JPH03172179A - ２型―制限エンドヌクレアーゼＭｃｒＩ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野１ 本発明は■型一制限エンドヌクレアーゼＭｃｒＩ，その
取得法及び使用に関する。

【従来の技術】

■型−ｍ＠工冫ドヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ配列を
認識し、切断することのできるエンドデソキシリポヌク
レアーゼである。この際、Ｕ的配列中のホスホジエステ
ル禍が、しかモ各ポリヌクレオチド鎖中で加水分解され
る。従って、■型制限工冫ドヌクレアーゼは、ＤＮＡ一
分子の分析にとって重要である。多くのＤＮＡ−配列に
関して特異的なｎ型一制限エンドヌクレアーゼは、既に
公知であるが、ＤＮＡ一配列に関して特異的であり、従
来、公知の制限エンドヌクレアーゼのいずれによっても
認識されない■型一制限エンドヌクレアーゼを提供する
必要がある。 ［発明が解決しようとする課題〕 従って、本発明は、従来の酵素によって認識されなかっ
た配列を特異的に認識し、かつ切断することのできる新
規の制限エンドヌクレアーゼを提供することを課題とし
ている。 ［課題を解決するための手段１ この課題は、本発明により、 の認識配列及び標識で定義された切断位置に関係する■
型一制限エンドヌクレアーゼにより解決される。 本発明による新規の制限エンドヌクレアーゼ（以後これ
をＭｃｒＩと称する）は、３７℃で至適温度を有する。 この酵素は、ｐ　Ｈ　７　．４〜８．３で、ＤＴＥ　（
ジチオスレイトール）１．０篇モル／Ｑ，酢酸マグネシ
ウム１０＋モル／Ｑを有スルトリスーＨＣＩ−緩衝液５
０ｍモル／ａ中で良好な活性を有する。この至適ｐＨは
ｐ　Ｈ　７　．８である。Ｍｃｒｌに対するアイソシゾ
マー（夏ｓｏｓｃｈｉｚｏ＋ｍａｒ）である酵素は知ら
れていない。 この認識配列は、ウイルスアデノ２、ファ−ジラムダ、
ｐｈｉＸ　ｌ　７　４及び７アージ誘導体Ｍ１３ｍｐ８
及びグラスミド，Ｂ３２２及びｐＢＲ３２８の完全消化
により確認できる。これらのＤＮＡ一分子をＭｃｒｌで
処理する。 第ｌ表に、次の配列： を認識する酵素に関する実験的に観察された切断位置特
異性とコンピュータ測定された切断位置特異性とを比較
して示す。 この酵素の認識配列内の切断位置は、ユニ／《一サルな
配列決定プライマー（　Ｓ　ｅｑｕｅｎｚｉｅｒｐｒ−
ｉｍｅｒｓ　；　Ｍ　ｅｓｓ　ｉｎｇ等によるＮ　ｕｃ
ｌ．Ａ　ｃｉｄｓ　Ｒ　ｅｓ．（＋　９８　１）　、旦
、３０９〜３２ｌ）の結合位置に対して約３０〜２００
塩基の距離にこの認識配列を有するＭ１３一誘導体で測
定できる。 このＭＩ３誘導体の１本鎖ＤＮＳの所で、まずユニバー
サルな配列決定プライマーとジデソキシ連鎖中断法によ
る配列決定反応を実施する（Ｓ　ａｎｇｅｒ　Ｆ　．等
による（　１　９　７　７　）　、Ｐ　ｒｏｃ．Ｎａ−
ｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓ　ｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　７　４、
５６０〜５６４Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ．　Ｊ　．等による（
　１　９　８　１）　、Ｎｕｃｌ．Ａ　ａｉｄｓ　Ｒ　
ｅｓ．　９、３０９〜３２１）。 これと並行して、配列決定プライマーをＴ４ーポリヌク
レオチドーキナーゼ及び［γ３１］ＡＴＰを用いて、５
′一末端の所で放射能標識付けをする。この５′一末端
標識付けされた配列決定プライマーの１本１１Ｍ１３−
ＤＮＳへのノ）イブリド結合の後に、ＤＮＳポリメラー
ゼＩ（クレノ７酵素）及びｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴ
Ｐ及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチドホス７エー
ト混合物での挿入反応で、部分的２本鎖ＤＮＳを製造す
る。新規に合威された鎖の５′末端の所で放射能標識さ
れているこのＤＮＳを、次いで制限エンドヌクレアーゼ
Ｍｃｒｒで切断する。この切断バッチの半分を、付加的
に、なお、平滑ＤＮＳ一末端を得るために、全ての４種
のデソキシヌクレオチドホスフェートの混合物の存在下
で、Ｔ４−ＤＮＳ−ポリメラーゼで処理する。 反応生虞物の分析を、配列決定ゲル（　Ｓ　ｅｑｕ−ｅ
ｎｚｉｅｒｇｅｌ）　　（尿素８モル／１２，ポリアク
リルアミド５％）上での電気泳勧及び引統くオートラジ
オグラフィにより行なう。結果の解析は、ブラウン（　
Ｂ　ｒｏｗｎ）　Ｎ　．　Ｌ　．及びスミス（　Ｓｍｉ
ｔｈ）Ｍ．による方法（　Ｍ　ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
　ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５、（１９８０）、３９１〜４
０１）で実施する。放射能標識されたフラグメントの移
動距離と配列リーダー（　Ｓ　ｅｑｕｅｎｚｌｅｉｔｅ
ｒ）との比較により、切断位置を決定する。付加的に７
４ＤＮＳボリメラーゼで処理された試料は、単にＭｃｒ
ｌで切断された試料と比べて２ｂｐだけ延長されたバン
ドの移動距離を示す。従って、Ｍｃｒｌは、３′一突出
しているＤＮＳ一末端を生じることが明らかである。従
って、ＭＣｒＩの切断は、次の特異性： を有する認識配列内で行なわれる。 実論的に測定された切断位置の数は、配列：に関する種
々のＤＮＳでのコンピュータ分析により得られた切断位
置の数と同じである（第ｌ表）。付加的に、これらのデ
ータをＧｅｎｌＯ（１９８０）３５７〜３７０からの表
と比較した。 有利に、Ｍａｒｌは、マイクロコッカス属の微生物を培
貢し、その細胞から酵素を取得する方法で得られる。マ
イクロコッカス・クリオ７イル７．　（　Ｍ　ｉｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　
２０４２９を使用するのが有利である。 この微生物は、Ｄ　Ｓ　Ｍ　（Ｄ　ｅｕｔｓｃｈｅｎ　
Ｓ　ａａ＋ＩＩＩｌｕｎｇｖｏｎ　Ｍ　ｉｋｒｏｏｒｇ
ａｎｉｓｍｅｎ　％Ｍａｎｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ
ｌｂｓ　３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，　ＢＲＤ
）に寄託されており、ＤＳＭ２　０　４　２　９の寄託
番号を有する。 この酵素の取得のために使用される微生物は、好気的に
メルク・スタンダード（Ｍｅｒｃｋ　Ｓ　ｔａ−ｎｄａ
ｒｄ）　Ｉ培地中で生長する。 至適生長条件は、ｌ８℃、ｐＨ７．２〜７．８である。 ２倍化時間は約２時間である。 その取得のためには、慣用の生物学的精製法が使用され
、この際、その都度に得られるフラクション中で、その
認識配列の切断により、この酵素の存在を容易に立征す
ることができる。 基質としては、例えばλ一ＤＮＡが好適である．得られ
るＤＮＡ−７ラグメントは、フラグメント分雌のために
慣用の緩衝剤系中でのアガロースゲルで、臭化エチジウ
ムの存在下に電気泳動により分離されうる。 この酵素を、慣用の化学的及びＩＩＩ械的方法例えば高
圧分散、超音波又は酵素的崩壊法により単離しかつ精製
する。本発明方法の有利なｌ実施形では、細胞を５バー
ルの過圧に露呈する。 この際に生じた細胞物質を、トリスーＨＣＩ緩衡液（ｐ
Ｈ８．０、これはグロテアーゼ阻害剤を含有する）中に
再懸濁させる。引続きこの細胞を７レンチプレス（　Ｆ
　ｒｅｎｃｈ　−　Ｐ　ｒｅｓｓｅ）により崩壊させる
。上澄みを更に精製するために、有利に７７イニテイク
口マトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラフィを実
施する。ア７イニテイクロマトグラフィ用材料としては
、例えばヘバリンーセ７アロースＣ　Ｌ−６Ｂ　（Ｈ　
ｅｐａｒｉｎ　一Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃ　Ｌ　−　
６　Ｂ　；　Ｐ　ｈａｒｗ＋ａｃｉａ）が好適である。 アニオン交換体としては、Ｑ−セファロース（　Ｑ　−
　　Ｓ　ｅｐｈａｒｏｓｅ　；　Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ
　）なる名称で入手される製品が好適である。しかしな
がら、当業者に公知である他のクロマトグラフィ材料も
好適である。

【実施例】

次の例で本発明を更に説明する。 例　　ｌ マイクロコッカス・クリオフィルスＤＳＭ２０４２９を
１８℃で２５時間培養し、対数後期に収獲する．培貴媒
体としてメルク・スタンダードＩ　（Ｍｅｒｃｋ　Ｓ　
ｔａｎｄａｒｄｌ　）一培地を使用する。 細胞ペースト（湿重量３０ｇ）を、プロテアーゼ阻害剤
を含・有する緩衝液Ａ（トリスーＨＣＬ４０ｓ＋モル／
Ｑ％ｐ　Ｈ　８　．０、ＥＤＴＡ　　Ｏ．１モル／Ｑ１
２−メルカプトエタノール７ｍモル７０２．４容量中に
再懸濁させる。引続き、細胞を２３０　０　０　ｌｂ／
　ｉｎ２でフレンチーグレスに２回通すことにより崩壊
させ、沈殿を分離する。上澄み１：ｍＮｉＪ，ｍｌ！−
加讐ス（ｌｋ鉢逃麿ｎＲ＊ル／ｏ）ポリミンー沈殿法で
核酸を除去する。引続き、遠心分離された上澄みを５５
％ｆＩＬ酸アルミニウムで処理する。沈殿を緩衝液Ｂ（
１−リスーＨＣ１４０ｍモル／Ｑ，ｐＨ８．０、ＥＤＴ
Ａ　　Ｏ．ｌｍモル／Ｑ，　２−メルカプトエタノール
７ｗモル／Ｑ１　グリセリンＩ　Ｏ　（ｖ／ｖ）％）中
ニ入レ、Ｑ一セファロースーカラムを通して分別する。 溶雌のためにＮａＣＩＯ〜０．５モル／Ｑの勾配液を使
用する。Ｍａｒｌは、ＮａＣ　１　０　−２　〜０　．
３モル／Ｑの間のフラクシＢン中に認められる。この活
性フラクションをＳ−セ７アロースカラム上で分別する
。溶離のために，ＮａＣＩＯ”１モル／Ｑの勾配液を使
用する。ＮａＣＩ　０．４　〜０．５モル／ａの間の活
性フラクションを緩衝液Ｂに対して平衡化させ、ヘバリ
ンーセ７７ロースーカラム上に装入する。溶離のために
、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌＯ〜１モル／Ｑの勾配液を使用
する．Ｍｃｒ■はＮａＣＩ　Ｏ−４〜０．６モル／１２
の間の７ラクション中に認められる。 活性フラクションを一集め、貯藏緩衝液（トリスーＨＣ
Ｌ　　２０１１モル／１２，ｐＨ８．０、２−メルカプ
トエタノールｌＯｍモル／（＋、Ｎａｃ１１００ｍモル
／１２、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　　０　．　１　ｍ％ル／ｆｆ
及びグリセリン５　０　（ｖ／ｖ）％）に対して透析さ
せる例　　２ 活性の測定 酵素単位の定義：ＭｃｒｌＵは、最終量２５μα中、３
７℃で１時間以内にλ−ＤＮＡ　　ｌｐｇを切断する。 インキュベーション緩衝液（トリスーＨＣＬ５００ｍモ
ル／Ｑ，　ｐｔｔ　７　．５、３７℃、酢酸マグネシウ
ム１００ｍモル／Ｑ１ＮａＣ１　　１モル／ｉ２及びＤ
ＴＥ　　ｌＯｍ−ｔ−ル／ｆｆ）２．５μｌ２の混合物
に、水ｌ７．９μＱ１及びλ一ＤＮＡ　（光学密度＝５
．６　　０Ｄ／ｍ（２）　３．６／７１２及びＭｃｒｌ
−溶液（ｌＵ／μ０／μａを加える。 この溶液を、３７℃で１時間インキユベートし、氷上で
冷却し、尿素７冒モル／１２、サッカロース２　０　　
（ｖ／ｖ）％、ＥＤＴＡ　　ａｏｍモル／ａ及びブロム
フェノールプル一０　．０　１　（ｖ／ｖ）％より戊る
停止試薬（　Ａ　ｂｓｔｏｐｐ　−　Ｒ　ｅａｇｅｎｓ
ｅｓ）　５　ｐ　Ｑを加える。 引続き、ｌ％アガロースゲル中で，ＩＯＯＶ３〜４時間
の電気泳動により分離を実施する。得られるバンドをＤ
ＮＡ一長さ標準と比較することにより同定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、 【ＤＮＡ配列があります】 の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置に関係す
   るII型−制限エンドヌクレアーゼ。 ２、 【ＤＮＡ配列があります】 の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置に関係す
   るII型−制限エンドヌクレアーゼを使用することを特徴
   とする、補足性２本鎖ＤＮＡ−配列： 【ＤＮＡ配列があります】 を認識し、かつ切断する方法。