JPH04228069A - クラスｉｉ−制限酵素、その作成法及び、相補的二本鎖ｄｎａ−配列の認識及び切断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規のクラスＩＩ−制限
酵素ＳｗａＩ、その作成法及びその使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】クラスＩＩ−制限酵素は、特定のＤＮＡ
−配列を認識し、切断することのできるエンドデオキシ
リボヌクレアーゼである。この場合標的配列中の２つの
ホスホジエステル結合、すなわち各ポリヌクレオチド鎖
につき１つずつを加水分解する。従ってクラスＩＩ−制
限酵素はＤＮＡ−分子の解析にとって重要である。多く
のＤＮＡ−配列に対して特異的なクラスＩＩ−制限酵素
はすでに公知であるが、ＤＮＡ−配列に対して特異的で
また公知の制限酵素のいずれからも従来認識し得ない別
のクラスＩＩ−制限酵素を作成することの必要性はなお
依然して存在する。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、従来
この種のいずれの酵素からも認識することのできなかっ
た配列を特異的に認識し、切断することのできる新規の
制限酵素を提供することを根本課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】この課題は本発明によれ
ば、認識配列及び標識によって特定された切断位置：

【
０００５】

【化４】

【０００６】を有するクラスＩＩ−制限酵素によって解
決される。

【０００７】本発明による新規制限酵素（以後ＳｗａＩ
と記載する）は２５℃の最適温度を有する。この酵素は
トリス／ＨＣｌ−緩衝液（ＤＴＥ（ジチオトレイトール
）１．０ｍモル／ｌ、ＭｇＣｌ１０ｍモル／ｌ及びＮａ
Ｃｌ１００ｍモル／ｌを有する）５０ｍモル／ｌ中でｐ
Ｈ７．０〜ｐＨ８．０間で良好な活性を有する。最適ｐ
ＨはｐＨ７．５である。

【０００８】認識配列はウイルス：ＳＶ４０及びアデノ
２、ファージ：ラムダ、Ｔ７及びファイＸ１７４、及び
ファージ誘導体：Ｍ１３ｍｐ７並びにプラスミドｐＢＲ
３２２及びｐＢＲ３２８の各ＤＮＡを完全に消化するこ
とによって確認することができる。これらのＤＮＡ−分
子はＳｗａＩで処理される。

【０００９】第Ｉ表は次の配列：５′−ＡＴＴＴＡＡＡ
Ｔ−３′ を認識する酵素に関し、実験的に観察された切断位置特
異性を、コンピュータで決定された切断位置特異性と比
較して示すものである。

【００１０】

【表１】

【００１１】酵素の認識配列内の切断位置をＭ１３−誘
導体で決定するが、この場合誘導体は普遍的な配列決定
プライマー［メッシング（Ｊ．Ｍｅｓｓｉｎｇ）その他
の論文（１９８１）、“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　　Ｒｅ
ｓ．”９、３０９〜３２１］の結合位置に対して約３０
〜２００塩基の間隔でこの認識配列を有する。まずＭ１
３−誘導体の一本鎖ＤＮＡで普遍的な配列決定プライマ
ーを用いてチエインターミネーター法により配列反応を
行う（サンガー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ）その他、（１９７
７）、“Ｐｒｏｓ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ”、７４、５６０〜５６４、メッシング（Ｊ．Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ）その他、（１９８１）、“Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ　　Ｒｅｓ．”、９、３０９〜３２１）。

【００１２】これと並行して配列決定プライマーを、Ｔ
４−ポリヌクレオチド−キナーゼ及び［γ−３２Ｐ］Ａ
ＴＰでその５′−末端を放射能で標識する。５′−末端
を標識した配列決定プライマーを一本鎖Ｍ１３−ＤＮＡ
に混成した後、ＤＮＡポリメラーゼＩ、（クレノウ酵素
）及び、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰか
らなるデオキシヌクレオチド三リン酸混合物と取込反応
を実施することにより、部分的に二本鎖ＤＮＡを作成す
る。新たに合成された鎖が５′−末端を放射能で標識さ
れているこのＤＮＡを、制限酵素ＳｇｒＡＩで切断する
。切断産物の半分を付加的に更にＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼで４種のデオキシヌクレオチド三リン酸のすべてから
なる混合物の存在において処理することにより、平滑な
ＤＮＡ−末端を得る。

【００１３】反応生成物の解析は配列決定ゲル（尿素８
モル／ｌ、５％ポリアクリルアミド）での電気泳動及び
その後のオートラジオグラフィにより行う。その結果の
解説はブラウン（Ｎ．Ｌ．Ｂｒｏｗｎ）及びスミス（Ｍ
．Ｓｍｉｔｈ）（“Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ”、６５（１９８０）、３９１〜４０１
）によって行われている。放射能で標識した断片の鎖長
を配列リーダと比較することによって切断位置を決定す
る。付加的にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理したプロー
ブはＳｗａＩで切断されたプローブと比較した際各バン
ドの同一鎖長を示す。これによりＳｗａＩは平滑なＤＮ
Ａ−末端を生じることが明らかである。ＳｗａＩの切断
は従って次の特異性を有する標識配列内で行われる：

【
００１４】

【化５】

【００１５】実験的に決定された切断位置の数は、配列
５′−ＡＴＴＴＡＡＡＴ−３′ に関し種々のＤＮＡでコンピュータ解析することによっ
て得られた切断位置の数と一致する（第Ｉ表）。付加的
にこれらのデータを更に“Ｇｅｎｅ”、１０（１９８０
）３５７〜３７０からの各表と比較した。

【００１６】ＳｗａＩは有利には、ブドウ球菌（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、有利にはスタフィロコッ
カス・ワルネリ（ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＷａｒ
ｎｅｒｉ）種の微生物を培養し、この酵素を細胞から得
ることによって、作成することができる。スタフィロコ
ッカス・ワルネリＤＳＭ５８７２を使用するのが特に有
利である。微生物スタフィロコッカス・ワルネリはドイ
ツ微生物寄託局（ＤＳＭ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　
　Ｗｅｇ１６、３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｂ
ＲＤ在）に寄託され、寄託番号ＤＳＭ５８７２を有する
。

【００１７】この作成には通常の生化学精製法を使用す
ることができ、この場合その都度得られた分画で酵素の
存在を、その認識配列の切断により容易に検出すること
ができる。基質としては例えばアデノ２−ＤＮＡが適し
ている。得られたＤＮＡ−断片はアガロースゲル内で断
片分離に常用の緩衝系において臭化エチジウムの存在で
電気泳動的に分離する。

【００１８】酵素を作成するために使用した微生物はＤ
ｉｆｃｏ社製の脳−心臓−浸出培地中で好気的に成長さ
せる。最適の成長条件は３７℃、ｐＨ６．５〜７．５で
ある。倍加時間は約３時間である。

【００１９】酵素を分離し、通常の化学的及び機械的方
法により、例えば高圧分散、超音波又は酵素的破壊によ
って精製する。本発明による方法の１つの優れた実施態
様では細胞をフレンチプレスを介して破壊する。上澄み
の他の精製はアフィニティ−クロマトグラフィ及びイオ
ン交換クロマトグラフィを介して実施するのが有利であ
る。アフィニティクロマトグラフィ用の材料としては例
えばヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ社製）が適当である。適当な陽イオン交換体は例
えばホスホ−セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ社製）である
。陰イオン交換体としてはＤＥＡＣファスト−フロー（
ＤＥＡＣ　　ｆａｓｔ−ｆｌｏｗ）の商品名で市販され
ている生成物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）が適している
。しかし当業者に公知の他のクロマトグラフィ材料もま
た適している。

【００２０】

【実施例】次の各実施例により本発明を更に詳述する。

【００２１】例　　１ スタフィロコッカス・ワルネリＤＳＭ５８７２を３７℃
で１２〜１５時間培養し、対数期の終りに収集する。培
地としては脳−心臓培地（Ｂｒａｉｎ　　Ｈｅａｒｔ　
　Ｍｅｄｉｕｍ、Ｄｉｆｃｏ社製）を使用する。

【００２２】細胞パスタ（生重量３０ｇ）を、プロテア
ーゼインヒビターを含む緩衝液Ａ（トリス−ＨＣｌ４０
ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０、ＥＤＴＡ０．１ｍモル／ｌ、
２−メルカプトエタノール７ｍモル／ｌ）２．４容量に
再度懸濁させる。引続き細胞をフレンチプレスの反復工
程によって２３，０００ｌｂ／ｉｎ２で破壊し、沈殿を
分離する。上澄みにＮＨ４Ｃｌを加える（最終濃度０．
１モル／ｌ）。ポリミン−沈殿によって核酸を除去する
。引続き遠心分離した上澄みをヘパリン−セファロース
カラムで分画する。溶出するためＮａＣｌ０〜１モル／
ｌの勾配を使用する。ＳｗａＩはＮａＣｌ０．４〜０．
６モル／ｌの分画中に認められる。活性分画を緩衝液Ｂ
（トリス−ＨＣｌ４０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０；ＥＤＴ
Ａ０．１ｍモル／ｌ；２−メルカプトエタノール７ｍモ
ル／ｌ；１０％（ｗ／ｖ）グリセリン）に対して平衡化
し、ＤＥＡＥ−ファスト−フローカラムで分画する。溶
出するためＮａＣｌ０〜０．５モル／ｌの勾配を使用す
る。活性分画を緩衝液Ｂに対して透析する。

【００２３】引続きこれを、緩衝液Ｂで平衡化したホス
ホセルロース−カラムに装入する。溶出のため緩衝液Ｂ
でＮａＣｌ０〜１モル／ｌの勾配を使用する。ＳｗａＩ
はＮａＣｌ０．３〜０．５モル／ｌの分画中に認められ
る。

【００２４】各活性分画を収集し、貯蔵緩衝液（トリス
−ＨＣｌ２０ｍモル／ｌ、ｐＨ８．０；２−メルカプト
エタノール１０ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ１００ｍモル／ｌ
、ＥＤＴＡ０．１ｍモル／ｌ及び５０％（ｖ／ｖ）グリ
セリン）に対して透析する。 例　　２ 活性の測定 酵素単位の特定：ＳｗａＩ１Ｕは、最終容量２５μｌで
アデノ２−ＤＮＡ１μｇを２５℃で１時間以内に切断す
る。

【００２５】インキュベーション緩衝液（トリス−ＨＣ
ｌ５００ｍモル／ｌ、ｐＨ７．５、３７℃、塩化マグネ
シウム１００ｍモル／ｌ、ＮａＣｌ１モル／ｌ及びＤＴ
Ｅ１０ｍモル／ｌ）２．５μｌの混合物に、水１７．９
μｌ及びアデノ２−ＤＮＡ（光学密度：５．６ＯＤ／ｍ
ｌ）３．６μｌ並びにＳｗａＩ−溶液（１Ｕ／μｌ）１
μｌを加える。この溶液を２５℃で１時間インキュベー
トし、氷上で冷却し、尿素７ｍモル／ｌ、２０％（ｗ／
ｖ）サッカロース、ＥＤＴＡ６０ｍモル／ｌ及び０．０
１％（ｗ／ｖ）ブロムフェノールブルーからなる停止−
試薬５μｌを加える。引続き分離を電気泳動法により１
％アガロースゲル中で１００Ｖで３〜４時間行う。得ら
れたバンドをＤＮＡ長さの基準と比較して同定する。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　認識配列及び標識によって特定された
   切断位置： 【化１】 を有するクラスＩＩ−制限酵素。
2. 【請求項２】　　スタフィロコッカス・ワルネリ（Ｓｔ
   ａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓＷａｒｎｅｒｉ）ＤＳＭ５８
   ７２から得ることのできる請求項１記載の制限酵素。
3. 【請求項３】　　認識配列及び標識によって特定された
   切断位置： 【化２】 を有するクラスＩＩ−制限酵素を得るに当り、ブドウ球
   菌属の微生物を培養し、酵素を細胞から得ることを特徴
   とするクラスＩＩ−制限酵素の作成法。
4. 【請求項４】　　スタフィロコッカス・ワルネリＤＳＭ
   ５８７２を培養する請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】　　認識配列及び標識によって特定された
   切断位置： 【化３】 を有するクラスＩＩ−制限酵素を使用することを特徴と
   する、相補的二本鎖ＤＮＡ−配列：５′−ＡＴＴＴＡＡ
   ＡＴ−３′の認識及び切断法。