JPH02215379A - 新規制限酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】 本発明は新規な制限酵素及びその製造法に関するもので
ある。 ［従ｉゝに技術］ 制限酵素とはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上のある特定
の塩基配列を認識し、この配列内または近傍の２本鎖を
切断するエンドメクレアーゼである。 この酵素は１、その酵素活性に高い基質特異性と再現性
を備えており、遺伝子の単離、塩基配列の解析や蛋白質
の構造解析を初め、遺伝物質の大量生産などの遺伝子操
作を行う上で不可欠である。 また、今後の遺伝病の解明や治療、遺伝子の人工変換等
に重大な産業的意義を有する試薬でもある。 制限酵素は種々の微生物より単離されており、その認識
する塩基配列、切断様式により、現在までに約１００種
類が知られている。 しかし、これらの中には病原微生物を生産するものや、
数種類の制限酵素を持っているため精製が困難なもの、
酵素活性が不安定なもの、極めて特異な条件のもとでし
か活性を持たないものなど多くの問題を抱えるものがあ
る。 また、 ↓ ５’−Ｔ　　　Ｔ　　　ＣＧ　　　Ａ　　　Ａ−３゜３
’−Ａ　　　′Ａ　　　Ｇ　　　ＣＴ　　　Ｔ−’ａ↑ というｍ基配列を認識し、矢印の部位で切断する酵素と
してはＮａｐ（７５２４）Ｖなどが知られている。しか
しこれらは生産量が低いこと、精製が困難などの問題点
があった。 ［本発明の目的］ 本発明者等は有能な制限酵素の開発の目的で多数の制限
酵素生産菌の研究を行った結果、クロストリジウム属に
属する菌が、精製が簡便で、しかも従来知られている Ｎ５ｐ（７５２４）Ｖよりも極めて安定していて取扱い
やすい制限酵素を生産することを突き止め、本発明を完
成するに至った。 すなわち、本発明は従来知られている制限」ン′ 酵素より安定していて取扱いやすい新規制限酵素および
より簡便な工業的生産方法を提供できるようにした。 ［問題点を解決する為の手段］ 本発明中の第１発明は次ざの酵素化学的諸性質を有する
。新規制限酵素Ｃｂｉ１に関するものである。 ａ）作用及び基質特異性 制限酵素ＣｂＩは２本鎖デオキシリボ核酸中の ↓ ５’−Ｔ　　　Ｔ　　　ＣＧ　　　Ａ　　　Ａ−３’３
’−Ａ　　　Ａ　　　Ｇ　　　ＣＴ　　　Ｔ−５’↑ という塩基配列を認識し、矢印の部位で切断する酵素で
ある。 制限酵素ＣｂＩの認識部位の決定は、大腸菌ファージＮ
ＤＮＡ　、動物ウィルスＡｄ２ｆｆＮＡ、動物ウィルス
５Ｖ４０ＤＮＡ　、大腸菌ファージ＄　Ｘ１７４ＲＦ［
ｌＮＡ　、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡの各Ｄ
ＮＡの切断数を調べ、ロバートの表（Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒ＋、＋ｅａＴｅｈ　　１１１８５．
１３．ｒ１８５）に照らし合せて行った。 その結果、制限酵素ＣｂＩは制限酵素 Ｎｓｐ　（７５２４）Ｖのアイソシゾマーであることが
示された。 さらに、、ｅ物つィルスＡｄ２ｔ）ＨＡに制限酵素Ｃｂ
ｉＩと制限酵素Ｎ５ｐ（７５２４）Ｖを同時に作用させ
、切断片が変化しないことでこれらの酵素がアイソシゾ
マーの関係にあることを確認した。 切断点の決定は次ぎの方法にて行った。 まず大腸菌ファージλＤＭＡを制限酵素ＣｂＩで切断し
、最少のＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動
にて分取した。 このＤＮＡ断片をアルカリフォスファターゼで処理し、
ＤＮＡ断片の５°末端のリン酸を取除いた。 次ぎにポリヌクレオチドカイネース及び［γ−３２Ｐ］
　アデノシン玉リン酸を用１．％てＤＮＡ断片の５°末
端に放射性リン酸を付加した。 この放射性リン酸を付加したＤＮＡ断片を制限酵素！ｃ
ｏ０１０９１で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で２つの小断片に分離Φ分取した。 それぞれの口ＨＡ断片をマクサム・ギルバート法により
各５°末端からの塩基配列を調べた。 これらの実験から制限酵素ＣｂＩは ↓ ↑ という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断していると
判明した。 ｂ）酵素反応の至適条件及び酵素の安定性至適ｐＨ：制
限酵素ＣｂｉＩの至適ｐ）Ｉは５．５〜７．０であった
。 安定ｐＨ：４℃２４時間の処理に対し、ｐＨ４，０〜７
．５で１００％の酵素活性を維持していた。 至−槌′度：制限−素ｑｂ弓の至適温度は３０〜４０℃
であった。 安定温度：５５°０で５分間の加熱に対し、１００％の
酵素活性を維持してい た。 塩濃度：塩化ナトリウムはＯ−１５０ｍＭで、塩化カル
シウムは０〜５０ｍＭで、硫 酸アンモニウムは０〜ＩＱＯｍＭで安 定に酵素活性を示した。 塩化マグネシウム濃度： １〜ｉｏ■にで高い酵素活性を示し た。７ｍＭが至適濃度であった。 Ｃ）分子量 丁ＳＫｇｅｌ　Ｇ３ＱＯＱＳＷ　Ｇｌａｇｓ　（東ソー
■製）を用いたゲルろ適法で４９．２００．０．１％Ｓ
Ｏ３を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて４８
，８００であった。制限酵素ＣｂＩは分子ｊ約４ｉ９．
０００の単量体であった。 本発明中の第２発明は、クロストリジウム属に属する制
限酵素ＣｂＩ生産菌を栄養培地で培養し、＊Ｐζ書り制
限酵素ＣｂｉＸを採取することを特徴とするものである
。 本発明で使用する微生物はクロストリジウム属に属する
ＣｂＩ生産菌であればいずれでもよいが、例えば人糞便
中より分離されたクロストリジウム・ビファーメンタン
スＢ−４（Ｃｌｏｇｔｒｉｄｉｕｉ＋　ｂｉｆｅｒｍｅ
＋５ｔａｎａ　Ｂ−４微工研菌条寄第１０５１８号）で
ある。 培養法に制限はなく１通常行われるクロストリジウム属
細菌の培養法で増殖可能であるものなら何でもよい。 また、本酵素の抽出、精製は一般の制限酵１ｇ精製法に
従った方法で行なえる。 すなわち培養菌体は常法に従って集菌 し、超音波処理などの方法により菌体な破砕する。 破砕の後、遠心分離などの方法で無細胞抽出液を得る。 この抽出液をイオン交換クロマトグラ フィー法、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー法
、ゲルる適法、アフィニ ティークロマトグラライ−法などのクロマトグラフィー
法の組合せにより精製を行い、Ｇｂｉｌを得る。 ＣｂＩの活性測定を次ざのとおり行った。 下記表１の組成からなる反応系に酵素を加えて全量を５
０１ｊ、１とし、３７℃で１時間反応させる。１％Ｓ　
［ＩＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、５０％グリセロー
ル、０．１％ＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）からな
る酵素反応停止液を５ＪＪ、ｌ加えて反応を停止させる
０反応液中の大腸菌ファージ入ＤＮＡを１％アガロース
ゲル電気泳動法にて分離する。ゲルにＯ−５１Ｌｇ／ｍ
ｌのエチジウムブロマイドを含ませておき、ｕｖ熱照射
ＤＮＡのバンドを検出し、バンドの数と量が変化しなく
なった時を終点とする。 上記反応においてｌｐｇ入［ＩＮＡを完全に切断する酵
素活性を１単位とする。 表１ １０ｍＭ　　　　　　）　　リ　ス塩酸、　ＰＨ７，５
７膳Ｍ２−メルカプトエタノール７ ｌ終ｇ入ＤＮＡ　　（宝酒造■製） ［実施例］ クロストリジウム・ビファーメンタンス日−４（微工研
菌条寄第１０５１８号）をスチールジャーにて３７℃で
２４時間嫌気培養を行った。 この前培養液をカザミノ酸培地に１／１００　！接種し
、３７℃で４８時間嫌気培養を行った．遠心分離で菌体
を集めたところ，約２０ｇの湿菌体を得た。 カザミノ酸液体培地　　ｉ！Ｌ 塩化ナトリウム　　　　　　１．５ｇ ツイーン８０　　　　　　　　　　１，３ｇシスティン
塩酸　　　　　　０．４ｇ ｐＨ７．０（ＮａＯＨ） 得られた菌体に緩衝液Ａ　（１０−圓トリス塩酸，　ｐ
Ｈ７．５，　ｌＯｍＭ　ｉ！−メルカプト！　タ／　−
　）Ｌｔ、７鳳舅塩化マグネシウム）　２００ｍｌを加
え、超音波で処理し、菌体を破砕した．遠心分離で無細
胞抽出液を得、０．４５ｐ讃のフィルターに通した．得
られた無細胞抽出液を１００■Ｘの塩化ナトリウムを含
む緩衝液Ｂ（５０■にトリス塩酸，　ｐＨ７．５　、　
７■に塩化マグネシウムＪに一夜透析を行った．この透
析後の無細胞抽出液を以下の高速液体クロマトグラフィ
ー（東ソー■製）にて精製を行った。 初めに１００ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂで平
衡したＤＥＡＥ−　）ヨパールパック８５０Ｍ　（イオ
ン交換クロマトグラフィー）に無細胞抽出液を吸着させ
、３００履Ｘの塩化ナトリウムを含む緩衝液Ｂでタンパ
ク質を溶出させた．初めのピークを制限酵素画分として
得、これを再び緩衝液Ｂで一夜透析した。 この制限酵素画分を緩衝液Ｂで平向したＴＳＫｇｅｌ　
ＤＥＡＥ−５ＰＷ　Ｇｌａｓｓ（イオン交換１）　ｅｌ
　−２　トゲラフイー）に吸着させた．Ｏ〜５０Ｇ−Ｍ
の塩化ナトリウムの直線的濃度勾配を持つ緩衝ＩＢで溶
出させ、１７０〜２７ＯｍＮ塩化ナトリウム濃度に制限
酵素画分を得た．この制限酵素画分を緩衝液Ｃ　（１０
１舅リン酸ナトリウム、　ｐＨ７．５，　０．０２ｍＭ
塩化カルシウム）に−夜透析した。 この制限酵素画分を緩衝液Ｃで平衡したＴＳＫｇｅｌ　
ＨＡ−１０００　Ｇｌａｓｓ　（ヒドロキシアパタイト
クロマトグラフィー）に吸着させ，ｌｓ衝液Ｃから緩衝
液Ｄ　（　５００■阿リン酸ナトリウムｐＨ７．５，　
０．０２ｍＭ塩化カルシウム）までの直線的濃度勾配で
溶出を行った．２００〜２２０＋にリン酸ナトリウム濃
度に制限酵素画分を得た。 この制限酵素画分を緩衝液Ｅ（５０層にトリス塩酸，　
ｐ）！７，．５，　７嘗Ｍ２ーメルカプトエタノール’
？＋Ｍ塩化マネシウム，　１０％グリセロール）にてＴ
ＳＫｇｅｌ　Ｇ３０００ＳｌＩ　ＧＩａｓｓＣゲルろ過
）に供した．リテンションタイム１４．５分のピークを
制限酵素画分として得た。 得られた制限酵素画分を５０％グリセロールを含む緩衝
液Ａで一夜透析を行い，最終酵素標本とした。ゲルろ過
画分はもとよりヒドロキシアパタイト画分にも非特異的
なりＮＡ分解酵素は見られなかった。 以上の方法により湿菌体２０ｇから１０，Ｇ００単位の
制限酵素ＣｂＩが得られた。 ［効　果］ 上述した本発明により，精製が容易で、しかも酵素活性
が安定した制限酵素ＣｂＩおよびその製造が可能となっ
た。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の酵素化学的諸性質を有する新規制限酵素Ｃｂ
   Ｉ イ）作用及び基質特異性 ２本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列 【塩基配列が有ります。】 を認識し、かつこれを矢印の位置で切断する（但し、上
   記式中のＡはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジ
   ン、Ｃはシチジンを示す）。 ロ）至適ｐＨ　５．５〜７．０ ハ）安定ｐＨ　４．０〜７．５ ニ）至適温度　３０〜４０℃ ホ）安定温度　５５℃ 但し、５分間の加熱で１００％の酵素活性を保持する温
   度。 ヘ）安定塩濃度　１５０ｍＭ 但し、塩化ナトリウム、塩の要求性はない。 ト）分子量　４９，０００ 但し、ゲルろ過法及びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
   気泳動法による。
2. （２）クロストリジウム属に属する制限酵素ＣｂｉＩ生
   産菌を栄養培地で培養し、培養物より制限酵素ＣｂｉＩ
   を採取することを特徴とする制限酵素ＣｂｉＩの製造方
   法。
3. （３）クロストリジウム属に属する制限酵素ＣｂｉＩ生
   産菌が、クロストリジウム・ビファーメンタンスＢ−４
   （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ
   　Ｂ−４（微工研菌条寄第１０５１８号））である特許
   請求の範囲第２項記載の製造方法。