JPH0422554B2 - - Google Patents
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- JPH0422554B2 JPH0422554B2 JP1081667A JP8166789A JPH0422554B2 JP H0422554 B2 JPH0422554 B2 JP H0422554B2 JP 1081667 A JP1081667 A JP 1081667A JP 8166789 A JP8166789 A JP 8166789A JP H0422554 B2 JPH0422554 B2 JP H0422554B2
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- restriction endonuclease
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、クラス制限エンドヌクレアーゼ
Asp、それを取得する方法及びその使用に関す
る。 〔従来の技術〕 型−制限エンドヌクレアーゼは、特定の
DNA−配列を認識し、切断することのできるエ
ンドデソキシリボヌクレアーゼである。この際、
目的配列中のホスホジエステルブリツジが、しか
も各々のポリヌクレオチド連鎖中で１個が加水分
解される。従つて、クラス制限エンドヌクレア
ーゼは、DNA−分子の分析のために重要である。
既に、多くのDNA−配列に関して特異的なクラ
ス制限エンドヌクレアーゼは公知であるが、そ
の入手性は屡々不満足である。多くの場合に、こ
の制限エンドヌクレアーゼを単離することのでき
る微生物は、培養困難であるか又は、病原性であ
る。同様に、大規模製造時の収率は屡々低い。 例えば、制限エンドヌクレアーゼＴ th 111
〔Gene 47（1986）１−153〕は、Ｔ th111
からの分離が困難であり、収率は低い。更
に、Ｔ th 111 は比較的低い約65℃の至適温
度を有する欠点を有する。 〔発明の解決しようとする課題〕 従つて、本発明の課題は、簡単かつ高収率で製
造でき、できるだけ生理学的温度における作用至
適を有するＴ th 111 に対するアイソシゾマ
ーを供給することにある。 〔課題を解決する手段〕 この課題は、本発明により、認識配列及び標識
により規定された切断位置： を有するクラス制限エンドヌクレアーゼにより
解決され、これは、アクロモバクター属の微生物
から入手される。 ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表わし、この
際、相補的DNA−連鎖中でそれぞれＧはＣと、
ＡはＴと対応している。 本発明による新規の制限エンドヌクレアーゼ
（これは以後Aspと称される）は、至適温度約
37℃を有する。この酵素は、PH7.2〜7.8で、１価
のカチオンの濃度約50ｍモル／（NaClに関し
て）で、MgCl210ｍモル／及びメルカプトエタ
ノール10ｍモル／中で良好な活性を有する。こ
の至適PHは約7.5である。AspはＴ th 111
に対するアイソシゾマーである。 この認識配列は、ウイルスSV40及びアデノ２、
フアージλ、phiX174のDNAsの完全消化によ
り、フアー誘導体M13mp8及びブラスミド
pBR322及びpBR328を確認することができる。
このDNA−分子をAspで処理する。 第１表は、配列GACNNNGTCを認識する酵
素に関する実験的に観察された切断特異性とコン
ピユータ測定切断位置特異性との比較を示してい
る。
Asp、それを取得する方法及びその使用に関す
る。 〔従来の技術〕 型−制限エンドヌクレアーゼは、特定の
DNA−配列を認識し、切断することのできるエ
ンドデソキシリボヌクレアーゼである。この際、
目的配列中のホスホジエステルブリツジが、しか
も各々のポリヌクレオチド連鎖中で１個が加水分
解される。従つて、クラス制限エンドヌクレア
ーゼは、DNA−分子の分析のために重要である。
既に、多くのDNA−配列に関して特異的なクラ
ス制限エンドヌクレアーゼは公知であるが、そ
の入手性は屡々不満足である。多くの場合に、こ
の制限エンドヌクレアーゼを単離することのでき
る微生物は、培養困難であるか又は、病原性であ
る。同様に、大規模製造時の収率は屡々低い。 例えば、制限エンドヌクレアーゼＴ th 111
〔Gene 47（1986）１−153〕は、Ｔ th111
からの分離が困難であり、収率は低い。更
に、Ｔ th 111 は比較的低い約65℃の至適温
度を有する欠点を有する。 〔発明の解決しようとする課題〕 従つて、本発明の課題は、簡単かつ高収率で製
造でき、できるだけ生理学的温度における作用至
適を有するＴ th 111 に対するアイソシゾマ
ーを供給することにある。 〔課題を解決する手段〕 この課題は、本発明により、認識配列及び標識
により規定された切断位置： を有するクラス制限エンドヌクレアーゼにより
解決され、これは、アクロモバクター属の微生物
から入手される。 ここで、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表わし、この
際、相補的DNA−連鎖中でそれぞれＧはＣと、
ＡはＴと対応している。 本発明による新規の制限エンドヌクレアーゼ
（これは以後Aspと称される）は、至適温度約
37℃を有する。この酵素は、PH7.2〜7.8で、１価
のカチオンの濃度約50ｍモル／（NaClに関し
て）で、MgCl210ｍモル／及びメルカプトエタ
ノール10ｍモル／中で良好な活性を有する。こ
の至適PHは約7.5である。AspはＴ th 111
に対するアイソシゾマーである。 この認識配列は、ウイルスSV40及びアデノ２、
フアージλ、phiX174のDNAsの完全消化によ
り、フアー誘導体M13mp8及びブラスミド
pBR322及びpBR328を確認することができる。
このDNA−分子をAspで処理する。 第１表は、配列GACNNNGTCを認識する酵
素に関する実験的に観察された切断特異性とコン
ピユータ測定切断位置特異性との比較を示してい
る。
次の実施例につき本発明を詳説する。
例 １
アクロモバクター・Spec.DSM4318を30℃で20
時間培養し、対数後期もしくは定常期に収獲す
る。培養媒体としてメルク・スタンダード培地
（Merck Standardmedium ）を使用する。 細胞ペースト（湿重量30ｇ）を３培量の緩衝液
Ａ〔トリス−HCl（PH8.0）40ｍモル／、
EDTA0.1ｍモル／、２−メルカプトエタノー
ル７ｍモル／；これはプロテアーゼインヒビタ
ーを含有する〕中に再懸濁させる。引続き、この
細胞23000lb／インチ2でフレンチ・プレス
（French−Presse）に２回通すことにより溶解さ
せる。引続き、ポリミン（Polymin）Ｐを添加
し、沈殿を分離する。引続き、上澄みを50（ｗ／
ｖ）％硫酸アンモニウムの添加により処理する。
この際に生じる沈殿を、緩衝液Ｂ〔トリス−HCl
（PH8.0）40ｍモル／、EDTA0.1ｍモル／、
２−メルカプトエタノール７ｍモル／、10
（ｖ／ｖ）％グリセリン〕15ml中に溶かす。引続
き、緩衝液Ｂに対する透析の後に、ヘパリン−サ
ツカロースゲル−カラムで分別する。溶離のため
にNaCl0〜1Mの勾配溶液を用いる。Aspは
NaCl0.2〜0.3Mの間のフラクシヨン中に認められ
る。この活性フラクシヨンを90％硫酸アンモニウ
ムで処理し、沈殿を緩衝液Ｂに対する透析の後
に、NaCl0.5ｍモル／が添加される緩衝液Ｂで
予め平衡化されているウルトロゲル（Ultrogel）
AcA34−カラムで分別する。活性フラクシヨン
を緩衝液Ｂに対して透析させる。引続きこれを、
DEAEセフアロース・フアスト・フロウーカラム
（これは緩衝液Ｂで平衡化された）上に与える。
溶離のために、緩衝液Ｂ中のNaCl0〜1.0ｍモ
ル／の勾配溶液を使用する。 フラクシヨンの活性フラクシヨンを集め、ラー
ガー緩衝液（Lagerpuffer：トリス−HClPH8.0
20ｍモル／、２−メルカプトエタノール10ｍモ
ル／及びNaCl100ｍモル／、グリセリン50
（ｖ／ｖ）％）に対して透析させる。 例 ２ 活性の測定 酵素単位の定義：Asp1Uは、最終量25μ中の
λ−DNA.1μｇを37℃で１時間以内に分解す
る。 インキユベーシヨン緩衝液〔トリス−HCl（PH
7.5／37℃）80ｍモル／、塩化マグネシウム100
ｍモル／、NaCl500ｍモル／及び２−メルカ
プトエタノール100ｍモル／〕2.5μ及びRSA
（牛血清アルブミン）100μｇ／mlの混合物に、水
1.5μ及びλ・DNA（光学密度：40D／ml）5μ
並びにAsp−溶液（1U／μ）1μを加える。
この溶液を37℃で１時間インキユベートし、氷上
で冷却し、アブストツプ−試薬（Abstopp−
Reagenses：尿素７ｍモル／、サツカロース20
（ｖ／ｖ）％、EDTA60ｍモル／及びブロムフ
エノールブルー0.01（ｖ／ｖ）％よりなる）5μ
を加える。引続き、アガロースゲル0.8％中での
電気泳動による分離を100Vで３〜４時間で実施
する。得られるバンドをDNA−レンゲンスタン
ダード（DNA−La¨ngenstandard）との比較によ
り同定する。
時間培養し、対数後期もしくは定常期に収獲す
る。培養媒体としてメルク・スタンダード培地
（Merck Standardmedium ）を使用する。 細胞ペースト（湿重量30ｇ）を３培量の緩衝液
Ａ〔トリス−HCl（PH8.0）40ｍモル／、
EDTA0.1ｍモル／、２−メルカプトエタノー
ル７ｍモル／；これはプロテアーゼインヒビタ
ーを含有する〕中に再懸濁させる。引続き、この
細胞23000lb／インチ2でフレンチ・プレス
（French−Presse）に２回通すことにより溶解さ
せる。引続き、ポリミン（Polymin）Ｐを添加
し、沈殿を分離する。引続き、上澄みを50（ｗ／
ｖ）％硫酸アンモニウムの添加により処理する。
この際に生じる沈殿を、緩衝液Ｂ〔トリス−HCl
（PH8.0）40ｍモル／、EDTA0.1ｍモル／、
２−メルカプトエタノール７ｍモル／、10
（ｖ／ｖ）％グリセリン〕15ml中に溶かす。引続
き、緩衝液Ｂに対する透析の後に、ヘパリン−サ
ツカロースゲル−カラムで分別する。溶離のため
にNaCl0〜1Mの勾配溶液を用いる。Aspは
NaCl0.2〜0.3Mの間のフラクシヨン中に認められ
る。この活性フラクシヨンを90％硫酸アンモニウ
ムで処理し、沈殿を緩衝液Ｂに対する透析の後
に、NaCl0.5ｍモル／が添加される緩衝液Ｂで
予め平衡化されているウルトロゲル（Ultrogel）
AcA34−カラムで分別する。活性フラクシヨン
を緩衝液Ｂに対して透析させる。引続きこれを、
DEAEセフアロース・フアスト・フロウーカラム
（これは緩衝液Ｂで平衡化された）上に与える。
溶離のために、緩衝液Ｂ中のNaCl0〜1.0ｍモ
ル／の勾配溶液を使用する。 フラクシヨンの活性フラクシヨンを集め、ラー
ガー緩衝液（Lagerpuffer：トリス−HClPH8.0
20ｍモル／、２−メルカプトエタノール10ｍモ
ル／及びNaCl100ｍモル／、グリセリン50
（ｖ／ｖ）％）に対して透析させる。 例 ２ 活性の測定 酵素単位の定義：Asp1Uは、最終量25μ中の
λ−DNA.1μｇを37℃で１時間以内に分解す
る。 インキユベーシヨン緩衝液〔トリス−HCl（PH
7.5／37℃）80ｍモル／、塩化マグネシウム100
ｍモル／、NaCl500ｍモル／及び２−メルカ
プトエタノール100ｍモル／〕2.5μ及びRSA
（牛血清アルブミン）100μｇ／mlの混合物に、水
1.5μ及びλ・DNA（光学密度：40D／ml）5μ
並びにAsp−溶液（1U／μ）1μを加える。
この溶液を37℃で１時間インキユベートし、氷上
で冷却し、アブストツプ−試薬（Abstopp−
Reagenses：尿素７ｍモル／、サツカロース20
（ｖ／ｖ）％、EDTA60ｍモル／及びブロムフ
エノールブルー0.01（ｖ／ｖ）％よりなる）5μ
を加える。引続き、アガロースゲル0.8％中での
電気泳動による分離を100Vで３〜４時間で実施
する。得られるバンドをDNA−レンゲンスタン
ダード（DNA−La¨ngenstandard）との比較によ
り同定する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 認識配列および標識により特徴付けられた切
断位置： を有するクラス−制限エンドヌクレアーゼにお
いて、これは、約37℃の至適温度及び至適PH範囲
7.2〜7.8を有し、アクロモバクター属の微生物か
ら入手されるものであることを特徴とする、クラ
スエンドヌクレアーゼ。 ２ 認識配列および標識により特徴付けられた切
断位置： を有する制限エンドヌクレアーゼを取得するため
に、アクロモバクター属の微生物を培養し、この
細胞から酵素を取得することを特徴とする、制限
エンドヌクレアーゼの製法。 ３ アクロモバクター属の微生物から得られ、認
識配列および標識により特性付けられた切断位
置： を有するクラス制限エンドヌクレアーゼを使用
することを特徴とする、相補的二本鎖DNA−配
列 5′−GACNNNGTC−3′ を認識しかつ切断する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3811279.5 | 1988-04-02 | ||
| DE19883811279 DE3811279A1 (de) | 1988-04-02 | 1988-04-02 | Typ ii-restriktionsendonuklease aspi |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01285187A JPH01285187A (ja) | 1989-11-16 |
| JPH0422554B2 true JPH0422554B2 (ja) | 1992-04-17 |
Family
ID=6351328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1081667A Granted JPH01285187A (ja) | 1988-04-02 | 1989-04-03 | クラス２制限エンドヌクレアーゼ及びその製法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0336285A3 (ja) |
| JP (1) | JPH01285187A (ja) |
| DE (1) | DE3811279A1 (ja) |
-
1988
- 1988-04-02 DE DE19883811279 patent/DE3811279A1/de active Granted
-
1989
- 1989-03-30 EP EP19890105581 patent/EP0336285A3/de not_active Withdrawn
- 1989-04-03 JP JP1081667A patent/JPH01285187A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3811279A1 (de) | 1989-10-12 |
| EP0336285A3 (de) | 1990-10-10 |
| JPH01285187A (ja) | 1989-11-16 |
| EP0336285A2 (de) | 1989-10-11 |
| DE3811279C2 (ja) | 1990-03-01 |
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