JPS6398383A - 制限エンドヌクレア−ゼＭｒｏＩ及びその生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、制限エンドヌクレアーゼＭｒｏＩ及びその生
産方法に関するものである。

［従来の技術］ 第１Ｉ型制限酵素は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）鎖中
のある特定の塩基配列を認識して切断する極めて特異性
の高い制限エンドヌクレアーセである。

この様な第１Ｔ型制限酵素は、その優れた特異性に注目
され遺伝子工学の分野で幅広く利用されている。即ちＤ
ＮＡを特定の位置で切断して希望する遺伝子を取り出し
、それを大腸菌、枯草菌又は酵母等の微生物に組込み、
目的生産物を大量に生産する遺伝子操作や遺伝子構造の
解析研究等において、前記第１Ｉ制限酵素は極めて重要
な役割を担っているのである。

一方上記制限酵素の基質となるＤＮＡは、その塩基配列
等における多様性に起因して様々な種類があるので、特
異性の異なる各種の第１Ｉ型制限酵素が必要となり、多
様で且つ高品質の制限酵素が安価に供給されることが望
まれている。そして現在までのところ、細菌等の原生生
物から各種の第１Ｉ型制限酵素か単離されており、既に
約１００種類のものが知られており、その酵素化学的性
質が明らかにされている。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｆｌのある特定の塩基
配列を認識してこれを切断する様な極めて特異性の高い
新規な制限エンドヌクレアーゼ及びその生産方法を提供
することにある。

［問題点を解決する為の手段］ 本発明の第１Ｉ制限酵素は、次の理化学的性質を有する
制限エンドヌクレアーゼである。

（ａ）作用及び基質特異性 二重鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列：↓ ５’　−ＴＣＣＧＧＡ−３’ ３’　−ＡＧＧＣＣＴ−５’ ↑ （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
、Ｃはシチジンを夫々示す）を認識し、上記の矢印の位
置で切断する。

（ｂ）至適ｐＨ６，５〜８．５ （ｃ）安定ｐ　Ｈ６，０〜９．０ （ｄ）至適温度　　　　２５〜３５℃ 又木発明は、ミクロコツカス属に属する制限エンドヌク
レアーゼＭｒｏＴ生産菌を栄養借地で培養し、培養物か
ら次の理化学的性質を有する制限エンドヌクレアーゼＭ
ｒｏＩを採取する点に要旨を有する制限エンドヌクレア
ーゼの生産方法である。

（ａ）作用及び基質特異性 二重鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列・↓ ５’　−ＴＣＣＧＧＡ−３’ ３’　−ＡＧＧＯＣＴ−５’ ↑ （式中Ａはアゾリジン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
、Ｃはシチジンを夫々示す）を認識し、上記の矢印の位
置で切断する。

（ｂ）至適ｐ　Ｈ６，５〜８．５ （ｃ）安定ｐ　Ｈ６，０〜９．０ （ｄ）至適温度　　　　２５〜３５℃ ［作用］ 本発明者らはミクロコツカス（Ｍ　１ｃｒｏｃｏｃｃｕ
ｓ）属細菌における生化学的研究の一環として第１Ｉ制
限酵素（制限エンドヌクレアーゼ）の検索を行なってい
たところ、ミクロコツカス・ロゼウスＳ（Ｍ　１ｃｒｏ
ｃｏｃｃｕｓ　ｒｏｓｅｕｓ　Ｓ　）菌が新規な制限エ
ンドヌクレアーゼＭｒｏＩを生産することを見出し、本
発明を完成するに至った。そして上記の菌株は工業技術
院微生物工業研究所に寄託されている（受託番号：微工
研菌寄第８９９６号）。

従来、同一の微生物から特異生の異なる２種以上の制限
エンドヌクレアーゼが生産されることがあるのは良く知
られているところであった。そして２種以上の酵素を相
互に分離することは困難である為、上述の様な状況は工
業化における大きな障害となっていることも良く知られ
ているところであった。従って制限エンドヌクレアーゼ
生産菌の工業的生産においては、生産性が高く且つ単一
の酵素を生産する微生物の開発が望まれているのが実情
である。

これに対し、本発明の制限エンドヌクレアーゼＭｒｏＩ
（以下、本酵素と呼ぶこともある）は上記菌から単一で
生産されるものであるので、本酵素の生産菌は工業的生
産に最適の菌種と言うことができる。又本酵素は後述す
る様な新規な特異性を有しているので、遺伝子ＤＮＡの
構造と機能を研究する為の生化学試薬として、或は遺伝
子免疫の解析や遺伝子組換え研究等に極めて有効な指針
を与えるものである。

本発明で用いられる微生物（本酵素生産菌）としては、
ミクロコツカス属に属する本酵素生産菌であれば全て使
用することができるが、前述したミクロコツカス・ロゼ
ウスＳが最適である。

一方、上記生産菌を培養する方法としては、現在行なわ
れている最も一般的な方法を採用すれば良い。例えば窒
素源としてポリペプトン、肉エキス、アミノ酸、カゼイ
ン分解物、酵母エキス、麦芽エキス等；炭素源としてブ
ドウ糖やグリセロール等：無機塩類として燐酸塩、硫酸
塩、マグネシウム塩等を任意に含有する培地に、前記生
産菌を接種し、２５〜３５℃程度の温度においてジャー
ファメンタ等で通気培養する方法が挙げられる。

尚培養中にはｐＨが低下することもあるが、この場合に
はアルカリで中和しながら培養する様にしてもよいのは
勿論である。

そして対数期から定常期初期において集菌し、菌体な適
当な緩衝液で洗浄した後、超音波破砕し、更に遠心分離
することによって無細胞抽出液が得られる。

得られた無細胞抽出液に、ストレプトマイシン硫酸塩処
理又はポリエチレンイミン処理或はアンモニウム分画を
行ない、透析後、ホスホセルロースやＤＥＡＥセルロー
スによるイオン交換クロマトグラフィー法、又はヘパリ
ンセファロースによるアフィニティクロマトグラフィー
或はセファクリル５−２００ゲル濾過法等によって本酵
素が精製できる。

この様にして得られる本酵素は、下記の理化学的性質を
有する。

（１）作用及び基質特異性 下記の手順に従い、本酵素の作用及び基質特異性を調査
した。

まず酵素反応の基質として、プラスミドｐＢＲ３２２，
アデノウィルス−２ＤＮＡ及びλ−ＤＮＡを用いて酵素
反応を進行させ、酵素反応後の生成部位をアガロースゲ
ル電気泳動で処理した。

その結果を第１図に示すが、本酵素の作用によって断片
化したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動図が得られた。

その結果、本酵素はえ−ＤＮＡを２４カ所、アデノウィ
ルス−２ＤＮＡを８カ所、ｐＢＲ３２２ＤＮＡを１カ所
で切断することが分かった。

次に、本酵素の認識する塩基配列及び切断様式％式％ まずプラスミドｐＢＲ３２２５０μｇを本酵素で切断し
、切断ＤＮＡフラグメントをアルカリフォスファターゼ
で処理してＤＮＡフラグメント末端の燐酸を取り除いた
。その後、（γ−３２Ｐ）−ＡＴＰをポリヌクレオチド
キナーゼで作用させて５′末端を放射性燐酸で標識した
。その後、放射性燐酸で標識したＤＮＡ断片を使用し、
本酵素によって切断された部位付近の塩基配列をヌキサ
ム・ギルバート法によって決定した。

この結果を第２図に模式的に示すが、第２図の結果から
明らかである様に、本酵素は５′−ＴＣＣＧＧＡ−３’
の塩基配列を認識し、矢印Ｘ、Ｙの位置（第２図参照）
で切断することが分かった。

次に下記の手順に従って第２図に示した切断状況を確認
した。

まず本酵素によって、λ−ＤＮＡを完全に消化した。こ
れをアルカリフォスファターゼで処理してＤＮＡフラグ
メントの末端の燐酸を取り除いた後、ポリヌクレオチド
キナーゼとγ−３２Ｐ−ＡＴＰとを用いてＤＮＡフラグ
メントの末端に放射性燐酸を標識した。その後Ｐ１ヌク
レアーゼでモノヌクレオチドまで分解し、ＰＥｌ−セル
ロース薄層クロマトプレートを用いて分析した。その結
果、標識された５′−モノヌクレオチドはシトシンであ
ることが分かり、これは第２図に示した矢印Ｘ、Ｙの位
置で切断されることを示すものである。

本発明は上述した様な作用及び基質特異性を有するもの
であるが、その他下記に示す理化学的性質を有すること
が確認された。

（２）至適ｐＨｐＨ６，５〜８．５ （３）安定ｐＨｐＨｆｉ、ｏ〜９．０ （４）至適温度　　　２５〜３５℃ （４０℃では活性が低下する） （５）塩濃度　　　　　ＮａＣ１，ＫＣＩ濃度が３００
ｍＭまでは本酵素の活性 が維持されるが、それ以上では 阻害される。

（６）金属塩　　　　　ＭｇＣ１は必須であり、１０ｍ
Ｍの濃度が最適である が、２０ｍＭ以上では阻害され る。又ＭｎＣｌ２によっても賦 活されるが、Ｍｇ　２＋より劣る。

［実施例］ ミクロコツカス・ロゼウスＳを本酵素生産菌として用い
、ポリペプトン（犬五宋養化学社製）１％、肉エキス（
極東社製）１％、ＮａＣ１０，５％及び酵素エキス（大
玉栄養化学社製）０．３％を含むブイヨン培地（ｐ　Ｈ
６，８）　１　ｕで３０’Ｃ×４０時間培養しく５Ｊ２
容量の３角フラスコ）、菌体重量（湿菌体）　７．２３
ｇの本酵素生産菌が得られた。得られた菌体を４０ｎｌ
の燐酸緩衝液（ＰＨ７，０）に懸濁し、２００Ｍｇ／ｍ
ｕリゾチームー１ｍＭ　　ＮａＮ５を（２５μｇ／ｍｅ
）　ＰＭＳ　Ｆになる様に加え、０℃で３０分間反応さ
せた後、更に食塩を０．４Ｍ　　ＮａＣ１となる様に加
え、超音波処理（２００Ｗ、２０分間）した後２７００
０ｒｐｍＸ６０分の超遠心分離で上澄液を得た。得られ
た上澄液に１０ｍＭの燐酸緩衝液を加え、約０．２　Ｍ
ＮａＣｌとなる様に希釈した。希釈した酵素溶液をホス
ホセルロース（ワットマンＰ１１）のカラム（１，５Ｘ
　１　Ｂｃｍ）に吸着させ、７倍量のＭ衝液で洗浄後、
０．２〜１．０　Ｍ　　ＮａＣ１グラジェント溶出を行
なった。

その結果を第３図に示すが、第３図から明らかな様に、
ＮａＣ１濃度が０．３４〜０．４４Ｍ付近における溶出
画分に酵素活性が検出された。

次に、溶出した酵素液を透析チューブに入れてポリエチ
レングリコール６０００の粉末に対して濃縮し、更に１
０ｍＭの燐酸緩衝液（５０％グリセロールを含む）に透
析して０．６ｍｅの酵素液を得た。得られた酵素液の酵
素活性を測定したところ、約３０００単位であった。尚
酵素活性の測定は、下記の方法に準じた。即ち、１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、　１０ｍＭＭ
ｇＣ１２，１００ｍＭ　　ＮａＣ１，７ｍＭメルカプト
エタノール及び０．０１％ＢＳＡの反応液中で、λ−Ｄ
　Ｎ　Ａ　１．０Ｍｇを３５℃×６０分間反応させ、Ｄ
ＮＡを完全分解する酵素量を１酵素量位（ユニット）と
した。

この様にして菌体７．２３ｇから約３０００ユニツトの
酵素液が得られたのであるが、得られた酵素液には非特
異的なりＮＡ分解酵素であるホスファターゼ等は全く混
入していなかった。

［発明の効果］ 以上述べた如く本発明によれば、Ｄ　Ｎ　Ａ　＠９４の
ある特定の塩基配列を認識してこれを切断する様な、極
めて特異性の高い新規な制限エンドヌクレアーゼが得ら
れると共に、その生産方法においても工業的価値の高い
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種基質に対して本酵素を作用させた場合のア
ガロースゲル電気泳動図、第２図はプラスミドｐＢＲ３
２２に本酵素を作用させた場合の切断前後の塩基配列を
示す模式図、第３図は本酵素溶液なホスホセルロースカ
ラムクロマトグラフィで溶出させた場合の結果を示すグ
ラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の理化学的性質を有することを特徴とする制限
   エンドヌクレアーゼＭｒｏ I 。 （ａ）作用及び基質特異性 二重鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列： ５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′ ３′−ＡＧＧＣＣＴ−５′ （式中Ａはアデノシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
   、Ｃはシチジンを夫々示す） を認識し、上記の矢印の位置で切断する。 （ｂ）至適ｐＨ６．５〜８．５ （ｃ）安定ｐＨ６．０〜９．０ （ｄ）至適温度２５〜３５℃
2. （２）ミクロコッカス属に属する制限エンドヌクレアー
   ゼＭｒｏ I 生産菌を栄養培地で培養し、培養物から次
   の理化学的性質を有する制限エンドヌクレアーゼＭｒｏ
   I を採取することを特徴とする制限エンドヌクレアー
   ゼＭｒｏ I の生産方法。 （ａ）作用及び基質特異性 二重鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列： ５′−ＴＣＣＧＧＡ−３′ ３′−ＡＧＧＣＣＴ−５′ （式中Ａはアデリシン、Ｇはグアノシン、Ｔはチミジン
   、Ｃはシチジンを夫々示す） を認識し、上記の矢印の位置で切断する。 （ｂ）至適ｐＨ６．５〜８．５ （ｃ）安定ｐＨ８．０〜９．０ （ｄ）至適温度２５〜３５℃
3. （３）ミクロコッカス属に属する制限エンドヌクレアー
   ゼＭｒｏ I 生産菌がミクロコッカス・ロゼウスＳであ
   る特許請求の範囲第２項に記載の制限エンドヌクレアー
   ゼＭｒｏ I の生産方法。