SU908793A1 - Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 - Google Patents
Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 Download PDFInfo
- Publication number
- SU908793A1 SU908793A1 SU792822401A SU2822401A SU908793A1 SU 908793 A1 SU908793 A1 SU 908793A1 SU 792822401 A SU792822401 A SU 792822401A SU 2822401 A SU2822401 A SU 2822401A SU 908793 A1 SU908793 A1 SU 908793A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- dna
- minutes
- plasmid
- cells
- mixture
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
(54) ШТАММ ESCHERiCHiA COli В834 (r . т ), НЕСУЩИЙ , ПЛАЗМИДУ RS F2I24-TECT-СУБСТРАТ ДЛЯ РЕСТРИКЦИОННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЕСО R 11
1
Изобретение относитс к микробиолопсческой промь1шленности и представл ет собой штамм Escherichia coli, несущий плазмиду, используемую как тест.-субстрат дл определеии активности фермента при вьщелении и очистке рестрикционной эндоиук еазы Есо В 11, котора используетс в молекул рной биологии и генной инженерии.
Одиим из последних достижений молекул риой биологии в последнее врем вл етс создание методов, которые позвол ют получать рекомбинантные ДНК in vitro.
Рестрикциоиные эндоиуклеазы стали мощным инструментом при создании рекомбинантиых ДНК in vitro, а также дл излучени первичной структуры и физического картировани ДНК. Позтому прогресс в молекул рной биологии и генной инженерии обусловлен прогрессом в области изучени и выделени ферментов рестрикционных зндопуклеаз.
Среди рестрикционных зндонуклеаз, особое место занимает рестрикционна : ндонуклеаза Есо R II, котора узнает последовательность 5 ЦЦ ГГЗ (1.Однако рестриктаза Есо R 11 - это мелкощеп ща зндонуклеаза, ДНК фага л мбда, она расщепл ет iSortee чем на 35 фрагментов, в то врем как друга широко используема рестриктаза Есо R 1 -на 6 фрагментов.
Таким образом, при выделении и очистке Есо R 11 практически невозможно оценить активность электрофорезом при использовании ДНК фага л мбда. Множество фрагментов, образующихс при гидролизе ДНК фага л м10 бда рестриктазой Есо R 11, не дает сной картины о степени гидролиза ДНК.
Дл определени активности Есо R 11 требуетс ДНК-субстрат с небольшим молекул рным весом, иа роль такой ДНК могут
15 подойти ДНК плазмцц.
Такими ДНК-субстратами могут быть ДНК амплифицируемых, дающих множество копий ДНК на клетку, плазмид, например известна плазмида RS F2124, молекул рный
Ш вес 7,4 мегадальтон 2.
Claims (3)
- Однако эти плазмидные ДНК наход тс в штаммах Е. coli К, которые имеют специфический фермент ДНК-цитозин метилазу. Фермент MCTHJtHpyeT iiHioimi н JUIK и 1аким образом пеласг JIMK irjiaiMwi устойчивым к действию р -стрик1шоииой )нлонуклса)ы Fko R 11 3. Поэтому плагмнды, наход щиес в этих штаммах, нг могут служить субстратом дл 1;х:о R П. Лл этих целей лриюдны ДНК, если они выделены н) штамма, не содержаще го ДНК-11Итоз шмстилазу. Предлагаемый титамм характеризуетс следующими признаками. Мор }ю;101ические признаки. Клегки пр мы . налочкопидной формы, 1,1-1,5x2,0-6,0 мк, подвижные с перитрихиальными жгутиками, I рамотрикательные, неспороносные. Культуральные признаки. Хорошо растут на простых питательных средах. При росте на м со-пептонном агаре, питательном агаре Лифко, минимальном агаре Дэвиса с глюкозой и казаминовыми кислотами - колонии гладкие, круглые, прижатые, блест щие, серые край ровный, мутные (на синтетических средах -- более слизистые и мутные). При росте в жидких средах: м со-пептонный бульон, бульон Дифко, минимальный М9 с глюкозо и казаминовыми кислотами образуют ровную интенсивную муть. Физиолого-биохим}р4еские признаки штамм Растет в пределах от 4 до 45С при оптимум рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника углерода использует многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу, d-фрукгозу, сахарозу, арабииозу, ксилозу, лак тозу, трегалозу. Пс усваивает адетат, адамит, галактозу, в средах с глюкозой активно подкисл ет с образованием газа. В качестве источника азота используют ка минимальные соли в аммонийной и нитратной форме, так в органической форме в виде пеп тона, аминокислот. Нитраты восстанавливает д нитритов. Желантину не разжижает. Уреазна активность не обнаруживаетс . Индол не образует. Про вл ет устойчивость к антибиотикам - ампициллину (25 мкг/мл). Пример 1. Выледение плазмидной ДНК. Клетки, содержапще плазмиду, выращиваю в 5(Ю мл бульона до плотности 0,6 (ФЭК. светофильтр № 6, кювета 0,5 см). Затем клетки собирают центрифугированием (6000 20 мин), суспендируют в 4 мл 25%-нойг сахарозы в 50 мм трис-НС1, рН 3,0, иобавл ки 1,2 мл лизогшма (10 мг/мл) и 1шкубир ют 10 мин во льду при перемешива К смес-и добавл ют 2,4 мл 0.25 М ЭДТА ( рН 8.0), оставл ют во льду на 10 мии, а мтгм доГпнп ни последовательно 2,6 мл 5М pacrnnria NaCI и 1,2 м.л 10%-ного раствора одецилсульфата нагри , шжубируюг во льду в течение 5-7 ч. Осветле1гаые лизаты получают центрифугированием смеси при 16000 д в течение 1 ч. К экстрактам добавл ют CsCl из расчета 0,94 г на I мл и бромид этиди до конечной кондонтрации 200 мкг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44000 об/мин в течение 40 ч в роторе Ti 50. Нижнюю, прокрашенную бромистым этидием зону, собирают по капл м, прокалыва пробирку под зоной. Бромид этили удал ют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом. Полученную ДНК диализуют против 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 20 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Пример
- 2. Трансформаци плазмидиой ДНК. В 100 мл бульона внос т 1 мл культуры Е. coli В834 и выращивают до плотности 0,4. После охлаждени клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мл NaC1. После 20 мин инкубации во льду клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объеме 75 мМ CaClj. Клетки инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием. Осадок рс(.успендируют в I мл 75 мМ Са Clj. К 0,2 мл суспензии полученных клеток добавл ют 0,1 мл ДНК плазмиды RS F2I24, инкубируют во льду 20 мин. Затем смесь подвергают 2 мин обработке при 42°С и выдерживают 15 мин при , Смесь разбавл ют в 10 раз бульоном, подращивают клетки 30 мин при 37 С и отбирают по 0,1 мл суспензии, затем высевают на чашки с питательным агаром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина. Пример
- 3. Определение активности рестрикционной эндонуклеазы Бсо R 11, К 1 мкг ДНК в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС1 , рН 7,5, 10 мМ MgClj, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, добавл ют 5 мкл эндонуклеазы Есо R 11, общий объем смеси составл ет 40 мкл. Гидролиз ведут при 37°С в течение 15 мин. Полученные фрагменты ДНК анализируют с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном пластиичатом геле в трисацетатиом буфере, рН 8,0. Предалагемый штамм, несущий плазмиду, котора может быть использована в качестве тест-субстрата дл рестрикционной эндонуклеазы Есо R 11, обеспечивает возможность определени и оценки активности фермента не только очищенного, но и в грубых экстрактах. Формула изобретени Штамм Escherichia coli В834 (r , гп), несущий плазмиду RS Р2124-гест-субс1рэг дл рестрикционной эндонуклеазы Есо R It.5 908793, дХранитс во Всесоюзной коллегии мккро- I. Bigger С. Н. et. ai. rattir New Bloloорганизмов при Институте биохимии и физио-jy. 1979, v. 244, p. 7-10.логии микроорганизмов АН СССР под номером2. Sfe М. et. a1. Mol. Gen. Genetic. 1975ВКМВ-1442Д.V. 142, p. 239.Источники 1шформащш,5 3. Гусейнов О. А. к др. Биохими , т. 43.прин тые во внимание при экспертизе1978. 1718 (прототип).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792822401A SU908793A1 (ru) | 1979-09-17 | 1979-09-17 | Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU792822401A SU908793A1 (ru) | 1979-09-17 | 1979-09-17 | Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU908793A1 true SU908793A1 (ru) | 1982-02-28 |
Family
ID=20851771
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU792822401A SU908793A1 (ru) | 1979-09-17 | 1979-09-17 | Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU908793A1 (ru) |
-
1979
- 1979-09-17 SU SU792822401A patent/SU908793A1/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4493893A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into Escherichia coli and Bacillus subtilis | |
CA1170202A (en) | Process for cloning the gene coding for a thermostable alpha-amylase into escherichia coli and bacillus subtilis | |
US4806480A (en) | Novel E. coli hybrid plasmid vector conferring sucrose fermenting capacity | |
US5702939A (en) | Glucosamine-6-phosphate deaminase and process for producing the same | |
EP0129119B1 (en) | Method for producting l-aspartic acid | |
SU908793A1 (ru) | Штамм еSснеRIснIа coLI в834 ( @ , @ ),несущий плазмиду RSF 2124,-тест субстрат дл рестрикционной эндонуклеазы ecoR11 | |
EP0123903A2 (en) | Method for producing L-aspartic acid | |
US4420562A (en) | Method for producing creatinase | |
SU941423A1 (ru) | Способ конструировани штаммов еSснеRIснIа coLI-продуцентов рестриктазы и метилазы е со R @ | |
RU2044053C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco27k1 | |
SU918304A1 (ru) | Штамм еSснеRIснIа coLI в 834 ( @ @ )/PBR 322 | |
US5043279A (en) | DNA encoding a bacillus creatinase | |
RU2077577C1 (ru) | Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы | |
SU1650697A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS LIснеNI FоRмIS - продуцент рестриктазы В @ 13I | |
IE48703B1 (en) | Preparing glucose isomerase | |
SU1761803A1 (ru) | Штамм бактерий BacILLUS aLVeI - продуцент рестриктазы BaV В II | |
JPH10262674A (ja) | アルカリホスファターゼをコードする遺伝子 | |
JP3829950B2 (ja) | 新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ | |
ISHIDO et al. | Comparative studies of DNA polymerase I of enteric bacteria | |
RU2044055C1 (ru) | Штамм бактерий klebsiella azeanae - продуцент эндонуклеазы рестрикции kaz 48 ki | |
JP3803832B2 (ja) | クレアチンアミジノヒドロラーゼをコードする遺伝子 | |
RU2044054C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 110 ki | |
RU2053298C1 (ru) | Штамм бактерий escherichia coli - продуцент эндонуклеазы рестрикции eco 75 ki | |
SU1532585A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 33, кодирующа метилазу S @ 11, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент метилазы S @ 11 | |
RU2026347C1 (ru) | Штамм бактерии alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы |