JPH0159873B2 - - Google Patents

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JPH0159873B2
JPH0159873B2 JP59202199A JP20219984A JPH0159873B2 JP H0159873 B2 JPH0159873 B2 JP H0159873B2 JP 59202199 A JP59202199 A JP 59202199A JP 20219984 A JP20219984 A JP 20219984A JP H0159873 B2 JPH0159873 B2 JP H0159873B2
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enzyme
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restriction enzyme
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Akira Oohayashi
Shinji Hiraoka
Keiko Kita
Hiroshi Nakajima
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Takara Shuzo Co Ltd
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Takara Shuzo Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は制限酵素の製造法に関し、更に詳細に
はグルコノバクター属の細菌の生産する制限酵素
の製造法に関する。
従来の技術 制限酵素とはデオキシリボ核酸（DNA）上の
ある特定の塩基配列を認識し、二本鎖を切断する
エンド型ヌクレアーゼである。分子遺伝学や生化
学等の発達により、DNAが遺伝をつかさどる本
体であることが明らかになつて以来、制限酵素は
遺伝病解明のための利用や、遺伝子操作による遺
伝物質の大量生産への利用等現在広く用いられて
いる有用な酵素である。制限酵素は種々の微生物
より単離されており、その認識する塩基配列、切
断様式により現在までに約100種類が知られてい
る。
これまでに ↓ 5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−3′ 3′−Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ−5′ ↑ （式中Ｃはシチジン、Ｇはグアノシンを示す） という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断する
制限酵素（以下本酵素と称する）として、ストレ
プトマイセス アクロモゲネス（Streptomyces
achromogenes）ATCC12767が生産するSacお
よびストレプトマイセス スタンフオード
（Streptomyces stanford）の生産するSst
（Nucleic Acids Res.11巻、r135頁、1983年）が
知られている。
発明が解決しようとする問題点 SacおよびSstではその生産量が低いこと、
またSacまたはSstの混入があり、除去が困
難であることなど工業化には問題がある。
本発明の目的はSacおよびSstと同様の塩
基配列の認識部位および切断部位を有する制限酵
素の工業的生産に適した製造法を提供することに
ある。
問題点を解決するための手段 本発明を概説すれば、本発明はグルコノバクタ
ー属に属し、下記ヌクレオチド配列の式中矢印の
部位で特異的に切断する制限酵素生産能を有する
細菌を培養し、得られた培養物より下記ヌクレオ
チド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制
限酵素を採取することを特徴とする制限酵素の製
造法に関する。
↓ 5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−3′ 3′−Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ−5′ ↑ （式中Ｃはシチジン、Ｇはグアノシンを示す） 本発明者らはSacおよびSstと同様の塩基
配列の認識部位および切断部位を有する制限酵素
が新たにグルコノバクター属細菌によつて生産さ
れること、かつ該細菌は該制限酵素以外の制限酵
素を生成しないことから精製を容易に行なうこと
ができることを見い出し本発明を完成した。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明で使用する微生物はグルコノバクター属
に属する本酵素生産菌は全て使用できるが、たと
えば財団法人発酵研究所保存菌グルコノバクター
アルビダス（Gluconobacter albidus）IFO
3251およびグルコノバクター セリヌス
（Gluconobacter cerinus）IFO 3262がある。
培養を行なう場合には、培地組成としては使用
微生物が資化でき、かつ本酵素を生産する炭素
源、窒素源および無機塩等を適宜組合わせて使用
する。培地のPHは3.5〜8.0が好ましい。培養法と
しては振盪培養、撹拌培養、通気培養を用いるこ
とができるが、大量に培養するには通気撹拌培養
が好ましい。培養温度は酵素を生産する範囲内で
変更することができるが、特に好ましくは20℃〜
30℃である。培養時間は、培養条件により異な
り、本酵素の生産量が最高に達するまで培養を行
なう。
本酵素は主として菌体内に生産される。
培養液からの菌体の分離はたとえば遠心分離に
より行なうことができる。
本酵素の抽出、精製は一般の制限酵素精製法に
従つた方法で行なえる。すなわち、菌体を緩衝液
に懸濁後、超音波処理により破砕し、細胞内酵素
の抽出を行なう。次に細胞残渣を超遠心分離によ
り除去後、抽出液を硫酸アンモニウムで塩析す
る。沈殿物をリン酸カリウム緩衝液（PH7.5）に
溶解し、同緩衝液にて透析を行なう。得られる透
析内液をDEAE−セルロースのイオン交換クロマ
トグラフイー、アフイゲルブル−アガロース、ヘ
パリンセフアロースのアフイニテイクロマトグラ
フイーを用いた精製法で本制限酵素を得る。本酵
素の活性測定法を示す。下記表１に示す組成の反
応液50μを予め37℃で予熱した後、本酵素を加
え酵素反応を進める。60分後に酵素反応停止液
（１％SDS、50％グリセロール、0.02％ブロムフ
エノールブルー）を5μ添加して反応を停止さ
せる。
表 １ 10ｍＭ トリス−HCl、PH8.0 ７ｍＭ MgCl2 ７ｍＭ ２−メルカプトエタノール 0.01％ 牛血清アルブミン 1.0μｇ λ−DNA（宝酒造製品） 反応液を１％アガローススラブゲルに重層し、
10V／cmの定電圧下で約１時間から２時間、電気
泳動を行なう。電気泳動用緩衝液は90ｍＭトリス
−ほう酸緩衝液（PH8.3）2.5ｍＭ EDTAを用い
る。
ゲルに前もつて0.5μｇ／mlのエチジウムブロマ
イドを含ませておくことによりUV照射でDNA
のバンドが検出可能である。DNAフラグメント
のバンドの数と量が変化しなくなつた時を終点と
する。
活性の定義は37℃で１時間に1μｇのλ−DNA
を完全に分解する酵素活性を１単位とする。
本発明により得られた本酵素は以下のような理
化学的性質を持つている。
(1) 作用および基質特異性 本酵素は二本鎖デオキシリボ核酸中の ↓ 5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−3′ 3′−Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ−5′ ↑ という塩基配列を認識し、矢印の位置で切断す
る酵素で、公知の制限酵素SacおよびSst
とアイソシゾマーである。
本酵素の認識部位の決定はλ−DNA、
pBR322 DNA、φ×174 RFI DNA（以上宝酒
造製品）とアデノバイラス−２ DNA（ベセス
ダ リサーチ ラボラトリー製品）を基質に用
いて行なつた。その結果、本酵素はλ−DNA
を４カ所、φ×174 RFI DNAを１カ所切断
し、アデノバイラス−２ DNAを25カ所以上
切断した。しかしpBR322 DNAには作用しな
かつた。さらに既知制限酵素Sacをそれら基
質に作用させ、本酵素のそれと切断パターンを
比較したところ同一のパターンを示した。以上
の結果から本酵素の認識するDNA上のヌクレ
オチド配列は5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−
3′であると結論された。
本発明の制限酵素の切断部位の決定には、ア
デノバイラス−２ DNAを、本酵素で切断し
たのち得られるフラグメントの5′末端塩基を決
定する方法と、本酵素認識部位をもつオリゴヌ
クレオチドを合成し、これに本酵素を作用させ
生成物の鎖長から切断部位を決定する方法を用
いた。
詳細は以下のとおりである。
すなわち、アデノバイラス−２ DNAを酵
素標品で完全に分解する。これをアルカリフオ
スフアターゼ（宝酒造製品）で処理して、
DNAフラグメントの末端のリン酸を取り除く。
その後、ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造製
品）と〔γ− 32P〕アデノシン三リン酸を用い
てDNAフラグメントの末端に放射性リン酸を
付加する。これをP1ヌクレアーゼ（ヤマサ製
品）でモノヌクレオチドにまで分解する。これ
をPEI−セルロース薄層プレート（マシエレイ
ナゲル社製品）を用いて分析した。この時検
出された標識された5′モノヌレオチドはグアノ
シンであつた。
一方、セルフコンプリメンタリーの構造をも
つオリゴヌクレオチドｄ（GACCGCGGTC）を
固相法により合成したポリヌクレオチドキナー
ゼと〔γ− 32P〕アデノシン三リン酸を用いて
5′末端に放射性リン酸を付加する。オリゴヌク
レオチドをアニーリングさせて二本鎖DNAと
した後、本酵素で切断し、DEAE−セルロース
薄層プレート（マシエレイ ナゲル社製品）に
より分析した。この時、生成物として鎖長六塩
基（5′−Ｇ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ）の標識され
たスポツトが検出された。
このことから本酵素は ↓ 5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−3′ 3′−Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ−5′ ↑ を認識し矢印の位置で切断していると結論され
た。
(2) 至適酵素活性条件 () 至適温度 至適温度は約37℃であつた。
() 至適PH 至適PHは、PH7.5〜8.5の範囲にある。
() 塩濃度 NaCl、KCl濃度について両者とも20ｍＭ
以上の濃度から阻害される。
() MgCl2濃度 MgCl2濃度が５ｍＭ〜20ｍＭの存在下で酵
素反応が活性化される。
(3) 分子量 約25000±5000 分子量はセフアデツクスＧ−100を用いたゲ
ル過法により測定した。
実施例 以下、本発明を実施例により具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されるものでは
ない。
実施例 １ 200容のジヤーフアーメンターに下記表２に
示す培地160を仕込み常法により培地を滅菌し
た。
上記と同じ培地で26℃で36時間振盪培養したグ
ルコノバクター アルビダス IFO 3251の種培
養液３を上記ジヤーフアーメンターに移植し、
通気量1vvm、撹拌数250rpm、26℃で18時間培養
を行なつた。次いで冷却遠心機を用いて菌体を得
た。培養液160から湿重量にして約640ｇの菌体
が得られた。
表 ２ グルコース ５ｇ グリセロール 15ml イーストエキス ５ｇ ポリペプトン ５ｇ KH2PO4 0.5ｇ K2HPO4 0.5ｇ 脱イオン水 １ PH6.5 得られた200ｇの菌体を1000mlの抽出緩衝液
（20ｍＭトリス−HCl、PH7.5、10ｍM2−メルカ
プトエタノール）に懸濁し、超音波破砕機を用い
て破砕後、100000×ｇで１時間遠心分離を行な
い、残渣を除去、抽出液を得た。
得られた抽出液に硫酸アンモニウムを80％飽和
になるように加え、沈殿物を遠心分離にて集め、
緩衝液Ａ（10ｍＭリン酸カリウム緩衝液、PH7.5、
10ｍM2−メルカプトエタノール、５％グリセロ
ール）に溶解後、同緩衝液Ａで一晩透析を行なつ
た。
次に透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させてお
いたDEAE−セルロース（ワツトマン製品DE52）
のカラム（65×95mm）に吸着させ、緩衝液Ａで洗
浄後、０〜0.6Mの塩化カリウムの直線濃度勾配
を持つ緩衝液Ａで溶出させると0.15〜0.23Mの塩
化カリウム濃度画分に本酵素の活性が検出でき
た。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ａで一晩
透析後、透析内液を予め緩衝液Ａで平衡化させて
おいたアフイゲルブルーアガロース（バイオラツ
ド製品、100〜200mesh）のカラム（25×100mm）
に吸着させ、緩衝液Ａで洗浄後０〜1.0Mの塩化
カリウムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ａで溶出さ
せると、0.44〜0.66Mの塩化カリウム濃度画分に
本酵素の活性が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ、緩衝液Ｂ（20
ｍＭリン酸カリウム緩衝液、PH7.5、10ｍM2−メ
ルカプトエタノール、10％グリセロール）で一晩
透析後、透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させて
おいたヘパリン−セフアロース（フアルマシア製
品、CL 6B）のカラム（10×130mm）に吸着さ
せ、緩衝液Ｂで洗浄後、０〜0.8Mの塩化カリウ
ムの直線濃度勾配を持つ緩衝液Ｂで溶出させると
0.20〜0.26Mの塩化カリウム濃度画分に本酵素の
活性が検出できた。
次に得られた活性画分を合わせ緩衝液Ｂで一晩
透析後、透析内液を予め緩衝液Ｂで平衡化させて
おいたヘパリン−セフアロース（フアルマシア製
品、CL 6B）のカラム（５×50mm）に吸着させ、
緩衝液Ｂで洗浄後、0.5Mの塩化カリウム濃度を
持つ緩衝液Ｂで溶出させ、本酵素の最終標品とし
て得た。
この酵素標品には非特異的なDNA分解酵素お
よびホスフアターゼは夾雑していなかつた。
以上述べた方法により200ｇの湿菌体より75000
単位の活性単位を得た。
発明の効果 以上詳細に説明したとおり、本発明によりSac
およびSstと同様の塩基配列の認識部位およ
び切断部位を有する制限酵素の工業的に有利な製
造法が提供された。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ グルコノバクター属に属し、下記ヌクレオチ
    ド配列の式中矢印の部位で特異的に切断する制限
    酵素生産能を有する細菌を培養し、得られた培養
    物より下記ヌクレオチド配列の式中矢印の部位で
    特異的に切断する制限酵素を採取することを特徴
    とする制限酵素の製造法。 ↓ 5′−Ｃ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ−3′ 3′−Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｃ−5′ ↑ （式中Ｃはシチジン、Ｇはグアノシンを示す）
JP59202199A 1984-09-27 1984-09-27 制限酵素の製造法 Granted JPS6178382A (ja)

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GB08521891A GB2164946B (en) 1984-09-27 1985-09-03 New restriction enzyme and process for producing the same
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JPS5860986A (ja) * 1981-10-05 1983-04-11 Yakult Honsha Co Ltd 新規制限酵素及びその製造法

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US4668631A (en) 1987-05-26
DE3530218A1 (de) 1986-04-03
GB2164946B (en) 1988-11-09
DE3530218C2 (ja) 1988-03-31
GB2164946A (en) 1986-04-03

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