JPS62126972A - 新規制限酵素及びその製造法 - Google Patents
新規制限酵素及びその製造法Info
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- JPS62126972A JPS62126972A JP60268896A JP26889685A JPS62126972A JP S62126972 A JPS62126972 A JP S62126972A JP 60268896 A JP60268896 A JP 60268896A JP 26889685 A JP26889685 A JP 26889685A JP S62126972 A JPS62126972 A JP S62126972A
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- enzyme
- microorganism
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- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分骨〕
本発明は新規制限酵素およびその製造法に関し、更に詳
細にはアチネトバクター（Ａｃ１ｎθｔｏｂａｃｔｅｒ
）属の細菌の生産する新規制限酵素およびその製造法
に関する。
細にはアチネトバクター（Ａｃ１ｎθｔｏｂａｃｔｅｒ
）属の細菌の生産する新規制限酵素およびその製造法
に関する。
制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ ）上のある特
定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌク
レアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、
ＤＮＡが遺伝をつかさどることが明らかになって以来、
制限酵素は遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作によ
る遺伝物質の大量生産への利用等現在広く用いられてい
る有用な酵素である。制限酵素は種々の微生物より単離
されており、その認識する塩基配列、切断様式により現
在までに約１００種類が知られている。遺伝子操作にお
いてはその作用において多様な制限酵素を必要とする。
定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌク
レアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により、
ＤＮＡが遺伝をつかさどることが明らかになって以来、
制限酵素は遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作によ
る遺伝物質の大量生産への利用等現在広く用いられてい
る有用な酵素である。制限酵素は種々の微生物より単離
されており、その認識する塩基配列、切断様式により現
在までに約１００種類が知られている。遺伝子操作にお
いてはその作用において多様な制限酵素を必要とする。
しかしながら本発明者等の知る限りにおいては二本鎖デ
オキシリボ核酸中の塩基配列↓ ５’−ＴＯＯＧＧＡ−３’ ３’ −ＡＧＧ（１！ＯＴ −５’ ↑ （式中人はアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
、Ｃはシチジンを示す）を認識し、がつこれを矢印の位
置で切断する制限酵素は見出されていない。
オキシリボ核酸中の塩基配列↓ ５’−ＴＯＯＧＧＡ−３’ ３’ −ＡＧＧ（１！ＯＴ −５’ ↑ （式中人はアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
、Ｃはシチジンを示す）を認識し、がつこれを矢印の位
置で切断する制限酵素は見出されていない。
従って本発明は上記二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配
列を認識し、かつこれを上記矢印の位置で切断する従来
知られていながった新規制限酵素を提供することにある
。
列を認識し、かつこれを上記矢印の位置で切断する従来
知られていながった新規制限酵素を提供することにある
。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は下記の理化
学的性質を有する新規制限酵素にある。
学的性質を有する新規制限酵素にある。
（イ）作用および基質特異性：
二本鎖デオキシリボ核醗中の塩基配列
↓
５’ −Ｔｏｏ（）ＧＡ −３’
３’ −ＡＧＧＩｊＯＴ −５’
↑
を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。
（式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
、Ｃはシチジンを示す） （ロ）至適ｐＨ：８．５ （ハ）安定ｐＨ：６．０〜９．５ に）至適反応温度： ６０〜６５℃ なお本発明による上記新規制限酵素は二本鎖デオキシリ
ボ核酸χ−ＤＮＡを２４個所、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを１
個所、アデノパイラス・タイプ２を８個所で切断する。
、Ｃはシチジンを示す） （ロ）至適ｐＨ：８．５ （ハ）安定ｐＨ：６．０〜９．５ に）至適反応温度： ６０〜６５℃ なお本発明による上記新規制限酵素は二本鎖デオキシリ
ボ核酸χ−ＤＮＡを２４個所、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを１
個所、アデノパイラス・タイプ２を８個所で切断する。
φＸ１７４ＲＩＦＤＮＡ。
８７４０ ＤＮＡは切断しない。
また本発明の第２の発明は上記新規制限酵素の製造方法
に関し、アチネトバクター属に属する上記新規制限酵素
を生産する細菌を栄養培地で培養し、培養物より上記新
規制限酵素を採取することにある。
に関し、アチネトバクター属に属する上記新規制限酵素
を生産する細菌を栄養培地で培養し、培養物より上記新
規制限酵素を採取することにある。
本発明で使用する微生物としては、アチネトバクター属
に属する上記新規制限酵素生産菌の全てを使用できるが
、−例としてアチネトバクター・カルコアセティカス（
Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｏｏａｃｅｔｉｃｕ
ｓ ）がある０上記細菌の菌学的性質についてはバーシ
ーズ・マニュアル・オフ・デイターミネイティブ拳バク
テリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｄａｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）第８版第４３７頁に記載されている。
に属する上記新規制限酵素生産菌の全てを使用できるが
、−例としてアチネトバクター・カルコアセティカス（
Ａｃ１ｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｃａｌｏｏａｃｅｔｉｃｕ
ｓ ）がある０上記細菌の菌学的性質についてはバーシ
ーズ・マニュアル・オフ・デイターミネイティブ拳バク
テリオロジ−（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ
Ｄａｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）第８版第４３７頁に記載されている。
なお本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研
条寄第９３５号（ＦＩＣＲＭ ＢＰ −９３５）とし
て寄託されている。
条寄第９３５号（ＦＩＣＲＭ ＢＰ −９３５）とし
て寄託されている。
本発明による新規制限酵素の製造方法についてさらに詳
細に説明する。まず培養の際、培地に加える栄養源は使
用する菌株が利用し、新規制限酵素を生産するものであ
ればよく、炭素源としては例えばグルコース、穿素源と
しては酵母エキス、ペプトン、プレインハートインフュ
ージョンなどが利用できる。
細に説明する。まず培養の際、培地に加える栄養源は使
用する菌株が利用し、新規制限酵素を生産するものであ
ればよく、炭素源としては例えばグルコース、穿素源と
しては酵母エキス、ペプトン、プレインハートインフュ
ージョンなどが利用できる。
本発明による制限酵素の生産量は培養条件により大きく
変動するが一般に培養温度は２５〜４０℃、培地のｐＨ
４〜８が良く、１〜２日間の通気撹拌培養で本発明によ
る制限酵素の生産は最高に達する。培養条件は使用する
菌株、培地組成などに応じ、制限酵素の生産量が最大に
なるように設定するのは轟然である。本発明の菌株によ
って生成された制限酵素は主に菌体内に存在する。
変動するが一般に培養温度は２５〜４０℃、培地のｐＨ
４〜８が良く、１〜２日間の通気撹拌培養で本発明によ
る制限酵素の生産は最高に達する。培養条件は使用する
菌株、培地組成などに応じ、制限酵素の生産量が最大に
なるように設定するのは轟然である。本発明の菌株によ
って生成された制限酵素は主に菌体内に存在する。
培養液からの菌体の分離はたとえば遠心分離により行な
うことができる。
うことができる。
本発明の酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に従
った方法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後
、超音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行なう
。次に細胞残渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、同１ｍ液にて透析を行な
う。得られる透析内液をイオン交換クロマト法、分子ふ
るいクロマト法およびアフイニテイクロマト法を用いた
精製法で本発明の制限酵素を得る。−例を挙げると、透
析内液をホスホセルロースＰ１１（ワットマン社製）カ
ラムに吸着させて、次いで０〜１．０Ｍの塩化カリウム
で溶出する、活性画分をＤＥＡＥ−セルロースＤＥ ５
２（ワットマン社製）カラムに吸着させ、次いで０〜１
．０Ｍ塩化カリウムで溶出する。活性画分をヘパリン−
セファロース０Ｌ−５Ｂ（ファルマシア社製）カラムに
吸着させ、０．７Ｍ塩化カリウムで洗浄後、ｉ、ｏＭの
塩化カリウムで溶出する。活性画分をさらにアミノヘキ
シルアガロース（ベセスダ社製）カラムに吸着させて、
次いでＯ〜１．５Ｍの塩化カリウムで溶出することによ
り本発明による制限酵素標品を得ることができる。
った方法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後
、超音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行なう
。次に細胞残渣を超遠心分離により除去後、抽出液を硫
酸アンモニウムで塩析する。沈殿物をリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、同１ｍ液にて透析を行な
う。得られる透析内液をイオン交換クロマト法、分子ふ
るいクロマト法およびアフイニテイクロマト法を用いた
精製法で本発明の制限酵素を得る。−例を挙げると、透
析内液をホスホセルロースＰ１１（ワットマン社製）カ
ラムに吸着させて、次いで０〜１．０Ｍの塩化カリウム
で溶出する、活性画分をＤＥＡＥ−セルロースＤＥ ５
２（ワットマン社製）カラムに吸着させ、次いで０〜１
．０Ｍ塩化カリウムで溶出する。活性画分をヘパリン−
セファロース０Ｌ−５Ｂ（ファルマシア社製）カラムに
吸着させ、０．７Ｍ塩化カリウムで洗浄後、ｉ、ｏＭの
塩化カリウムで溶出する。活性画分をさらにアミノヘキ
シルアガロース（ベセスダ社製）カラムに吸着させて、
次いでＯ〜１．５Ｍの塩化カリウムで溶出することによ
り本発明による制限酵素標品を得ることができる。
本発明による制限酵素の活性測定方法を示す。
下記表１に示す組成の反応液５０メｔを予め３７℃で予
熱した後、本酵素を加え酵素反応を進める。１０分後に
酵素反応停止液（１％ＳＤＳ 、 ５０％グリセロール
、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５／’を添加
して反応を停止させる。
熱した後、本酵素を加え酵素反応を進める。１０分後に
酵素反応停止液（１％ＳＤＳ 、 ５０％グリセロール
、０．０２％ブロムフェノールブルー）を５／’を添加
して反応を停止させる。
表 １
１ＱｍＭ トリス−）（Ｃｔ、 ｐＨ７，５７
ｍＭ ＭｇＣＬｚ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール５ Ｑ ｍＭ
ＮａＣ６ ０，０１％ 牛血清アルブミン １．０，１ χ−ＤＮＡ 反応液を１％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／
ａｍの定電圧下で約１時間から２時間電気泳動を行なう
。電気泳動用緩衝液は９０ ｍＭトリス−はう酸緩衝液
（ｐＨ８，３） ２．５ ｍＭ ＥＤＴＡを用いる。
ｍＭ ＭｇＣＬｚ ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール５ Ｑ ｍＭ
ＮａＣ６ ０，０１％ 牛血清アルブミン １．０，１ χ−ＤＮＡ 反応液を１％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／
ａｍの定電圧下で約１時間から２時間電気泳動を行なう
。電気泳動用緩衝液は９０ ｍＭトリス−はう酸緩衝液
（ｐＨ８，３） ２．５ ｍＭ ＥＤＴＡを用いる。
ゲルに前もって０．５）’ｆ／ｍｅのエチジウムブロマ
イドを含ませておくことにより、Ｕｖ前照射ＤＮＡのバ
ンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバンドの
数と債が変化しなくなった時を終点とする。
イドを含ませておくことにより、Ｕｖ前照射ＤＮＡのバ
ンドが検出可能である。ＤＮＡフラグメントのバンドの
数と債が変化しなくなった時を終点とする。
活性の定義は３７℃で１時間に１声２のχ−ＤＮＡを完
全に分解する酵素活性を１単位とする。
全に分解する酵素活性を１単位とする。
本発明により得られた新規制限酵素は以下のような理化
学的性質を持っている。
学的性質を持っている。
（１）作用および基質特異性：
本酵素は二本鎖デオキシリボ核酸中の
↓
５’−ＴＯＯＧＧＡ−３’
３’ −ＡＧＧＯＣＴ−５’
↑
（式中Ａ、Ｔ、Ｏ１Ｇは前述したとおりである）を認識
し、かつこれを矢印の位置で切断する酵素である。
し、かつこれを矢印の位置で切断する酵素である。
本発明の新規制限酵素の認識部位の決定は以下のように
行なった。
行なった。
本制限酵素はアデノパイラス・タイプ２ ＤＮＡを８カ
所切断したが、φＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡおよび５Ｖ
４０ＤＮＡは分解しなかった。またＤａｍ＋χ−ＤＮＡ
とＤａｍ−χ−ＤＮＡを２０力所以上切断したが、生成
フラグメントの数が、Ｄａｍ＋χ−ＤＮＡの場合には３
本少なかった。さらにＤａｍ−ｐＢＲ３２２ＤＮＡは１
力所切断したがＤａｍ＋ｐＢＲ３２２ＤＮＡは切断され
なかった。これらの結果よりこの酵素の認識部位は大腸
菌のｃｌａｎ遺伝子により認識され、Ａがメチル化を受
ける塩基配列５ｌ−ＧＡＴＣ−３’の一部が関係してい
ると考えられた。
所切断したが、φＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡおよび５Ｖ
４０ＤＮＡは分解しなかった。またＤａｍ＋χ−ＤＮＡ
とＤａｍ−χ−ＤＮＡを２０力所以上切断したが、生成
フラグメントの数が、Ｄａｍ＋χ−ＤＮＡの場合には３
本少なかった。さらにＤａｍ−ｐＢＲ３２２ＤＮＡは１
力所切断したがＤａｍ＋ｐＢＲ３２２ＤＮＡは切断され
なかった。これらの結果よりこの酵素の認識部位は大腸
菌のｃｌａｎ遺伝子により認識され、Ａがメチル化を受
ける塩基配列５ｌ−ＧＡＴＣ−３’の一部が関係してい
ると考えられた。
Ｄａｍ ｐＢＲ３２２を本制限酵素とＨｌｎｄ ｌ
Ｘ５ａｄＩ ５Ｈ１ｎｃ ｌ 、Ｐｓｔ ｌのそれぞれ
の酵素と二重分解を行ない本制限酵素の１）ＢＲ３２２
上の位置を調べたところ１７００ ｂｐ （ベースペア
ー）付近であることが明らかになった。その付近のＧＡ
Ｔ（！配列を探したところ１６６４より１６７１にＴＯ
ＯＧＧＡＴＯの配列があった。したがって本制限酵素は
ＴＯＯＧＧＡを認識していることが推測される。
Ｘ５ａｄＩ ５Ｈ１ｎｃ ｌ 、Ｐｓｔ ｌのそれぞれ
の酵素と二重分解を行ない本制限酵素の１）ＢＲ３２２
上の位置を調べたところ１７００ ｂｐ （ベースペア
ー）付近であることが明らかになった。その付近のＧＡ
Ｔ（！配列を探したところ１６６４より１６７１にＴＯ
ＯＧＧＡＴＯの配列があった。したがって本制限酵素は
ＴＯＯＧＧＡを認識していることが推測される。
次にアデノパイラス・タイプ２ＤＮＡ、φＸ１７４ＲＦ
Ｉ）ＮＡ、 ＳＶ ４０ ＤＮＡ、χ−ＤＮＡ中ノ
ＴＣＣＧＧＡの数を調べたところ８．０．０．２４と実
験結果を一致した。χ−ＤＮＡの２４カ所の内３カ所＋
７）ＴＯＯＧＧＡのＡがｄａｍ遺伝子によりメチル化を
受けていて切断されないことも明らかになった。
Ｉ）ＮＡ、 ＳＶ ４０ ＤＮＡ、χ−ＤＮＡ中ノ
ＴＣＣＧＧＡの数を調べたところ８．０．０．２４と実
験結果を一致した。χ−ＤＮＡの２４カ所の内３カ所＋
７）ＴＯＯＧＧＡのＡがｄａｍ遺伝子によりメチル化を
受けていて切断されないことも明らかになった。
次に本発明の新規制限酵素の切断部位の決定は以下のよ
うに行なった。
うに行なった。
本制限酵素の認識部位を中央に持った２回転対称形のオ
リゴヌクレオチドｄ （ＧＴＴ（ＩＣ！ＧＧＡＡＯ）を
固相法により合成しポリヌクレオチドキナーゼと（７−
ｐ）アデノシン三リン酸を用いて５１末端に放射性リン
酸を付加する。このオリゴヌクレオチドをアニーリング
させて二本鎖ＤＮＡとした後、本酵素で切断しＤＫＡＥ
−セルロース９１プレート（マシエレイ・ナゲル社製品
）により分析した。この時、生成物として鎖長三項基（
５’ −ｐＧＴＴ ）の標識されたスポットが検出され
た。
リゴヌクレオチドｄ （ＧＴＴ（ＩＣ！ＧＧＡＡＯ）を
固相法により合成しポリヌクレオチドキナーゼと（７−
ｐ）アデノシン三リン酸を用いて５１末端に放射性リン
酸を付加する。このオリゴヌクレオチドをアニーリング
させて二本鎖ＤＮＡとした後、本酵素で切断しＤＫＡＥ
−セルロース９１プレート（マシエレイ・ナゲル社製品
）により分析した。この時、生成物として鎖長三項基（
５’ −ｐＧＴＴ ）の標識されたスポットが検出され
た。
このことから本酵素は
↓
５’ −Ｔｏｅ（）ＧＡ −３’
３’−ＡＧＧＣＯＴ−５’
↑
を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。
（２）至適酵素活性条件
１）至適反応温度：
本酵素の至適反応温度は６０〜６５℃であった。
１１）至ａｐＨ：
本酵素の至適ｐＨは８．５であった。
Ｉｌｌ ）ＫＣｔ％ Ｎａ０６ａ度：
本酵素の至適塩濃度はＫＣｌ 、 ＮａＣ１とも１５０
ｍＭであった。
ｍＭであった。
ＩＶ）ＭｇＯ２ｚ濃度：
ＭｇＣ２ｘ濃度が５ ｍＭ〜５９ ｍＭの存在下で酵素
反応が活性化される。
反応が活性化される。
■）安定ｐＨ：
本酵素の安定ｐＨは６．０〜９．５である、〔実施例〕
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。
明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例 １
アチネトバクター〇カルコアセティカス（？ＥＲＭ Ｂ
Ｐ −９３５）を下記表２に示す組成の培地１６０ｔで
３２℃にて１０時間通気猾拌培養を行ない、その後、冷
却遠心機を用いて菌体を得る。培養液１６０ｔから湿重
量にして約１２８０２の菌体が得られた。
Ｐ −９３５）を下記表２に示す組成の培地１６０ｔで
３２℃にて１０時間通気猾拌培養を行ない、その後、冷
却遠心機を用いて菌体を得る。培養液１６０ｔから湿重
量にして約１２８０２の菌体が得られた。
表 ２
ポリペプトン １０？
イーストエキス ５タ
グルコース １２
ＮａＧ！ｔ５ｙ
脱イオン水 １ｔ
ｐＨ７，２
得られた菌体の内、３５０Ｆの菌体を７００−の抽出緩
衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５，１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に′！ｆ！！濁し
、超音波破砕機を用いて破砕後、１０００００Ｘｒで１
時間遠心分離を行ない、残渣を除去、抽出液を得た。
衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５，１
０ｍＭ ２−メルカプトエタノール）に′！ｆ！！濁し
、超音波破砕機を用いて破砕後、１０００００Ｘｒで１
時間遠心分離を行ない、残渣を除去、抽出液を得た。
この抽出液に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるよう
に加え、沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ （１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５、ｌ Ｑ ｍＭ
ｉ−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に溶
解後、同緩衝液Ａで一晩透析を行なった。
に加え、沈殿物を遠心分離にて集め、緩衝液Ａ （１０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，５、ｌ Ｑ ｍＭ
ｉ−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に溶
解後、同緩衝液Ａで一晩透析を行なった。
次に透析内液を、予め緩衝液Ａで平衡化させておいたホ
スホセルロースＰ１１（ワットマン社製）のカラム（３
００ｄ）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後０〜１．０Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させ
ると０６５〜０．７０ Ｍの塩化カリウム濃度画分に制
限酵素活性が検出できた。
スホセルロースＰ１１（ワットマン社製）のカラム（３
００ｄ）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後０〜１．０Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させ
ると０６５〜０．７０ Ｍの塩化カリウム濃度画分に制
限酵素活性が検出できた。
次にこの活性画分を合わせ、緩衝液Ａで一晩透析後、透
析内液を、予め緩衝浪人で平衡化させておいたＤＫＡＩ
Ｇ−セルロースＤＫ５２（ワットマン社製）のカラム（
１０ｍ／）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜１．０
Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出
させると０．２０〜０．２５ Ｍの塩化カリウム濃度画
分に制限酵素活性が検出できた。
析内液を、予め緩衝浪人で平衡化させておいたＤＫＡＩ
Ｇ−セルロースＤＫ５２（ワットマン社製）のカラム（
１０ｍ／）に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜１．０
Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出
させると０．２０〜０．２５ Ｍの塩化カリウム濃度画
分に制限酵素活性が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ａで透析後、透析
内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたヘパリン−セ
ファロース０Ｌ−（３Ｂ（ファルマシア社製）のカラム
（４ｍｅ ）に吸着させ、０．７Ｍの塩化カリウムを含
む緩衝液Ａで洗浄後、１．０Ｍの塩化カリウムを含む緩
衝液Ａにて溶出させた。
内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたヘパリン−セ
ファロース０Ｌ−（３Ｂ（ファルマシア社製）のカラム
（４ｍｅ ）に吸着させ、０．７Ｍの塩化カリウムを含
む緩衝液Ａで洗浄後、１．０Ｍの塩化カリウムを含む緩
衝液Ａにて溶出させた。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ａで透析後、透析
内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたアミノへキシ
ルアガロース（ベセスダ社製）のカラムＣ４ｍｅ）に吸
着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜１．５Ｍの塩化カリウ
ムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させると０．３
２〜０．６５Ｍの塩化カリウム温良画分に制限酵素活性
が検出できた。
内液を予め緩衝液Ａで平衡化させておいたアミノへキシ
ルアガロース（ベセスダ社製）のカラムＣ４ｍｅ）に吸
着させ、緩衝液Ａで洗浄後、０〜１．５Ｍの塩化カリウ
ムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出させると０．３
２〜０．６５Ｍの塩化カリウム温良画分に制限酵素活性
が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ、ポリエチレンブライフ
ールにて濃縮を行ない、濃縮液に等量のグリセロールを
加え、制限酵素の最終標品を得た。
ールにて濃縮を行ない、濃縮液に等量のグリセロールを
加え、制限酵素の最終標品を得た。
この酵素標品には非特異的なりＮＡ分解酵素およびホス
ファターゼは夾雑していなかった。
ファターゼは夾雑していなかった。
以上、述べた方法により３５０？の湿菌体より３０００
単位の活性単位が得られた。
単位の活性単位が得られた。
以上詳細に説朗したとおり、本発明により従来知られて
いなかった基質特異性を有する新規制限酵素およびその
工業的に有利な製造法が提供された。
いなかった基質特異性を有する新規制限酵素およびその
工業的に有利な製造法が提供された。
手続補正書
昭和６１年 ８月１４日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有する新規制限酵素。 （イ）作用および基質特異性： 二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。 （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
ン、Ｃはシチジンを示す） （ロ）至適ｐＨ：８．５ （ハ）安定ｐＨ：６．０〜９．５ （ニ）至適反応温度：６０〜６５℃ ２、アチネトバクター属に属する新規制限酵素生産菌を
栄養培地で培養し、培養物より新規制限酵素を採取する
ことを特徴とする新規制限酵素の製造法。 ３、アチネトバクター属に属する新規制限酵素生産菌が
アチネトバクター・カルコアセテイカスである特許請求
の範囲第２項記載の製造法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60268896A JPS62126972A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 新規制限酵素及びその製造法 |
| GB8625652A GB2183657B (en) | 1985-11-28 | 1986-10-27 | New restriction enzyme and process for producing the same |
| DE19863640382 DE3640382A1 (de) | 1985-11-28 | 1986-11-26 | Neues restriktionsenzym und verfahren zu seiner herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60268896A JPS62126972A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 新規制限酵素及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62126972A true JPS62126972A (ja) | 1987-06-09 |
| JPS649000B2 JPS649000B2 (ja) | 1989-02-15 |
Family
ID=17464770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60268896A Granted JPS62126972A (ja) | 1985-11-28 | 1985-11-28 | 新規制限酵素及びその製造法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS62126972A (ja) |
| DE (1) | DE3640382A1 (ja) |
| GB (1) | GB2183657B (ja) |
-
1985
- 1985-11-28 JP JP60268896A patent/JPS62126972A/ja active Granted
-
1986
- 1986-10-27 GB GB8625652A patent/GB2183657B/en not_active Expired
- 1986-11-26 DE DE19863640382 patent/DE3640382A1/de active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2183657B (en) | 1989-10-04 |
| DE3640382A1 (de) | 1987-06-04 |
| JPS649000B2 (ja) | 1989-02-15 |
| GB8625652D0 (en) | 1986-11-26 |
| GB2183657A (en) | 1987-06-10 |
| DE3640382C2 (ja) | 1989-06-22 |
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