硫酸塩水溶液を加え、30分間
撹拌後、遠心分離を行ない、核酸を除去した上澄
液を得た。この上澄液に硫酸アンモニウムを70％
飽和になるように加え、沈殿物を遠心分離にて集
め、緩衝液Ａ（10mMリン酸カリウム緩衝液、PH
7.5、10mM2―メルカプトエタノール、1mM
EDTA、５％グリセロール）に溶解後、同緩衝
液Ａで一晩透析を行なつた。

次に透析内液を、予め緩衝液Ａで平衡化させて
おいたDEAE―セルロースDE52のカラム（35×
100mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後０〜1.0M
の塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで
溶出させると0.18〜0.38Mの塩化カリウム濃度画
分にApaLの活性が検出できた。

次にこの活性画分を合わせ、緩衝液Ａで一晩透
析後、透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させてお
いたアフイゲルブルーアガロース（バイオラツド
社製、100〜200メツシユ）のカラム（24×110mm）
に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜1.0Mの塩
化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出
させると0.14〜0.32Mの塩化カリウム濃度画分に
ApaLの活性が検出できた。

次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ａで一晩
透析後、透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させて
おいたヘパリン―セフアロースCL―6Bのカラム
（15×60mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後０〜
1.0Mの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝
液Ａで溶出させると0.13〜0.34Mの塩化カリウム
濃度画分にApaLの活性が検出できた。

次に得られた活性画分を合わせ、50％グリセロ
ールを含む緩衝液Ａで透析を行ない、２倍に濃縮
し、ApaLの最終標品を得た。

この酵素標品には非特異的なDNA分解酵素お
よびホスフアターゼは夾雑していなかつた。

以上述べた方法により100ｇの湿菌体より39000
単位の活性単位が得られ、２％の収量で比活性は
50倍に精製された。

〔発明の効果〕 以上詳細に説明したとおり、本発明により従来
知られていなかつた基質特異性を有する新規制限
酵素ApaLおよびその工業的に有利な製造法が
提供された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 次の理化学的性質を有する制限酵素ApaL (イ) 作用及び基質特異性： 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。 （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔ
   はチミジン、Ｃはシチジンを示す） (ロ) 至適PH：7.5〜8.5 (ハ) 安定PH：7.0〜9.0 (ニ) 至適温度：約37℃ (ホ) 分子量：26000±8000（測定法：ゲル過法） ２ アセトバクター属に属する制限酵素ApaL
   生産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵素
   ApaLを採取することを特徴とする制限酵素
   ApaLの製造法。 ３ アセトバクター属に属する制限酵素ApaL
   生産菌がアセトバクター・パステリアヌスIFO
   13753である特許請求の範囲第２項記載の製造法。