SU918304A1 - Штамм еSснеRIснIа coLI в 834 ( @ @ )/PBR 322 - Google Patents

Description

I - : ,

Изобретение относитс  к ми обиопогвческой промьпаленности ИПредставп ет собой ш аммEscheHcliia соЕл f опазмиду, используемую как Tediv субстрат дл  определени  активности фермента при выделении и очистке рес1ь. рвкпвоЕШС экдонукпеааы Бсо ЯН., котора  . вспользуетс  в молекул рнсй) биоаогив .В генной инженерии.

Рес1рикционные эндонуклеазы ctahtr мощным инструментом 11ри создш ии ре комбинать к ДНК Iw vitiro ,: а также дн  изучени  первичной структуры и фвзвческого картврюани /ШК. Поэтомупрогресс в молекул рной биологии и гераней инженерии обусловлен nporpeccoNi в области изучени  и выделени  фермент(ю-рестрвкцишных эндшуклеаз.

этих рестрикционных эндонук леаз, особое место занимает эндснукпеаза Есо R. , котора  узнает последова-г тельностъ 5 ЦЦ ГГ. з tl .

Эта 1рестрикционна  эндон клеаза была открыта и описана с помощью метода центрифугировани  фрагментов взотопномеченнс фагов1 ДНК в градиенте концентрации сахарозы при определенвв активности фермента 12 .

Этот метод предполагает испопьзоёание в качестве тесть-субстрата меченный ДНК фага л мба, но процесс прпучв ва и использовани  этого тестмгубстрата следует считать очень трудоемким в весьма неудобным.

10

В последнее врем  дл  тестврозайва реатриктаз наиболее широко используетс  метод электрофореза в полиакриламид ных и агарозных гел х. В качестве стан дартных тестмзубстратов в том случае

15 используют ДНК фага л мбда, ШЖ адено вируса 2 и вируса V 40. После гидролиза рестриктазой фрагменты ДНК фракцвовгвруют в геле, после электрофоретическсго разделени  гель окрашивают бромистым

20 этидием и фрагменты ДНК визуализирую юте  при УФ освещении гел  З .

Claims (2)

1. Но рестриктаза ЕСО RR .. это мелкощеп ща  эндовуклеаза, ДНК фага л мбда , 3918 сиа расщепл ет более чем на 35 фрагментов в то врем  как друга  широко используема  рестриктааа Ёсо R1 на 6 фрагментов) . Таким образом, 1фи выделении R очвст ке Есо Rii практически невозможно с«енить активность электрофорезом при испопьасюании ДНК фага л мбда. Множестлво }ч5агменто©, образующихс  при Гйдролвае ДНК фага л мбда рестиктазой tcoRff, не дают  сной картины о степени гидр лиза ДНК. Дл  определени  активности EcoRff тре буетс  ДНК-субстрат с небольшим мопекул5фным весом, на роль так( ДН могут подойти ДНК плазмид. Такими ДНК-субстратами могут быть ДНК амплифидируемых, дающих множество копий ДНК на клетку, плазмид, например , хорошо известна  плазмнда PRR 322, мол. вес 2,8 мегадальтсн 15 . Но этим плазмидные ДНК наход тс  в штаммах Е. coEi К, которые имеют специфический фермент ДНК-цитозин метилазу . Фермент метелирует цитозин в ДНК и делает ХШК плазмид устойчивым к действию рестрикцаонной эндшузклеа- зы Есо RH , riosTofviy гухазмйды, наход щиес  в ЭТИХ штаммах не могут служить субстратом дл  tco R|. Дл  этих целей пригодны ДНК, если оиги выделены из штамма не содержащего ДНК-цитозин метилазу. . Цель изобретени  - штамм E.coti, содержащий плазмиду Р RR 322, котора  монсет быть использована дл  тирист ровани  активности рестракцишнсй эндон. нуклеазы Есо RJl. .; Штамм получен Путем трансформации плазмидыРВК322 в штамм E.CX)EiB834, который не содержит ДНК-цитозин метвл Предлагаемый штамм характеризуетс  следующими признаками. . , Морфологические признаки. Клетки пр мые, палочковидной формы, 1,1-1,5V Х2,,0 мк, подвижные с перетрвхиаль ными жгутиками, грамотрицательные и несп ор(И осные. Культурные враанаки. Хорошо растут на простых питательных средах. росте на м с(-пептоннсй«г , питательном агаре Дифко, минимальном агаре Дэвиса с глюкозой и казаминовыми квспотами - колонии гладкие, 1фуглые, прижатые , блест щие, серые, край ровный, мутные (на синтетических средах- более слизистые н мутные). При росте в ких м со еитонный бульон, бульон Дифко, минимальна  среда М9) с глюкозой и казаминовыми киспотакги образуют ровную, интенсивную муть. Физиолого-гбиохимические признаки. Растет в пределах.от 4 до при оптимум рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органичес кислоты, в частности: oL-глюкову, d-Фруктозу, сахарозу, арабинозу, ксилоЗУ , лактозу, трегалозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу, В средах с глюкозой активно, подкисл ет с офазова «ием газа. В качестве источника азота использует как минеральные соли в аммонийной и нитратной ффме, так и в органической , в виде пептона, амин(жислот. Нитраты восстанавливает до нитрв здв. Желатину не разжи)кает. По вл етс  устойчивость к антибиотикi кам: тетрацюслину (30 мг/мл), ампотиллину (25 мг/мл). Пример. Выделение плазмидН1й ДНК. Клетки, содержащею п;|азмиду выращивают в 50Р мл бульона До плотности Oj6/5 10 клеток на 1 tai Затем клетки собирают центрифугщ)ованием (500О об/мин., 2О мин), суспенд уют в 4 мл 25%-ной сахарозы, в 50 мл трис-НСб, рН О,8, добавл ют 1,2 мл лизоцима ( Ю мг/мп) и инкубируют 1О мин. во льду tipa перемешвванви. К смеси добавл ют 2,4 мл 0,25 М ЭДТА (рН 0,8), оставл ют во льду на 10 мин, а затем добавл ют послеаовательно 2,6 мл 5М р-ра NaCfc и 1,2 мл 1О%-нрго р-ра подецилсульфата натри , инкубируют во льду в течение 5-7 ч. Осветленные лизаты получают центрифугирсшанием смеси 160000-в течение 1 ч. К экстрактам добавл ют СеСЕ из расчета 0,94 г на 1 мл и бромид эгипи  до конечной концентрации 200 мг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44ООО об/мин, в течение 4О ч в роторе Tj 5О. Нижнюю, прокрашенную бромистым этидием, зону собирают по капл м, прокалывают пробирку под зоной. Бромид этиди  удал ют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом . Полученную ДНК диализуюг против 1О мм грйс-НСе , рН 7, 5, 20 мМ, Nace , 1 мМ ЭДТА. П р и м е р 2-. Трансформаци  плазми ной ДНК. В 100 мл бульона внос т 1 мл культуры E.COCi в 834 и выращивают до плотности 0,4. После охлаждени  клеток собирают центрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 1О мЛ1 МоСС ,, После 2О мин инкубации во льду клетки собирают центрифугированием и ресуспендируют в 1/2 объема 75 мМ СаСЧу Клетки инкубируют 20 мин- и вновь собирают центрифугированием. Осадок расуспедируют в 1 мл -75 мМ CaCt . К 0,2 мл суспензии полученных клеФок добавл ют 0,1 мл ДНК плазмиды рв  322, инкубируют во льду 20 мни. Затем смесь подвергают 2-ос минутной обработке при 42С и выдерживают 15 мви при . Смесь разбавл ют в Ю раз бульоном, подращивают клетки 30 ми при 37 с и отбирают по 0,1 мл суспензий и высеивают на чашки с питательным агаром, содержащие 25 мг/мл ампициллЁна . Пример 3. Определение активное та рестрикцисиной эндо:нуклеазы Есо Ц-, К 1 мг /ЩК в буфере, содержащем 5О мМ ирис рН 7,5 10 мМ . , 10 мМ 2-меркаптоэтанап, 1 мМ ЭДТА, добаап пот of .0,1 до 5 мл эндснуклеазы ЕСО RH , общий, объем смеси 40 мл. Гидролиз ведут при 15 мин. Полученные фрагменты ДНК анализируют с «(МОЩЬЮ электрофсреза в агарозном пластинчатом геле в трис-ацетатном буфере (рН 8,0). Предложенный штамм,  лазмида из которого используетс  в качестве тест-субстрата дл  ресорвкционной эндонуклеазы ,позвол ет получать тест-суб ,страт, которъ1й может быть нспользюав дл  определени  и ооенкв активности фермента как очищеннсго, так в грубых экстрактах . Формулаизобретёнв  Штамм E5cberic1lia Cogi В 834 (% WB /Р 22, № ВКМ В14411 ) (хранитс  во Всесоюзной коллекции ми1фоорганизмов прв институте бво- химии и физиологии микроорганизме АН СССР), используемый в качестве тест-субстрата дл  рестрвкционвой эндоч нуклеазы EcoR.n. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе l. cH-etaE. Nature Ысесцу. 1973, 244,7-10.
2. 2.JoffWwioK R.N-,P1i-T)-Ttiesis,H971,OHiv. o CQiti ovY ia3 . РЛ- et at-BiocVieYY istv. 1973, V.12. 3055. 4.Roberts R.D.crit.Rev.Biochevn., 1976, V.4, 133. 5.Bot.ivar Р...1917,У.2,95--иа1,6 , Биохими , 1978, т. 43, 1718.