JPH0213373A - クラス２制限エンドヌクレアーゼ、その製造方法および相補的二重鎖ｄｎａ配列の認識および切断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、クラス■制限エンドヌクレアーゼ、その製造
方法お＝び相補的二＊　９ｆ４　ＤＮＡ配列の認識およ
び切断方法に関する。

従来の技術 クテス■制限エンげヌクレアーゼは、′＃定のＤＮＡ配
列をｇ識し、切断することのできるエンドデソキシリポ
ヌクレアーゼである。この際目標配列における、エフ厳
密に言えばすべてのポリヌクレオチド領におけるホスホ
ジエステル給金が加水分解される。従ってクラス１１　
ｆｌｔｌＪ限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子の分析に
とって重要である。なるほど多数のＤＮＡ配列に明して
特定のクラス■制限エンＶヌクレアーゼがすでに知られ
ているが、それらを入手することはなかなか困難である
ことが多い。多くの場合前記制限酵素がそれから単離さ
れる微生物は培養困難であるかまたは病原的である。ま
ｔ大工業的製造の場合の収量は一般に小さい◇ 制限エンドヌクレアーゼＳａｃ　［［（Ｇｅｎｅ　４７
（１９８６）、１〜１５３］はＳａｃ　Ｉから分離し蛯
い。収量もわずかである。

発明が解決しようとする問題点 従って本発明は、より簡単に、より高い収量で製造する
ことのできるＳａｃ　ｎ　ｉｃ対するアイノシデ、　−
（Ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ　）　７ｊ（使用するとい
う課題を基礎としている。

問題点を解決するための手段 前記課題は本発明により、次のＭ、ｉｔ配列および標識
に１って限定されｔ切断位置： を有するクラス！Ｉ制限エンｒヌクレアーゼによって解
決され、その特徴とするところは該制限エンドヌクレア
ーゼがクルイベラ（Ｋｌｕｙｖｅｒａ　）属の微生物か
ら得られることである。

本発明による新規制限エンドヌクレアーゼ（以下にはＫ
ｓｐ　ｌと記載する）は、約３７℃の最３＠温度を有す
る。該酵素は、λ’ｇＣ１ｚ　１０　ｍｍｏ／＝　／　
／、おＬひＤ！　（ジチオエリトリトール）ｊｍｍｏｔ
／ｌを含むトリｘ　／　ＨＣ／、緩衝液１０ｍｍｏｔ／
　を中でｐ）１７．２〜７．８で優れた活性を有する。

＃ＪＰＨは約７．５であるｏ　Ｋｓｐ　ＩはＳａｃ　ｌ
に対するアイソシ・戸マーである。しかしＳａｃ　［［
は鑑識配列Ｃ’ＣＧＣＧＧの１個のシトシン基における
メチル化に対して感受性があるので、この工５にメチル
化されたＤＮＡ全切断することはできない。これに対し
てＫｓｐ　ｌは前記位置におけるメチル化に対して不感
受性であって、このようにメチル化されたＤＮＡはＫｓ
ｐ　［によって切断される。認識配列は、ウィルスＳＶ
４０：ｂよびアデノ２、ファージλ、ｐｈｉＸ　１１７
４、ファージ誘導体Ｍ１３ｍｐ８おＬびプラスミドＴ）
ＢＲ３２２およびｐＢＲ３２８のＤＮＡの完全な分解に
よって１党することができる。これらのＤＮＡ分子七Ｋ
ａｐｌＶｃ！つて処理する。

畳１ぺ、配列ＣｃＧｃＧｏを認識する酵素に関して、実
験的に観察された切断位置時ん性Ａコンビエーター計算
に１って得られた切断位置時角性との比較をホす。

酵素の認識配列内の切断位置は矢の工５にしてＭ認する
ことができる： ｐｈｉ＞Ｃ１７４ＤＮＡをＡａもＨで線状に切断する。

Ａａｔｌｌ断片を６′末端でターミナルトランスフェラ
ーゼおよび〔α”Ｐ　）　−ｄｄＡＴＰ　”Ｐにより標
識する。Ａｖａ　１７でさらに切断しｔ後、ＡａｔＱ末
端３′で４Ａ歳されている２、２５　Ｋｂ断片を、アが
ロース−ルミ気未動法によって単離し、デルからｊ＃視
する。

この断片のアリコートをＫｓｐ　Ｉで処理するかまたほ
このものに塩基を矯的化学的分解（東国おＬびｆ’）ｉ
ｌｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ印ｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ　６５ｔ１９８０．４９９〜５６０）を施して配列
決定を行う。

断片の分析に、序列ｒルミ気泳動（６６ポリアクリルア
ミー、尿素８　ｒｎｏＬ／’ｔ　）　ｂ工び引続くオー
トラジオグラフィーによって行う。結果の解釈は、ａｎ
ｚｙｒｎｏｌｏｇｙ　６５　＃　１９８０　＋　３９１
〜４０１に記載され九方法に従って行なう。この結果Ｋ
ｓｐ　［は、ｐｈｉＸ　１７４の配列における立置２８
６２（塩ｆｆ対）と２８６３との間で欠の待鴇性： 金もって切断することが判る。従って一般的特異性とし
ては次の切断位置： が得られる。

実験的に測定され九切断位電のａに、配列−ター分析に
よって得られた切断位置の数Ｖ同じである（表１）。さ
らにこれらのデータ金、ＧｅｎｅｔＯ，１９８０，３５
７〜３７０からの表と比較した。

本発明に工ればＫｓｐ　Ｉは、クルイペラ属の微生換金
培養し、同微生物の細胞から該酸素を製出することにぶ
って得られる。ｌ１しくにクルイベラ５ｐｅｃ、　ＤＳ
Ｍ　４４９６を使用する。該酵素の製出の定めには、常
用の生化学的精製法を使用することができ、この際酵素
の存在は、その都度得られる画分においてその認識配列
の切断にエリ容易に横比することができる。基′ｎとし
ては例えばλＤＮＡが適当でちる。得られたＤＮＡ断片
は、断片分離のために用いられる緩衝系中のアがロース
デル中で、エチジウムゾロミドの存在で電気泳動法によ
り分離する。

酵素製出のｔめに使用し九微生物は、メルク（Ｍｅｒｋ
　）標準培地１中で好気的に生育する。

前記微生物はＤＳＭ　（ＤＲＭ　−ＤｅｕｔｓｃｈｏＳ
ａｍｍｌ−ｖａｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ、
　ｆｌｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｆｕｒｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅ　Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　ｍｂＨ＋
　６独Ｉブラウンシユヴアイク市マツシエルオーデル・
ヴエーク１６．３０００在〕で寄託され、寄託番号ＤＳ
Ｍ　４４９６を有する。最適生育条件は３０’Ｃ，Ｐ）
！７．２〜７．８である。倍加時間は約２時間である。

酵素′ｆ：単離し、常用の化学的お工び機械的方法、例
えば高圧分散、起音波壇九に酵素的分解Ｖこ工ってＭＩ
ｌｌする。本発明の好ましい実施態様の場合には細胞を
５バールの過剰圧力に暴露する。この際生じ念細胞物質
を、ゾロテアーゼインヒーターを含有するトリスＨＣ１
緩衝液（出８．０）中で再懸濁する。次に細胞をフレン
チプレス（Ｆｒｅｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓｅ　）により分解
し、ストレプトマイシンスルフェートおヨヒアンモニウ
ムスル７エートで沈殿を行う。さらに上澄みと、好まし
くはアフィニティークロマトグラフィー、モレキュラー
シーズクロマトグラフィーむよびイオン交換クロマトグ
ラフィーにより楕ｊＥＪする。

アフィニティークロマトグラフィー用但体としテハ例、
ｔ　ハヘバリンーセファロースＣＬ−６８（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社）が適当である。適当なモレキュラーシープ
は例えばウルトロｒル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡＣＡ　５
４　（ＬＫＢ社）である。

アニオン交換体としてはＤ　ＥＡＥセファロースファー
スト　フａ−（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　）（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社）の名称下で得られる生成物が適当である。

しかしま次、当業者に周知の他のクロマトグラフィー物
質も適当である。

次に本発明を実権例に１９＃Ｐ述する。

例　　１ クルイベラ５ｐｅｃ、　ＤＳＭ　４４９６を３０’Ｃで
５時間層便し、対数増殖期ｖｋ明お工び定常期に採取す
る。培養基としてはメルク標準培地１を使用する。

細胞ペースト（湿潤重曹３０．Ｆ）を、ゾロテアーゼイ
ンヒーターを含有する緩衝液Ａ（トリｘ−ＨＣｌ４　Ｑ
ｍｍｏｔ／ｌ、　ｐＨ８，Ｑ、’　ｇＤＴＡｏ、１ｍ　
ｍｏｔ／　ｌ　％　　２−メルカプトエタノール７ｍｒ
ｎｏｔ　／　ｔ　）　１．５容中で再＠濁する。久にａ
胞を７し／スゲレスｔ”　２３，０００１ｂ　／　１ｎ
ｃｈ”　テ２１通過させて分解する。次にストレプトマ
イシンスルフェートを加え、沈殿を分離する。次に上澄
みを、３０係お工び６ｏ％（Ｗ／ｖ）のアンモニウムス
ルフェートを加えて処理する。ここで生じ７２１．Ｉ！
を殿を緩衝液Ｂ（トリｘ　−ＨＣｌ４０ｍ　ｍｏｔ／　
ｔ　、　ｐＨ８−０、ＥＤＴＡ　Ｏ，１ｍ　ｍｏｔ／　
ｔ　。

２−メルカプトエタノール７ｒｎｒｎｏｔ／ｌ、　　１
０チ（’／／ｌグリセリン）　１５１１ｊ中で溶かす。

矢に緩衝液Ｂに対する透析後に、緩衝液Ｂ中のＮａＣｌ
　Ｑ、ｉ　ｒｎｏｔ　／　ｌで前洗浄し九ヘパリンーセ
ファロースカラムにエリ分画を施す。溶離のために０〜
Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１のグラジェントを用いる。

Ｋｓｐ　ｌはＮａＣ１Ｏ−３〜０．５　Ｍ中のフラクシ
ョン中に見出される。活性フラクションを８０％アンモ
ニウムスルフェートで処理シ、緩衝液Ｂに対する透析後
の沈殿を、ＮａＣｔＱ、５　ｍ　ｍｏｌ　／　ｔを加え
た緩衝液Ｂで予め平衡しであるウルトロＣル（Ｕｌｔｒ
ｏｇｅｌ　）　ＡＣＡ　５４−カラムにエリ分画する。

活性フラクションを緩衝液Ｂに対して透析する。次に同
フラクションを、緩衝ＭＢで平衡しｆｃＤＥＡ印セファ
ロースファーストフローカラムに供給する。ｆｆｊ′ｍ
のなめには緩衝液Ｂ中のＮａＣ２０〜０．５　ｍｏｔ／
　ｔのグラジェントを用いる。Ｋｓｐ　ｌはＮａＣｔＯ
，１５〜０．３５　Ｍのフラクション中に検出される。

活性フラクションを緩衝ａＳに対して透析し、緩衝液Ｂ
中のＮａＣ１Ｏ−２ｍｏｔ／　ｔで平衡し２　ｐｃ１１
カラムで分画する。溶離のｔめには緩＃液Ｂ中のＮａＣ
１Ｏ，２〜１　ｒｎｏｔ　／　ｌのグラジェントを用り
る。Ｋｓｐ　ｌはＮａＣｔＯ，２５〜０．５　Ｍのフラ
クション中で検出される。活性フラクションを集め、貯
蔵緩衝液（トリス−ＨＣｌ２０　ｍ　ｍｏｔ／　ｔｚ　
ｐＨ８，０；　２−７１　ｈカプトエタノール１゜ｒｎ
　ｍｏｔ／　ｌ　ｂ　ＬびＮａＣ４１００（Ｏｍｏｔ／
　Ａｓ　５０％　（ｖ　／　ｖ　）グリセリン）に対し
て透析する。

例　　２ 活性の測定 酵素単位の定義：　Ｋｓｐ　Ｉ　Ｉ　Ｕは最終容量２５
μを中で６７°Ｃで１時間以内にλＤＮＡ　１μｇを分
解する。

インキュベーション緩衝ａＣトリス−ＨＣｌ８０　ｍ　
ｍｏｔ／　ｌ、　ｐ）１７．５／　３７℃：１１！化マ
グネシウＡ　１　Ｑ　Ｑ　ｍ　ｍｏＡ　／　ｔ　、　Ｎ
ａＣ１５Ｑ　Ｑ　ｍ　ｍｏｔ／ｌお工び２−メルカプト
エタノール１００ｍｍｏｔ／　ｔ　）　２−５１’ｌ　
’ｈ工びＲ８Ａ　（ウシ血清アルブミン）１００μ９／
１の混合物に、水１．５μｔお工ひλＤＮＡ　５μｔ（
光学屑度：４０Ｄ／ＩｎＡ）７にらびにＫｓｐ　Ｉ　Ｍ
液（ｔ　Ｕ／ｌｔｌ　）　１　ａｌｋ加える・この溶液
ｔ−３７℃で１時間インキュベートし、水冷却し、スト
ップ試薬〔尿素７　ｍ　ｍｏｔ／　ｔ　ｘサッカロース
２０　’６　（ｗ　／　ｖ　）、ｖＤＴｐ、　６０　ｍ
０１１０ｔ／　ｌおよびブロムフェノールブルー肌０１
暢（Ｗ／ｖ）より成る〕５μｔを加える。矢に０．８慢
アがロースデル中の電気泳動によって１００ｖで３〜４
時間分離を行う。得られ九バンドをＤＮＡの長さ標準と
の比較にぶり同定する。

］、３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の認識配列および標識によつて特性表示される切
   断位置： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するクラスII制限エンドヌクレアーゼにおいて、該
   酵素が認識配列ＣＣＧＣＧＧの１個のシトシン基におけ
   るメチル化に対して不活性でありかつクルイベラ属の微
   生物から得られることを特徴とする前記のクラスII制限
   エンドヌクレアーゼ。 ２、次の認識配列および標識によつて特性表示される切
   断位置： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するクラスII制限エンドヌクレアーゼを製造するに
   当り、クルイベラ属の微生物を培養し、同微生物の細胞
   から該酵素を製出することを特徴とする前記クラスII制
   限エンドヌクレアーゼの製造方法。 ３、クルイベラ属の微生物から得られる、次の認識配列
   および標識によつて特性表示される切断位置： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するタイプII制限エンドヌクレアーゼを使用するこ
   とを特徴とする相補的二重鎖ＤＮＡ切断 配列５′−ＣＣＧＣＧＧ−３′の認識および方法。