JPH03172178A - ２型―制限エンドヌクレアーゼＳｇｒＡＩ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規の■型制限エンドヌクレアーゼＳｇｒＡＩ
，これを得る方法及びその使用に関する。

［従来の技術１ ■型制限エンドヌクレアーゼは、特定のＤＮ八一配列を
認識し、切断することのできるエンドデソキシリポヌク
レアーゼである。この際、目的配列中のホスホジエステ
ル橋が、しかも各ポリヌクレオチド鎖中で加水分解され
なる。従って、■型制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ
一分子の分析にとって重要である。多くのＤＮ八一配列
に対して特異的な■型制限工冫ドヌクレアーゼは既に公
知であるが、なお、ＤＮＡ−配列に対して特異的であり
、従来、公知の制限エンドヌクレアーゼのいずれによっ
ても認識されない、他の■型制限エンドヌクレアーゼを
提供することが必要になっている。

［発明が解決しようとする課題１ 従って、本発明は、従来は、この種のいずれの酵素によ
っても認識されなかった配列を特異的に認識しかつ切断
することのできる新規の制限エンドヌクレアーゼを提供
することを課題としている。

［課題を解決するための手段１ この課題は、本発明により、次の認識配列及び標識によ
り定義された切断位置： ？関係する■型制限エンドヌクレアーゼにより解決され
る。

本発明による新規制限エンドヌクレアーゼ（以後Ｓｇｒ
ＡＩと称する）は、３７℃に至適温度を有する。この酵
素は、ｐＨ７．５〜８．５で、ＤＴＥ　（ジチオスレイ
トール）１　．０重モル／Ｑ，ＭｇＣｌｌＯ＋ｍモル／
Ｑ及び酢酸カリウム６６＋ｗモル／Ｑを含有するトリス
ー酢酸一緩衝液３３＋ｍモル／Ｑ中で良好な活性を有す
る。至適９Ｈは約ｐＨ７．９である。ＳｐｒＡＩに対す
るアイソシゾマー（　ｌ　ｓ■ｓ（：ｈｉｚｏｍｅｒ）
である酵素は知られていない。

その認識配列は、のＤＮＡウイルスＳＶ４　０及びアデ
ノ２、ファージラムダ、ｐｈｉＸ　ｌ　１　７　４及び
ファージ誘導体Ｍｌ３ｍｐ８及びブラスミドｐＢＲ３２
２及びｐＢＲ３２８の完全消化により確認できる。これ
らのＤＮＡ分子をＳｇｒＡＩで処理する。

第ｌ表に、次の配列： を認識する酵素に関する、実験的に観察された切断位置
特異性とコンピュータで測定された切断位置特異性とを
比較して示す。

この酵素の認識配列内の切断位置は、ユニバーサルな配
列決定プライマー（　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ　．等のＮｕ
ｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　９　　３　０　９〜３
　２　１）の結合位置に対して約３０〜２００塩基の距
離にこの認識配列を有するＭ１３一誘導体で測定できる
。Ｍｌ３一誘導体の１本鎖ＤＮＳで、まずユニバーサル
な配列決定プライマーを用いてジデソキシ連鎖中断法に
よる配列決定反応を実施する（　Ｓ　ａｎｇｅｒ　Ｆ　
．等による（１９７７）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃ
ａｄ．　Ｓｃｉ．Ｕ　Ｓ　Ａ　７　４　％５６０−５６
４、Ｍ　ｅｓｓｉｎｇ．　Ｊ　．等による（１９８　１
）　、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．９、３　０　
９＝３　２ｌ）。

これと並行して、配列決定プライマーをＴ４−ポリヌク
レオチドーキナーゼ及び【γ−３２′］ＡＴＰを用いて
、５′一末端の所で放射能標識付けをする。この５′一
末端標識付けされた配列決定ブライマーの１本１’ｌＭ
１３−ＤＮＳへのハイブリド結合の後に、ＤＮＳポリメ
ラーゼ！（クレノフ酵素）及びｄＡＴＰ％ｄＣＴＰ，ｄ
ＧＴＰ及びｄＴＴＰからのデソキシヌクレオチドホス７
　エ−　ト５９合物での挿入反応で、部分的２本鎖ＤＮ
Ｓを製造する。新規に合威された鎖の５′一末端の所で
放射能標識されているこのＤＮＳヲ制限エンドヌクレア
ーゼＳｇｒＡＩで切断するこの切断バッチの半分を、付
加的に、なお、平滑ＤＮＳ一末端を得るために、全ての
４種のデソキシヌクレオチドホスフエートの混合物の存
在でＴ４ＤＮＳポリメラーゼで処理する。

反応生戒物の分析を、配列決定ゲル（尿素８モル／Ｑ，
ポリアクリルアミド５％）上での電気泳動疎び引続くオ
ートラジオグラフィにより行なう。結果の解析は、ブラ
ウン（　Ｂ　ｒｏｗｎ）　Ｎ　＋Ｌ．及びスミス（　　
Ｓｍｉｔｈ　）　Ｍ．にょる方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６　５、（１９８０）３９
１〜４０１）で実施する。放射能標識された７ラグメン
トの移動距離と配列リーダー（Ｓ　ｅｑｕｅｎｚｌｅｉ
ｔｅｒ）との比較により、切断位置を決定する。付加的
に７４ＤＮＳポリメラーゼで処理された試料は、単にＳ
ｇｒＡＩで切断された試料と比べて４ｂｐだけ短かいバ
ンドの移動距離を示す。従って、ＳｇｒＡＩは、４　ｂ
ｐだけ５′一突出しているＤＮＳ一末端を生じることが
明らかである。従って、ＳｇｒＡＩでの切断は、次の特
異性： を有する認識配列内で行なわれる。

実験的に測定された切断位置の数は、配列：に関する種
々のＤＮＳを用いてコンピュータ分析により得られた切
断位置の数と同じである（第１表参照）。付加的にこれ
らのデータを、Ｇｅｎ１０　（１９８０）３５７〜３７
０に記載の表と比較した。

有利に、ＳｇｒＡＩは、ストレプトマイセス属の微生物
を培養し、その細胞から酵素を取得する方法で得られる
。ストレプトマイセス・グリセウス（　Ｓ　ｔｒｅｐｔ
ｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ）　Ｄ　Ｓ　Ｍ　５　６　
２ｌを使用するのが有利である。

この微生物ストレプトマイセス・グリセウスは、Ｄ　Ｓ
　Ｍ　（　Ｄ　ｅｕｔｓｃｈｅｎ　Ｓ　ａｍｍｌｕｎｇ
　ｖｏｎ　Ｍ　ｉｋｒ−ｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　％Ｍ
ａｎｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗａｇ　ｌ　ｂ　ｓ　３３　
０　０　Ｂ　ｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ　，　Ｂ　Ｒ　Ｄ
　）に寄託されており、ＤＳＭ５６２１の寄託番号を有
する。

その取得のために、慣用の生物学的精製法が使用され、
この際、その都度に得られる７ラクションで、その認識
配列の切断により、この酵素の存在を容易に立証するこ
とができる。基質としては、例えばλ−ＤＮＡが好適で
ある。得られるＤＮＡ−７ラグメントは、７ラグメント
分離のために慣用の緩衝剤系中でのアガロースゲルで、
臭化エチジウムの存在下に電気泳動により分離されうる
。

この酵素の取得のために使用される微生物は、好気的に
、Ｍｌｌｌ一培地（イーストエキス１０９／４２＋麦芽
エキス１０ｇ／１２）中で生長する至適生長条件は、２
６°Ｏ，ｐＨ６．５〜７．５である。２倍化時間は約２
．５時間である。

この酵素を、慣用の化学的及び機械的方法例えば高圧分
散、超音波又は酵素的崩壊法により単離しかつ精製する
。本発明方法の有利なｌ実施形では、細胞をフレンチプ
レス（　Ｆ　ｒｅｎｃｈ　−Ｐ　ｒｅｓｓｅ）により崩
壊させる。上澄みを更に精製することは、有利に７７イ
ニテイクロマトグラフィ及びイオン交換体クロマトグラ
フィにより実施されうる。ア７イニテイクロマトグラフ
ィ用材料としては、例えばヘパリンーセファロースＣ　
Ｌ　−　５　Ｂ　（Ｈ　ｅｐａｒｉｎ　−　Ｓ　ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　Ｃ　Ｌ　−　６Ｂ　；　Ｐ　ｈａｒＩＩａ
ｃｉａ）が好適である。好適なカチオン交換体は例えば
ホスホーセルロース（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｃｅｌｌｕｌｏ
ｓｅ　　；　ＷｈａＬｗ＋ａｎ）である●アニオン交換
体としては、ＤＥＡＥセファセｌレ（　Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ
　　Ｓ　ｅｐｈａｃｅｌＨＰ　ｈａｒｍａｃｉａ　）な
る名称で入手される製品が好適である。しかしながら、
当業者に公知の他のクロマトグラ７イ材料も好適である
。

［実施例］ 次の例で本発明を詳述する。

例　　ｌ ストレプトマイセス・グリセウスＤＳＭ５６２ｌを２５
℃で５時間培養し、対数期に収穫する。培養媒体として
Ｍｉｌｌ一培地を使用する細胞ペースト（湿重量３０ｇ
）を、プロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液Ａ（１−リ
スーＨＣＬ４０麓モル／ａ、ｐ　Ｈ　８　．０、ＥＤＴ
Ａ　Ｏ．１モル／Ｑ１２−メルカプトエタノール７ｍモ
ル／０２．４容量中に再懸濁させる。引続き、この細胞
を２３０００ｌｂ／ｉｎ２で７レンチプｔ，　スｉ．：
　２　回通すことにより崩壊させ、沈殿を分離させる。

上澄みにＮＨ４Ｃｌを加え（最終濃度１．３モル／０、
ボリミン沈殿法を用いて核酸を除去する。

引続き、遠心分雌された上澄みを５５％硫酸アンモニウ
ムで処理し、沈殿をヘパリンーセファロースー力ラムを
通して分別する。溶離のためにＮａＣＩＯ〜１モル／１
２の勾配溶液を使用する．ＳｇｒＡｒは、ＮａＣ　Ｉ　
０　．４　−　０　．６モル／Ｑの間のフラクション中
に認められる。この活性フラクンヨンを緩衝液Ｂ（トリ
スーＨＣＬ　　４０ｍモル／Ｑ，ｐＨ８．０１ＥＤＴＡ
　　Ｏ．ｌｍモル／１２、２−メルカプトエタノール７
１ｍモル／Ｑ１　グリセリンＩ　Ｏ　（ｖ／ｖ）％）に
対して平衡化させ、ＤＥＡＥ−セ７アセルカラム上で分
別させる。溶離のためにＮａＣＩＯ〜０．５モル／Ｑの
勾配溶液を用いる。活性フラクションを緩衝剤液Ｂに対
して透析させる。

引続き、これを、緩衝液Ｂで平衡化されたホスホーセル
ロース（　Ｐ　ｈｏｓｐｈｏ　−　Ｃ　ｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ）　−カラム上に装入する。溶離のために、緩衝液Ｂ
中のＮａＣＩＯ〜１モル／Ｑの勾配溶液を用いるＳｇｒ
ＡＩはＮａＣＩ　０．３〜０．５モル／１２の間のフラ
クション中に認められる。

活性フラクシａンを一緒に、貯蔵緩衝液（Ｌａ−？ｅｒ
ｐｕｆＩｅｒ　：　　｝リスーＨＣＬ　　２０ｇ＋モル
／ＱｓｐＨ８．０、２−メノレカプトエタノーノレｌ■
ｗモル／（１，　　ＮａＣｌ　　ｌ　０　０萬モル／Ｑ
ＳＥＤＴＡ　　０．１＋ｍモル／Ｑ及びグリセリン５　
０　（ｖ／ｖ）％）に対して透析させる。

例　　２ 活性の測定 酵素単位の定義：ＳｇｒＡＩＵは、ラムダＤＮＡ１μ９
を最終量２５μα中、３７℃で１時間以内に切断する。

インキュベーション緩衝液（トリスーＨＣＬ１　０　０
ｍモ４／１２，　ｐＨ　７　．５、３７゜ｃ１塩化マグ
ネシウムｌ００ＩＩモル／ａ及びＤＴＥ　　ｌＯ＋ｗモ
ル／１２）２．５μＱの混合物に、水ｌ７．９μＱ１ラ
ムダＤＮＡ　（光学密度：　５．６０Ｄ／Ｉｔ（２）３
．６／７Ｑ並びにＳｐｒＡＩ一溶液ＣＬＵ／ｐ（１’）
／ｐＱを加える。この溶液を３７℃で１時間インキユベ
ートし、氷上で冷却し、尿素７Ｎモル／Ｑ，サッヵロー
ス２　０　（ｖ／ｖ）％、ＥＤＴＡ　　６０＋モル／Ｑ
及びプロムフェノールブルー０　．０　１　（ｖ／ｖ）
％より或る停止試薬（　Ａ　ｂｓｔｏｐｐ　−　Ｒ　ｅ
ａｇｅｎｓｅｓ）　５μＱを加える。引続き、１％アガ
ロースゲル中、１００ｖで３〜４時間の電気泳動により
、分離を実施する。得られるバンドをＤＮＡ一長さ標準
との比較により同定する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、 【ＤＮＡ配列があります】 の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置に関係す
   るII型−制限エンドヌクレアーゼ。 ２、 【ＤＮＡ配列があります】 の認識配列及び標識で特徴付けられた切断位置に関係す
   るII型−制限エンドヌクレアーゼを使用することを特徴
   とする、補足性二本鎖ＤＮＡ−配列： 【ＤＮＡ配列があります】 を認識し、かつ切断する方法。