JPH044875A - 制限酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は制限酵素の製造方法に関し、更に詳細には、ブ
レビバクテリウム属の細菌の生産する制限酵素の製造方
法に関する。

［従来の技術］ 制限酵素とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）上のある
特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断するエンド型ヌ
クレアーゼである。分子遺伝学や生化学等の発達により
、ＤＮＡが遺伝をつかさどる本体であることが明らかに
なって以来、制限酵素は、遺伝病解明のための利用や遺
伝子操作による物質の大量生産への利用等現在広く用い
られている有用な酵素である。制限酵素は、種々の微生
物より単離されており、その認識する塩素配列、切断様
式により現在まで約１５０種類が知られている。

これまでに、 ↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’ ↑ （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す）という塩基配列を認識し、矢印
の位置で切断する制限酵素（以下本酵素と称する）とし
て、アナベナ　パリアビリスＵＷ　（Ａｎａｂａｅｎａ
　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ　ＵＷ）の生産するＡｖｒ　Ｉ
Ｉ［シーン（Ｇｅｎｅ）　、第７巻、第２１７頁〜第２
７０頁、１９７９年）が知られている。

［発明が解決しようとする課題］ Ａｖｒ　ＩＩ生産菌は、藻類であり、培養が困難であり
、又極めて生産量が低いことなど、工業化には問題があ
る。

本発明の目的は、Ａｖｒ　ＩＩと同様の塩基配列の認識
部位、及び切断位置を有する制限酵素の工業的生産に適
した製造方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明を概説すれば、本発明は制限酵素の製造方法に関
し、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレオチド配
列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
を有する細菌を培養し、得られた培養物より、下記ヌク
レオチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
酵素を採取することを特徴とする。

↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣ，Ｃ−５’ （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らは、Ａｖｒ　ＩＩと同様の塩基配列の認識部
位及び切断部位を有する制限酵素が新たに、ブレビバク
テリウム属細菌によって、大量に生産されること、かつ
該細菌は、該制限酵素以外の制限酵素を生産しないこと
から、精製を安易に行うことかできることを見い出し、
本発明を完成した。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明で使用する微生物としては、ブレビバクテリウム
属に属する本酵素生産菌は、全て使用できるが、例えば
東京大学応用微生物研究所有用菌株保存施設保存菌ブレ
ビバクテリウム　リネンス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍ　１ｉｎｅｎｓ　）　ＩＡＭ　Ｉ　９０２があり、
本菌株はＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｉｎｅｎｓ
　ＪＡＭ　１９０２と表示にし、工業技術院微生物工業
技術研究所に微工研条寄第２８７０号（ＦＥＲＭ　ＢＰ
　−２８７０）として寄託されている。

培養を行う場合には、培地組成としては、使用微生物が
資化でき、かつ本酵素を生産する炭素源、窒素源および
無機塩類等を適宜組合わせて使用する。培地のｐＨは、
５．０〜９，０が好ましい。培養法としては、振盪培養
、攪拌培養、通気培養を用いることができるが、大量培
養を行うには、通気攪拌培養が好ましい。培養温度は、
酵素を生産する範囲内で変更することができるが、特に
好ましくは、２０℃〜３３℃である８培養時間は、培養
条件によって異なり、本酵素の生産量が最高に達するま
で培養を行う。

本酵素は主として菌体内に生産される。培養液からの菌
体分離は、たとえば遠心分離により行うことができる。

本酵素の抽出、精製は、一般の制限酵素精製方法に従っ
た方法で行える。すなわち、菌体を緩衝液に懸濁後、超
音波処理により破砕し、細胞内酵素の抽出を行う。次に
、細胞残渣を超遠心分離にて除去後、抽出液を１％スト
レプトマイシン処理し、除核酸処理を行う、更に、硫酸
アンモニウムで塩析する。沈殿物をトリス−ＦＩＣＩ緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解し、同緩衝液にて透析を行う
。得られる透析内液を、−ホスホ−セルロース、ハイド
ロキシアパタイトのイオン交換クロマトグラフィー、ヘ
パリン−セファロースのアフィニティークロマトグラフ
ィーを用いた精製方法で本制限酵素を得る。

本酵素の活性測定法を以下に示す。下記表１に示す組成
の反応液５０μβを予め３７℃で予熱した後、本酵素を
加え酵素反応を行う。６０分後に酵素反応停止液（１％
ＳＯＳ、５０％グリセロール０．０２％ブロモフェノー
ルブルー）を５μ℃添加にて反応を停止させる。

表　　　１ １０ｍＭ　　トリス−ＨＣｌ　　ｐＨ７，５７ｍＭ　Ｍ
ｇＣ１ｚ ７ｍＭ　　　２−メルカプトエタノール１００ｍＭ　　
　ＮａＣ１ １，０μｇ　　λ−ＤＡＮ　　（宝酒造製品）反応液を
１％アガローススラブゲルに重層し、１０Ｖ／ｃｍの定
電圧下で約１〜２時間電気泳動を行う。電気泳動用緩衝
液は、９０ｍＭトリス−はう酸緩衝液（ｐｔ（８，３）
　２．５ｍＭ　ＥＤＴＡを用いる。ゲルに前もって０．
５μｓ／ｍβのエチジウムブロマイドを含ませておくこ
とによりＵＶ照射でＤＮＡのバンドが検出可能である。

ＤＮＡフラグメントのバントの数と量が変化しなくなっ
た時を終点とする。

活性の定義は、３７℃で１時間に１μｇのλ−ＤＡＮを
完全に分解する酵素活性を１単位とする。

本発明により得られた本酵素は、以下のような理化学的
性質を持っている。

（１）作用及び基質特異性 本酵素は、二本鎖デオキシリボ核酸中の↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’ ↑ という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する酵素で
、公知の制限酵素Ａｖｒ　ＩＩのイソシゾマーである。

本酵素の認識部位の決定は、λ−ＤＮＡ　、　ｐＢＲ３
２２ＤＮＡ、φＸ　１７４ＲＦＩ　ＤＮＡ　　（以上宝
酒造製品）とアデノパイラス−２ＯＮＡＣベセスダ　リ
サーチ　ラボラトリ−製品）を基質に用いて行った。

その結果、本酵素は、λ−ＤＡＮを２カ所、アデノパイ
ラス−２ＤＮＡを２カ所切断した。しかし、ｐＢＲ３２
２ＤＮＡ、φＸ　ｌ　７４ＲＦＩ　ＤＮＡ　１．’ニー
はイ乍用しなかった。さらに既知制限酵素Ａｖｒ　ＩＩ
をそれら基質に作用させ、本酵素のそれと切断パターン
を比較したところ、本酵素の切断パターンは、Ａｖｒ　
ＩＩの切断パターンと一致した。以上の結果から本酵素
の認識するＤＮＡ上のヌクレオチド配列は、５’　−Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’であると結論された。

本発明の制限酵素の切断部位の決定は、Ｍ１３ｍｐｌ　
８ＲＦＩ　ＤＮＡ　　（宝酒造製品）に、本酵素の認識
配列である５’　−ＣＣＴＡＧＧ−３’　を含む５’　
−ＧＣＣＴＡＧＧＣ−３’　を導入したベクターより、
重鎖ＤＮＡを回収し、５′末端塩基を放射性リン酸化し
たプライマー（５’　−ＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣ
ＧＡＣ−３’）とアニール後大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
Ｉクレノー断片により２本鎖を合成し、その２本鎖ＤＮ
Ａを本酵素により切断し、変性ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により、切断断片の鎖長な測定する方法を用い
行った。この時、生成物として得られた鎖長は５’−Ｃ
ＣＴＡＧＧ−３’の矢印のところで切断されたスポット
が検出され、このことから本酵素は ↓ ５’−ＣＣＴＡＧＧ−３’ ３’−ＧＧＡＴＣＣ−５’ ↑ を認識し、矢印の位置で切断していると結論された。

（２）至適酵素活性条件 ■）至適温度 至適温度は、約３７℃であった。

ＩＩ　）至適ｐ）Ｉ 至適ｐＨは、ｐＨ７，０〜ｐＨ８，５の範囲にある■）
塩濃度 塩濃度は、ＮａＣｌの場合５０〜１５０ｍＭであった。

■）　ＭｇＣ１ｚ濃度 ＭｇＣＩｚ濃度が、５ｍＭ〜２０ｍＭの存在下で酵素反
応が活性化される。

（３）分子量 本酵素の分子量は、セファデックスＧ−１００を用いた
ゲル濾過法により９６０００±４０００ダルトン、５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により４２００
０±２０００ダルトンでありこれより、本酵素は分子量
約４５０００ダルトンのサブユニット２個よりなるダイ
マー酵素である。

［実施例１ 以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発
明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例　１ ３０β容ジャーファーメンタ−に下記表２に示す培地２
０βを仕込み常法により培地を滅菌した上記と同じ培地
で３０℃で２４時間振盪培養した、ブレビバクテリウム
　リネンスＩＡＭ１９０２の種培養液５００　ｍβを上
記ジャーファーメンタ−に移植し、通気量１　ｖｖｍ　
、攪拌数２５　Ｏｒｐｍ、３０℃で１８時間培養を行っ
た。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得た。培養液２０
℃より湿重量にして約１４４ｇの菌体が得られた。

表　　　　　２ グルコース　　　　　１ｇ 酵母エキス　　　　　５ｇ ポリペプトン　　　１０ｇ 食塩　　　　　　　　５ｇ 脱イオン水　　　　　１ｆ２ ｐＨ７，２ 得られた７２ｇの菌株を３６０ｍｆ２の緩衝液Ａ（２０
ｍＭトリス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）　　１０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、５％グリセロール）に懸濁し
、超音波破砕機を用いて破砕後、１０００００ｘｇで１
時間遠心分離を行い、残渣を除去、抽出液４００　ｍβ
を得た。

得られた抽出液に、４ｇのストレプトマイシンを添加し
、４℃、１時間放置後１００００×ｇで１０分遠心分離
を行い、上清を回収した。得られた上清に硫酸アンモニ
ウムを８０％飽和になるよう加え、沈殿物を遠心分離に
て集め緩衝液Ａ＋０２ＭにＣ１に溶解後、同緩衝液で一
晩透析を行った。

次に透析内液を予め０．２Ｍ　ＫＣＩを含む緩衝液Ａて
平衡化させたホスホ−セルロース（ワットマン製品）１
００ｎ＋ｊｌ！のカラムに吸着させ、０．２ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液Ａで洗浄後、０．２〜ＩＭの直線濃度勾配
をもつ緩衝液Ａで溶出させた。得られた活性区分を合わ
せ、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液で平衡化したハイ
ドロキシアパタイト（バイオラド社製品）３０ｍ℃のカ
ラムに吸着させ、１０〜５００ｍＭの直線濃度勾配をも
つリン酸カリウム緩衝液で溶出させた。得られた活性区
分を合わせ、緩衝液Ａで４時間透析後、緩衝液Ａで平衡
化したヘパリン−セファロース（ファルマシア社製品）
に吸着させ、緩衝液Ａで十分洗浄後、０．８ＭのＫＣＩ
を含む緩衝液で溶出し、本酵素の標品を得たこの酵素標
品には、非特異的なりＮＡ分解酵素およびホスファター
ゼは夾雑していなかった。

以上述べた方法により、７２ｇの湿菌体より８０万単位
の活性が得られた。

［発明の効果〕 以上詳細に説明したとおり、本発明によりＡｖｒ■と同
様の塩基配列の認識部位及び切断部位を有する制限酵素
の工業的に有利な製造方法が提供された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ブレビバクテリウム属に属し、下記ヌクレオチド配
   列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵素生産能
   を有する細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌクレ
   オチド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限酵
   素を採取することを特徴とする制限酵素の製造方法。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （式中Ｃはシチジン、Ｔはチミジン、Ａはアデノシン、
   Ｇはグアノシンを示す）