JPH0260585A

JPH0260585A - 耐熱性ｄｎａポリメラーゼおよびその製法

Info

Publication number: JPH0260585A
Application number: JP21333088A
Authority: JP
Inventors: Yasuo Oshima; 泰郎大島; Hitoshi Sakashita; 阪下　日登志; Hiroji Matsumoto; 博治松本; Yoshihiko Maekawa; 前川　宜彦
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1990-03-01
Anticipated expiration: 2011-09-04
Also published as: US5192674A; EP0359006A1; EP0359006B1; DE68923503T2; JP2531246B2; US5413926A; DE68923503D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその製法に
関する。さらに詳しくは、本発明はサーマス（Ｔｈｅｒ
ｍｕｓ　）属に属する菌株、例えばサマー・モフイラス
（Ｔｈｅ−ｒｍｕｓ　ｔｈｅｒ＋ＩＩｏｐｂｉｌｕｓ）
が生産する熱安定性に優れたＤＮＡポリメラーゼおよび
その製法に関する。

本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型ＤＮＡ〜プ
ライマーと４種のデオキシヌクレオチド−３リン酸から
鋳型ＤＮＡに相補的なりＮＡを合成する酵素で、核酸配
列の増幅およびＤＮＡの塩基配列決定等の遺伝子操作技
術に用いられる。

（従来の技術）従来から知られている耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとして
は、サーマス・アクアティカスＹＴ−１（Ｔｈｅｍｕｓ
　ａｑｕａｔｉｃｕｓＹＴ−１：ＡＴＣＣ２５１０４）
由来のものが知られている。エイ・チェノ（Ａ、Ｃｈｉ
ｅｎ　）ら、（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｌ、（１９７６年）
１２７巻、１５５０〜１５５７頁〕は、サーマス・アク
アティカスＹＴ−ｒ（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃ
ｕｓＹＴ−１）から、ＤＮＡポリメラーゼの単離及び精
製法を開示し、この酵素の酵素的性ｆ（温度、ｐＨ，２
価イオン濃度等の影響）を報告している。

またサーマス・アクアティカスＹＴ−１由来ＤＮＡポリ
メラーゼ（以下Ｔａｑポリメラーゼと呼ぶ）の利用法と
して、既存の核酸配列を初めに存在する量に比べて大量
に増幅する方法が、サイキ（Ｓａｉｋｉ）らの５ｃｉｅ
ｎｃｅ＋　２３０巻、１３５０〜１３５４頁（１９８５
年）及びサイキ（Ｓａｉｋｉ）　　らのＢｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、　３巻、１００８〜１０１２頁（１９
８５年）、及び特開昭６３−１０２６７７号公報に記載
されている。この方法は、核酸の変性、鋳型とブライマ
ーのアニリングブライマーの伸長の各工程からなり、こ
の工程のくり返すことにより増幅する。このプライマー
伸長工程で、ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、熱によって酵素活性
が破壊されないので、各変性工程の後に酵素を添加する
必要がないと言う利点がある。しかしながらＴａｑポリ
メラーゼをこの工程に用いた場合、各工程のくり返し、
特に、核酸の変性工程（約９０°Ｃ〜１０５°Ｃへの加
温）において酵素活性の低下が起り、充分な増幅が得ら
れない短所があった。したがってより耐熱性の高いポリ
メラーゼが望まれていた。

（問題点を解決するための手段）本発明者らは、上記問題点を解決するため、従来の耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱安定性に優れた耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼを見い出すことを目的として鋭意研究
を重ねた結果、サーマス属に属する菌株からより熱安定
性に優れた耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを見い出すことに
成功した。

すなわち本発明はｐ　Ｉ＋　８　、０において８５°Ｃ
１２時間の処理によって、その残存活性が少なくとも約
６０％である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびサーマス
属に属する菌株を培養し、培養物から、ｐＨ８，５にお
いて８５゛Ｃ５２時間の処理によって、その残存活性が
少なくとも約６０％である耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを
採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
製法である。

本発明の酵素を生産する菌株としては、サーマス属に属
する菌株、例えばサーマス・サーモフィラスＨＢ　８　
（ＡＴＣＣ２７６３４）などが挙げられる。

本発明の酵素を製造するに当っては、サーマス属に属す
る菌株、例えばサーマス・サーモフィラスＨＢ８（ＡＴ
ＣＣ２７６３４）を通常の方法で培養する。

使用する培地組成は、使用菌株が、責化しうる炭素源、
窒素源、ｍ機動、その他栄養素を適量含有するものであ
れば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。例えば
炭素源としては、グルコース、シュークロース、デキス
トリン、糖蜜などが使用される。窒素源としては、例え
ばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解
物などの窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、グルタミン酸などのアミノ酸など、無機あ
るいは有機の窒素化合物が、使用される。

培養は、通常振盪培養あるいは、通気撹拌培養で行なう
、培養温度は５０″Ｃ〜８０’Ｃの範囲、好ましくは、
７５°Ｃ付近、培養ｐＨは、５〜１０の範囲、好ましく
はｐＨ１〜９に制御するのが良い。これら以外の条件下
でも使用する菌株が生育すれば、実施できる。培養期間
は、通常１〜３日間で生育し菌体内に耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼが生成蓄積される。

本発明の酵素の精製方法は一般に使用される精製法を用
いればよい０例えば抽出法には、超音波破砕、ガラスピ
ーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性
剤など、いずれを用いてもよい、さらに抽出液について
は、公知の硫安や芒硝などの塩析法、塩化マグネシウム
や塩化カルシウムなどの金属凝集法、さらにはＤＥＡＥ
　（ジエチルアミノエチル）セファロース、ＣＭ　（カ
ルボキシメチル）セファロースなどのイオン交換体クロ
マト法などにより精製することができる。

次に本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの理化学的性質
について述べる。

（＋）　　作用核酸の鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するためのヌクレ
オチド−３リン酸の結合を触媒する。

（２）　　至適ｐＨが約８．０である。

（３）　　至適温度が約７５°Ｃである。

（４）　　Ｍ　ｇ　”　”を要求し、その至適濃度が６
〜２０ｍＭである。

（５）　　至適塩濃度が約１０〜３０ＭのＮａＣ１又は
ＫＣＩである。

（６）　　ｐＨ８，０において８５℃、２時間の処理に
よって、その残存活性が少なくとも約６０％である。

（７）　　分子量が約８５，０００〜９５，０００ダル
トン（ＳＯＳポリアクリルアミド電気泳動による）であ
る。

次に本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性測定法を
示す。

５００ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液、ｐＨ８，０（２５°
Ｃにての値）１００ｍＭ　ＭｇＣＩｚ２ａ＋Ｍ　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ２ｍＭ　　（
３Ｈ）　ＴＴＰ１００ｎＭ　　２−メルカプトエタノール上記液５μｌ
に、１Ｈｇ／μｌの活性化した仔牛胸線ＤＮＡ　５μゼ
を加え、さらに蒸留水３５μｌを加え反応液とする。反
応液４５μｌに酵素液５μρを添加し、ゆるやかに混和
後、７５°Ｃで３０分間加温する。

反応終了後、氷上にて、０．１Ｍピロリン酸ナトリウム
５０μｌ、１Ｍ過塩素酸１００μＰを加え、１時間以上
氷上に放置する。この後、ＧＦ／Ｃフィルター（Ｗｈａ
ｔｍａｎ社製）にて濾過を行なう。フィルターを０．Ｉ
Ｎ塩酸及び冷エタノールで洗浄し、フィルターをン夜体
シンチレーションカウンター（アロ力ＬＳＣ−７００）
にて、〔３Ｈ〕を測定し、酸不溶画分への（”Ｈ）　Ｔ
ＴＰの取り込み量を計算する。

本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性の表示は上記
条件下で３０分間に１０ｎＭのＴＴＰの酸不溶画分への
取り込みを１単位（Ｕ）とした。

本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはｐＨ８，０におい
て８５°Ｃ１２時間の処理によって、その残存活性が少
なくとも６０％であり、従来のＤＮＡポリメラーゼより
耐熱性に優れる。

（実施例）以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。

実施例１ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１
Ｏ１２％を含む培地（ｐＨ７，５）　　１００ｍを５０
０戚容坂ロフラスコに移し、１２１°Ｃで、１５分間オ
ートクレーブ殺菌を行なった。放冷した後、種菌として
サーマスサーモフィラスＩＩ８８　（ＡＴＣＣ２７６３
４）を同培地に一白金耳接種し、７０°Ｃで２４時間振
盪培養し、種培養液とした０次に同培地６２を１０ｆ・
ジャーファメンターに移し、１２１℃、１５分間オート
クレーブを行なった。放冷後これに種培養液１００　ｄ
を移し、４００ｒｐｍ、通気１２　ｆ／分、７０°Ｃで
１０時間培養した。

培養液６１を遠心分離にて集画し、１０ｍＭ　２−メル
カプトエタノール、５％グリセロールを含むにリン酸緩
衝液ｐｉｌｌｓ　（以下緩衝液Ａとする）に懸濁した。

超音波破砕機（海上電気製、１９ＫＩＩｚ）にて２０分
間処理し、遠心分離してその上清液を得た。上清液を硫
安塩析後、緩衝浪人に対して透析を行なった。この液を
緩衝液Ａにて平衝化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６８（ファルマシア社製）カラクロマトグラフィーに供
し、０〜０，５ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ溶出画分にＤ
ＮＡポリメラーゼ活性を得た。活性画分を５０　ｍ　Ｍ
　緩衝液Ａに対して透析した。

同透析液を緩衝液Ａにて平衝化したフォスホセルロース
Ｐ−１１（−ｈａｔｎ＋ａｎ社製）カラクロマトグラフ
ィーに供し、０〜０．５ＭＮａＣ１を含む緩衝液Ａ溶出
画分にＤＮＡポリメラーゼ活性を得た。活性画分を緩衝
液Ａに対して透析した。さらに同透析液を緩衝液Ａにて
平衡化したｎａｔｉｖｅＤＮＡセルロース（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、Ｏ−０，５
ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ？８出画分に１　、２０００
のＤＮＡポリメラーゼを得た。

得られたＤＮＡポリメラーゼの理化学的性質は次の通り
であった。

（１）　　至適ｐＨサーマス・サーモフィラスＨＢ　８　（ＡＴＣＣ２７６
３４）の生産するＤＮＡポリメラーゼの反応ｐＨの影響
を求めた。緩衝液は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　（ヒドロ
キシメチル・アミノメタン）塩酸緩衝・液を用いて行な
った。各ｐＨでの活性測定結果は第１図に示す通りで、
至適ρ１１は８．０付近であった。

（２）　　至適温度各温度における酵素活性を測定した。その結果は第２図
に示す通り、至適温度は７５°Ｃ付近であった。

（３）　　至適Ｍｇ２゛濃度本酵素は１１ｇ２゛を要求する。各Ｈｇ１″濃度での活
性測定の結果は第３図に示す通りで、至適Ｍｇ２−濃度
は５ｍＭ〜２０ｍＭ付近であった。

（４）　　至適塩濃度各塩濃度における酵素活性を測定した。その結果は第４
図に示す通りとなった。第４図中、◎−◎はＮａＣｌ、
Ｏ−０はにＣ１を示す。

（５）熱安定性本発明の酵素を９　）１−８　、０で、７５°Ｃ〜９８
°Ｃで２時間加熱後、残存活性を測定した。その結果は
第５図に示す通りとなった。対照として市販の、サーマ
ス・アクアティカスＹＴ−１由来の耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼについても同様の実験を行なった。第５図中、◎
−◎は本発明の酵素、Ｏ−Ｏはサーマス・アクアティカ
スＹＴ−１由来の酵素を示す。

（６）　　分子量５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動により測定したと
ころ、約８５．０００〜９５，０００であった。

（発明の効果）本発明では、熱安定性により優れた耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼが得られ、遺伝子増幅において有効に利用し得る
。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラー早　Ｉｖ！
Ｊ７．０８．０９．０（ｐＨ）ゼの至適ｐＨを示す。第２図は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適温
度を示す。第３図は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適Ｍ
ｇ！−濃度を示す。第４図は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの至適塩
濃度を示す。第５図は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの温度安
定性を市販のＴａｑポリメラーゼと比較したものである
。特許出願人　　東洋紡績株式会社準２　図温度（°Ｃ）早園相ｔＩｒ活性半図相対活性凹（０Ｃ）早園相対活性手続補正書（自発）平成１年２月河口発明の名称耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよびその製法＆補正をする者事件との関係

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ｐＨ８．０において８５℃、２時間の処理によっ
て、その残存活性が少なくとも約６０％である耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼ。
（２）サーマス属に属する菌株を培養し、培養物から、
ｐＨ８．０において８５℃、２時間の処理によって、そ
の残存活性が少なくとも約６０％耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼを採取することを特徴とする耐熱性ＤＮＡポリメラ
ーゼの製法。