JPH02283281A

JPH02283281A - 新規制限酵素及びその製造法

Info

Publication number: JPH02283281A
Application number: JP1104991A
Authority: JP
Inventors: Tadashi Kanematsu; 兼松　正; Osamu Ozawa; 修小沢; Makoto Murakami; 真村上
Original assignee: Nisshin Seito KK
Current assignee: Nisshin Seito KK
Priority date: 1989-04-25
Filing date: 1989-04-25
Publication date: 1990-11-20

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は新規な制限酵素及びその製造法に関するもので
ある。

［従来の技術］制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）上のある特
定の塩基配列を認識し、この配列内または近傍の二本鎖
を切断するエンドヌクレアーゼである。

この酵素は、その酵素活性に高い基質特異性と再現性を
有しており、遺伝子の単離、塩基配列の解析やタンパク
質の構造解析を初め、遺伝物質の大量生産などの遺伝子
操作を行う上で不可欠である。

また、今後の遺伝病の解明や治療、遺伝子の人工変換等
に重大な産業的意義を有する試薬である。

制限酵素は種々の微生物より単離されており、その認識
する塩基配列、切断様式により、現在までに約１００種
類が知られている。

［発明が解決しようとする課題］しかし、既に発見された制限酵素は理論上考えられる種
類の酵素の半分はどでしかない。

したがって、本発明は従来知られていないまったく新し
い認識塩基配列を有する新規制限酵素及びその工業的生
産方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］本発明者等は有能な制限酵素を開発することを目的とし
て多数の制限酵素生産菌の研究を行った結果、バクテロ
イデス属に属する菌が、従来より知られていない認識塩
基を認識するまったく新しい制限酵素を生産することを
突止め、本発明を完成するに至った。

本発明の新規制限酵素ＢｄｉＩは次の酵素化学的諸性質
を有するものである。

ａ）作用及び基質特異性制限酵素ＢｄｔＩは二本鎖デオキシリボ核酸中の↓ ↑ （式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
ン、Ｃはシチジンを示す）という塩基配列を認識し、矢印で切断する酵素である。

制限酵素Ｂ＋ｌｉＩの認識部位の決定のため、大腸菌フ
ァージλＤＮ＾、大腸菌ウィルスＭｉ３ｍｐ１８ＲＦＤ
ＮＡ、動物ウィルス５Ｖ４ＯＤＮ＾、大腸菌ファージφ
Ｘ１７４ＲＦＤＮＡ　、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
ＤＮＡの各ＤＮＡの切断数を調べ、ロバートの表（Ｎｕ
ｃｉｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１９１１５
．１３．　ｒ１６５　）に照らし合わせた。その結果、
制限酵素ＢｄｉＩと同種の酵素はロパートの表にはなく
、また１９８８年までの各雑誌の文献にも見出されなか
った。よって本発明者等が知るかぎり、まったく新しい
認識塩基配列を有する新規制限酵素であることが示され
た。

また、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡに制限酵素
Ｂｄｉ　Ｉを作用させたとき生成されるＤＮＡ断片の長
さを、アガロースゲル電気泳動法にて測定したところ、
制限酵素Ｂｄｉ　Ｉによる切断片の長さはそれぞれ約１
９０．　６８１１．　８９０．　２６００ｂｐ　（ベー
スペアー）であった。そこで、この切断片の長さ及び各
種ＤＮＡの切断数をファックスのデータ（Ｇｅｎｅ、　
１９８０゜１０、　３７１）に照らし合わせた。その結
果、下記の表１に示した通り制限酵素Ｂｄｉ　Ｉは二本
鎖デオキシリボ核酸中の ↓ という塩基配列を認識していると推定された。

さらに、５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’　　という塩基配列
を認識切断する制限酵素Ｐｓ目と大腸菌プラスミドｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡを用い、制限酵素Ｂｄｉ　Ｉとのダブル
ダイゼッションを行った。その結果、制限酵素Ｂｄｉ　
Ｉのみで生成される切断片とまったく同じであり、制限
酵素ＢｄｉＩは５’−ＣＴＧＣＡＧ−３’　　という塩
基配列を認識切断することが明らかになった。また、大
腸菌プラスミド９ＢＲ３２２ＤＮＡの１３７の位置に５
’−ＣＴＧＴＡＧ−３’　、２９２９の位置に５′−Ｃ
ＴＡＣＡＧ−３’　、２７３８の位置に５’−ＣＴＧＴ
ＡＧ−３′　そして３６０フの位置にＰｓｔＩの５’−
ＣＴＧＣＡＧ−３’　の配列が確認され、この配列で切
断されると１９１　、６７８　、８９１　、２６ＱＩｂ
ｐ　（ベースペアー）の切断片が生成されると分かった
。以上の結果から、制限酵素ＢｄｉＩの認識塩基配列は
であることが判明した。

切断点の決定は次の方法で行った。まず、大腸菌プラス
ミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを制限酵素Ｂｄｉ　Ｉで切断し
、切断末端のリン酸をアルカリフォスファターゼで除い
た。次に、ポリヌクレオチドカイネース及び［γ−３２
Ｐ］アデノシン三リン酸を用いて、ＤＮＡ断片の５′末
端に放射性リン酸を付加した。この放射性リン酸を付加
したＤＮＡ断片を、制限酵素Ｂｉｎｄｎ［で切断した。

制限酵素旧ｎｄｌｌ［で新たに生成された２つの小断片
を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離・分取した
。各々のＤＮＡ断片をマクサム・ギルバート法によりそ
の５′末端からの塩基配列を調べた。これらの実験から
制限酵素Ｂｄｉ■は ↓ という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断していると
判明した。

ｂ）酵素反応の至適条件及び酵素の安定性至　適ｐＨ：
制限酵素Ｂｄｉ　Ｉの至適ｐＨは８．２であった。

安　定ｐＨ：４℃２４時間の処理に対し、ｐ）１６．　
［１〜７．５で１００％の酵素活性を維持していた。

至適温度：制限酵素ＢｄｉＩの至適温度は４５℃であっ
た。

安定温度：４０°０５分間の加熱に対し、１００％の酵
素活性を維持していた。

塩濃度：塩化ナトリウム濃度０〜５００１Ｍで安定に酵
素活性を示した。

塩化マグネシウム濃度：１〜ｌ０ｍＭで高い酵素活性を示した。

７ｍＭが至適濃度であった。

Ｃ）　分子量ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３０ＱＯ３Ｗ　Ｇｌａｓｓ　（東ソー
■製）を用いたゲルろ適法で、２５，１１００±５，０
００であった。

本発明の新規制限酵素の製造法は、バクテロイデス属に
属する制限酵素ＢｄｉＩ生産菌を栄養培地で培養し、培
養物より制限酵素ＢｄｉＩを採取することを特徴とする
ものである。

本発明で使用する微生物はバクテロイデス属に属するＢ
ｄｉＩ生産菌であればいずれでもよいが、例えば人糞便
中より分離されたバクテロイデス・ディスクツニスＳ−
７（Ｂａｃｔｅ＋ｏｉｄｅｓ　ｄｉｃｔａｓｏｎｉｓＳ
−７）　　（微工研菌寄第１０６５４号）である。本菌
は以下に示す生理学的性質を有していた。

（１）個性嫌気性菌（２）芽胞形成　−、ダラム陰性桿菌（０，６〜ｉ、ＯＸ　１．ｌｌ−１１，０ｆｔｍ　）（
３）胆汁による発育促進　＋、硫化水素ガスの発生　−
１運動性　−２窒素固定インドール生成　−、ゼラチン生成（４）コハク酸・酢酸醗酵ペプトン、酵母エキス、フィルデス液、グルコース培地
による。

（５）炭素源同化性アラビノース　−、キシロース　＋。

リボース　＋、グルコース　＋。

マンノース　＋、フラクトース　＋・。

ガラクトース　＋６　シュークロース　＋。

マルトース　＋、セロビオース　＋。

ラクトース　＋、トレハロース　＋。

メリビオース　＋、ラフィノース　＋。

メレチトース　＋、グリセロールマニトール　−　ソルビトール− エリスリトール　−、イノシトール本菌は以上の生理学的性質から「腸内菌の世界・嫌気性
菌の分離と同定」　（光岡知足著）によりバクテロイデ
ス・ディスタソニス（Ｂａｃｔｅ＋ｏｉｄｅｓｄｉｓｔ
ａｓｏｎｉｓ）と同定された。

培養法に制限はなく通常行われるバクテロイデス属細菌
の培養法で増殖可能であるものなら何でもよい。例えば
、炭素源としてはグルコースをはじめとする多くの糖類
及び有機酸などでよく、窒素源としては肉エキス、酵母
エキス、ペプトン。

アミノ酸などがある。また、血液成分を数％加えること
により生育が良くなる。

本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に従った方
法で行える。すなわち、培養菌体は常法に従って集菌し
、超音波処理などの方法により菌体を破砕する。破砕の
後、遠心分離などの方法で無細胞抽出液を得る。この抽
出液をイオン交換クロマトグラフィー法、ヒドロキシア
パタイトクロマトグラフィー法、ゲルろ適法、アフィニ
ティークロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー
法の組合わせにより精製を行い、制限酵素Ｎｉｌを得る
。

［１ｄｉＩの活性測定を次の通り行った。１０ｍＭ　ｈ
リス塩酸ｐＨ７，５，７ｍＭ　２−メルカプトエタノー
ル。

７μｍ１Ｍ塩化マグネシウム、１μｇλＤＮ＾からなる
反応系に、酵素を加えて全量を５０μｍとし、３７℃で
１時間反応させた。反応液に１％ＳＯ３（ドデシル硫酸
ナトリウム）、５０％グリセロール、０．１％ＢＰＢ　
　（ブロモフェノールブルー）からなる酵素反応停止液
を５μｍ加えて反応を停止させた。反応液中の大腸菌フ
ァージλＤＮ＾を０．５μｇｅｍ　ｌのエチジウムブロ
マイドを含ませた１％アガロースゲル電気泳動にて分離
し、ＵＶ照射でＤＮＡのバンドを検出した。バンドの数
と量が変化しな（なった時を終点きした。上記反応にお
いて１μｇλＤＮＡを完全に切断する酵素活性を１単位
とした。

〔実施例コバクテロイデス・ディスタソニス５−７（微工研菌寄第
１０６５４号）はスチールジャー及び表２に示すカザミ
ノ酸液体培地を用いて嫌気培養を行った。

前培養は３７℃で２４時間、本培養は前培養液を本培養
液の１／１００量摂取し、３７℃で４８時間行った。

遠心分離で菌体を集めたところ、約９ｇ湿菌体を得た。

注）ツイーン８０（相当品）はポリオキシエチレン（２
０）ソルビタンモノオレートである得られた菌体に緩衝液Ａ　（ＩＱｍＭ　）リス塩酸ｐＨ
７，５，１ｈＭ　２−メルカプトエタノール、　７ｍＭ
塩化マグネシウム）９０１を加え、超音波で処理し、菌
体を破砕した。遠心分離で無細胞抽出液を得、３０〜６
０％（Ｗ／Ｙ）の硫酸アンモニウム塩析画分を制限酵素
画分として得た。この制限酵素画分を緩衝液Ｂ　（５０
ｍＭトリス塩酸ｐＨ７，５，７ｍＭ塩化マグネシウム、
７ｍＭ２−メルカプトエタノール）　２０ｍ１に溶解さ
せ、同緩衝液ＩＱで一夜透析した。

この透析後の制限酵素画分を以下の高速液体クロマトグ
ラフィー（東ソー■製）にて精製を行った。

まずこの透析液を０．４５μｍのフィルターに通した後
、緩衝液Ｂで平衡したＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ
Ｇｌａｓｓ　　（イオン交換クロマトグラフィー）に吸
着させた。０〜５００ｍＭの塩化ナトリウムの直線的濃
度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出させ、１３０〜１６ｆ１ｍ
Ｍ塩化ナトリウム濃度に制限酵素画分を得た。この制限
酵素画分を緩衝液Ｃ（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
，５，０，０２ｍＭ塩化カルシウム、１０％　（Ｖ／Ｖ
）グリセロール）に−夜透析した。

この制限酵素画分を緩衝液Ｃで平衡したＴＳＫｇｅＨ＾
−１０００Ｇｌａｓｓ　（ヒドロキシアパタイトクロマ
トグラフィー）に吸着させ、緩衝液Ｃから緩衝液Ｄ（５
００ｍＭ　リン酸ナトリウムｐＨ７，５，０，０２ｄ塩
化カルシウム、　　１０％（Ｖ／Ｖ）　グリセロール）
までの直線的濃度勾配で溶出を行った。７５〜ｌｆ１５
ｍＭリン酸ナトリウム濃度に制限酵素画分を得た。

この制限酵素画分を８倍に濃縮して、３００ｍＭ塩化ナ
トリウム及び１０％（Ｖ／Ｖ）　グリセロールを含む緩
衝液ＢにてＴＳＫｇｅｌ　Ｇ３（１００ｓＷ　Ｇｌａｓ
ｓ　（ゲルろ過）に供した。リテンションタイム１４．
７〜１６．６分に制限酵素画分を得た。

得られた制限酵素画分を５０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール
を含む緩衝液Ａで一夜透析を行い、最終酵素標品とした
。ゲルろ過画分において、非特異的なりＮＡ分解酵素は
ほとんど見られなかった。

［発明の効果］上述した本発明により、まったく新しい認識塩基配列を
有する新規制限酵素Ｂｄｉ　Ｉ及びその製造が可能とな
った。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の酵素化学的諸性質を有する新規制限酵素Ｂｄ
ｉ I イ）作用及び基質特異性二本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列【遺伝子配列があります】を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する。（式中、Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
ン、Ｃはシチジンを示す）ロ）至適ｐＨ８．２ハ）安定ｐＨ６．０〜７．５ニ）至適温度４５℃ ホ）安定温度４０℃ 但し、５分間の加熱で１００％の酵素活性を保持する温
度。ヘ）安定塩濃度０〜５０ｍＭ但し、塩化ナトリウム、塩の要求性はない。ホ）分子量２５，０００±５，０００但し、ゲルろ過法による。
（２）バクテロイデス属に属する制限酵素Ｂｄｉ I 生
産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵素Ｂｄｉ
I を採取することを特徴とする制限酵素Ｂｄｉ I の製
造法。
（３）バクテロイデス属に属する制限酵素Ｂｄｉ I 生
産菌が、バクテロイデス・ディスタソニスＳ−７である
請求項第（２）項に記載の製造法。