JPH03504319A - 新規の制限エンドヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の制限エンドヌクレアーゼ これは、西暦１９８８年３月１７日に出願された係属中の出願番号Ｓ／Ｎ　　０ ７／１６９．４８７の一部継続出願である。

本発明は、制限酵素類に概して関する。更に具体的には、本発明は、ここではＭ ｆｅ　Ｉ　　と定義され、ヌクレオチド配列ＣＡＡＴＴＧを特異的に認識し、そ して配列ＣＡＡＴＴＧ内のＣと最初のＡとの間を切断する標的部位特異性の制限 エンドヌクレアーゼの同定、性質および製法に関する。

このような酵素は、今まで知られても、記載されてもいなかった。

の 従って、本発明の目的は新規の制限酵素を提供することである。

本発明の別の目的は、マイコプラズマの診断試験法を提供することである。

本発明の別の目的および利点は、本発明に関する下記の記述から明瞭になる。

図面の簡単な説明 本発明のこれらのおよび他の目的、特徴および付随する利点の多くは、添付した 図面と関連せしめて考察しながら下記の詳細な説明を読めばさらに良く理解され るであろう。

図１はジュルカー）　（Ｊｕｒｋａｒｔ）抽出物中の標的部位特異的ヌクレアー ゼの活性を示したものである。

ＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ（−４８１／÷１０９）　（列１−３）およびＰｓｔＩ／ Ｐｓｔｌ　（−１２４２／÷１０９）　（列４−６）ＩＬ２Ｒプロモーター断片 〔クロス他（Ｃｒｏｓｓ　ｅｔ　ａｌ）＋　セル（Ｃｅｌｌ）　４９：４１−５ ６１９８７　）をｐＵｃ１３中でクローン化した；プラスミドをＥｃｏＲｌおよ びＰｖｕｌｌ　、またはｘＩｌｌａＩおよびＰｖｕｌｌで、それぞれ消化し、プ ロモータと隣接部位のラクトースオペロン領域を放出する。断片（７７８および １５６２　　塩基対の各々）を　２１２で末端標識して、ラクトースリプレッサ ー／β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質に結合させ、そしてこの断片を抗−β−ガ ラクトシグーゼ抗体で免疫沈降させた。

次いで、これらの標識したＤＮＡ断片を非抽出物（列１．４）、ＨＵＴ−１０２ ８２抽出物（列２．５）またはジュルカート（Ｊｕｒｋａｒｔ）抽出物（列３． ６）とインキュベートせしめた０次いで、試料をフェノール／クロロホルムで抽 出し、次いでエタノールで沈降させ、そしてオートラジオグラフィーにより８Ｍ 尿素、６％ポリアクリルアミドゲル上分析した。

図２は、Ｃ’　ＡＡＴＴＧ部位に特異的なヌクレアーゼによる認識と切断を示す ものである。

皿１Δ：分裂部位（−１９５／−１５０）　、およびＣＡＡＴＴＧパリンドロー ム以外の塩基を共存するか〔オリゴ（ｏｌｉｇｏ）１〕、共有しない〔オリゴ（ ｏｌｉｇｏ）　２　）合成オリゴヌクレオチドを含むＩＬ２Ｒ４プロモータの領 域の配列を示している。

５′−オーバーハングを満たして（ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ　５　’−ｏｖｅｒｈ ａｎｇｓ）から放射性標識された塩基はアステリスク（＊）により表示される。

両方のオリゴヌクレオチドはパリンドローム中で切断される。

辺ユ」ノ断片はクローン化次いで標識され、ここでは１ｎｆｒａとして記述され る。

オリゴ（ｏｌｉｇｏ）　０列１）とオリゴ（ｏｌｉｇｏ）　２　（列２）をジュ ルカート（Ｊｕｒｋａｒｔ）抽出物とインキュベートし、次いで　フェノール／ クロロホルムで抽出し、次いでエタノールで沈降させ、そし、て図１中と同様に して、変性ゲル上分析する。

Ｇ、　Ａ、　ＴおよびＣで印を付した列は、Ｍ１３ｍｐ１８および１７塩基共通 配列プライマー（１７ｂａｓｅ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐ ｒｉｍｅｒ）を使用することにより生成されたジデオキシ配列担体（ｄｉｄｅｏ ｘｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　１ａｄｄｅｒ）を表す。

［工：　Ｍ１３ｍｐ１９中にクローン化されたオリゴ（ｏｌｉｇｏ）　１を１７ 塩基対共通配列ブライマー（１”／　ｂａｓｅｐａｉｒ　ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　 ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）にアニールし、標識配列（ＣＡＡＴＴ（ １）を通じて３２２−デオキシヌクレオチドトリホスフェート　（ｄＮＴＰｓ） で延長された０次いで、ジュルカートＵｕｒｋａｒｔ）抽出物を添加した。

得られた反応物の半分をゲルに通しく列１）、残りの半分を２番目の延長反応に かけた（列２）。

親構造（ｐａｒｅｎｔ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）の配列化反応Ｔｈ（列Ｃ；、　Ａ 。

Ｔ、　Ｃ）並びに公知の制限酵素器ｎｄｌｌＩ　（列３および４）による切断反 応物が対照として分析された０列１と２は両方のストランド上でＣ’　ＡＡＴＴ Ｃ，における特異的切断を示している。

図３は、切断のいろいろな条件の影響を示している。

オリゴ（ｏｌｉｇｏ）　１は、図２で記述されたように使用された。

列１：ＢＭサイタリン（ｃｙｃｌｉｎｅ）で処理されたジュルカート（Ｊｕｒｋ ａｒｔ）抽出物； 列２から１５：８Ｍサイクリン（ｃｙｃｌｉｎｅ）で処理されていないジュルカ ート（Ｊｕｒ、ｋａｒｔ）抽出物；列１６　：　ＭＴ−２細胞からの抽出物；列 １７二非蛋白抽出物： 抽出は下記のようにして行われた。

列２：ブロテイナーゼ　Ｋ、６７０μｇ／ｄ；列３：６５℃で１５分間−列４： ５％グリセリン；列５：１０％グリセリン；列６：５０％グリセリン；列７：１ ０ｍＭ　　ＫＣｆ！Ｈ列８：５０ｍＭ　　ＫＣｊ２；列９：１００ｍＭ　　ＫＣ ｊ！； 列１０　：　２００ｍＭ　　ＫＣｊ！　；列１１：１０ｍＭ　　ＮａＣｆ； 列１２：５０ｍＭ　　ＮａＣｆ； 列１３：１００ｍＭ　　ＮａＣｌ２； 列１４：２００ｍＭ　　ＮａＣｊｌ！；列１５：２０ｍＭ　　ＥＤＴＡ； 光１ｊ」Ｉ■［ピ肌 本発明の上述の、そしているいろの多数の他の目的と利点は、Ｍｆｅ　Ｉにより 実施され、このＭｆｅ　ＩはパリンドロームＣＡＡＴＴＧを認識し、これをパリ ンドロームのＣと１番目のＡの間で切断する生物学的に単離された制限エンドヌ クレアーゼである。

別に定義されない限りは、ここで使用されるすべての技術的および科学的述語は 、本発明が属する技術における通常の熟練者により普通に理解されるような同じ 意味を有する。

ここで記述されるものに同様または同等の方法および物質のいずれも本発明の実 験または試験に使用されるものの、好ましい方法および物質はここで記述される 。

以下、記述される全ての刊行物はここでは参考文献に包含される。別に説明の無 い限りここで使用される技術はこの技術における通常の熟練者によく知られてい る標準の方法である。

Ｍｆｅ　Ｉ　　は化学的合成技術およびＤＮＡ　＆ｌｌみ換え技術および同様の 技術により合成されるというものの、酵素の好ましい起源は、マイコプラズマ特 にマイコプラズマＭｆｅ　Ｉ　　はｍＡ、　　　　−、／７ｊじ／　Ｚ　　（Ｍ 、　　ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）から下記のように精製される。このマイコプラズ マは適当な培地中で生育され、（下記の指針は、ＡＴＣＣによる細菌、ファージ およびｒＤＮ八　ベクターのカタログ、およびＡＴＣＣによる培地ハンドブック に含まれている。）そして抽出物が調製される。このような抽出物は、硫安を使 用する標準沈澱技術により濃縮され、次いでセファクリル（ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ）　Ｓ　３００ゲル濾過カラムにかける。活性のあるフラクシヨンを集め、次い で０．１ＭＫＣｊ！中のヘパリンアガロースカラムにかける０次いで、このカラ ムを０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍおよび１．０ＭＫＣｆｌを含有す る緩衝液で逐次的に溶離する０次いで、活性のあるフラクシヨンを５０ｍＭ　　 ＫＣｆに希釈し、ＦＰＬＣＭｏｎｏ　　Ｓ　　カラム、（陽イオン交換カラム） を使用して精製する。蛋白質を溶離するのに、０．０５　Ｍないし０．３Ｍ　　 ＫＣＩ！のリニア　グラジェント（ｌｉｎｅａｒｇｒａｄｉｅｎｔ）が利用され る０次いで蛋白質は、蛋白質を結合するために標的認識部位を含む配列：を包含 する鎖状にした（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒｉｚｅｄ）　２本鎖を使用するＤＮＡ− アフィニティークロマトグラフィーにより純度を上げた。蛋白質は０．１ないし ０．５Ｍ　　ＫＣｌのグラジェント（ｇｒａｄｉｅｎＬ）を使用することに溶離 される。この方法によって、生物学的に単離されかつ精製されたＭｆｅ　Ｉが取 得される。

酵素の最適活性を支配するいろいろのパラメーターを試験かつ決定するために、 汚染されたマイコプラズマ細胞からの核抽出物それ自体は、酵素のそれ以上の精 製なしに使用されてもよいということには、ここで注目してもよい０図１に示し たようにジェルカートＵｕｒｋａｒｔ）細胞から調製された抽出物は、ＨＴＬＶ −１を形質変換したＴ細胞系であるＨＵＴ−１０２８２細胞の抽出物にはないヌ クレアーゼ活性を含む、ＤＮＡ断片の各々は、特異的ヌクレアーゼ活性部位を暗 示する特別な部位で、一度切断される。４７０塩基のバンドは各々のＤＮＡ試料 の切断の後に生成したものであり、これには関与する３′末端があることを示し ている。

次に、その活性がジェルカー）　（Ｊｕｒｋａｒｔ）細胞に特異的であるかどう かを評価す、るために、数個の他の型の細胞からの抽出物が調製された。

ＨＴＬＶ−１を形質変換したＭＴ−２Ｔｅｌ胞（図３に示した０列１６、異なる ＤＮＡ構造を伴う）およびホルボール　ミリステート　アセテ−）　（ｐｈｏｒ ｂｏｌ　ｍｙｒｉｓｔａｔｅａｃｅｔａｔｅ）　　により誘導されたジェルカー ）　（Ｊｕｒｋａｒｔ）細胞中に同様の活性が検出された。しかし、ＣＥＭ　　 Ｔ細胞またはＨｅＬａ細胞には検出されなかった（データを提示しなかった）。

ここで、エンドヌクレアーゼ活性はヱ土ユ１立ｘヱー　ン　ンス　ＭｃＯ１ａＳ Ｉｌｌａｂ扛μ卸壇狙幻−の存在に伴うということが見出されたと言及できる。

生成した断片（図１参照）の大きさを基礎にして、パリンドロームＣＡＡＴＴＧ への推定切断部位をマツプ（ｍａｐｐｅｄ）　した、この６個の塩基配列が認識 と切断のために充分であることを確立するために、２種の合成２本鎖オリゴヌク レオイドをてＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステム　モデル（Ａｐｐｌｉ ｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｏｄｅｌ）３８１Ａ）上で合成した。各々はＢ ａｍＨＩ／Ｘｂａｌ相補性の付着端を含むのでｐＵｃ１３ポリリンカーにクロー ンされた。

Ｔｊ！Ｊ２Ａの最上部の配列は、−１９５から−１５０へのＩ　Ｌ−２レセプタ ーアルファー鎖プロモーターにおける配列を示している。

２番目と３番目の配列は合成オリゴヌクレオチドを含むｐＵｃ１３ポリンカーを ｊ−ｃｏＲＩとＨｉｎｄｌＩＴで消化した後、５′−オーバーハング（５’−ｏ ｖｅｒｈａｎｇｓ）を　３！ｐ−ｄＮＴＰｓおよびクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）で 満たして（ｆｉｌｌｉｎｇ　ｉｎ）得られた配列を示している。

オリゴヌクレオチドはどちらも、推定切断配列、ＣＡＡＴＴＧ　（四角で囲んだ ）の両側に同類の〔オリゴ（ｏｌｉｇｏ）１）または非同類の〔オリゴ　（ｏｌ ｉｇｏ）２）の数個の塩基対を配している。

合成オリゴヌクレオチド（ｐＵｃ１３ボリリ°ンカー配列を除く）には下線を付 しである。

これらのオリゴ（ｏｌｉｇｏｓ）を、ジェルカート（Ｊｕｒｋａｒｔ）Ｔ細胞か ら得られた核抽出物にインキュベートした。２木調断片の３′末端は標識されて いるので、切断が起きた時は、２種の放射性標識されたバンドがゲル上に検出さ れる０図２Ａに描いたオリゴヌクレオチドは消化された（図２Ｂ参照）が、これ は６個の塩基配列が認識と切断の両方のために充分であることを暗示している。

図２０では、Ｍｌ　３！ｐ　１９にクローンされたオリゴ１がプライマー（ｐｒ ｉｍｅｒ）にアニールされ、そして２本鎖ＤＮＡが”　Ｐ−ｄＮＴＰｓおよびク レノー（Ｋｌｅｎｏｗ）で合成された。次いで、このＤＮＡはジェルカー）　（ Ｊｕｒｋａｒｔ）　Ｔ細胞からの核抽出物にインキュベートされた。これは、配 列ＣＡＡＴＴＧのＣと最初のＡの間の切断を起こした。

ゲル上、列１中で確認されるバンドはブライマーの末端からこの切断部位まで延 伸している断片を表している。

切断生成物を満たす（ｆｉｌＪｉｎｇ　ｉｎ）と（列２）、酵素は５′オーバー ハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を持つ４塩基を伴って切断することを示した。従っ て、Ｍｆｅ　Ｉ　　のための切断部位はパリンドローム中のＣと１番目のＡの間 にあることは明瞭である。

６塩基で充分であるよりも、４もしくは５塩基でも充分であるという可能性を排 除するために、ＣＡＡＴ、ＡＡＴＴ、ＡＴＴＧ、ＣＡＡＴＴ、ＡＡＴＴＧ、のよ うな可能性がＩ　Ｌ　２　Ｒ，Ｇプロモータ断片の配列中に多数倍台まれている のに、図１に示したように、ＣＡＡＴＴＧだけでただ１回だけの切断が起きたこ とが決定された。

これに加えて、プリン／ピリミジン置換体の部位における切断の可能性は、ｐＢ Ｒ３２２のＰｙＡＡＴＴＦ’ｕ（ＴＡＡＴＴＧ）　、ＣＰｕＡＴＰｙＧ　（ＣＧ ＡＴＣＧ）、およびＣＡＰｕＰｙＴＧ　（ＣＡＡＣＴＧ、ＣＡＧＣＴＧ、および ＣＡＧＴＴＧ）に該当する部位においての消化を検出できないことにより評価さ れた。

従って、ＣＡＡＴＴＧの配列はこの酵素により特異的に切断されることが確立さ れた。

この配列の認識をする酵素は、以前には報告されていない。〔ロバート（Ｒｏｂ ｅｒｔｓ）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１６：ｒ２７１−ｒ３１３． １９８８　） 従って、ジュルカート（Ｊｕｒｋａｒｔ）およびＭＴ−２の抽出物から、特殊な 認識部位で消化する新規の■型の制限酵素のための明瞭な事実が得られた。

更に、マイコプラズマが２クレアーゼの起源であるかどうかを決定するために、 マイコプラズマのジュルカー）　（Ｊｕｒｋａｒｔ）細胞系を、製造者の指示に 従ってＢＭ−サイクリン（ｃｙｃｌｉｎｅ）　　（ボーリンガ−マンハイム（Ｂ ｏｅｒｆｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉａ＋）　）により保蔵した。保蔵した細胞系か らの核抽出物の評価は、ヌクレアーゼの活性は最早存在しないことが示された。

（図３、列１　対　列４）更に加えて、活性はプロテナーゼＫにより破壊された （列３）、更に完全な消化は、より高い塩濃度でより１０ｍＭの濃度のＮａＣ１ またはＫＣｌで得られた（列７−１４）、そして、酵素は１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ により不活性化することができた。これは、Ｍ　ｇ　ｔ　’または他の２価の陽 イオンが必要であることを示している。

ここで伝統的な命名法に従ってＭｆｅ　＋　　と命名された酵素は、短いパリン ドローム配列をＬ２ＴｆＡし、そして認識部位の中で切断するので典型的な■型 の酵素である。

１’ｌｆｅ　Ｉは、特異的な６塩基対の認識部位を切断し、そこ　　　してＥｃ ｏＲＩが生成する末端に対して相補的な付着端を形成するので非常に価値あるも のである。

また、これはＭｆｅ　Ｉ　　を生産するどの、起源をも検出するのに有用である ９例として、Ｍ　　　−ン　ン＆二五ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓＬを使用する検出分 析法を今説明しである。　明らかに、Ｍｆｅ　Ｉ　　を生産すると思われるどの ような起源をも同定するための同様の方法は容易に開発されるであろう。

Ｍｆｅ　Ｉ　　の起源またはマイコプラズマの存在の検出ための診断道具一式は 、配列として少なくともＣＡＡＴＴＧを含有する容器を包含する。勿論、標準法 において陽性の対照区がルーチン的に使用される。

のＭ　　　−ン　ンス　Ｍ、ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ−るｉ゛Ｂｎ、°　　Ｓ マイクプラズマの存在を分析するために、汚染されたまたは汚染されたと推定さ れる細胞の核抽出物が調製され、これはここでは−Ｌｊ」ＬＬ」−と記述される 。゛合成オリゴ　（ｏｌｉｇｏ）２　（図２Ａ参照）を適当に標識化し、抽出物 とインキュベートし、次いでフェノール／クロロホルムで抽出、エタノールで沈 澱しそして８Ｍ尿素、６％ポリアクリルアミドゲル上分析する。ゲルをオートラ ジオグラフィーし、そして次に特殊なヌクレアーゼ活性の存在をここでは上！Ｌ Ｌ主と記述されているものとして決定する。

ここで記述された実施例と実施Ｂ様は、説明の目的のためだＥすのものであり、 そして、これらに照らして見てのいろいろな応用や変換はこの技術の熟練者に暗 示されるだろうのものであり、かつ本出願の精神と要部およびここに付した特許 請求の範囲に包含されるものであると理解される。

ＦＩＧ、ｌ ３０８−一−− Ｒ１／Ｐｖｕｌｌ　Ｘｍａｌ／ＰｖｕｌｌＦＩＧ、２Ｂ ＦＩＧ、２Ｃ ＦＩＧ、３ 手続補正書 平成２年１２月１０日

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．ＣＡＡＴＴＧのヌクレオチドの配列を特異的に認識し、そして該配列のヌク レオチドＣＡの間を切断する単離されたかつ生物学的に純粋なエンドヌクレアー ゼ。
2. ２．細胞培養でマイコプラズマ，ファーメンタンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｆ ｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を生育し、その抽出物から通常の精製技術により該ヌクレ アーゼを回収することにより生産された請求の範囲１記載のエンドヌクレアーゼ 。
3. ３．少なくとも配列ＣＡＡＴＴＧを含有する容器を包含する、試料中のマイコプ ラズマの存在の検出のための診断道具一式。
4. ４．（ａ）マイコプラズマまたはＭｆｅＩの起源が存在するのではないかと思わ れる試料から抽出物を取得する工程および （ｂ）工程（ａ）の抽出物をＭｆｅＩ活性に対する試験をする工程からなり、Ｍ ｆｅＩ活性の存在はＭｆｅＩの起源またはマイコプラズマの存在を示すものであ ることを特徴とするＭｆｅＩの起源またはマイコプラズマの存在を検出するため の分析法。