JPH01285187A - クラス２制限エンドヌクレアーゼ及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ａｓｐｌ、それを取得する方法及びその使用に関する。

〔従来の技術〕

「型−制限二ンＶヌクレアーゼは、特定のＤＮＡ−配列
を認識し、切断することのできる二ンｒデソキシリゴヌ
クレアーゼである。この際目的配列中のホスホジエステ
ルブリッジが１しレアーゼは、ＤＮＡ−分子の分析のた
めに重要でか、その入手性は屡々不満足である。多くの
場合に、この制限エンｒヌクレアーゼを単離することの
できる微生物は、培讐困難であるか又は、病原性である
。同様に、大規模製造時の収率は屡々低い。

例えば、制限エンドヌクレアーぜＴ　ｔｈ　１１１１［
Ｇｅｎｅ　４７　（１９８６）　１−１５３　）は、Ｔ
ｔｈ　ｉｉｔ　ｕからの分離が困難であり、収率は低＾
。更に、Ｔ　ｔｈｌｌｌ　１は比較的低い約６５°Ｃの
至適温度を有する欠点を有する。

〔発明の解決しようとする課題〕

従って、本発明の課題は、簡単かつ高収率で製造でき、
できるだけ生理学的＠度における作用至適を有するＴｔ
ｈｌｌｌｌに対するアイソシゾマーを供給することにあ
る。

〔課題を解決する手段〕

この課題は、本発明により、認識配列及び標識化により
規定された切断位置： 解決され、これは、アクロモバクタ−属の微生物から入
手される。

ここで、ＮはＡＸＧ、Ｃ又はＴを表わし、この際、相補
的ＤＮＡ一連鎖中でそれぞれＧはＣと、ＡはＴと対応し
ている。

本発明による新規の制限エンドヌクレアーゼ（これは以
後Ａｓｐｌと称される）は、至適温度的３７°Ｃ１−有
する。この酵素は、−八２〜７．８で、１価のカチオン
の濃度約５０ｍモル／ｌ（ＮａＣｔｉｃ　ｒＪＡして）
で、ＭｇＣｌ２１０　ｍモル／を及びメルカプトエタノ
ール１０ｍモル／を中で良好な活性を有する。この至適
−は約へ５である。ＡｓｐｌはＴ　ｔｈ　１１１１に対
するアイソシゾマーである。

このＲＲ配列は、ウィルス５Ｖ４Ｑ及びアデノ２フアー
ジλ、ｐｈｉｘ　１７４のＤＮＡ　ｓの完全消化によシ
、ファージ誘導体Ｍ　１３　ｍｐ　８及びグラスミドｐ
ＢＲ３２２及びｐＢＲ３２８を確認することができる。

このＤＮＡ−分子はＡ８ｐＩＫ１２１する。

第１表は、配列（）ＡＣ’ＮＮＩ（ＧＴｏ　１に認識す
る酵素に関する実験的に観察され九切断特異性とコンピ
ュータ測定切断位置特異性との比較を示している。

この酵素の認識配列内の切断位置は、次のようにして測
定できるニブラスミドｐＢＲ３２２をＮｄｅｉで線状化
する。このＮｄｓ　ｌ−フラグメントを、５−末端で（
ｒ３２ｐ）　−ＡＴＰ　１１７）使用下１ｃ、Ｔ４−ポ
リヌクレオチド−キナーゼで標識し、３′−末端で末端
トランスフェラーゼ及ヒ〔α３２ｐ〕−ｄｄＡＴＰを用
りて３２ｐで標識する。更に消化の後に、Ｎｄｅ　ｌ−
末端で５′−標識又は３′−標識されている生成フラグ
メントをアがロースデル−電気泳動によシ単帷し、この
ビルから精製する。

このフラグメントの少量をＡｓｐ　ｌで処理し、同時に
、塩基特異性の化学的切断を行なって配列決定する［：
　Ｍａｘａｍ及びＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５．１９８０．４９９〜
５６０〕。

このフラグメントの分析は配列ｒルミ気泳動（６％ポリ
アクリルアミド、尿素８モル／１）及び引続くオートラ
ジオグラフィにより実施する。この結果の解釈はＥｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　６５　、（１９８０）、６９１〜４０
１頁に記載の方法と同様にして実施する。この際Ａｓｐ
ｌは、ベクターｐＢＲ３２２の配列中の２２２２と２２
２３（塩基対）との間の位置で、次の特異性： で切断することが明らかである。

これにより、一般的特異性として、 が明らかである。

切断位置の実験により測定される数は、配列ＧＡＣＮＮ
ＮＣ）ＴＣＫ　５１する稽々のＤＮＡ５でのコンピュー
タ分析によシ得られる切断位置の数と同じである（第１
表）。付加的に、このデータを、Ｇｅｎｅｌｏ、（１９
８０）３５７〜３７０頁の表と比較し九。Ｐｓｔｌ及び
Ａｓｐｌを用いるｐＢＲ３２２ＤＮＡ並びにＰｓｔｌ及
びＡｓｐ　（を甲いるｐＢＲ３２Ｂ　ＤＮＡの二重消化
は、この特異性が（）ＡＣＮＮＮＧＴＣであることを実
証している。

本発明によれば、アクロモバクタ−属の微生物を培養し
、細胞から酵素を取得することによすＡｓｐ　Ｉが得ら
れる。アクロモバクタ−・５ｐｅｃ’ＤＳＭ　４３１８
を使用するのが有利である。取得のためには、通常の生
化学的精製法を使用す゛ることができ、この際、その都
度得られるフラクション中で、その認識配列の切断によ
り酵素の存在を容易に検出することができる。基質とし
ては例えばλ−ＤＮＡが好適である。この得られるＤＮ
Ａ−７ラグメントをフラグメント分離に慣用の緩衝系中
でのアがロースビル中で臭化エチジウムの存在で、電気
泳動により分離させる。

この酵素の取得のために使用される微生物は、ド メルク・スタンダー／Ｉ培地中で好気的に生長する。

アクロモバクタ−５ｐｅｃ・は西ドイツ微生物寄託機関
に寄託番号ＤＡＭ　４３１８として寄託されている。そ
の至適生育条件は、１０〜３０℃、ｐ）１７．２〜７．
８である。２暗化時間は約２時間である。

この酵素を単離し、慣用の化学的及び機械的方法、例え
ば高圧分散、超音波又は酵素的溶解（Ａ１１ｆｓｃｈｌ
ｕｓｓ　）によシ精製する。本発明方法の有利な実施形
では、細胞に５バールの過圧をかける。この場合に生じ
る細胞物質をトリスＨＣ１緩衝液ｐＨ８，０（これはプ
ロテアーゼ−インヒビターを含有する）中に再懸濁させ
る。引続き、細胞をフレンチ−プレス（Ｆｒｅｎ６ｈ−
Ｐｒｅｓｓｅ　）を通して溶解させ、ポリイミン及び硫
酸アンモニウムで沈殿させる。上澄みを更に有利に分子
篩クロマトグラフィ、イオン交換体クロマトグラフィ並
びに親和性クロマトグラフィにより更に精製する。好適
な分子篩の例はウルトロビル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　）　
ＡＣＡ　３４　（ＬＫＢ　）である。

アニオン交換体としては、ＤＥＡＥセファロース・ファ
ースト・フロラ（ＤｇＡＥ　８ｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓ
ｔ　ＦＩＯＷ　；　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）なる名称で
得られる製品が有利である。親和性クロマトグラフィ用
物質としては、例えばヘパリン−セファロースＣＬ　−
６８（Ｈｅｐａｒｉｎ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　−
６Ｂ　；Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）が好適である。しかし
ながら、当業者に公知である他のクロマトグラフィ物質
も好適である。

〔実施例〕

次の実施例につき本発明を詳説する０ 例　　１ アク０モバクター・５ｐｅｃ、　ＤＳＭ　４３１８を３
０℃で２０時間培養し、対数後期もしくは定常期に収穫
する。培養媒体としてメルク・スタンダード培地１　（
Ｍｅｒｃｋ　Ｓｔａｎｄａｒｄｍｅｄｉｕｍ　ｌ　）を
使用する。

細胞ペースト（湿ｉｆ３０ｇ）を３培量の緩衝液Ａ〔ト
リス−ＨＣｌ（ｐ）１８．０　）　４０　ｍモル／ｌ、
　　ｇＤＴＡ　０．１　ｍモル／１１２−メルカプトエ
タノール７ｍモル／ｌ；これはプロテアーゼインヒビタ
ーを含有する〕中に再＠濁させる。引続き、この細胞ｔ
２３０００ｔｂ／インチ２でフレンチ・プレス（Ｆｒｅ
ｎｃｈ−Ｐｒｅｓｓｅ　）に２回通すことにより溶解さ
せる。引続き、ボリミン（Ｐｏｌｙｍｉｎ　）　Ｐを添
加し、沈殿を分離する。引続き、上澄みを５０（Ｗ／ｖ
）憾硫酸アンモニウムの添加により処理する。この際に
生じる沈殿を、緩衝液Ｂ〔トリス−Ｈｃｚ　（ｐＨ８，
０）　４０ｍモル／　ｔ、　　ＥＤＴＡ　０．１　ｍモ
ル／１１２−メルカプトエタノール７ｍモル／ｌ、　１
０　（Ｖ／Ｖ）優グリセリン〕１５Ｎ中に溶かす。引続
き、緩衝液Ｂに対する迅析の後に、ヘパリン−サッカロ
ース２ルーカラムで分別する。溶離のためにＮａＣ２Ｑ
〜１Ｍの勾配溶液を用いる。ＡｓｐｌはＮａＣｔＯ，２
〜０．６Ｍの間のフラクション中に認められる。この活
性フラクションを９０係硫酸アンモニウムで処理し、沈
殿を緩衝液Ｂに対する透析の後に、ＮａＣｌ　Ｑ、５　
ｍモル／ｌが添加される緩衝液Ｂで予め平衡化されてゐ
るウルトロｒ　ル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　）　ＡｃＡ　３
４−カラムで分別する。活性フラクションを緩衝液Ｂに
対して透析させる。引続きこれ金、ＤＥＡＥセファロー
ス・ファスト・フロラ−カラム（これは緩衝ｒＬＢで平
衡化された）上に与える。溶離のために、緩衝液Ｂ中の
ＮａＣｔＱ　〜ｊ　、Ｑ　ｍモル／ｌの勾配溶液を使用
する。

フラクションの活性フラクションを集め、ラーが一緩衝
液（Ｔ、ａｇｅｒｐｕｆｆｅｒ　：　）リス−ＨＣｔｐ
Ｈ８−０２０ｍモル／１１２−メルカプトエタノール１
０ｍモル／を及びＮａＣ２１００’Ｌｌ　／　’　％グ
リセリン５０　（ｖ／ｖ　）　％　）に対して透析させ
る。

例　　２ 活性の測定 μを中のλ−ＤＮＡ、　１μｇを３７℃で１時間以内に
分解する。

インキュベーション緩衝液〔トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，
５／３７°Ｃ）８０ｍモル／４．塩化マグネシウム１０
０ｍモル／　Ｚ　％　ＮａＣｌ５００　ｍ　モ１’ｌｔ
＆び２−メルカプトエタノール１００ｍモル／　ｔ　］
　２．５μを及びＲ８Ａ　（牛血清アルデミ７）１００
μｇ／ｍｔの混合物に、水１．５μを及びλ・ＤＮＡ（
光学密度：　４　ｏＤ／ｍ／）　５　μを並びにＡｓｐ
　Ｉ−溶液（１Ｕ／μｔ）１μｔを加える。この溶液ｔ
−３７℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却し、ア
ブストップ−試薬（Ａｂｓｔｏｐｐ−Ｒｅａｇｅｎｓｅ
ｓ　：尿素７ｍモＡ／　／　４　、サッカロース２０　
（Ｖ／Ｖ　）％、ＥＤＴＡ　６０　ｍモル／を及びブロ
ムフェノールブルー０．０１　（Ｖ／Ｖ　）％よりなる
）５μｔを加える。引続き、アがロースデル０．８％中
での電気泳動による分離？１００Ｖで３〜４時間で実施
する。得られるバンドをＤＮＡ　−７ンデンスタンダー
ド（ＤＮＡ−ＬＫｎｇｅｎｓｔａｎ−ｄａｒｄ　）との
比較にｘ＃）同定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、認識配列及び標識化により特徴付けられた切断位置
   ： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するクラスII制限エンドヌクレアーゼにおいて、こ
   れは、約３７℃の至適温度を有し、アクロモバクター属
   の微生物から入手されるものであることを特徴とするク
   ラスII制限エンドヌクレアーゼ。 ２、認識配列及び標識化により特徴付けられた切断位置
   ： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する制限エンドヌクレアーゼを取得するために、ア
   クロモバクター属の微生物を培養し、この細胞から酵素
   を取得することを特徴とする制限エンドヌクレーアーゼ
   の取得法。３、アクロモバクター属の微生物から得られ
   、認識配列及び標識化により特性付けられた切断位置： ▲数式、化学式、表等があります▼ を有するクラスII制限エンドヌクレアーゼを使用するこ
   とを特徴とする、相補的二本鎖ＤＮＡ−配列 ５′−ＧＡＣＮＮＮＧＴＣ−３′ を認識しかつ切断する方法。