JPS6140789A - 新規制限酵素及びその製造方法 - Google Patents
新規制限酵素及びその製造方法Info
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- JPS6140789A JPS6140789A JP16160984A JP16160984A JPS6140789A JP S6140789 A JPS6140789 A JP S6140789A JP 16160984 A JP16160984 A JP 16160984A JP 16160984 A JP16160984 A JP 16160984A JP S6140789 A JPS6140789 A JP S6140789A
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- JP
- Japan
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- restriction enzyme
- dna
- spli
- spirulina
- enzyme
- Prior art date
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Organic Chemistry (AREA)
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- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な制限酵素ＳｐＱ Ｉ及びその製造法に関
するものである。
するものである。
一般に、制限酵素は２本鎖デオキシリボ核酸（以下、ｒ
ＤＮＡＪと略称する）中のある特定の数個の塩基配列を
認識してＤＮＡ鎖を切断するＤＮＡ分解酵素である。こ
の酵素はその酵素活性により長いＤＮＡ分子の特定部位
を切断出来、それによって得られるＤＮＡ断片の分離、
塩基配列の決定等のＤＮＡの溝造と機能の解析に有用で
ある。
ＤＮＡＪと略称する）中のある特定の数個の塩基配列を
認識してＤＮＡ鎖を切断するＤＮＡ分解酵素である。こ
の酵素はその酵素活性により長いＤＮＡ分子の特定部位
を切断出来、それによって得られるＤＮＡ断片の分離、
塩基配列の決定等のＤＮＡの溝造と機能の解析に有用で
ある。
さらに今後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子工学
のための試薬として不可欠のものである。
のための試薬として不可欠のものである。
本発明者らは、このように実用性に富む重要な生化学試
薬としての制限酵素を、いまだ検束が不一十分であった
藻類について研究を行ったところ、スピルリナ属に屈す
る藻類がＤＮＡを特異的に切断する従来未知の制限酵素
ＳｐρＩを生産していることを見い出し本発明を完成す
るに至った。
薬としての制限酵素を、いまだ検束が不一十分であった
藻類について研究を行ったところ、スピルリナ属に屈す
る藻類がＤＮＡを特異的に切断する従来未知の制限酵素
ＳｐρＩを生産していることを見い出し本発明を完成す
るに至った。
すなわち、本発明は新規制限酵素ｓｐａ Ｉ及びその製
造方法−に関するものである。
造方法−に関するものである。
本発明の制限酵素５ｐ１２１の切断部位の決定にはφＸ
１７４ ＲＦ ＤＮＡ （全酒造製品）を本酵素及び
性質の良く知られた制限酵素で二重消化する方法により
φＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡ上の切断点を求めた。その
結果。
１７４ ＲＦ ＤＮＡ （全酒造製品）を本酵素及び
性質の良く知られた制限酵素で二重消化する方法により
φＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡ上の切断点を求めた。その
結果。
Ｐｓｔ Ｉ切断点を０番とする番地付けで、４３０±２
０番と２８１０±２０番に本酵素の切断点があると結論
された。同様の実験をλＤＮＡについても行ったところ
、１９，０００±５００番に本酵素の切断点があった６
以上のデータ及びｐＢＲ３２２とｐＡＯ３−を切断しな
いこと、さらにＣ，Ｆｕｃｈｓらのコンピュータによる
検束法（Ｇｅｎｅ第１０巻、３５７〜３７０頁、１９８
０年）より本酵素の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配
列はＣＧＴＡＣＧであると結論された。さらに本酵素の
切断点認識部位はφＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡを本酵素
で切断したのち得られる２本のフラグメントの末端の塩
基配列をマキサムとギルバートの方法（Ｐｒｏｃ。
０番と２８１０±２０番に本酵素の切断点があると結論
された。同様の実験をλＤＮＡについても行ったところ
、１９，０００±５００番に本酵素の切断点があった６
以上のデータ及びｐＢＲ３２２とｐＡＯ３−を切断しな
いこと、さらにＣ，Ｆｕｃｈｓらのコンピュータによる
検束法（Ｇｅｎｅ第１０巻、３５７〜３７０頁、１９８
０年）より本酵素の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配
列はＣＧＴＡＣＧであると結論された。さらに本酵素の
切断点認識部位はφＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡを本酵素
で切断したのち得られる２本のフラグメントの末端の塩
基配列をマキサムとギルバートの方法（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｔ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、第７４巻
、第５６０頁、１９７７年）により決定した。
、第５６０頁、１９７７年）により決定した。
詳細は以下の通りである。
すなわち、φＸ １７４ ＲＦ ＤＮＡ（全酒造製品）
を本酵素で完全に分解する。これをアルカリ性ホスファ
ターゼ（シグマ社製）で処理して、ＤＮＡフラグメント
の末端のリン酸を取り除く。その後、ポリヌクレオチド
キナーゼ（全酒造製 ）と〔γ−３２ｐ〕アデノシン三
リン酸を用いて、ＤＮＡフラグメントの５′末端に放射
性リン酸を付加する。この状態ではＤＮＡの両末端に２
２Ｐリン酸が付加しているので、一端のみ３２Ｐで標識
されたフラグメントを得るためにＴｔｈ Ｈ８８Ｉ （
全酒造製品）により切断し、５％アクリルアミドゲル電
気泳動により分離する。この時、４本の標識されたバン
ドが検出されるが６５ｂｐと２５０ｂｐの長さをもつバ
ンドを各々抽出し、その５′末端付近を、前記のマキサ
ムとギルバートの方法により分析した。その結果、切断
点付近の配列は、以下のようであることが明らかとなっ
た。
を本酵素で完全に分解する。これをアルカリ性ホスファ
ターゼ（シグマ社製）で処理して、ＤＮＡフラグメント
の末端のリン酸を取り除く。その後、ポリヌクレオチド
キナーゼ（全酒造製 ）と〔γ−３２ｐ〕アデノシン三
リン酸を用いて、ＤＮＡフラグメントの５′末端に放射
性リン酸を付加する。この状態ではＤＮＡの両末端に２
２Ｐリン酸が付加しているので、一端のみ３２Ｐで標識
されたフラグメントを得るためにＴｔｈ Ｈ８８Ｉ （
全酒造製品）により切断し、５％アクリルアミドゲル電
気泳動により分離する。この時、４本の標識されたバン
ドが検出されるが６５ｂｐと２５０ｂｐの長さをもつバ
ンドを各々抽出し、その５′末端付近を、前記のマキサ
ムとギルバートの方法により分析した。その結果、切断
点付近の配列は、以下のようであることが明らかとなっ
た。
一５’−ＧＴＡＣＧＴＴＴＣＣＡ−
−ＧＣＡＴＧ−５’□
ると結論できる。また、ここで調べた切断点はφＸ １
７４ ＲＦ ＤＮＡ ４１４番にあり、切断部位の決定
で述べた４３０±２０番という結果とよく一致する。
７４ ＲＦ ＤＮＡ ４１４番にあり、切断部位の決定
で述べた４３０±２０番という結果とよく一致する。
以上より、本酵素の切断点認識部位は。
↓
５’−ＣＧＴＡＣＧ−３’
３’−〇ＣＡＴＧＣ−５’
↑
であり、切断点は矢印の場所であると結論された。
本酵素はＳｍ１ｔｈとＮａｔｈａｎｓの命名法（Ｊ、
Ｍｏｌ。
Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、第８１巻、４１９〜４２３頁、１９７３年）
に従い５ｐｆｆｉ■と命名された。
に従い５ｐｆｆｉ■と命名された。
制限酵素Ｓｐρ■は５基質特異性の点でヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、第１２巻、ｙ１６７頁、１９８４年）記
載のロバーッ（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ、 Ｒｏｂｅｒｔｓ
）の制限酵素の表にも記載なく新規な制限酵素と認めら
れるものであり、次の様な特性を持っている。
アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅ
ｓｅａｒｃｈ、第１２巻、ｙ１６７頁、１９８４年）記
載のロバーッ（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｊ、 Ｒｏｂｅｒｔｓ
）の制限酵素の表にも記載なく新規な制限酵素と認めら
れるものであり、次の様な特性を持っている。
（１）基質特異性
この酵素による種々の基質ＤＮＡの切断個所の数は第１
表のとおりである。
表のとおりである。
第１表
λＤＮＡ ｌ
Ｃｏ１１ Ｅｌ ２
ｐ１３８３２２ ０
φＸ１７４ＲＦ ２
↓
５’−ＣＧＴＡＣＧ−３’
３’−〇ＣＡＴＧＣ−５’
↑
を認識し、矢印で示したＣ−０間のホスポジエステル結
合を切断し、５′末端に４塩基の長さの１本鎖を持つＤ
ＮＡを生成する。
合を切断し、５′末端に４塩基の長さの１本鎖を持つＤ
ＮＡを生成する。
（２）至適、）ＩＩ ： ；１．ｏ〜７．５（３）至Ｊ
温度：３７℃付近 （４） ＮｔｈＣＬ２ｆｊｉｔ）Ｊｌｆ： ： ０〜２
００＋ｎＭで活性を有する。
温度：３７℃付近 （４） ＮｔｈＣＬ２ｆｊｉｔ）Ｊｌｆ： ： ０〜２
００＋ｎＭで活性を有する。
（５）活性化：５〜２０ｍＭ Ｍｇ”で活性化されるが
、Ａ Ｔ Ｐ’ｌ’、 Ｓ−アデノシルメチオニンのよ
うなコーファクターを必要としない。
、Ａ Ｔ Ｐ’ｌ’、 Ｓ−アデノシルメチオニンのよ
うなコーファクターを必要としない。
上述のような制限酵素ｓｐｇ Ｉを生産する藻株として
はスピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス（Ｓ
ｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ） Ｍ−１８５
、スピルリナ・マキシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｘ
ｉｍａ） ＵＴＥＸ ＬＢ−２３４２の公領株。及び本
発明者らが独自にエチオピアの塩湖より分離したスピル
リナ・プラテンシス・サブスピーシス・サイアミーゼ（
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ、
ｓｉａｍｅｓｓ）をあげることができる、スピルリナ・
プラテンシスト１８５は東京大学応用微生物研究所に微
細藻類系統保存株として保存されている公知株であり、
スピルリナ・マキシマＵＴＥＸ ＬＢ−２３４２はテキ
サス大学の藻類保存施設（丁ｈａ ｃｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ Ｔｈｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｘａｓ ａｔ Ａｕ５
ｔｉｎ）で保存されている公知株である。
はスピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス（Ｓ
ｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ） Ｍ−１８５
、スピルリナ・マキシマ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｍａｘ
ｉｍａ） ＵＴＥＸ ＬＢ−２３４２の公領株。及び本
発明者らが独自にエチオピアの塩湖より分離したスピル
リナ・プラテンシス・サブスピーシス・サイアミーゼ（
Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓｓｕｂｓｐ、
ｓｉａｍｅｓｓ）をあげることができる、スピルリナ・
プラテンシスト１８５は東京大学応用微生物研究所に微
細藻類系統保存株として保存されている公知株であり、
スピルリナ・マキシマＵＴＥＸ ＬＢ−２３４２はテキ
サス大学の藻類保存施設（丁ｈａ ｃｕｌｔｕｒｅＣｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ Ｔｈｅ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆＴｅｘａｓ ａｔ Ａｕ５
ｔｉｎ）で保存されている公知株である。
スピルリナの培養は周知の培養法に従い行うことができ
る。培地の主成分として１重炭酸ソーダを含むものを用
い、培養中培地を、ＰＨ８〜９．５に保持することが好
ましい。
る。培地の主成分として１重炭酸ソーダを含むものを用
い、培養中培地を、ＰＨ８〜９．５に保持することが好
ましい。
培養終了後は、培養液を濾過し、濾紙及び濾布上に藻体
を収穫する。酵素の抽出・精製は常法に従って行えばよ
く、得られた藻体を緩衝液に懸濁し超音波破砕した後、
遠心分離などの方法で抽出液を得る。この抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩またはポリエチレンイミンで処理
し、更に硫酸アンモニウムで分画した後、ホスホセルロ
ースなどを用いるイオン交換クロマト法、ヘパリンアガ
ロース、ＤＮＡ−セルロースなどを用いるアフィニティ
ークロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製し
て得られる＝ このように本発明は、培養並びに酵素抽出が容易である
スピルリナを用いて新規な制限酵素を提供することに成
功したもので、制限酵素を必要とする生化学研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
を収穫する。酵素の抽出・精製は常法に従って行えばよ
く、得られた藻体を緩衝液に懸濁し超音波破砕した後、
遠心分離などの方法で抽出液を得る。この抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩またはポリエチレンイミンで処理
し、更に硫酸アンモニウムで分画した後、ホスホセルロ
ースなどを用いるイオン交換クロマト法、ヘパリンアガ
ロース、ＤＮＡ−セルロースなどを用いるアフィニティ
ークロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製し
て得られる＝ このように本発明は、培養並びに酵素抽出が容易である
スピルリナを用いて新規な制限酵素を提供することに成
功したもので、制限酵素を必要とする生化学研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
尚、これらｓｐｇ Ｉを生産するスピルリナには５ｐｆ
ｆｉ夏 の他に５ｐｊｌ ＩＩ 、 ｓｐｘｍと命名し
た２種の制限酵素の存在が確認された。 ５ｐＱｎは
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈａｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）ストレイン１１１の生産するＴｔｈ
ｌｌｌＩのアイソシゾマーであり、Ｓｐｆｆｉｍはフェ
モフィラス・エジプテイウス（）Ｉａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ） Ａ’ＴＣＣ−１１１１６の
生産するＨａｅ ｍのアイソシゾマーであった。
ｆｉ夏 の他に５ｐｊｌ ＩＩ 、 ｓｐｘｍと命名し
た２種の制限酵素の存在が確認された。 ５ｐＱｎは
サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈａｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）ストレイン１１１の生産するＴｔｈ
ｌｌｌＩのアイソシゾマーであり、Ｓｐｆｆｉｍはフェ
モフィラス・エジプテイウス（）Ｉａｅｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ａｅｇｙｐｔｉｕｓ） Ａ’ＴＣＣ−１１１１６の
生産するＨａｅ ｍのアイソシゾマーであった。
以下、実施例を示して本発明の詳細な説明する。
実施例１
スピルリナ・プラテンシスト１８５を第２表に示したＳ
ＯＴ培地に○Ｄ ５６０ｎｍで０．１となるよう１．５
であった。この培養液５（Ｍｌを５００メツシユの濾布
により濾過して湿重量で約１００ｇの藻体を収穫した。
ＯＴ培地に○Ｄ ５６０ｎｍで０．１となるよう１．５
であった。この培養液５（Ｍｌを５００メツシユの濾布
により濾過して湿重量で約１００ｇの藻体を収穫した。
第２表 ＳＯＴ培地の組成
ＮａＨＣＯ３１６，８ｇ／ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇ／ｌ１
ＮａＮＯ３２，５ｇ／Ｒ
Ｋ２Ｓ０． １．０ ｇｉｆ
ｔＮａＣｌ ７．Ｏｇ／ｎ
恥Ｓ０４・７１１２０ ０．２
ｇＩＱＣａＣ１２’７１１２０
０．０４ ｇＩＱＦｃＳ（１４・７１１２０
０．０１ ｇＩＱＩＥＤＴＡ
０．０８ ｇｉｆｔＡｌ、
溶液 １ ｄ／ＱＡ５溶液 １１３００コ
２．８５ ｇ／ｇＭｎＣ１２・
４１１２０ １．８１ ｇ／Ｒ
。
ｔＮａＣｌ ７．Ｏｇ／ｎ
恥Ｓ０４・７１１２０ ０．２
ｇＩＱＣａＣ１２’７１１２０
０．０４ ｇＩＱＦｃＳ（１４・７１１２０
０．０１ ｇＩＱＩＥＤＴＡ
０．０８ ｇｉｆｔＡｌ、
溶液 １ ｄ／ＱＡ５溶液 １１３００コ
２．８５ ｇ／ｇＭｎＣ１２・
４１１２０ １．８１ ｇ／Ｒ
。
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２００，２２ｇ／４２ＣｕＳＯ４・５
１１２０ ０．０８ ｇ／ＩＭＯ
Ｏ：１ ０．０１５ｇ／
ｌｌまた制限酵素ｓｐａ Ｉ活性は、基質ＤＮＡとして
Ｃｏｔ Ｅｌを１／ＩＺＩＥ含む反応液（１０＋＋＋Ｍ
ｈリス塩酸。
１１２０ ０．０８ ｇ／ＩＭＯ
Ｏ：１ ０．０１５ｇ／
ｌｌまた制限酵素ｓｐａ Ｉ活性は、基質ＤＮＡとして
Ｃｏｔ Ｅｌを１／ＩＺＩＥ含む反応液（１０＋＋＋Ｍ
ｈリス塩酸。
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２．７＋ｕＭ ２−メルカプトエタ
ノール、５０ｍＭ ＮＩ＋Ｃ１，ｐＨ７，５）に酵素を
加えて５０μ２とし、３７℃、１時間反応させた後、反
応生成物をアガロース電気泳動法で分析した。上記反応
条件で１μｇのＤＮＡを完全分解する酵素活性を１単位
とした。
ノール、５０ｍＭ ＮＩ＋Ｃ１，ｐＨ７，５）に酵素を
加えて５０μ２とし、３７℃、１時間反応させた後、反
応生成物をアガロース電気泳動法で分析した。上記反応
条件で１μｇのＤＮＡを完全分解する酵素活性を１単位
とした。
収穫した湿菌体１００ｇを３倍量のＭｉ漣液Ａ（１０腸
阿リン酸功リウム緩衝液ｐＨ７，４，７鱈２−メルカプ
トエタノ、−ル、４ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波
破砕機により菌体を破砕した後、 １０，０００Ｘｇ、
１時間の遠心分離により残渣を除去し、抽出液を得た。
阿リン酸功リウム緩衝液ｐＨ７，４，７鱈２−メルカプ
トエタノ、−ル、４ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁し、超音波
破砕機により菌体を破砕した後、 １０，０００Ｘｇ、
１時間の遠心分離により残渣を除去し、抽出液を得た。
この抽出液に最終濃度２％になるようにストレプトマイ
シン硫酸塩水溶液（５〜１０％）を加え、３０分間攪拌
後１５，０００Ｘｇ、 ２０分間の遠心を行い、核酸を
除き上清を得る。この上清に硫酸アンモニウムを７０％
飽和になるように添加し、生じた沈殿を遠心分！（１５
，０００Ｘｇ、２０分１’１ｌｌ） ニテ集メタ、：１
７）沈殿を緩衝液Ｂ （１０＋ｏＭ トリス塩酸緩衝液
ＰＨ７，３゜７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
１ａ＋Ｍ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）
に溶解し、同ａ衝液に対し一夜透析した。あらかじめ緩
衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン
ＤＥ ５２）のカラム（２，５ｘ３０ ｃｍ）に、透析
内液を吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後、０〜０．５ｍＭ塩
化ナトリウムのり、υＤ〜Ｕ、ｔ Ｍ ［（じアトリワ
ム源反の画分に粘性が見い出さ４ｂたに の両分をＢＷｕ液Ｃ（１０％グリセロールを含む緩衝液
Ａ）に−夜透析後、あらかじめ緩衝液Ｃで平衡化したｓ
ｐ−セファデックス（ファルマシア）のカラム（３，Ｏ
Ｘ３０ｃｍ）に吸着させ、緩衝液Ｃで洗トリウム濃度の
両分に活性が見い出された。この活性画分を再度、緩衝
液Ｂに一夜透析し、あらかじめ平衝化したＤＥＡＥ−セ
ルロースのカラム（１，２Ｘ１５ｃ＋ｕ）に吸着させ、
緩衝液Ｂで洗浄後０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線的
濃度勾配を持つ緩衝液１３で溶出させると０．０５〜０
．２Ｈ塩化ナトリウム濃度の両分に制限酵素５ｐ１２１
の活性が認められ、活性画分（約５千単位）を得た。
シン硫酸塩水溶液（５〜１０％）を加え、３０分間攪拌
後１５，０００Ｘｇ、 ２０分間の遠心を行い、核酸を
除き上清を得る。この上清に硫酸アンモニウムを７０％
飽和になるように添加し、生じた沈殿を遠心分！（１５
，０００Ｘｇ、２０分１’１ｌｌ） ニテ集メタ、：１
７）沈殿を緩衝液Ｂ （１０＋ｏＭ トリス塩酸緩衝液
ＰＨ７，３゜７ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
１ａ＋Ｍ ＥＤＴＡ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール）
に溶解し、同ａ衝液に対し一夜透析した。あらかじめ緩
衝液Ｂで平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ワットマン
ＤＥ ５２）のカラム（２，５ｘ３０ ｃｍ）に、透析
内液を吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後、０〜０．５ｍＭ塩
化ナトリウムのり、υＤ〜Ｕ、ｔ Ｍ ［（じアトリワ
ム源反の画分に粘性が見い出さ４ｂたに の両分をＢＷｕ液Ｃ（１０％グリセロールを含む緩衝液
Ａ）に−夜透析後、あらかじめ緩衝液Ｃで平衡化したｓ
ｐ−セファデックス（ファルマシア）のカラム（３，Ｏ
Ｘ３０ｃｍ）に吸着させ、緩衝液Ｃで洗トリウム濃度の
両分に活性が見い出された。この活性画分を再度、緩衝
液Ｂに一夜透析し、あらかじめ平衝化したＤＥＡＥ−セ
ルロースのカラム（１，２Ｘ１５ｃ＋ｕ）に吸着させ、
緩衝液Ｂで洗浄後０〜０．５Ｍ塩化ナトリウムの直線的
濃度勾配を持つ緩衝液１３で溶出させると０．０５〜０
．２Ｈ塩化ナトリウム濃度の両分に制限酵素５ｐ１２１
の活性が認められ、活性画分（約５千単位）を得た。
実施例２
実施例１と同様の方法でスピルリナ・マキシマＬＩＴＥ
Ｘ Ｌｌｌ−２３４２を培養し約１１０ｇの湿菌体を得
た。
Ｘ Ｌｌｌ−２３４２を培養し約１１０ｇの湿菌体を得
た。
制限酵素の精製も実施例１と同様の方法で行ったところ
５ｐＩｌＩの活性が認められ約８千単位を得た。
５ｐＩｌＩの活性が認められ約８千単位を得た。
手続補正書
昭和６０年６月１０日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、次の理化学的性質を有する新規制限酵素ＳｐｌＩ。 （イ）２本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列【塩基酸配
列があります】 を認識し且つこれを矢印で示したＣ−Ｇ間のホスホジエ
ステル結合を切断し、５′末端に４塩基の長さの１本鎖
を持つＤＮＡ断片を生成する。 （ロ）２本鎖デオキシリボ核酸λ−ＤＮＡを１ケ所、Ｃ
ｏｌＥ１を２ケ所、φＸ１７４ＲＦを２ケ所切断する。 （ハ）５〜２０ｍＭ Ｍｇ＾２＾＋で活性化される。 （ニ）ＮａＣｌ濃度０〜２００ｍＭで活性を有する。 ２、制限酵素ＳｐｌＩ生産能を量するスピルリナ属に属
する藻類を培養し、得られた藻体の抽出液から制限酵素
ＳｐｌＩを採取することを特徴とする新規制限酵素Ｓｐ
ｌＩの製造方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16160984A JPS6140789A (ja) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | 新規制限酵素及びその製造方法 |
| GB08518457A GB2162852B (en) | 1984-08-02 | 1985-07-22 | Restriction endonuclease |
| US06/758,536 US4886756A (en) | 1984-08-02 | 1985-07-24 | Novel restriction endonuclease SplI and process for the production of the same |
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Family
ID=15738410
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP16160984A Granted JPS6140789A (ja) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | 新規制限酵素及びその製造方法 |
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- 1985-08-01 DE DE19853527682 patent/DE3527682A1/de active Granted
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|---|---|---|---|---|
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