JPS6348516B2

JPS6348516B2 -

Info

Publication number: JPS6348516B2
Application number: JP59161609A
Authority: JP
Inventors: Masahide Kawamura; Masaki Sakakibara; Teruo Watanabe; Akira Oohayashi; Shinji Hiraoka; Keiko Kita
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd; Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: Takara Shuzo Co Ltd; DIC Corp
Priority date: 1984-08-02
Filing date: 1984-08-02
Publication date: 1988-09-29
Also published as: DE3527682A1; GB2162852A; JPS6140789A; GB8518457D0; US4886756A; GB2162852B; DE3527682C2

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な制限酵素Spl及びその製造法
に関するものである。一般に、制限酵素は２本鎖デオキシリボ核酸
（以下、「DNA」と略称する）中のある特定の数
個の塩基配列を認識してDNA鎖を切断するDNA
分解酵素である。この酵素はその酵素活性により
長いDNA分子の特定部位を切断出来、それによ
つて得られるDNA断片の分離、塩基配列の決定
等のDNAの構造と機能の解析に有用である。さ
らに今後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子
工学のための試薬として不可欠のものである。本発明者らは、このように実用性に富む重要な
生化学試薬としての制限酵素を、いまだ検索が不
十分であつた藻類について研究を行つたところ、
スピルリナ属に属する藻類がDNAを特異的に切
断する従来未知の制限酵素Splを生産している
ことを見い出し本発明を完成するに至つた。すなわち、本発明は新規制限酵素Spl及びそ
の製造方法に関するものである。本発明の制限酵素Splの切断部位の決定には
φX174RF DNA（宝酒造製品）を本酵素及び性質
の良く知られた制限酵素で二重消化する方法によ
りφX174RF DNA上の切断点を求めた。その結
果、Pst切断点を０番とする番地付けで、430±
20番と2810±20番に本酵素の切断点があると結論
された。同様の実験をλDNAについても行つた
ところ、19000±500番に本酵素の切断点があつ
た。以上のデータ及びpBR322とpA03を切断しな
いこと、さらにC.Fuchsらのコンピユータによる
検索法（Gene第10巻、357〜370頁、1980年）よ
り本酵素の認識するDNA上のヌクレオチド配列
はCGTACGであると結論された。さらに本酵素
の切断点認識部位はφX174RF DNAを本酵素で
切断したのち得られる２本のフラグメントの末端
の塩基配列をマキサムとギルバートの方法
（Proc.Natl、Acat.Sci.USA、第74巻、第560頁、
1977年）により決定した。詳細は以下の通りである。すなわち、φX174RF DNA（宝酒造製品）を本
酵素で完全に分解する。これをアルカリ性ホスフ
アターゼ（シグマ社製）で処理して、DNAフラ
グメントの末端のリン酸を取り除く。その後、ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製）と〔γ−
³²p〕アデノシン三リン酸を用いて、DNAフラグ
メントの5′末端に放射性リン酸を付加する。この
状態ではDNAの両末端に ³²pリン酸が付加して
いるので、一端のみ ³²pで標識されたフラグメン
トを得るためにTth H88I（宝酒造製品）により
切断し、５％アクリルアミドゲル電気泳動により
分離する。この時、４本の標識されたバンドが検
出されるが65bpと250bpの長さをもつバンドを
各々抽出し、その5′末端付近を、前記のマキサム
とギルバートの方法により分析した。その結果、
切断点付近の配列は、以下のようであることが明
らかとなつた。このことから、本酵素は

【式】を認識し、なる切断点を形成すると結論できる。また、ここ
で調べた切断点はφX174RF DNA414番にあり、
切断部位の決定で述べた430±20番という結果と
よく一致する。以上より、本酵素の切断点認識部位は、であり、切断点は矢印の場所であると結論され
た。本酵素はSmithとNathansの命名法（J.Mol.
Biol.第81巻、419〜423頁、1973年）に従いSpl
と命名された。制限酵素Splは、基質特異性の点でヌクレイ
ツク・アシツズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research、第12巻、γ167頁、1984年）記載のロ
バーツ（Richard J.Roberts）の制限酵素の表に
も記載なく新規な制限酵素と認められるものであ
り、次の様な特性を持つている。 (1) 基質特異性この酵素による種々の基質DNAの切断個所
の数は第１表のとおりである。

【表】また塩基配列を認識し、矢印で示したＣ−Ｇ間のホスホジエ
ステル結合を切断し、5′末端に４塩基の長さの
１本鎖を持つDNAを生成する。 (2) NaCl濃度：NaCl濃度を０〜200ｍＭに調整
した反応液を用い、後述の力価の測定方法と同
様の処理を行つて活性を調べたところ、本酵素
は０〜200ｍＭで活性を示し、特に100〜120ｍ
Ｍで最も高い活性を示した。 (3) 至適PH：PH3.5〜5.5は酢酸塩、PH5.5〜7.5は
トリス・マレイト−苛性ソーダ、PH7.2〜9.0は
トリス塩酸、PH8.6〜11はグリシン苛性ソーダ
の各PHで調整した反応液を用い、後述の力価の
測定方法と同様の処理を行つて活性を調べたと
ころ本酵素はPH5.5〜10.0の範囲で活性を示し
PH7.0〜7.5で最も高い活性を示した。 (4) 至適反応温度：温度を20〜75℃に変化させた
以外は、後述の力価の測定と同様の処理を行つ
て活性を調べたところ、本酵素は20〜65℃で活
性を示し、至適反応温度は50〜55℃であること
が分つた。 (5) 失活の条件（温度安定性）本酵素試料溶液をPH7.5に調整し、75℃で60
分間処理した後、後述の力価の測定法と同様の
処理を行つて活性を調べたところ、本酵素は75
℃で完全に失活することが分つた。 (6) 力価の測定法本酵素試料を10ｍＭトリス−塩酸緩衝液（PH
7.5）、７ｍＭ MgCl₂、７ｍM2−メルカプト
エタノール、100ｍＭ NaCl、0.01％ウシ血清
アルブミン並びに各種のバクテリオフアージ
DNA又はプラスミドDNAを含有する反応液に
加え、55℃で60分間反応させる。反応生成物を
0.7％アガロース・ゲル電気泳動にかけ、泳動
後のアガロース板をエチジウムブロマイド存在
下で紫外線照射し、発生する蛍光を写真撮影す
ることにより、泳動帯をバンドとして検出し、
そのバンドの数と各バンドの泳動値及び量を測
定した。 (7) 活性化：５〜20ｍＭ Mg⁺⁺で活性化される
が、ATPやＳ−アデノシルメチオニンのよう
なコフアクターを必要としない。 (8) 分子量：本酵素は、セフアデツクスＧ−150
（フアルマシア）を用いるゲル過法によつて、
その分子量は約400000±30000であることが認
められた。上述のような制限酵素Splを生産する藻株と
してはスピルリナ属に属するスピルリナ・プラテ
ンシス（Spirulina Platensis）Ｍ−185、スピル
リナ・マキシマ（Spirulina maxima）UTEX
LB−2342の公知株及び本発明者らが独自にエチ
オピアの塩湖より分離したスピルリナ・プラテン
シス・サブスピーシス・サイアミーゼ
（Spirulina platensis subsp.siamese）をあげる
ことができる。スピルリナ・プラテンシスＭ−
185は東京大学応用微生物研究所に微細藻類系統
保存株として保存されている公知株であり、スピ
ルリナ・マキシマUTEX LB−2342はテキサス
大学の藻類保存施設（The culture Collection
of Algae at The University of Texas at
Austin）で保存されている公知株である。スピルリナの培養は周知の培養法に従い行うこ
とができる。培地の主成分として、重炭酸ソーダ
を含むものを用い、培養中培地を、PH８〜9.5に
保持することが好ましい。培養終了後は、培養液を濾過し、濾紙及び濾布
上に藻体を収穫する。酵素の抽出・精製は常法に
従つて行えばよく、得られた藻体を緩衝液に懸濁
し超音波破砕した後、遠心分離などの方法で抽出
液を得る。この抽出液をストレプトマイシン硫酸
塩またはポリエチレンイミンで処理し、更に硫酸
アンモニウムで分画した後、ホスホセルロース、
DEAE−セルロースなどを用いるイオン交換クロ
マト法、ヘパリンアガロース、DNA−セルロー
スなどを用いるアフイニテイークロマト法、又は
これらの方法の組合せにより精製して得られる。このように本発明は、培養並びに酵素抽出が容
易であるスピルリナを用いて新規な制限酵素を提
供することに成功したもので、制限酵素を必要と
する生化学研究及び各種産業に貢献するところ大
なものである。これらSplを生産するスピルリナ属に属する
藻類は、Spl以外に他の制限酵素を持つ場合が
多い。他の制限酵素とは、例えばTth111、
Hae、Pvu、Pvu等のアイソシゾマーであ
る。例えばスピルリナ・プラテンシスはSplの
他にSpl、Splと命名した２種の制限酵素の存
在が確認された。Splはサーマス・サーモフイ
ラス（Thermus thermophilus）ストレイン111
の生産するTth111Iのアイソシゾマーであり、
Splはフエモフイラス・エジプテイウス
（Haemophilus aegyptius）ATCC−11116の生
産するHaeのアイソシゾマーであつた。又、スピルリナ・マキシマは、Spl（Sma^d
、Smxと呼ぶこともある）の他に、Smx、
Smx、Smxと命名した３種の他の制限酵素
を有する。Smxは、サーマス・サーモフイラ
スストレイン111の生産するTth111のアイソ
シゾマー（isoshizomer）であり、Smxは、プ
ロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）の生
産するPvuのアイソシゾマー（isoshizomer）
であり、Smxは、プロテウスブルガリス
（Proteus vulgris）の生産するPvuのアイソシ
ゾマー（isoshizomer）であつた。これらのSpl以外の制限酵素は、Splを抽
出、分離する工程中に順次分離することができ
る。好ましくは、核酸を除いた上清を硫酸アンモ
ニウムで分画した後に、DEAE−セルロースなど
を用いるイオン交換クロマト法により分離され、
更に前記のイオン交換クロマト法、アフイニテー
クロマト法、又はこれらの組合せにより精製され
る。以下、実施例を示して本発明を詳細に説明す
る。実施例１スピルリナ・プラテンシスＭ−185を第２表に
示したSOT培地にOD560nｍで0.1となるように
接種し、7000ルツクスの照度で35℃にて振盪培養
し、７日後に濁度を測定したところOD560nｍで
1.5であつた。この培養液50を500メツシユの濾
布により濾過して湿重量で約100ｇの藻体を収穫
した。第２表 SOT培地の組成 NaHCO₃ 16.8ｇ／ K₂HPO₄ 0.5ｇ／ NaNO₃ 2.5ｇ／ K₂SO₄ 1.0ｇ／ NaCl 7.0ｇ／ MgSO₄・7H₂O 0.2ｇ／ CaCl₂・7H₂O 0.04ｇ／ FeSO₄・7H₂O 0.01ｇ／ EDTA 0.08ｇ／ A₅溶液１ml／ A₅溶液 H₃BO₃ 2.85ｇ／ MnCl₂・4H₂O 1.81ｇ／ ZnSO₄・7H₂O 0.22ｇ／ CuSO₄・5H₂O 0.08ｇ／ MoO₃ 0.015ｇ／また制限酵素Spl活性は、基質DNAとして
Col E1を1μｇ含む反応液（10ｍＭトリス塩酸、
10ｍＭ MgCl₂、７ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール、50ｍＭ NaCl、PH7.5）に酵素を加えて
50μとし、37℃、１時間反応させた後、反応生
成物をアガロース電気泳動法で分析した。上記反
応条件で1μｇのDNAを完全分解する酵素活性を
１単位とした。収穫した湿菌体100ｇを３倍量の緩衝液Ａ（10ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液PH7.4、７ｍＭ２−メ
ルカプトエタノール、１ｍＭ EDTA）に懸濁
し、超音波破砕機により菌体を破砕した後、
10000×ｇ、１時間の遠心分離により残渣を除去
し、抽出液を得た。この抽出液に最終濃度２％に
なるようにストレプトマイシン硫酸塩水溶液（５
〜10％）を加え、30分間撹拌後15000×ｇ、20分
間の遠心を行い、核酸を除き上清を得る。この上
清に硫酸アンモニウムを70％飽和になるように添
加し、生じた沈殿を遠心分離（15000×ｇ、20分
間）にて集めた。この沈殿を緩衝液Ｂ（10ｍＭト
リス塩酸緩衝液PH7.3、７ｍＭ２−メルカプト
エタノール、１ｍＭ EDTA、10％（ｗ／ｖ）
グリセロール）に溶解し、同緩衝液に対し一夜透
析した。あらかじめ緩衝液Ｂで平衝化したDEAE
−セルロース（ワツトマンDE52）のカラム（2.5
×30cm）に、透析内液を吸着させ、緩衝液Ｂで洗
浄液、０〜0.5ｍＭ塩化ナトリウムの直線的濃度
勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出させると、0.05〜
0.2M塩化ナトリウム濃度の画分に活性が見い出
された。この画分を緩衝液Ｃ（10％グリセロールを含む
緩衝液Ａ）に一夜透析後、あらかじめ緩衝液Ｃで
平衝化したsp−セフアデツクス（フアルマシア）
のカラム（3.0×30cm）に吸着させ、緩衝液Ｃで
洗浄後０〜0.6M液化ナトリウムの直線的濃度勾
配を持つ緩衝液Ｃで溶出させると0.2〜0.5M塩化
ナトリウム濃度の画分に活性が見い出された。こ
の活性画分を再度、緩衝液Ｂに一夜透析し、あら
かじめ平衝化したDEAE−セルロースのカラム
（1.2×15cm）に吸着させ、緩衝液Ｂで洗浄後０〜
0.5M塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を持つ緩
衝液Ｂで溶出させると0.05〜0.2M塩化ナトリウ
ム濃度の画分に制限酵素Splの活性が認められ、
活性画分（約５千単位）を得た。実施例２実施例１と同様の方法でスピルリナ・マキシマ
UTEX LB−2342を培養し約110ｇの湿菌体を得
た。制限酵素の精製も実施例１と同様の方法で行
つたところSplの活性が認められ約８千単位を
得た。

Claims

【特許請求の範囲】１次の理化学的性質を有する新規制限酵素Spl
。 (イ) ２本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列を認識し且つこれを矢印で示したＣ−Ｇ間のホ
スホジエステル結合を切断し、5′末端に４塩基
の長さの１本鎖を持つDNA断片を生成する。 (ロ) ２本鎖デオキシリボ核酸λ−DNAを１ケ所、
Col E1を２ケ所、φX174RFを２ケ所切断す
る。 (ハ) ５〜20ｍＭ Mg²⁺で活性化されるが、ATP
やＳ−アデノシルメチオニンのようなコフアク
ターを必要としない。 (ニ) NaCl濃度０〜200ｍＭで活性を示し、至適
NaCl濃度は100〜120ｍＭである。 (ホ) PH5.5〜10.0の範囲で活性を示し、至適作用
PHは7.0〜7.5である。 (ヘ) 温度20〜65℃の範囲で活性を示し、至適作用
温度は50〜55℃である。 (ト) 失活の条件（温度安定性）は75℃で60分であ
り、この条件で完全に失活する。 (チ) 分子量は、ゲル濾過法による測定で約400000
±30000である。２次の理化学的性質を有する制限酵素Spl生
産能を有するスピルリナ属に属する藻類を培養
し、得られた藻体の抽出液から前記制限酵素Spl
を採取することを特徴とする新規制限酵素Spl
の製造方法。 (イ) ２本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列を認識し且つこれを矢印で示したＣ−Ｇ間のホ
スホジエステル結合を切断し、5′末端に４塩基
の長さの１本鎖を持つDNA断片を生成する。 (ロ) ２本鎖デオキシリボ核酸λ−DNAを１ケ所、
Col E1を２ケ所、φX174RFを２ケ所切断す
る。 (ハ) ５〜20ｍＭ Mg²⁺で活性化されるが、ATP
やＳ−アデノシルメチオニンのようなコフアク
ターを必要としない。 (ニ) NaCl濃度０〜200ｍＭで活性を示し、至適
NaCl濃度は100〜120ｍＭである。 (ホ) PH5.5〜10.0の範囲で活性を示し、至適作用
PHは7.0〜7.5である。 (ヘ) 温度20〜65℃の範囲で活性を示し、至適作用
温度は50〜55℃である。 (ト) 失活の条件（温度安定性）は75℃で60分であ
り、この条件で完全に失活する。 (チ) 分子量は、ゲル濾過法による測定で約400000
±30000である。