JPS6211091A - 制限酵素の製造法 - Google Patents
制限酵素の製造法Info
- Publication number
- JPS6211091A JPS6211091A JP60146807A JP14680785A JPS6211091A JP S6211091 A JPS6211091 A JP S6211091A JP 60146807 A JP60146807 A JP 60146807A JP 14680785 A JP14680785 A JP 14680785A JP S6211091 A JPS6211091 A JP S6211091A
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- JP
- Japan
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- restriction enzyme
- type
- enzyme
- aaai
- mold
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- Pending
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は核酸分解酵素である第■型制限酵素の製造法に
関するものである。
関するものである。
〔従来技術及び発明が解決しようとする問題点〕第■型
制限酵素はＤＮＡ鎖の特定の塩基配列を認識して切断す
る高い特異性を持ったエンド型ヌクレアーゼであり、種
々の特異性をもつ第■型制限酵素が種々の微生物から分
離されている。そして、第■型制限酵素はＤＮＡを特定
の位置で切断して目的とする遺伝子を取り出し、それを
微生物に導入して目的生産物を生産する遺伝子操作の研
究などに必須の手段となってきている。さらに、研究対
象であるＤＮＡは多様性を持つため、種々の塩基配列を
認識する制限酵素が望まれている。
制限酵素はＤＮＡ鎖の特定の塩基配列を認識して切断す
る高い特異性を持ったエンド型ヌクレアーゼであり、種
々の特異性をもつ第■型制限酵素が種々の微生物から分
離されている。そして、第■型制限酵素はＤＮＡを特定
の位置で切断して目的とする遺伝子を取り出し、それを
微生物に導入して目的生産物を生産する遺伝子操作の研
究などに必須の手段となってきている。さらに、研究対
象であるＤＮＡは多様性を持つため、種々の塩基配列を
認識する制限酵素が望まれている。
本発明者らは、酢酸菌の遺伝生化学的研究の一環として
、酢酸菌の制限酵素に注目した〔酢酸菌の制限酵素につ
いては「ヌクレイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 、’Ｊ １
２巻、サブレメント（１９８４） 、ｐ、ｒ １６７
−ｒ２０４Ｊに開示されている。〕。その結果、アセト
バクター （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酢酸
菌から第■型制限酵素ＸｍａＤＩのアイソシゾマー、Ａ
ａａＩを得る方法を開発し、本発明を完成させるに到っ
た。
、酢酸菌の制限酵素に注目した〔酢酸菌の制限酵素につ
いては「ヌクレイツク・アシッヅ・リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） 、’Ｊ １
２巻、サブレメント（１９８４） 、ｐ、ｒ １６７
−ｒ２０４Ｊに開示されている。〕。その結果、アセト
バクター （Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する酢酸
菌から第■型制限酵素ＸｍａＤＩのアイソシゾマー、Ａ
ａａＩを得る方法を開発し、本発明を完成させるに到っ
た。
すなわち本発明は、アセトバクター属に属する第■型制
限酵素ＡａａＩ生産菌を培養し、得られた上記菌体より
第■型制限酵素ＡａａＩを採取することを特徴とする制
限酵素の製造法に関する。
限酵素ＡａａＩ生産菌を培養し、得られた上記菌体より
第■型制限酵素ＡａａＩを採取することを特徴とする制
限酵素の製造法に関する。
第■型制限酵素Ｘ ｍ ａ ｍはザントモナス・マルバ
セラム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｔｖａｃｅａｒ
ｕｍ ）により生産される（Ｊ９Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ
、 （１９７９） １３２゜１３３−１３９）が、本
菌は植物病原菌であり、培養には特別な注意を払う必要
がある。これに対し、酢酸菌は病原性を有しないため、
その必要はなく、菌体を得ることが容易である。また、
酢酸菌は一般に他の微生物に比較して酢酸に対し耐性で
あり、酢酸を含む培地で菌体を培養すれば、他の微生物
の混入を防ぐことができるので、特別な純粋培養装置を
必要としない。さらに、前述のザントモナス・マルバセ
ラムは制限酵素を３種類（ＸｍａＩ、 ＸｍａＩＩ、
ＸｍａＩ［［）、持ち、目的のＸｍａｍの精製が煩
雑であるのに対し、本発明で使用する酢酸菌は制限酵素
Ａａａ１１種類しか持たないため、その精製が容易であ
る。
セラム（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｍａｔｖａｃｅａｒ
ｕｍ ）により生産される（Ｊ９Ｍｏｌ、 Ｂｉｏｌ
、 （１９７９） １３２゜１３３−１３９）が、本
菌は植物病原菌であり、培養には特別な注意を払う必要
がある。これに対し、酢酸菌は病原性を有しないため、
その必要はなく、菌体を得ることが容易である。また、
酢酸菌は一般に他の微生物に比較して酢酸に対し耐性で
あり、酢酸を含む培地で菌体を培養すれば、他の微生物
の混入を防ぐことができるので、特別な純粋培養装置を
必要としない。さらに、前述のザントモナス・マルバセ
ラムは制限酵素を３種類（ＸｍａＩ、 ＸｍａＩＩ、
ＸｍａＩ［［）、持ち、目的のＸｍａｍの精製が煩
雑であるのに対し、本発明で使用する酢酸菌は制限酵素
Ａａａ１１種類しか持たないため、その精製が容易であ
る。
本発明に用いるアセトバクター属に属する第■型制限酵
素ＡａａＩ生産菌としては、例えばアセ（ＦＥＲＭ
Ｐ−７１２２）株などがある。
素ＡａａＩ生産菌としては、例えばアセ（ＦＥＲＭ
Ｐ−７１２２）株などがある。
本発明において、微生物の培養は一般的な培養方法に準
じて行うことができるが、例えば窒素源としてポリペプ
トン、酵母エキスなどを、炭素源としてブドウ糖などを
、また必要に応じてエタノール、酢酸を含有する培地に
前記微生物を接種して２５〜３５℃で２４〜４８時間（
通常、２４時間程度で定常期となる。）通気培養する。
じて行うことができるが、例えば窒素源としてポリペプ
トン、酵母エキスなどを、炭素源としてブドウ糖などを
、また必要に応じてエタノール、酢酸を含有する培地に
前記微生物を接種して２５〜３５℃で２４〜４８時間（
通常、２４時間程度で定常期となる。）通気培養する。
培養終了後、遠心分離等の手段により集菌したのち、酵
素を分離、精製する。酵素の分離、精製についても一般
的方法を適用すればよく、その１例を示す、集菌した菌
体を緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレスなど
の方法を用いて菌体を破砕し、遠心分離を行い無細胞抽
出液を得る。
素を分離、精製する。酵素の分離、精製についても一般
的方法を適用すればよく、その１例を示す、集菌した菌
体を緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレスなど
の方法を用いて菌体を破砕し、遠心分離を行い無細胞抽
出液を得る。
その後、ストレプトマイシン硫酸塩処理またはポリエチ
レンイミン処理あるいは水性二相分配処理を行った後硫
酸アンモニウム分画を行い、更にＤＥＡＥ−セファロー
スＣＬ−６Ｂ、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ、ホス
ホセルロース、セファデックスＧ−１００などのイオン
交換クロマト法、アフィニティークロマト法、ゲル濾過
法もしくはこれらの組合せにより菌体かも目的とする制
限酵素を得ることができる。
レンイミン処理あるいは水性二相分配処理を行った後硫
酸アンモニウム分画を行い、更にＤＥＡＥ−セファロー
スＣＬ−６Ｂ、ヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂ、ホス
ホセルロース、セファデックスＧ−１００などのイオン
交換クロマト法、アフィニティークロマト法、ゲル濾過
法もしくはこれらの組合せにより菌体かも目的とする制
限酵素を得ることができる。
本発明により得られる第■型制限酵素ＡａａＩは以下の
ような理化学的性質を有している。
ような理化学的性質を有している。
（１） 作用及び基質特異性
酵素反応の基質ＤＮＡとしてプラスミドｐＢＲ３２２、
プラスミドｐＢＲ３２Ｂ、Ｅ、Ｃｏ１１ファージλ−Ｄ
ＮＡ、ファージ−Ｘ１フ４．アデノパイラス（Ａｄｅｎ
ｏ Ｖｉｒｕｓ） ２ Ｄ Ｎ Ａを用いた０本酵素は
ｐＢＲ３２８とλ−ＤＮＡを２ケ所、ｐＢＲ３２２を１
ケ所、Ａｄ２を１０ケ所で切断し、φＸ１７４は切断し
なかった。
プラスミドｐＢＲ３２Ｂ、Ｅ、Ｃｏ１１ファージλ−Ｄ
ＮＡ、ファージ−Ｘ１フ４．アデノパイラス（Ａｄｅｎ
ｏ Ｖｉｒｕｓ） ２ Ｄ Ｎ Ａを用いた０本酵素は
ｐＢＲ３２８とλ−ＤＮＡを２ケ所、ｐＢＲ３２２を１
ケ所、Ａｄ２を１０ケ所で切断し、φＸ１７４は切断し
なかった。
これらの基質に対する本酵素の切断パターンは切断数、
切断断片の大きさともにＸｍａｍで処理した場合と同じ
結果を示した。さらに、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８な
どに対する切断位置は既知Ｘｍａｌ［Ｉとほぼ同一であ
ることも確認できた。
切断断片の大きさともにＸｍａｍで処理した場合と同じ
結果を示した。さらに、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８な
どに対する切断位置は既知Ｘｍａｌ［Ｉとほぼ同一であ
ることも確認できた。
本酵素の基質特異性を明らかにするため、本酵素で処理
したｐＢＲ３２２（１ケ所切断）とＸｍａｌ［Ｉで処理
したｐＢＲ３２８（２ケ所切断）との連結を行ったとこ
ろ、２種のＤＮＡ断片は相互に連結した。この連結した
ＤＮＡを再び制限酵素Ｘｍａｎ［で切断すると、連結前
と同一分子量の２つの断片が得られ、Ｘｍａｍサイトは
保存されていることが判明した。
したｐＢＲ３２２（１ケ所切断）とＸｍａｌ［Ｉで処理
したｐＢＲ３２８（２ケ所切断）との連結を行ったとこ
ろ、２種のＤＮＡ断片は相互に連結した。この連結した
ＤＮＡを再び制限酵素Ｘｍａｎ［で切断すると、連結前
と同一分子量の２つの断片が得られ、Ｘｍａｍサイトは
保存されていることが判明した。
このことから、本酵素の認識塩基配列および切断点はＸ
ｍａＩ［ｌと同一であり、特異性は↓ ＣＧＧＣＣＧであり、Ｘｔｓａｍのアイソシゾマーであ
ると結論された。
ｍａＩ［ｌと同一であり、特異性は↓ ＣＧＧＣＣＧであり、Ｘｔｓａｍのアイソシゾマーであ
ると結論された。
（２） 至適ｐＨ
至適ｐＨは８．５である。
安定ｐＨは７．５〜９．０である。
（３） 作用温度
１５〜５０℃、最適温度は３０℃〜４０℃である。
（４） 力価の測定
１０ｍＭ、）リスＨＣ１（ｐＨ８，５）、１００ｍＭＮ
ａＣｊｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール中で
λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で６０分間反応させ、完
全に分解する酵素量を１単位とする。
ａＣｊｌ、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノール中で
λ−ＤＮＡ １μｇを３７℃で６０分間反応させ、完
全に分解する酵素量を１単位とする。
（５）活性化および安定化
反応液中１ｍＭ−２０ｍＭのＭｇ＋゛で活性化される。
Ｍｈ”でもやや活性化される。また５０〜１００ｍＭ
ＮａＣ１で活性化される。
ＮａＣ１で活性化される。
グリセロールで安定化される。
（６） 精製方法
実施例記載の通りである。
本発明によって得られる第■型制限酵素ＡａａＩは、前
述したように、遺伝子ＤＮＡの構造と機能の研究や遺伝
子組換え研究などに有用な生化学的試薬として利用され
る。
述したように、遺伝子ＤＮＡの構造と機能の研究や遺伝
子組換え研究などに有用な生化学的試薬として利用され
る。
久に、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例１
アセトバクター・アセチ１ｌｈ１０２３ （ＦＥＲＭＰ
−７１２２）株をグルコース３％、酵母エキス０．５％
、ポリペプトン０．２％を含む培地１６０／中で３０℃
で通気攪拌して培養した。定常期の培養菌体を集菌した
。得られた菌体８０ｇを０．ＯＩＭトリスＨ（１！ （
ｐＨ７，５）で洗浄し、１０ｍＭメルカプトエタノール
存在下で、フレンチプレスにて破砕した。遠沈後、上澄
液に食塩を添加後（最終濃度２．０Ｍ）、核酸を除去す
るために２．０Ｍ ＮａＣ１を含むポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ６０００）とデキストラン（Ｄｅｘｔｒ
ａｎＴ５００）の混合液を添加した（最終濃度ＰＥＧ６
０００ ８．５％、Ｄｅｘｔｒａｎ ７５００ ２．
１％）。
−７１２２）株をグルコース３％、酵母エキス０．５％
、ポリペプトン０．２％を含む培地１６０／中で３０℃
で通気攪拌して培養した。定常期の培養菌体を集菌した
。得られた菌体８０ｇを０．ＯＩＭトリスＨ（１！ （
ｐＨ７，５）で洗浄し、１０ｍＭメルカプトエタノール
存在下で、フレンチプレスにて破砕した。遠沈後、上澄
液に食塩を添加後（最終濃度２．０Ｍ）、核酸を除去す
るために２．０Ｍ ＮａＣ１を含むポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ６０００）とデキストラン（Ｄｅｘｔｒ
ａｎＴ５００）の混合液を添加した（最終濃度ＰＥＧ６
０００ ８．５％、Ｄｅｘｔｒａｎ ７５００ ２．
１％）。
１時間攪拌した後、１０．０００Ｘｇ、１０分間遠心分
離し、２層に分かれた上層液に硫酸アンモニウムを３０
％飽和になるように攪拌しながら加えた。
離し、２層に分かれた上層液に硫酸アンモニウムを３０
％飽和になるように攪拌しながら加えた。
約１時間放置後、１０．０００Ｘｇ、６０分間遠心分離
を行い、得られた下層液に硫酸アンモニウムを６０％飽
和になるように攪拌しながら添加した。遠心分離した沈
澱を緩衝液Ａ（１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ１ｔ。
を行い、得られた下層液に硫酸アンモニウムを６０％飽
和になるように攪拌しながら添加した。遠心分離した沈
澱を緩衝液Ａ（１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ１ｔ。
１０％ グリセロール、１０ｍＭ１−リスＨＣＩ。
ｐ Ｈ７，５）で溶解したのち溶解液を緩衝液Ａで１夜
透析した。透析液４１．５ｍｌ１をあらかじめ緩衝液Ａ
で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（２，２
Ｘ４５．Ｏ）カラムに吸着せしめ緩衝液Ａで洗浄後、０
．０Ｍ ＮａＣｊ！−０，５Ｍ ＮａＣ１直線的濃
度勾配をもつ緩衝液で溶出した。ＡａａＩはカラムに吸
着せず、洗浄液に活性が検出された。
透析した。透析液４１．５ｍｌ１をあらかじめ緩衝液Ａ
で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（２，２
Ｘ４５．Ｏ）カラムに吸着せしめ緩衝液Ａで洗浄後、０
．０Ｍ ＮａＣｊ！−０，５Ｍ ＮａＣ１直線的濃
度勾配をもつ緩衝液で溶出した。ＡａａＩはカラムに吸
着せず、洗浄液に活性が検出された。
ＡａａＩ活性画分を限外濾過で濃縮後、あらかじめ緩衝
液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
（１，６ｘ３０）に吸着させた。緩衝液Ａで洗浄したの
ち、０．０Ｍ ＮａＣ１−＝０．５ＭＮａＣ１直線的
濃度勾配をもつ緩衝液で溶出した。
液Ａで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ
（１，６ｘ３０）に吸着させた。緩衝液Ａで洗浄したの
ち、０．０Ｍ ＮａＣ１−＝０．５ＭＮａＣ１直線的
濃度勾配をもつ緩衝液で溶出した。
ＡａａＩは０．３０Ｍ−０，４５Ｍ濃度の溶出液に溶出
された。
された。
Ａａａ■活性画分を限外濾過で濃縮後、緩衝液Ｂ（１０
ｍＭ 燐酸水素二カリウム−燐酸二水素カリウム、１
０ｍＭ２−メルカプトエタノール。
ｍＭ 燐酸水素二カリウム−燐酸二水素カリウム、１
０ｍＭ２−メルカプトエタノール。
１０％グリセロール、ｐＨ７，５）で透析した。透析液
をさらにあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したホスホセルロ
ース（１，６ｘ１５）カラムに吸着させた。緩衝液Ｂで
洗浄処理後、本酵素を０．２５ＭＮａＣ１と０．５Ｍ
ＮａＣ１で段階的に溶出した。
をさらにあらかじめ緩衝液Ｂで平衡化したホスホセルロ
ース（１，６ｘ１５）カラムに吸着させた。緩衝液Ｂで
洗浄処理後、本酵素を０．２５ＭＮａＣ１と０．５Ｍ
ＮａＣ１で段階的に溶出した。
ＡａａＩ活性は、０．５ Ｍ濃度溶出液に検出された。
本画分を限外濾過を用いて濃縮し、酵素３０００単位を
得た。
得た。
なお、本酵素精製の過程を表に示す。
Claims (2)
- （１）アセトバクター属に属する第II型制限酵素Ａａａ
I 生産菌を培養し、得られた上記菌体より第II型制限
酵素Ａａａ I を採取することを特徴とする制限酵素の
製造法。 - （２）アセトバクター属に属する第II型制限酵素Ａａａ
I 生産菌がアセトバクター・アセチＮｏ．１０２３（
ＦＥＲＭ Ｐ−７１２２）株である特許請求の範囲第１
項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60146807A JPS6211091A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 制限酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60146807A JPS6211091A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 制限酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6211091A true JPS6211091A (ja) | 1987-01-20 |
Family
ID=15415970
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60146807A Pending JPS6211091A (ja) | 1985-07-05 | 1985-07-05 | 制限酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6211091A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5139729A (en) * | 1989-10-20 | 1992-08-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Comapny | Process for making low shrinkage, high tenacity poly(epsilon-caproamide) yarn |
-
1985
- 1985-07-05 JP JP60146807A patent/JPS6211091A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5139729A (en) * | 1989-10-20 | 1992-08-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Comapny | Process for making low shrinkage, high tenacity poly(epsilon-caproamide) yarn |
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