JP2000262294A - アスタキサンチンシンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、β-カロテンからアスタキサンチ
ンへのアスタキサンチン生合成経路の最終段階に関与す
る遺伝子および酵素を提供することを課題とする。 【解決手段】 アスタキサンチンシンターゼ活性を有す
るポリペプチド、アスタキサンチンシンターゼをコード
するDNA断片、組換え生物などの、β-カロテンからアス
タキサンチンへの調製に有用な遺伝物質が提供された。
これらの新規な遺伝物質はPhaffia rhodozyma由来のも
のであり得る。またアスタキサンチンの製造方法も提供
された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カロテノイドの組
換え生産およびそれに有用な生物学的物質に関する。

【０００２】

【従来の技術】Phaffia rhodozyma（P.rhodozyma）はア
スタキサンチンを産生するカロテノイド生産酵母菌株で
ある。アスタキサンチンは、動物（フラミンゴおよび紅
色トキのような鳥類、ならびにニジマスおよびサケのよ
うな魚類）、藻類および微生物のような、非常に多様な
生物に存在する。また、アスタキサンチンは酸素ラジカ
ルに対する強力な抗酸化特性を有することが知られてお
り、ガンのようないくつかの病気から、生細胞を守るた
めの薬学的用途に応用することが期待されている。さら
に、アスタキサンチンは動物を明瞭なオレンジレッドに
染色し、市場での消費者の要望に応えることから、染色
試薬としてのアスタキサンチンの産業上の必要性が、サ
ケのような養殖魚産業で特に増加している。

【０００３】P.rhodozymaは、アスタキサンチンを生成
するカロテノイド生産酵母菌株として知られている。他
のカロテノイド生成酵母であるRhodotorula種と異な
り、P.rhodozymaは、D-グルコースのようないくつかの
糖を発酵することができる。この点は、産業上の応用の
観点からみて、重要な特徴である。最近の分類学的研究
において、P. rhodozymaの性周期が示され、その優性世
代はXanthophyllomycesdendrorhousと命名された。（W.
I. Golubev; Yeast 11, 101-110, 1995）。P. rhodozym
aからアスタキサンチンの高生産株を得るための菌株改
良研究が行われてきたが、ここ10年間は、そのような試
みは通常の突然変異誘発法およびプロトプラスト融合法
を利用することに限定されていた。最近、WeryらはP. r
hodozymaのリボソームDNAのゲノム中に、複製できない
プラスミドを多コピー数組み込んだP. rhodozymaを利用
した宿主ベクター系を開発した(Weryら, Gene, 184, 89
-97,1997)。また、Verdoesらは、P. rhodozymaの形質転
換体および、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ-カロ
テンへの反応を触媒する酵素をコードするP. rhodozyma
の3つのカロテノイド生成遺伝子と共に、さらに改良さ
れたベクターを報告した（国際公開公報第97/23633
号）。

【０００４】カロテノイド生成に特有の生合成経路は、
一般的イソプレノイド経路から重要な中間体であるファ
ルネシルピロリン酸（FPP）の点で分岐する（図1）。FP
PおよびIPPは、P. rhodozymaのcrtEによってコードされ
るゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）シンターゼによ
り縮合されて、GGPPを生成する。次いでGGPPは、crtBY
によってコードされ、フィトエンシンターゼおよびリコ
ペンシクラーゼとして二重に機能する酵素と、crtIによ
ってコードされるフィトエンデサチュラーゼの連続反応
によってβ-カロテンに変換される。

【０００５】細菌では、キサントフィル生成に関与する
酵素および遺伝子が単離され、詳細に特徴付けられてい
る。crtZによってコードされるβ-カロテンヒドロキシ
ラーゼは、β-カロテンの両端のβ-イオノン環に対する
水酸化の2段階に関与している。crtZ遺伝子は、エルウ
ィニア・ウレドボーラ（Erwinia uredovora）（Misawa
ら、J. Bacteriol.、172、6704〜6712、1990）、フラボ
バクター属（Flavobacter）（L. Pasamontesら、185
（1）、35〜41、1997）、およびアグロバクテリウム・
オーランティアクム（Agrobacterium aurantiacum）（M
isawaら、J. Bacteriol.、177（22）、6575〜6584、199
5）などの多様な生物からクローニングされた。crtWに
よってコードされるβ-カロテンケトラーゼは、β-カロ
テンの両端のβ-イオノン環へのオキソ基導入の2段階を
触媒する。Kajiwaraらは、ヘマトコッカス・ブルビアリ
ス（Haematococcus bluvialis）から真正細菌のcrtWに
対応するbkt遺伝子をクローニングして配列決定した（K
ajiwaraら、P. Mol. Biol.、29、343〜352、1995）。Ha
rkerらも、シネココッカス（Synechococcus）PCC7942か
ら真正細菌のcrtWに対応するcrtO遺伝子をクローニング
して配列決定した（Harkerら、FEBS Letters、404、129
〜134、1997）。ヒドロキシラーゼおよびケトラーゼの
両酵素は広い基質特異性を有しており、これによって両
酵素が同時に反応した場合にその反応条件に応じて多様
なキサントフィルが生成される。（図1）

【０００６】前述のとおり、FPPからのβ-カロテノイド
生成に関与するすべての遺伝子が単離されたが、β-カ
ロテンからキサントフィル生成の最終段階に関与すると
考えられる酵素および遺伝子はP. rhodozymaの蛋白質お
よびDNAレベルでは同定されていない。Johnsonら（Cri
t. Rev. Biotechnol、11（4）、297〜326、191）は、彼
らが単離したキサントフィル化合物の中にはアスタキサ
ンチン生合成の中間体となるものがあると仮定すること
により、アスタキサンチン生成には二つの別個の経路が
あることを提唱したが、このような二つの別個の経路に
関与する酵素や遺伝子が単離できないため、これらの経
路を証明することはできなかった。さらに、これらのキ
サントフィル化合物がこれら化合物の単離段階における
実験上の人工産物から生じた可能性も排除することはで
きない。β-カロテンからアスタキサンチンへの生合成
経路中の中間体を蓄積する突然変異体をP. rhodozymaか
ら単離できなかったことにより、β-カロテンからアス
タキサンチンへの生合成経路を明らかにすることが困難
となった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、β-カロテ
ンからアスタキサンチンへのアスタキサンチン生合成経
路の最終段階に関与する遺伝子および酵素を提供するこ
とを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、AST遺伝子の
ような、P. rhodozymaにおけるβ-カロテンからアスタ
キサンチンへの反応に関与するアスタキサンチンシンタ
ーゼをコードするヌクレオチド配列を含む単離DNA、一
例として特にcDNAを提供する。

【０００９】好ましい態様において、クローニングした
DNA断片は、（a）前記ヌクレオチド配列が配列番号：1
に記載のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、また
は（b）該ヌクレオチド配列が（i）対立遺伝子変異体、
もしくは（ii）一つまたは複数のアミノ酸の付加、挿
入、欠失および／または置換を有し、記述された酵素活
性を有する酵素より選択される該酵素の変異体をコード
することによって特徴付けることができる。

【００１０】もう一つの好ましい態様において、単離cD
NA断片はPhaffia rhodozymaの遺伝子から誘導すること
ができ、（i）配列番号：2に記載のcDNA配列、（ii）配
列番号：2に記載のcDNA配列の同義または対立遺伝子変
異体、および（iii）一つまたは複数のヌクレオチドの
付加、挿入、欠失および／または置換を有する配列番
号：2に記載のcDNA配列の誘導体で、前記酵素活性を有
するポリペプチドをコードする誘導体から選択される。

【００１１】もう一つの好ましい態様において、本発明
は、前記ヌクレオチド配列が（i）配列番号：2に記載の
ヌクレオチド配列、（ii）遺伝コードの縮退のために、
ヌクレオチド配列（i）によってコードされるアミノ酸
配列と同じ配列を有するアスタキサンチンシンターゼを
コードするヌクレオチド配列、または（iii）標準的な
ハイブリダイゼーション条件下でi）もしくはii）から
のヌクレオチド配列相補鎖にハイブリダイズするヌクレ
オチド配列であることを特徴とする、前述の単離cDNAを
包含する。

【００１２】さらにもう一つの好ましい態様において、
単離ゲノムDNA断片は、Phaffia rhodozymaの遺伝子から
誘導することができ、（i）配列番号：3に記載のゲノム
DNA配列、（ii）配列番号：3に記載のゲノムDNA配列の
同義または対立遺伝子変異体、および（iii）一つまた
は複数のヌクレオチドの付加、挿入、欠失および／また
は置換を有する配列番号：3に記載のゲノムDNA配列の誘
導体で、前記酵素活性を有するポリペプチドをコードす
る誘導体から選択される。

【００１３】もう一つの好ましい態様において、本発明
は、前記ヌクレオチド配列が（i）配列番号：3に記載の
ヌクレオチド配列、（ii）遺伝コードの縮退のために、
ヌクレオチド配列（i）によってコードされるアミノ酸
配列と同じ配列を有するアスタキサンチンシンターゼを
コードするヌクレオチド配列、または（iii）標準的な
ハイブリダイゼーション条件下でi）もしくはii）から
のヌクレオチド配列相補鎖にハイブリダイズするヌクレ
オチド配列であることを特徴とする、前述の単離ゲノム
DNAを包含する。

【００１４】本発明のもう一つの局面は、前述のクロー
ニングされたDNA断片の発現によって得られる、P. rhod
ozymaにおけるβ-カロテンからアスタキサンチンへの反
応に関与するアスタキサンチンシンターゼ活性を有する
組換えポリペプチドを提供する。

【００１５】本発明の組換えポリペプチドの好ましい態
様は、（a）前記ポリペプチドが配列番号：1に記載のア
ミノ酸配列を有する、または（b）該ポリペプチドが
（i）対立遺伝子変異体または（ii）一つもしくは複数
のアミノ酸の付加、挿入、欠失および／または置換を有
し、且つ記述された酵素活性を有する酵素から選択され
る、(a）で定義されたペプチドの変異体であることを特
徴とする。

【００１６】したがって、本発明は本発明のポリペプチ
ドの変異体をも包含する。このような変異体は、本発明
のアミノ酸配列に基づき、このような誘導体が依然とし
て本発明の対応するポリペプチドと同じ型の酵素活性を
有するか、またはこのような誘導体が対立遺伝子変異の
周知の現象の結果である、このような配列の一つまたは
複数のアミノ酸残基の付加、挿入、欠失および／または
置換によって定義される。このような活性は当技術分野
において公知の、または本明細書に具体的に記載されて
いるいかなる解析によっても評価することができる。こ
れらの変種は、当技術分野で公知のケミカルペプチド合
成法により、または当技術分野で公知の方法、例えばSa
mbrookらによって記された方法（Molecular Cloning, C
old Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA
second edition 1989）によって、本明細書に記載され
たDNA配列を基にして組換え技術により作製できる。概
してこのような分子の活性を変化させずにタンパク質お
よびペプチドのアミノ酸を改変する方法については、当
技術分野で公知であり、例えばH. NeurathおよびR.L. H
illによって記された書「The Proteins」に記載されて
いる(Academic Press, New York, 1979, 特に図6、14ペ
ージ参照)。最も一般的に行われている改変は次のよう
なものである：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、
Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/P
he、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、A
la/Glu、Asp/Gly、これらの逆も同様である。

【００１７】本発明のシンターゼの活性に重要な影響を
及ぼすことなく、一つもしくは複数のアミノ酸残基を該
酵素のN-末端および／またはC-末端において付加または
欠失させることもまた可能である。

【００１８】さらに、本発明は、例えば配列表に開示さ
れているDNA配列ならびにその相補鎖だけを目的として
いるのではなく、標準的な条件下でこのような配列また
はその断片とハイブリダイズするDNA配列、および遺伝
コードの縮退のために標準的な条件下でこのような配列
とハイブリダイズしないが、まったく同じアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含むDNA配
列も同様に目的とする。

【００１９】該酵素活性は、対応する遺伝子を該β-カ
ロテノイド生成宿主生物中に発現する形質転換により、
β-カロテノイド生成微生物にアスタキサンチン生産を
もたらす酵素活性として表される。

【００２０】該酵素活性はさらに、図１に記載のβ-カ
ロテンからアスタキサンチンへの中間体キサントフィ
ル、例えば、エキネノン(echinenone)、β-クリプトキ
サンチン(β-cryptoxanthin)、カンタキサンチン(canth
axanthin)、3'-ヒドロキシエキネノン(3'-hydroxyechin
enone)、3-ヒドロキシエキネノン(3-hydroxyechinenon
e)、ゼアキサンチン(zeaxanthin)、フェニコキサンチン
(phoenicoxanthin)、アドニキサンチン(adonixanthin)
を蓄積させる微生物にアスタキサンチン生産をもたらす
という酵素活性として表される。

【００２１】該酵素活性はまた、NADPH等の適当な電子
供与体を伴った膜画分、例えばミクロソーム等の天然膜
及びリポソーム等の人工膜、を適当な試験管内条件下に
おいて多様な基質、例えばβ-カロテン、エキネノン、
β-クリプトキサンチン、カンタキサンチン、3'-ヒドロ
キシエキネノン、3-ヒドロキシエキネノン、ゼアキサン
チン、フェニコキサンチン、及びアドニキサンチン等か
らアスタキサンチンの生成を触媒する酵素活性としても
表される。

【００２２】本発明においては、特記されていない限
り、ハイブリダイゼーション反応は概して、ほとんどの
DNAプローブのTmより15℃ないし35℃低い42℃で行わ
れ、それによりハイブリダイゼーションの最高値を確実
にしている。所望されるハイブリダイゼーションのスト
リンジェンシーは、例えば塩濃度及び、完全に適合する
ハイブリッドのためのTmより約5℃ないし15℃低い温度
でフィルターを洗浄することにより達成される。しかし
ながら、塩濃度及び温度は、配列の重要なミスマッチが
期待される場合（例えば異種における同一遺伝子または
別だが関係する配列のプローブを行う場合）にはより低
度なストリンジェント条件に調整されても良い。

【００２３】本明細書においてハイブリダイゼーション
の「標準的な条件」とは、特異的なハイブリダイゼーシ
ョンシグナルを検出するために当業者が一般に用いる条
件で、例えばSambrookら（前掲）によって記載されてい
る条件、または好ましくはいわゆるストリンジェントな
ハイブリダイゼーションおよび非ストリンジェントな洗
浄条件、またはより好ましくは当業者であれば精通して
おり、例えばSambrookら（前記）に記載されているいわ
ゆるストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび
ストリンジェントな洗浄条件、またはより好ましくは例
えばDIG（ジゴキシゲニン）標識キットおよびBoehringe
r Mannheim（ドイツ、マンハイム）の発光検出キットを
製造元が提供するプロトコールにしたがって用い、ハイ
ブリダイゼーション溶液として ホルムアミド（和光純薬工業株式会社、日本、大阪）50
%（V/V） 5xSSC ブロッキング試薬（Boehringer）2%（W/V） N-ラウロイルサルコシン0.1%（W/V） SDS 0.3%（W/V） を用いて42℃の温度で終夜反応させた後洗浄し、製造元
が示すとおりに検出する、いわゆる中等度にストリンジ
ェントな条件を意味する。

【００２４】例えば、典型的な洗浄順としては、ハイブ
リダイズしたブロットをまず最初に室温にて水溶液中2
×SSC及び0.1％SDSを含む溶液Ａにての洗浄が含まれ
る。次にブロットは所望されるストリンジェンシーの水
準に基づき決定された温度にて水溶液中0.1×SSC及び0.
1％SDSを含む溶液Ｂ中にて二度洗浄される。例えば、完
全に合致したハイブリッドはおよそ55℃から65℃までの
温度にて洗浄することができるであろうし、また或い
は、関連遺伝子に対する或いは異種由来のプローブに対
しては洗浄温度は例えばおよそ37℃から52℃までとなろ
う。特記されていない限り本発明においては本洗浄条件
が用いられた。

【００２５】本発明のDNA配列にハイブリダイズする
（前述参照）、またはこのようなDNA配列に基づいて設
計したプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応により
構築できることから、本発明のDNA配列から誘導したDNA
配列を、示されたとおり、すなわちPCR反応により、ま
たは部位特異的突然変異誘発［例えば、Smith、Ann. Re
v.Genet. 19、423（1985）参照］により、または例えば
欧州特許第747483号に記載のとおり合成的に、または例
えばSambrookら（前掲）に記載の「分子クローニング」
の通常の方法により、調製することができる。

【００２６】本発明はまた、前述のDNAを含むベクター
またはプラスミドおよび前述のDNAまたは前述のベクタ
ーもしくはプラスミドによって形質転換またはトランス
フェクトされた宿主細胞も包含する。

【００２７】本発明はまた、組換えDNAを用いた宿主の
形質転換によって得られる、前述のDNAを有する組換え
生物も提供する。

【００２８】本発明はまた、β-カロテンからアスタキ
サンチンへの反応を触媒することができる酵素ポリペプ
チドの製造法であって、前述の組換え生物を該酵素ポリ
ペプチドの産生を導く条件下で培養することを含む方法
にも関する。

【００２９】さらなる局面において、本発明は、前述の
DNAの一つまたは複数を適当な宿主生物に導入し、この
形質転換された生物をアスタキサンチンの産生を導く条
件下で培養することを含む、アスタキサンチンの生産法
を提供する。

【００３０】本発明の酵素ポリペプチドは、適当な再構
成膜を含む適当な反応混合物中、適当な電子供与体存在
下で、前述のβ-カロテンからアスタキサンチンへの反
応に関与するアスタキサンチンシンターゼ活性を有する
組換えポリペプチドにβ-カロテンを接触させる段階を
含む、アスタキサンチンの生産法に対しても有用である
と考えられる。この方法において、前記組換えポリペプ
チドは、マイクロゾームまたはミトコンドリア膜などの
生体膜から調製する再構成膜の形で存在してもよい。組
換えポリペプチドはまた、リポソームなどの再構成人工
膜の形で存在してもよい。チトクロームP450レダクター
ゼなどの電子供与体は、本発明の酵素の反応中心を還元
することができる適当な電子供与体である。

【００３１】一般に、生合成酵素をコードする遺伝子を
クローニングするための多くの方法がある。例えば、デ
ジェネレートPCRを使用することができる。デジェネレ
ートPCRは、同一または類似の機能を有する他の種由来
の既知の酵素の一つと高いアミノ酸配列相同性を有する
関心対象遺伝子をクローニングする方法である。デジェ
ネレートPCRで一組のプライマーとして用いるデジェネ
レートプライマーを、アミノ酸配列の対応するヌクレオ
チド配列への逆翻訳によって設計した（「デジェネレー
テッド」）。このようなデジェネレートプライマーにお
いて、A、C、GもしくはTのいずれかからなる混合プライ
マー、または多義コードにイノシンを含むプライマーを
一般に用いる。関心対象遺伝子の部分断片のクローニン
グ後に、クローニングし、標識した部分DNA断片をプロ
ーブに用いて、完全な遺伝子を含む遺伝子断片をスクリ
ーニングすることができる。

【００３２】活性を酵素アッセイによって測定すること
ができる酵素をコードする遺伝子をクローニングする場
合、酵素活性のモニタリングによるこのような酵素の精
製と酵素のアミノ酸配列の決定が良い方法である。この
ようにして得たアミノ酸配列は、対応するヌクレオチド
配列に容易に逆翻訳される。対応するヌクレオチド配列
を有するDNA断片を、DNA合成機を用いてインビトロで合
成し、ハイブリダイゼーションプローブとして直接用い
るために標識することができる。ハイブリダイゼーショ
ンプローブを得るための別法は、アミノ酸配列情報を用
いたデジェネレートPCR法である。

【００３３】機能を酵素的に特徴付けることができない
遺伝子をクローニングするために、ショットガンスクリ
ーニングと呼ばれる方法が通常のクローニング法として
用いられてきた。この方法は、関心対象となるいかなる
生合成酵素をコードする特定の遺伝子も持たない突然変
異株の単離と、そのように突然変異した遺伝子に対応す
る無傷の遺伝子を有する生物から調製したDNAによる突
然変異株の形質転換とを含む。このような突然変異体の
単離には、通常の突然変異誘発を用いることが多い。親
株のものと同じ表現型を獲得したことについては、その
栄養要求性などの試験によって確認することができる。
DNA供与体が突然変異株の突然変異遺伝子に対応する遺
伝子を含む場合、そのような遺伝子による形質転換体は
遺伝子相補の結果として親株と同じ表現型を獲得した。

【００３４】ショットガンクローニングのベクターとし
ては、クローニング宿主中で複製できるか否かには関係
なく、いかなる形のベクターも用いることができる。複
製ベクターの利用には、相補能力が必要条件であり、こ
のようなベクターが受容体のゲノムに対する相同配列を
含む必要はない。非複製ベクターを用いる場合は、ドナ
ーとレシピエントDNA間で組換えを起こすために、この
ようなベクターが宿主のゲノムに対する相同配列を含む
ことが必須である。

【００３５】本発明のDNAのクローニングには、「色相
補（color complementation）」と呼ばれる方法を用い
ることができる。大腸菌などの非カロテノイド生成生物
は、エルウィニア・ウレドボーラ、エルウィニア・ヘル
ビコーラなどのカロテノイド生成生物からクローニング
することができるカロテノイド生成遺伝子による形質転
換の結果、カロテノイド生成能を獲得することができ
る。crtE、crtB、crtIおよびcrtYを有する大腸菌はβ-
カロテンを産生し、細胞を黄色に着色させることができ
る。このような特徴を利用して、多くのカロテノイド生
成遺伝子が細菌および植物などの様々なカロテノイド生
成生物からクローニングされている。例えば、リコペン
シクラーゼをコードするcrtY遺伝子をクローニングする
ために、pUCベクターに対する適合性ベクター上のcrt
E、crtBおよびcrtIを有する大腸菌を形質転換宿主とし
て調製する。このような宿主はリコペンの蓄積を示す赤
色に変わる。次に、カロテノイド生成生物からのcDNAま
たはゲノムライブラリーをpUCベクターを用いて構築す
ることができる。ドナーであるカロテノイド生成生物の
crtYに対応する遺伝子が形質転換したプラスミド中に存
在する場合、遺伝子相補が起こり、大腸菌はβ-カロテ
ン生産能力を獲得したことを示す黄色に変わると考えら
れる。事実、crtE、crtBYおよびcrtI遺伝子がこの方法
によってP. rhodozymaからクローニングされた（Verdoe
sら、国際公開公報第97/23633号）。

【００３６】β-カロテンからアスタキサンチンへの反
応に関与する遺伝子のクローニングに関して、Kajiwara
らはE.ウレドボーラからのcrtE、crtB、crtIおよびcrtY
遺伝子を有する宿主大腸菌でP. rhodozymaからcDNA発現
ライブラリーを構築した（Kajiwaraら、国際公開公報第
96/28545号、1996）。このようなクローニングシステム
において、β-カロテンからアスタキサンチンへの反応
に関与する遺伝子を、理論的にはカンタキサンチンまた
はアスタキサンチンの蓄積を示す赤色着色を判定するこ
とによってP. rhodozymaからクローニングすることがで
きると考えられる。しかし、このような遺伝子はこれま
でに報告されていない。多くの研究者らが膜に結合した
カロテノイド生成酵素が酵素複合体を形成するという可
能性について推測している。このようなモデルにおい
て、カロテノイド生成酵素の間の親和性が効率的なカロ
テノイド生成に必須であると考えられる。このような仮
定に基づき、カロテノイド生成の連続反応において外因
性酵素はphaffiaのカロテノイド生成酵素に親和性を有
していないと考えられるため、この色相補法はアスタキ
サンチン生合成の最終段階、すなわちβ-カロテンから
アスタキサンチンへの段階に関与する酵素のクローニン
グには適していない。

【００３７】本文に用いられている通り、「蛋白質」及
び「ポリペプチド」という用語は本文を通じて可換的に
用いられている。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」と
いう用語も同様に可換的に用いられている。

【００３８】「核酸」という用語は制限なくDNA、RNA、
cDNA及びmRNAを包含する意味を有する。本文に用いられ
ている通り、ここで述べるDNAとはゲノム由来の、合成
の或いは半合成のものの可能性を有する。更には本発明
における核酸とは一本鎖及び二本鎖の分子を包含する。

【００３９】本文に用いられているとおり、「由来の」
という用語は例えばP.rhodozymaのような生物中で天然
に存在する蛋白質、ポリペプチド及び／またはポリヌク
レオチドを意味する。しかしながら、ポリペプチド及び
ポリヌクレオチドはどんな起源のものからも生成／取得
できる可能性を有する。従って、本発明には組換え体
の、合成の、そして半合成の蛋白質、ポリペプチドそし
てポリヌクレオチドが包含される。

【００４０】本発明は例えば「単離されたポリペプチ
ド」「単離されたポリヌクレオチド」などの様な「単離
された」と表現される構成要素を有する。ここで用いら
れている通り「単離された」という語はポリペプチドも
しくはポリヌクレオチドが精製された、または後の実施
例で更に詳細に述べられるように少なくとも部分精製さ
れたという意味を有する。

【００４１】本発明において、1999年2月18日に米国基
準株収集（American Type Culture Collection：ATCC）
に寄託番号74486のブダペスト条約寄託として再寄託さ
れており、β-カロテンからアスタキサンチンへの反応
が遮断されたP. rhodozyma ATCC96815を形質転換宿主と
して用いた（Schroeder, W.A.およびJohnson, E.A.、J.
Ind. Microbiol. 14、502〜507、1995）。1998年4月8日
に米国基準株収集（ATCC）に寄託番号74438のブダペス
ト条約寄託として同様に再寄託されているP. rhodozyma
ATCC96594の野生型株の染色体から調製したゲノムライ
ブラリーによるこの突然変異体の形質転換を用いて、ア
スタキサンチンを産生するクローンを単離した。本発明
において、P. rhodozymaにおけるβ-カロテンからアス
タキサンチンへの反応を相補するこのような遺伝子断片
を単離し、そのヌクレオチド配列を決定した。

【００４２】本発明のこのような遺伝子／DNAを、遮断
された突然変異の相補以外の遺伝子増幅またはプロモー
ター改変を用いた遺伝子量効果によって、アスタキサン
チンの過剰生産のために用いることができる。

【００４３】一般に遺伝子は、異なった機能を持ついく
つかの部分から構成されている。真核生物では、リボゾ
ームRNA(rRNA)、微小核RNA(snRNA)およびトランスファ
ーRNA(tRNA)の遺伝子とは異なり、相当するタンパク質
をコードする遺伝子は、未成熟メッセンジャーRNA(pre-
mRNA)に転写される。RNAポリメラーゼII(PolII)は、こ
の転写において中心的役割をしているが、プロモーター
を含む上流域、および上流活性化配列（UAS）を含むシ
スエレメント、ならびにトランス作用タンパク質ファク
ターなしで、PolIIは単独で転写を始めることはできな
い。最初に、いくつかの基礎タンパク質成分からなる転
写開始複合体は、発現する遺伝子の5’側に隣接した領
域にあるプロモーター配列を認識する。この過程で、熱
ショック応答、または栄養飢餓への適応などのある特別
な調節の下で発現される遺伝子の場合、いくつかの付加
的に動員される物質が必要である。そのような場合、UA
Sがプロモーター配列の周辺にある5’末端非翻訳上流域
に存在する必要があり、ポジティブまたはネガティブ調
節タンパク質は、UASを認識し結合する。転写開始複合
体のプロモーター配列への結合強度は、プロモーター周
辺のトランス作用ファクターの結合のようなものに影響
され、このことにより転写活性の調節が可能となる。

【００４４】リン酸化による転写開始複合体の活性化
後、転写開始複合体は転写開始点から転写を開始する。
転写開始複合体のいくつかの部分は、プロモーター領域
から遺伝子の3’方向へ分離して伸長複合体となり（こ
の段階は、プロモータークリアランスと呼ばれる）、伸
長複合体は遺伝子の3’側の下流域に位置する終結配列
へ到達するまで、転写を続ける。このようにして生成し
た前駆mRNAは核において、転写開始部位にほぼ相当する
キャップサイトでのキャップ構造の付加により、修飾さ
れる。そして、3’側の下流域に位置するポリAシグナル
部位で伸長したポリAの付加により修飾される。次に、
イントロン構造はコード領域から除かれ、エキソン部分
は結合し、相当するタンパク質の一次アミノ酸配列に相
当するオープンリーディングフレームが生成される。成
熟mRNAが生成されるこの修飾は安定な遺伝子の発現に必
要である。一般的な意味でcDNAは、この成熟mRNA配列か
ら逆転写されたDNA配列に相当する。cDNAは、実験的に
成熟mRNAを鋳型として用い、ウイルス種に由来する逆転
写酵素によって合成される。

【００４５】本発明において、P. rhodozyma野生型株に
β-カロテン生産を付与したP. rhodozyma ATCC96815株
の変異点が決定された。塩基配列決定の結果から、AST
遺伝子の第8イントロンのスプライシング配列における
塩基の変化が、mRNAの不適当なスプライシングによって
β-カロテンの特異的な蓄積といった表現型の原因とな
っていることが示唆された。RT-PCR分析により、AST遺
伝子の不適当にスプライシングされた産物が検出され、
変異点の同定が強く支持された。

【００４６】本発明はまた、大腸菌などの異なる宿主生
物で発現されうる組換えAST遺伝子をも提供する。本発
明において、このような組換えAST遺伝子が大腸菌で発
現され、そのサイズが導出された分子量に対応する蛋白
質産物をAST遺伝子がコードすることが確認された。ア
スタキサンチンの生物的生産を、新規AST遺伝子および
このような組換えDNA法の利用によって実現することが
できる。

【００４７】本発明にしたがい、アスタキサンチン生合
成の最終段階に関与する酵素をコードする遺伝子を、P.
rhodozymaのcDNAライブラリーからクローニングし、そ
のヌクレオチド配列を決定した。さらに、プロモーター
およびターミネーターを含むゲノムDNAの一部をクロー
ニングし、プロモーターおよびターミネーター領域を含
むその完全な遺伝子のクローニングに用いられた。

【００４８】そのコード領域、イントロン、ならびにプ
ロモーターおよびターミネーターなどの調節領域を有す
る完全な遺伝子を、スクリーニングプローブとして標識
cDNA断片を用いることにより適当な宿主中のファージま
たはプラスミドベクターにおいて構築したゲノムライブ
ラリーをスクリーニングすることによってクローニング
することができる。一般に、ゲノムライブラリー構築に
最もよく用いられる宿主株の一つは大腸菌である。ベク
ターとしては、ラムダファージベクターなどのファージ
ベクター、またはpUCベクターなどのプラスミドベクタ
ーを用いることができる。このようにして、例えばP. r
hodozyma DNAから構築したゲノムライブラリーは、関心
対象遺伝子の一部を含む標識DNA断片をプローブに用い
ることによってスクリーニングすることができる。次い
で、ハイブリダイズしたプラークまたはコロニーを回収
し、サブクローニングおよび／またはヌクレオチド配列
の決定に用いることができる。

【００４９】関心対象となる蛋白質の所望の酵素活性
を、そのDNA配列を利用することによって増強するいく
つかの方法がある。

【００５０】一つのストラテジーは、遺伝子自体をその
本来の形で用いるというものである。最も単純なアプロ
ーチは、プロモーターおよびターミネーターなどの調節
配列を含むゲノム配列を増幅することである。これは、
関心対象の酵素をコードするゲノム断片を、P. rhodozy
maで機能する選択マーカーを有する適当なベクター中に
クローニングすることにより実施することができる。宿
主を毒性抗生物質存在下で生存可能にする酵素をコード
する薬物耐性遺伝子を、選択マーカーとして用いること
が多い。pGB-Ph9上にあるG418耐性遺伝子（Weryら、Gen
e、184、89〜97、1997）は、このようなベクター構築の
一例である。ベクターとしては、二種類のベクターを一
般に用いることができる。これらのうちの一つは自律複
製配列を持たない組み込みベクターである。プラスミド
pGB-Ph9はこの型のベクターの一例である。このような
ベクターは自律複製配列を持たないため、前述のベクタ
ーはそれ自体では複製できず、ベクターと染色体との間
の相同配列を用いた単交差組換えの結果、宿主の染色体
に組み込まれた形でしか存在できない。選択培地中の対
応する薬物濃度を上げることにより、組み込まれた遺伝
子が染色体上で増幅した株だけが生き残ることができ
る。別の種類のベクターは、自律複製配列を有する複製
可能なベクターである。このようなベクターは多コピー
状態で存在しうる。この型のベクターにおいて、適当な
栄養要求マーカーを有する宿主中で栄養相補マーカーを
用いることもできる。増殖にシチジンを必要とするP. r
hodozymaATCC24221株は、このような栄養要求体の一例
である。ATCC24221のDNA供与体としてCTPシンセターゼ
を用いることにより、栄養相補を用いた宿主ベクターシ
ステムを確立することができる。

【００５１】関心対象酵素を過剰発現させるもう一つの
ストラテジーは、関心対象遺伝子を強力なプロモーター
の下に置くことである。このようなストラテジーにおい
て、関心対象遺伝子は必ずしも多コピー状態である必要
はない。さらに、プロモーター活性が適当な増殖期およ
び適当な培養時期に誘導されるプロモーターを用いるこ
ともできる。アスタキサンチンの生産は、二次代謝物生
産期などの増殖後期に加速する。例えば、カロテノイド
生成遺伝子をベジティティブプロモーターの制御下に置
くことによって、これらの遺伝子の遺伝子発現を指数増
殖期に誘導することができ、アスタキサンチンの生産を
生産株の増殖に関連させることができる。

【００５２】本発明において、このような構成的プロモ
ーターおよびターミネーターの一例として、トリオース
ホスフェートイソメラーゼ（TPI）遺伝子のプロモータ
ーおよびターミネーター断片をP. rhodozymaからクロー
ニングした。さらに、アスタキサンチン生産の回復が、
TPI遺伝子由来の構成的プロモーターおよびターミネー
ターによって推進されるβ-カロテン生産性P. rhodozym
a ATCC96815の染色体上の異なる遺伝子座（アミラーゼ
遺伝子があるAMY遺伝子座）でAST遺伝子が発現される形
質転換体で確認された。

【００５３】関心対象酵素を過剰発現するさらにもう一
つの方法は、その調節エレメントにおける変異である。
この目的のために、β-ガラクトシダーゼ遺伝子、ルシ
フェラーゼ遺伝子、緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子
などの一種のレポーター遺伝子を関心対象遺伝子のプロ
モーター配列とターミネーター配列との間に挿入し、プ
ロモーター、ターミネーターおよびレポーター遺伝子を
含むすべての部分が融合し、共に機能するようにする。
前述のレポーター遺伝子が染色体またはベクター上に導
入されたP. rhodozyma形質転換体を生体内で変異処理し
て、関心対象遺伝子のプロモーター領域における突然変
異を誘導することができる。変異は、レポーター遺伝子
によってコードされる活性の変化の検出によってモニタ
ーすることができる。変異が遺伝子のシスエレメントで
起こった場合、変異点は変異を起こした遺伝子の回収と
配列決定によって決定できると考えられる。次いでこの
変異を、本来のプロモーター配列と変異配列との間の組
換えによって、染色体上のプロモーター領域に導入する
ことができる。同様に、トランス作用ファクターをコー
ドする遺伝子の変異も起こすことができる。

【００５４】プロモーター領域のシスエレメントのイン
ビトロ変異誘発によって、変異を誘導することもでき
る。このアプローチでは、5’末端に目的の遺伝子に由
来するプロモーター領域、および3’末端に目的の遺伝
子に由来するターミネーター領域が融合したレポーター
遺伝子を含む遺伝子カセットを、変異誘発し、次にP. r
hodozymaへ導入する。レポーター遺伝子の活性の違いを
検出することにより、効果的な変異をスクリーニングす
ることができる。そのような変異は、インビボの変異導
入の場合と同じ方法で、染色体上の本来のプロモーター
領域の配列に導入できる。

【００５５】DNA供与体として、β-カロテンからアスタ
キサンチンへの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子
を導入することができる。もともとの配列と同一なコー
ド配列は、1つ以上のアミノ酸が付加、欠失、および/ま
たは置換されているアリル変異体同様、相当する酵素が
同種の酵素活性を持つ限り利用できる。そしてそのよう
なベクターは、P. rhodozymaへ形質転換によって導入で
き、形質転換体は、pGB-Ph9の場合にはジェネチシンを
含むYPD寒天培地または栄養要求株ATCC24221をレシピエ
ントとして使う場合にはシチジンを欠く最小寒天培地の
ような適当な選択培地上に、形質転換した細胞を播くこ
とにより選択することができる。

【００５６】そのような遺伝子的に処理されたP. rhodo
zymaを、適当な培地で培養し、アスタキサンチンの生産
性を評価することができる。このようにして選択された
アスタキサンチンの高生産株は、その生産性と遺伝子工
学によって導入された遺伝子またはタンパク質の発現の
レベルとの関係をみて、確かめることができると思われ
る。

【００５７】本発明に係る単離DNAにおいては、（１）
好ましくはP. rhodozymaにおけるβ-カロテンからアス
タキサンチンへの反応を触媒するアスタキサンチンシン
ターゼ活性を有する酵素をコードするヌクレオチド配列
を含む単離DNAであることを特徴とする。

【００５８】また、本発明に係る単離DNAにおいては、
（２）（a）前記ヌクレオチド配列が配列番号：1に記載
のアミノ酸配列を有する酵素をコードする、または
（b）該ヌクレオチド配列が（i）対立遺伝子変異体、ま
たは（ii）一つもしくは複数のアミノ酸の付加、挿入、
欠失および／または置換を有するが、依然として同じタ
イプの酵素活性を有する酵素より選択される該酵素の変
異体をコードすることを特徴とする、上記(1)記載の単
離DNAであることを特徴とする。。

【００５９】また、本発明に係る単離DNAにおいては、
（３）前記ヌクレオチド配列が（i）配列番号：2に記載
のヌクレオチド配列、（ii）遺伝コードの縮退のため
に、ヌクレオチド配列（i）によってコードされるアミ
ノ酸配列と同じ配列を有するアスタキサンチンシンター
ゼをコードするヌクレオチド配列、または（iii）標準
的なハイブリダイゼーション条件下でi）もしくはii）
からのヌクレオチド配列相補鎖にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列であることを特徴とする、上記(1)記載
の単離DNAであることを特徴とする。

【００６０】また、本発明に係る単離DNAにおいては、
（４）前記ヌクレオチド配列が（i）配列番号：3に記載
のヌクレオチド配列、（ii）遺伝コードの縮退のため
に、ヌクレオチド配列（i）によってコードされるアミ
ノ酸配列と同じ配列を有するアスタキサンチンシンター
ゼをコードするヌクレオチド配列、または（iii）標準
的なハイブリダイゼーション条件下でi）もしくはii）
からのヌクレオチド配列相補鎖にハイブリダイズするヌ
クレオチド配列であることを特徴とする、上記(1)記載
の単離DNAであることを特徴とする。

【００６１】また、本発明に係るベクターまたはプラス
ミドにおいては（５）上記(1)〜(4)のいずれか一項記載
の単離DNAを含むベクターまたはプラスミドであること
を特徴とする。

【００６２】また、本発明に係る宿主細胞においては、
（６）上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の単離DNAまた
は上記(5)記載のベクターもしくはプラスミドによって
形質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞で
あることを特徴とする。

【００６３】また、本発明に係るポリペプチドにおいて
は、（７）上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の単離DNA
によってコードされるポリペプチドであることを特徴と
する。

【００６４】また、本発明に係る製造方法においては、
（８）上記(6)記載の形質転換された宿主細胞を前記酵
素の産生を導く条件下で培養する段階を含む、アスタキ
サンチンシンターゼ活性を有するポリペプチドの製造方
法であることを特徴とする。

【００６５】また、本発明に係る製造方法においては、
（９）上記(1)〜(4)のいずれか一項記載の単離DNAの一
つまたは複数を適当な宿主生物に導入する段階と、得ら
れた生物をアスタキサンチンの産生を導く条件下で培養
する段階と、培養物からアスタキサンチンを回収する段
階とを含む、アスタキサンチンの生物学的製造方法であ
ることを特徴とする。

【００６６】また、本発明に係る製造方法においては、
（１０）適当な再構成膜を含む適当な反応混合物中、適
当な電子供与体存在下で、アスタキサンチンシンターゼ
活性を有するポリペプチドにβ-カロテンを接触させる
段階を含む、アスタキサンチンの製造方法であることを
特徴とする。

【００６７】また、本発明に係る方法においては、（１
１）ポリペプチドがミクロゾームまたはミトコンドリア
膜などの生体膜から調製した再構成膜の形で存在する、
上記(10)記載の方法であることを特徴とする。

【００６８】また、本発明に係る方法においては、（１
２）ポリペプチドがリポソームなどの再構成人工膜の形
で存在する、上記(10)記載の方法であることを特徴とす
る。

【００６９】また、本発明に係る方法においては、（１
３）前記電子供与体がチトクロームP450レダクターゼの
ように反応中心を還元することができる適当な電子供与
体である、上記(10)記載の方法であることを特徴とす
る。

【００７０】

【発明の実施の形態】以下に記載する特定の実施例にお
いて、次に示す物質および方法を使用した。また、図面
は、本明細書の詳細な説明と共に本発明をさらに例示す
るために含まれる。

【００７１】株 P. rhodozyma ATCC96594（この株は1998年4月8日に寄託
番号74438としてブダペスト条約寄託の下、再寄託され
た。）

【００７２】P. rhodozyma ATCC96815（この株は1999年
2月18日に寄託番号74486のブダペスト条約寄託として再
寄託された）

【００７３】ベクター pUC19（宝酒造、大津、日本） λZAPII（Stratagene） pCR2.1-TOPO（Invitrogen） pET11c（Stratagene）

【００７４】培地 P. rhodozyma株はYPD培地（DIFCO、デトロイト、USA）
で通常に維持される。大腸菌株は、LB培地（1リットル
あたり、10gバクトトリプトン、5g酵母抽出物（DIFC
O）、5g NaCl）で維持された。寒天培地を調製するとき
は、1．5％の寒天（WAKO、大阪、日本）を添加した。

【００７５】方法 一般的な分子生物学的方法は、「Molecular cloning: a
Laboratory Manual,第二版（Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1989年）」に記載されている方法に従っ
て行った。制限酵素およびT4DNAリガーゼは宝酒造から
購入した。

【００７６】P. rhodozymaからの染色体DNAの単離は、Q
IAGEN Genomic Kit (QIAGEN、Hilden、Germany)を用
い、製造元が提供したプロトコールに従って行った。形
質転換した大腸菌からのプラスミドDNAのミニプレップ
は、自動DNA単離システム（PI-50,倉紡株式会社、大
阪、日本）を用いて行った。大腸菌形質転換体からのプ
ラスミドDNAのミディプレップは、QIAGENカラム(QIAGE
N)を用いて行った。アガロースからのDNA断片の単離と
精製はQIAquickまたはQIAEX II (QIAGEN)を用いた。

【００７７】DNA塩基配列決定のための蛍光DNAプライマ
ーはPharmaciaから購入した。DNA塩基配列決定は自動蛍
光DNAシーケンサー（ALFred、Pharmacia、スウェーデ
ン、ウプサラ）を用いて実施した。

【００７８】DH5αのコンピテント細胞は、東洋紡から
購入した。

【００７９】P. rhodozymaのバイオリスティック法によ
る形質転換のための機器および試薬を日本バイオラッド
・ラボラトリーズ株式会社（日本、東京）から購入し
た。

【００８０】

【実施例】実施例１． P.rhodozymaからのゲノムDNAの単離 P.rhodozyma（ATCC96594）からゲノムDNAを単離するた
め、QIAGENゲノムキットを、製造者の説明書に従って用
いた。

【００８１】はじめに、YPD培地で終夜培養した100ml培
養液からP.rhodozyma ATCC96594の細胞を、遠心分離（1
500xg、10分）で回収し、TE緩衝液（1mM EDTAを含む10m
Mトリス/HClでpH 8.0に調製）で1回洗浄した。QIAGENゲ
ノムキットのY1緩衝液8mlに懸濁した後、リチカーゼ（S
IGMA、St.Louis, USA）を2mg/mlの濃度で加えて酵素消
化により細胞を破壊させ、反応混合液を30℃で90分イン
キュベートしてから、次の抽出段階に進んだ。最終的
に、20μgのゲノムDNAが得られた。

【００８２】実施例２． P. rhodozyma ATCC96594からのゲノムライブラリーの構
築 上述したとおり、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素
酵素(GAP）の遺伝子のプロモーター領域とターミネータ
ー領域との間にG418耐性構造遺伝子を挿入し、本薬物耐
性マーカーカセットをKpnI-およびHindIII-消化pUC19に
ライゲートすることにより、このようなカセットを有す
るプラスミドを構築した。このプラスミドをpUC-G418と
命名し、その後の試験に用いた。次いで、ClaIリンカー
をpUC-G418ベクターの唯一のEcoRI部位にライゲート
し、その結果プラスミドpUC-G418Cl512を得、Phaffiaの
ゲノムライブラリー構築においてベクター基本骨格とし
て用いた。

【００８３】次いで、実施例1で述べたとおり、P. rhod
ozyma ATCC96594から調製した染色体DNA 10μgを1.6ユ
ニットのHpaIIを用いて37℃で45分間部分消化し、アガ
ロースゲル電気泳動に供した。臭化エチジウムで染色
後、部分消化した4〜10kbのDNA種を透析膜を用いた電気
溶出によって回収した。回収したHpaII断片のエタノー
ル沈降後、1.215μgのDNAを得た。

【００８４】次に、3μgのpG418Cl512を10ユニットのCl
aIにより37℃で1時間消化し、エタノールで沈降した。
次いで、ClaI消化したpG418Cl512をウシ腸アルカリ性ホ
スファターゼを用いて脱リン酸化した。ClaI消化し、脱
リン酸化したpG418Cl512ベクターを次いで、アガロース
ゲル電気泳動にかけ、QIAquickプロトコールを製造元の
指示に従って用い、DNA断片を回収した。最終的に、2.6
2μgのClaI消化し、脱リン酸化したpG418Cl512を得た。

【００８５】2.62μgのClaI消化し、脱リン酸化したpG4
18Cl512を1.22μgのHpaII部分消化したPhaffiaゲノムDN
Aと16℃で終夜ライゲートし、得られたライゲーション
溶液を大腸菌DH5α株の形質転換にDNA供与体として用い
た。全ライゲーション混合物（270μl）を1mlのDH5αコ
ンピテント細胞（東洋紡）にトランスファーした。42℃
で45秒間の熱ショック処理に続き氷上に30分間維持した
後、形質転換した細胞を氷上に2分間置き、次いで下記
の成分を含む5mlのSOC培地を加えて37℃で1時間インキ
ュベートした： 0.5%酵母抽出液（DIFCO） 2%トリプトン（DIFCO） 10mM NaCl 2.5mM KCl 10mM MgCl₂ 20mM MgSO₄ 20mMグルコース。

【００８６】このようにインキュベートした細胞を100
μg/mlのアンピシリンを含むLB培地100mlに移した。培
養を37℃で終夜継続し、次いで細胞をプラスミドのミデ
ィ調製のために回収した。

【００８７】QIAGENミディプレップカラムを製造元が提
供する方法に従って用い、回収した細胞からプラスミド
ライブラリーを調製した。最終的に0.3mg/mlのPhaffia
ゲノムライブラリーを全量にして5ml得、その後の試験
でゲノムライブラリーとして用いた。

【００８８】実施例３． P. rhodozyma ATCC96815のバイオリスティック法を用い
た形質転換 「分子生物学の方法（Methods in Molecular Biolog
y）」（Johnstonら、53；147〜153、1996）に記載の方
法に従い、形質転換を実施した。宿主株として、P.rhod
ozyma ATCC96815をYPD培地中で定常期まで培養した。培
養液の遠心分離後、滅菌水を用いて細胞を10倍に濃縮
し、細胞懸濁液200μlを100μg/mlのジェネチシン、0.7
5Mのマンニトールおよびソルビトールを含むYPD培地上
に播種した。実施例2に記載のとおりに調製したゲノム
ライブラリー5μgを0.9μm金粒子1.5mgにコーティング
し、バイオリスティック法による形質転換にDNA供与体
として用いた。20℃で1週間のインキュベーション後、
約20,000のジェネチシン耐性クローンが得られた（各プ
レートに300〜500コロニー）。ほとんどの形質転換体が
黄色を呈した（宿主株ATCC96815と同様に）が、3つのコ
ロニーは赤に着色し、これらをその後の試験に用いた。

【００８９】実施例４． 赤色着色形質転換体から得られたカロテノイドの分析 P. rhodozyma ATCC96815から得た赤色着色形質転換体
を、試験管内で10mlのYPD培地中20℃で培養した。次い
で、培養液0.5mlから細胞を回収し、細胞からカロテノ
イドを抽出するために用いた。P. rhodozymaの細胞から
前述のガラスビーズを用いた破壊によるカロテノイド抽
出後、P. rhodozymaのカロテノイド含有量をHPLCによっ
て測定した。抽出後、破壊した細胞を遠心分離により回
収し、得られた上清をHPLCでカロテノイド含有量につい
て分析した。 HPLCカラム：Chrompack Lichrosorb si-60（4.6mm、250
mm） 温度：室温 溶出液：アセトン／ヘキサン(18／82）の溶出液に1ml/L
の水を添加 注入量：10μl 流速：2.0ml/分 検出：UV450nm β-カロテンのサンプルはSIGMAから購入し、アスタキサ
ンチンはHoffman La-Roche（スイス、バーゼル）から購
入した。

【００９０】HPLC分析の結果、宿主株ATCC96815はβ-カ
ロテンしか産生しないが、3つの赤色形質転換体はすべ
てアスタキサンチンを特異的に産生することが確認され
た。

【００９１】実施例５． アスタキサンチンを産生した赤色形質転換体の染色体か
らのプラスミド回収 染色体DNAをすべてのアスタキサンチン生産形質転換体
から調製した。この目的のために、実施例1に記載のと
おり、QIAGENゲノムキットを製造元が指定する方法にし
たがって用いた。このようにして調製した5μgの染色体
DNAをHindIIIによって消化し、次いでQIAquickプロトコ
ールに従って精製した。大腸菌DH5αコンピテント細胞
を、ライゲートしたDNA溶液により形質転換し、次いで1
00μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に播種した。
形質転換体はすべて、そのプラスミドの配列解析から判
断して、プラスミド中に同じ挿入断片を有していた。こ
のことから、P. rhodozyma ATCC96815由来の3つの別々
の赤色形質転換体は、ゲノムライブラリーのDNA供与体
と染色体DNAとの間の同じ型の組換え事象によって生じ
たことが示された。このようにして回収したプラスミド
の一つをpR2-4と命名し、その後の試験に用いた。

【００９２】実施例６． pR2-4をハイブリダイゼーションプローブとして用いる
ことによる元のゲノムライブラリーのスクリーニング 回復したpR2-4の断片はP. rhodozymaの赤色形質転換体
を生じる組換え事象の方向によっては突然変異を有し得
るため、元のゲノムライブラリーのスクリーニングをpR
2-4をハイブリダイゼーションプローブとして用いるこ
とにより実施した。

【００９３】この目的のために、実施例2に記載のとお
り、元のゲノムライブラリーの20,000の大腸菌形質転換
体をナイロンメンブレンフィルター（Hybond-N+、Amers
ham、英国バッキンガムシア）に移し、コロニーハイブ
リダイゼーションに供した。インサート中にpR2-4と同
じヌクレオチド配列を保持する3つの形質転換体が単離
された。これらの形質転換体から単離されたプラスミド
をpR3、pR5.1およびpR16と命名した。

【００９４】次に、P. rhodozyma ATCC96815を、pR3、p
R5.1およびpR16によって形質転換した。すべての形質転
換体は赤に着色した。この結果から、単離したプラスミ
ドがP. rhodozymaにおけるβ-カロテンからアスタキサ
ンチンへの反応に関与する酵素をコードする遺伝子を含
む可能性が示唆される。本発明者らはこの遺伝子をAST
遺伝子と命名した。これらのプラスミドのうち、pR16を
その後の試験で用いた。

【００９５】実施例７． cDNA分析のためのP. rhodozymaからのmRNAの単離 P. rhodozymaからの転写物のパターンを分析するため
に、全RNAを、ガラスビーズを用いた細胞破壊の組み合
わせによるフェノール抽出法によってP. rhodozyma ATC
C96594およびATCC96815から単離し、mRNAをmRNA分離キ
ット（Clontech、米国パロアルト）を用いて精製した。

【００９６】はじめに、YPD培地で2日間培養した10mlか
らATCC96594およびATCC96815株の細胞を、遠心分離（15
00xg、10分）で回収し、抽出緩衝液（0.1M LiClおよび
0.1mMEDTAを含む100mM Tris/ HCl（pH 7.5））で1回洗
浄した。50mlのディスポーザブル遠心管（岩城ガラス、
日本、東京）中、同じ抽出緩衝液で細胞懸濁液を5.0ml
に合わせた後、1.5mlのisogen-LS（株式会社ニッポンジ
ーン、日本、富山)および10gのガラスビーズを加えた。
細胞懸濁液とisogen-LSおよびガラスビーズを含む遠心
管を、水平卓上振盪機で1時間振盪した。この段階で、3
00μgの全RNAが回収された。

【００９７】次いで、mRNA分離キット（Clontech）を用
いてmRNAを精製した。P. rhodozymaATCC96594およびATC
C96815株から8.0μgのmRNAを得た。

【００９８】cDNAを合成するために、製造元が指定する
方法に従って、SMART cDNA構築キット（Clontech）を用
いた。2μgの精製したmRNAを、最初の鎖の合成、続いて
PCR増幅に用い、1mgのcDNAを得た。

【００９９】実施例８． pR16のサブクローニングおよびその挿入断片の機能分析 pR16の制限地図を図2に示す。長さが0.7および2.7kbの
各EcoRI断片をpUC-G418にサブクローニングし、それぞ
れpRS913およびpRLR913と命名した。

【０１００】次いで、アスタキサンチンを生産するP. r
hodozyma ATCC96594株をpRS913で形質転換した。この形
質転換試験の結果、黄色の形質転換体が得られた。この
ことから、0.7kbのEcoRI断片が切断されたAST遺伝子を
含み、0.7kbのEcoRI断片とP.rhodozymaの染色体上にあ
るその相同配列との間の単交差組換えを介した形質転換
の結果、P. rhodozymaの染色体上のAST遺伝子破壊が起
きることが示唆された。

【０１０１】次に、β-カロテンを生産するATCC96815株
をpRLR913で形質転換し、赤色の形質転換体を得た。こ
のことから、アスタキサンチンを生産する野生型株にβ
-カロテンを生産させるよう誘導するATCC96815株の変異
点は、本来pR16における0.7kbのEcoRI断片に隣接する2.
7kbのEcoRI断片上にあることが示唆された。

【０１０２】実施例7で調製した200μgのcDNAを仮想ノ
ーザン分析のためにアガロースゲル電気泳動にかけた。
ATCC96594および96815から調製したcDNAの場合、いずれ
の場合にもpRLR913の2.7kbのEcoRI断片をハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いることによって2つのバ
ンド、すなわち3.2および2.0kbのバンドがハイブリダイ
ズした。このことから、ATCC96815のast変異はミスセン
ス変異のようにmRNAの長さの変化に影響しない点変異で
あることが示唆された。

【０１０３】pRS913の0.7kbのEcoRI断片をハイブリダイ
ゼーションプローブとして用いた場合、2.0kbのバンド
がハイブリダイズした。この試験から、AST遺伝子はP.
rhodozymaにおいて2.0kbの転写物を与えると考えられ
た。

【０１０４】実施例９． AST遺伝子のcDNAのクローニング P. rhodozymaからAST遺伝子のcDNAをクローニングする
ために、P. rhodozymaATCC96594からcDNAライブラリー
を構築した。実施例7に記載のとおり、全RNAを、ガラス
ビーズを用いた細胞破壊の組み合わせによるフェノール
抽出法によって単離した。

【０１０５】はじめに、YPD培地で2日間培養した50mlか
らATCC96594株の細胞を、遠心分離（1500xg、10分）で
回収し、抽出緩衝液（0.1M LiClおよび0.1mM EDTAを含
む100mM Tris/ HCl（pH 7.5））で1回洗浄した。50mlの
ディスポーザブル遠心管（岩城ガラス、日本、東京）
中、同じ抽出緩衝液で細胞懸濁液を5.0mlに合わせた
後、1.5mlのisogen-LS（株式会社ニッポンジーン)およ
び10gのガラスビーズを加えた。細胞懸濁液とisogen-LS
およびガラスビーズを含む遠心管を、水平卓上振盪機で
1時間振盪した。この段階で、1.8mgの全RNAが回収され
た。

【０１０６】次いで、製造元が指定する方法に従って、
PolyATtract mRNA分離キット（Promega corp.、米国マ
ディソン）を用いてmRNAを精製した。最終的に、P. rho
dozyma ATCC96594株から8.0μgのmRNAが得られた。

【０１０７】cDNAライブラリーを構築するために、製造
元が指定するプロトコールにより、8.0μgの精製mRNAを
COPYキット（Invitrogen、米国カールスバッド）で用い
た。EcoRIアダプター（Stratagene）のライゲーション
後、合成cDNAをアガロースゲル電気泳動にかけた。長さ
1.9から2.3kbのcDNAに相当するアガロースゲルの切片を
切り出した後、回収したcDNA種をQIAEX II（QIAGEN）に
よって精製した。このサイズによって分画したcDNAをEc
oRI消化し、脱リン酸化したλZAPII（Stratagene）にラ
イゲートした。終夜ライゲートした混合物をGigapack I
II gold extract（Stratagene）を用いてインビトロパ
ッケージングし、大腸菌XL1-Blue MRF'株への感染に用
いた。

【０１０８】通常のプラークスクリーニングを、実施例
8に記載の2.7および0.7kbのEcoRI断片をハイブリダイゼ
ーションプローブに用いて、6000のプラークに対して実
施した。一つのプラークがこれらのプローブに強くハイ
ブリダイズし、滅菌つまようじで回収し、溶出したファ
ージ粒子を製造元が指定する方法にしたがってインビボ
切り出しに用いた。最終的に、アンピシリンに耐性を示
す大腸菌SOLR細胞の感染形質転換体を単離した。これら
の形質転換体から得た単離プラスミドの配列決定後、こ
れらのプラスミドが実施例6に記載したpR16の配列の一
部と同一の断片を含むことが判明した。

【０１０９】AST遺伝子のcDNAの全配列を決定して配列
番号：2に示し、その推定アミノ酸配列を配列番号：1に
示す。

【０１１０】実施例１０． 大腸菌におけるAST遺伝子の発現 AST遺伝子のORFが実際に蛋白質をコードしていることを
確認するために、AST遺伝子の発現試験を大腸菌発現シ
ステムで実施した。はじめに、次の精製段階を容易にす
るために、6xヒスチジン（His）タグをAST産物のカルボ
キシ末端に付加した。PCRプライマーを合成した（配列
を表１に示す）。

【０１１１】

【表１】6xHisタグを付加したAST遺伝子の3'部分をクロ
ーニングするためのPCRプライマー

【０１１２】次に、pAST1207の1.5kbのNdeIEcoRI断片お
よびpAST114の0.3kbのEcoRIBamHI断片をNdeIおよびBamH
Iで消化したpET11cにライゲートし、ライゲートしたDNA
を大腸菌JM109株に形質転換した。6つの独立したアンピ
シリン耐性クローンを制限酵素解析によって試験し、6
つのクローンのうち5つがAST遺伝子を含む組換え発現プ
ラスミドの正しい構造を有することが判明した。そのう
ちの1つをその後の試験のために選択し（pAST120）、次
いで大腸菌BL21（DE3）（pLysS）株に形質転換した。制
限酵素解析によって試験したアンピシリン耐性クローン
はすべて、pAST120を適切に有することが明らかとなっ
た。次に、発現試験を、大腸菌BL21（DE3）（pLysS）
（pAST120）増殖培養物に、600nmの光学密度（OD）が0.
8に達した時点で1mM IPTGを加え、行った。培養を37℃
で4時間続けた後、細胞を遠心分離により回収し、SDSサ
ンプル緩衝液（125mM Tris-HCl、pH6.8、20%グリセロー
ル、4%SDS、0.005%ブロモフェノールブルー、5%メルカ
プトエタノール）中で煮沸することにより溶解した。次
いで溶解産物をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（PAGE）にかけた。クーマシーブリリアントブルー（Ra
pid stain CBBキット、ナカライテスク株式会社、日
本、京都）による染色後、発現した蛋白質は観察されな
かった（データは示していない）。

【０１１３】一般に、大腸菌発現システムでP450蛋白質
を発現させるには、P450蛋白質のアミノ末端領域におけ
るアミノ酸配列にいくらかの改変が必要であると報告さ
れている。事実、無傷の配列を有していたAST遺伝子は
大腸菌で発現されず（データは示していない）、AST遺
伝子の場合にも他のP450酵素と同様にアミノ末端の配列
におけるいくらかの改変が必要であることが判明した。
組換えAST遺伝子発現の次のストラテジーとして、AST遺
伝子のアミノ末端にある疎水性アンカー配列欠失させた
上でAST蛋白質のアミノ末端に6xHisタグ配列を付加した
構造を作成した。

【０１１４】アミノ末端で欠失したアンカー配列上のAS
T蛋白質のアミノ末端に6xHisタグ配列を付加するため
に、下記のPCRプライマーを合成し、PCRクローニングに
用いた。

【０１１５】

【表２】アンカー配列が欠けた5'部分に6xHisタグを付
加したAST遺伝子をクローニングするためのPCRプライマ
ー

【０１１６】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、55℃30秒、72℃30秒を25サイクル。プラスミドpAST
1207をPCRの鋳型として用いた。所望の長さのPCR断片を
pCR2.1-TOPO（Invitrogen）にクローニングし、予想さ
れるインサートを有する6つの独立したクローンをその
インサートの配列について調べた。その結果、2つのク
ローンがそれぞれ正確なインサート配列を有しており、
1つのクローンを選んでその後の試験に用いた（それぞ
れ、AST遺伝子の3'末端用のpAST228とAST遺伝子の5'末
端用のpAST302#3202）。pAST302#3202から0.2kbのNdeIS
phI断片、pAST1207から1.5kbのSphIEcoRI断片、およびp
AST228から0.05kbのKpnIBamHI断片をNdeIおよびBamHIで
消化したpET11cにライゲートし、ライゲーション混合物
を大腸菌DH5αに形質転換した。6つの独立したクローン
の制限酵素解析の結果、すべてのクローンがその発現の
ためのAST遺伝子を有する正しい構造を持つことが判明
した。一つのクローンを選択し、その後の試験に用いた
（pAST315）。次に、pAST315を発現宿主の大腸菌BL21
（DE3）（pLysS）にトランスファーした。制限酵素解析
の結果、6つの形質転換体はすべて正しくpAST315を有す
ることが確認された。

【０１１７】次に、発現試験を、大腸菌BL21（DE3）（p
LysS）（pAST315）増殖培養物に1.5mM IPTGを、600nmの
光学密度（OD）が0.93に達した時点で加え、行った。培
養を37℃で4時間続けた後、細胞を遠心分離により回収
し、SDSサンプル緩衝液中で煮沸することにより溶解し
た。次いで溶解産物をPAGEにかけた。クーマシーブリリ
アントブルーによる染色後、分子量がその推定アミノ酸
配列とよく一致する発現蛋白質（約60kDa）が観察され
た（図3）。この結果から、AST遺伝子がその導出された
オープンリーディングフレームから予想される蛋白質を
コードすることが確認された。

【０１１８】実施例１１． AST遺伝子産物の試験管内の特徴付け AST遺伝子産物の酵素的特徴付けのために、P450酵素の
特性解析に用いる標準的なアッセイを利用することがで
きる。この目的のために、反応混合物は再構成膜を含ん
でいる必要がある。再構成膜としては、ミトコンドリア
膜またはミクロゾームなどの天然単離物および人工膜を
使用することが多い。いずれの場合にも、電子受容体と
レセプターとの間で電子の移動が起こる必要がある。電
子供与体としては、チトクロームP450レダクターゼを反
応混合物に加えることが多い。電子受容体としては、酸
素分子が含まれる。還元型NADPH+などの電子供給源の存
在下で、アスタキサンチンシンターゼの基質であるβ-
カロテンをアスタキサンチンに変換することできる。生
成したアスタキサンチンは、HPLC分析によって定性的且
つ定量的に分析することができる。

【０１１９】実施例１２． AST遺伝子を含むゲノム断片のクローニング AST遺伝子を含むゲノム配列を決定するために、プライ
マーウォーキング法を用いて配列決定実験を行った。pR
S913の配列解析により、pRS913はAST遺伝子の3'末端を
含まないことが判明した。AST遺伝子の3'隣接ゲノム断
片を得るために、ゲノムウォーキング実験を実施した。
このために、ユニバーサルゲノムウォーカーキット（Cl
ontech）を、製造元が指定する方法に従って利用した。
PCRの鋳型として、実施例1で調製した染色体DNAを用い
た。配列を表3に示す遺伝子特異的プライマー、ast15を
合成し、PCRプライマーに用いた。

【０１２０】

【表３】AST遺伝子のゲノムウォーキングに用いるプラ
イマーの塩基配列

【０１２１】適当な長さ（1kb未満）のPCR断片をEcoRV
およびStuIライブラリーから得、精製してpCR2.1-TOPO
(Invitrogen）にクローニングした。配列決定の結果、
いずれの断片もAST遺伝子を含むゲノム断片を含むこと
が判明した。AST遺伝子のポリA部位から200bpに位置す
る配列に基づき、表4に示すPCRプライマーを設計した。

【０１２２】

【表４】AST遺伝子の3'隣接断片をクローニングするた
めのプライマーの塩基配列

【０１２３】PCRプライマーとしてast15およびast18プ
ライマーと、PCRの鋳型として実施例1で調製した染色体
DNAを用いることにより、PCRを実施した。プルーフリー
ディングポリメラーゼ（HFポリメラーゼ、Clontech）に
よって正しい配列を持つPCR断片の増幅を確実にした。P
CR条件は以下のとおりであった：94℃15秒、55℃30秒、
72℃30秒を25サイクル。400bpのインサートを有する6つ
の独立したクローンは同一の配列を示した。

【０１２４】pRS913およびpRL913の配列を組み合わせる
ことにより、474bpのプロモーター領域および269bpのタ
ーミネーター領域を含むAST遺伝子を有する3.9kbの配列
が決定された（配列番号：3）。その結果、AST遺伝子は
イントロンの多い構造を示した（17イントロン）。

【０１２５】実施例１３． β-カロテン生産株P. rhodozyma ATCC96815における変
異点の決定 P. rhodozyma ATCC96815株によるβ-カロテンの生産がA
ST遺伝子内の変異が原因であったという事実を確認する
ために、ATCC96815とその親株P. rhodozyma ATCC24230
から得たAST遺伝子を含むゲノム配列を決定した。この
ために、配列を表5に示すPCRプライマーを合成し、PCR
クローニングに用いた。

【０１２６】

【表５】全長ゲノムAST遺伝子をクローニングするため
のPCRプライマー

【０１２７】PCRポリメラーゼとしてHFポリメラーゼ（C
lontech）と、PCRの鋳型として実施例1と同じプロトコ
ールによりATCC96815およびATCC24230株から調製した染
色体DNAを用いることにより、PCRを以下の条件で実施し
た：94℃15秒、55℃30秒、72℃4分を25サイクル。得ら
れた約3.5kbの長さのPCR断片をpCR2.1-TOPOにクローニ
ングし、プライマーウォーキング法によってその全配列
を決定した。P. rhodozyma ATCC96594株とATCC24230株
の配列間には7塩基の変化が認められた。4塩基の変化が
そのエキソン配列に認められたが、これらはアミノ酸の
変化をもたらすものではなかった。3塩基の変化がその
イントロン構造中に認められた。β-カロテン生産株ATC
C96815とその親株ATCC24230との比較において、第8イン
トロン内の5'スプライシング配列に1塩基の変化が見ら
れた（GTAAGT＞GTAAAT）。このことは、アスタキサンチ
ンを生産するP. rhodozymaにβ-カロテン蓄積の表現型
を与える変異はAST遺伝子のmRNAの不適当なスプライシ
ングに起因することを示していると考えられる。

【０１２８】この仮説を確認するために、PCRの鋳型と
してP. rhodozyma ATCC96815から調製したcDNAを用いる
ことによりRT-PCRを実施した。mRNAを実施例9と同じプ
ロトコールによってP. rhodozyma ATCC96815から単離
し、cDNA合成に用いた。ATCC96815から調製したこのmRN
AからPCR法によってcDNAを得るために、SMART PCR cDNA
ライブラリー構築キット（Clontech）を製造元が指定す
る方法に従って利用した。第8イントロンをカバーする
下記のプライマーを合成し、PCRプライマーに用いた
（配列を表6に示す）。

【０１２９】

【表６】AST遺伝子の不適当なスプライシング産物を検
出するためのRT-PCRのためのPCRプライマー

【０１３０】RT-PCR条件は以下のとおりであった：94℃
15秒、55℃30秒、72℃30秒を25サイクル。PCRの結果、3
00bpのPCR産物が増幅され、pCR2.1-TOPOにクローニング
した。300bpのインサートを有する2つの独立したクロー
ンの配列を決定した。その結果、AST遺伝子の不適当な
スプライシング産物は、P. rhodozyma ATCC96815株中で
合成されたことが確認された。停止コドンが第8イント
ロンにあることから、AST遺伝子の第8イントロンの不適
当なスプライシングが、適当にスプライシングされたAS
T蛋白質よりも短縮されたAST蛋白質生産を引き起こすと
考えられる。この結果から、変異点は適当なスプライシ
ング能を失ったAST遺伝子にあることが示された。

【０１３１】実施例１４． β-カロテンを生産するPhaffia rhodozymaにおけるAST
遺伝子の発現 AST遺伝子がβ-カロテンからアスタキサンチンへの変換
に関与する酵素をコードしていたという事実を確認する
ために、AST遺伝子をβ-カロテン生産株にクローニング
した。染色体上のAST遺伝子の本来の遺伝子座において
組換えが起こる可能性を排除するために、Phaffia rhod
ozymaの染色体のAMY遺伝子座上のAST遺伝子発現プラス
ミドを構築した。このために、Phaffia rhodozymaから
いくつかの遺伝エレメントをクローニングする必要があ
った。

【０１３２】1）Phaffia rhodozymaからの構成的プロモ
ーターおよびターミネーターのクローニング Phaffia rhodozymaから構成的プロモーターおよびター
ミネーターをクローニングするために、デジェネレート
PCR法を利用した。酵母の遺伝子操作で構成的プロモー
ターおよびターミネーターとしてよく用いられる遺伝子
の中で、トリオースホスフェートイソメラーゼをコード
するTPI遺伝子のクローニングを試みた。Blocksデータ
ベース（http://www.blocks.fhcrc.org/）に登録されて
いる保存アミノ酸配列の中で、2つのモティーフ配列（A
rg-Thr-Phe-Phe-Val-Gly-Gly-AsnおよびAsp-Val-Asp-Gl
y-Phe-Leu-Val-Gly-Gly-Ala）を選択し、そのデジェネ
レートプライマーを下記の通りに合成した。

【０１３３】

【表７】P. rhodozymaからTPI遺伝子をクローニングす
るためのデジェネレートPCRプライマー （M＝AまたはC；N＝A、C、GまたはT；Y＝CまたはT；R＝
AまたはG）

【０１３４】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、46℃30秒、72℃15秒を25サイクル。ExTaqポリメラ
ーゼ（宝酒造株式会社）をPCRポリメラーゼとして用い
た。PCRの鋳型として、SMART PCR cDNAライブラリー構
築キット（Clontech）を用いることにより、P. rhodozy
ma ATCC96594から単離したmRNAからcDNAプールを調製し
た。0.7kbのPCR断片を精製し、pCR2.1-TOPOにクローニ
ングした。制限酵素解析から判断して、6つの独立した
クローンが所望の長さのインサートを有していた。その
うちの2つを配列決定し、その両方が様々な生物由来の
既知のTPI遺伝子に著しい相同性を示すインサート配列
を有することが確認された。そのうちの1つを選択して
その後の試験に用いた（pTPI923）。

【０１３５】次に、pTPI923のインサート配列に基づ
き、配列を表8に示すいくつかのPCRプライマーを合成
し、TPI遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを
クローニングするためのゲノムウォーキングを行った。
この実験のために、ユニバーサルゲノムウォーカーキッ
ト（Clontech）を製造元が指定する方法にしたがって利
用した。

【０１３６】

【表８】TPIプロモーターおよびターミネーターをクロ
ーニングするゲノムウォーキングのためのPCRプライマ
ー

【０１３７】PCR条件は以下のとおりであった：94℃4
秒、74℃3分を7サイクルに続き94℃4秒、69℃3分を32サ
イクル、および69℃で4分の伸長。KODポリメラーゼ（東
洋紡績株式会社）をPCRポリメラーゼとして用いた。PCR
の鋳型としてP. rhodozyma ATCC96594から調製した染色
体DNAを用いた。その結果、ターミネーター領域の候補
がEcoRVおよびStuIライブラリーから得られた。これら
の候補の配列解析により、いずれのクローンもTPI構造
遺伝子の推定3'末端およびターミネーター領域を含むTP
I遺伝子の下流配列を有することが明らかとなった。プ
ロモーター領域をクローニングした場合、EcoRVライブ
ラリーから得た候補はTPI構造遺伝子の導出された5'末
端およびプロモーター領域を含んでいた。

【０１３８】次いで、PCRプライマー（配列を表９に示
す）を合成し、TPI遺伝子由来のプロモーターカセット
およびターミネーターカセットを構築した。

【０１３９】

【表９】TPIプロモーターおよびTPIターミネーターカセ
ットを構築するためのPCRプライマー

【０１４０】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、55℃30秒、72℃30秒を25サイクル。HFポリメラーゼ
（Clontech）をPCRポリメラーゼとして用い、得られたP
CR断片をpCR2.1-TOPOにクローニングした。制限酵素解
析および配列解析の結果、同一の配列を有するクローン
が得られたことが判明した。それぞれ1つのクローンを
選択して、その後の試験に用いた（それぞれ、プロモー
ターカセットにpTPIP1104およびターミネーターカセッ
トにpTPIT1104）。

【０１４１】2）Phaffia rhodozymaからの部分アミラー
ゼ遺伝子のクローニング P. rhodozymaの染色体上に外来遺伝子を所在させ発現さ
せるために、アミラーゼ遺伝子をP. rhodozymaからクロ
ーニングした。外来遺伝子がクローニングされた発現ベ
クターが、アミラーゼ遺伝子などのP. rhodozymaの染色
体配列に相同の遺伝子配列を含みうる場合、発現ベクタ
ーは単交差組換え後にP. rhodozymaの染色体上の相同領
域上に組み込まれる。

【０１４２】様々な生物由来アミラーゼをコードする11
のアミノ酸配列を、Entrezデータベース（http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/Entrez/）から選択し、clustal Wによ
るアミノ酸アライメントに用いた（Thompson, J.D., Hi
ggins, D.G.およびGibson, T.J.、Nucleic Acids Resea
rch、22：4673〜4680、1994）。アミラーゼ配列がデー
タベースに登録されている11の生物を表10に示す。

【０１４３】

【表１０】Clustal W分析のためのデータベースに登録
されている様々なアミラーゼ遺伝子 アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)アワモリ(aw
amori)変種amyA遺伝子（登録番号X52755） アスペルギルスニガー(Aspergillus niger)アワモリ(aw
amori)変種amyB遺伝子（登録番号X52756） アスペルギルスカワチ(Aspergillus kawachii)酸安定α
アミラーゼ遺伝子（登録番号AB008370） アスペルギルスオリザ(Aspergillus oryzae) amy1遺伝
子（登録番号X12725） アスペルギルスシロウサミ(Aspergillus Shirousamii)
αアミラーゼ遺伝子（登録番号P30292） クリプトコッカス属（Cryptococcus）αアミラーゼ遺伝
子（登録番号D83541） リポマイセスコノネンコエ（Lipomyces kononenkoae)ス
ペンセルマルチンシエ(spencermartinsiae)亜種αアミ
ラーゼ遺伝子（登録番号U30376） デバリョマイセスオクシデンタリス(Debaryomyces occi
dentalis) amy1遺伝子（登録番号X16040） サッカロマイコプシスフィブリゲラ(Saccharomycopsis
fibuligera) ALP1遺伝子（登録番号X05791） シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pom
be)αアミラーゼ遺伝子（登録番号Z64354）

【０１４４】デジェネレートPCR法によりP. rhodozyma
からアミラーゼ遺伝子をクローニングするために、アミ
ラーゼの2つの保存アミノ酸配列（Asp-Tyr-Ile-Gln-Gly
-Met-Gly-Phe-Asp/Thr-Ala-Ile-TrpおよびAsp-Gly-Ile-
Pro-Ile-Ile-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Glu-Gln）を選択し、次
いで、P. rhodozymaからAMY遺伝子をクローニングする
ために、PCRプライマーを合成した（配列を表11に示
す）。

【０１４５】

【表１１】P. rhodozymaからアミラーゼ（AMY）遺伝子
をクローニングするためのデジェネレートPCRプライマ
ー （Y＝CまたはT；H＝A、CまたはT；R＝AまたはG；N＝A、
C、GまたはT；M＝AまたはC；D＝A、GまたはT）

【０１４６】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、50℃30秒、72℃2分を25サイクル。ExTaqポリメラー
ゼ（宝酒造株式会社）をPCRポリメラーゼとして用い
た。PCRの鋳型として、実施例1で調製した染色体DNA
と、SMART PCR cDNAライブラリー構築キット（Clontec
h）を用いることによりP. rhodozyma ATCC96594から単
離したmRNAから調製したcDNAプールとを用いた。PCRの
鋳型として染色体およびcDNAを用いた場合、それぞれ1.
7kbおよび0.9kbのPCR断片が得られた。両方の断片を精
製し、pCR2.1-TOPOにクローニングした。制限酵素解析
から判断して、6つの独立したクローンが所望の長さの
インサートを有していた。そのうちの2つを配列決定
し、その両方が様々な生物由来の既知のアミラーゼ遺伝
子に著しい相同性を示すインサート配列を有することが
確認された。そのうちの染色体AMY断片を含む1つを選択
してその後の試験に用いた（pAMY216）。部分アミラー
ゼカセットを構築するために、pAMY216のインサート断
片の内部配列に基づき、2つのPCRプライマーを合成した
（配列を表12に示す）。

【０１４７】

【表１２】部分的AMYカセットを構築するためのPCRプラ
イマー

【０１４８】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、55℃30秒、72℃2分を25サイクル。HFポリメラーゼ
（Clontech）および染色体DNAをそれぞれPCRポリメラー
ゼおよびPCRの鋳型として用いた。得られたPCR断片をpC
R2.1-TOPOにクローニングした。制限酵素解析および配
列解析の結果、正しい配列を有するクローンが得られた
ことが判明した。1つのクローンを選択して、その後の
試験に用いた（pAMY1113）。

【０１４９】3）Phaffia rhodozymaで機能したAST遺伝
子の発現ベクター構築 AST遺伝子の発現プラスミドを、各遺伝子成分の制限酵
素による消化およびライゲーションにより構築した。は
じめに、pTPIT1104からの0.3kbのKpnIPstI断片およびpG
418Sa512からの1.7kbのSacIKpnI断片を、SacIおよびPst
Iで消化したpGEM-Tプラスミドにライゲートした。制限
酵素による消化の結果、12の形質転換体のうち9つのク
ローンが正しい構造を有することが判明し、そのうちの
1つをその後の試験のために選択した（pTPITG1120）。

【０１５０】次に、両端に適当な制限酵素切断部位を付
加するために、AST遺伝子のPCRクローニングを実施し
た。PCRプライマーを合成した（配列を表13に示す）。

【０１５１】

【表１３】完全なAST遺伝子カセットをクローニングす
るためのPCRプライマー

【０１５２】PCR条件は以下のとおりであった：94℃15
秒、55℃30秒、72℃2分を25サイクル。HFポリメラーゼ
（Clontech）およびpAST1207をそれぞれPCRポリメラー
ゼおよびPCRの鋳型として用いた。得られたPCR断片をpC
R2.1-TOPOにクローニングした。制限酵素解析および配
列解析の結果、正しい配列を有する1つのクローンが得
られたことが判明した。このクローンを選択して、その
後の試験に用いた（pAST113）。

【０１５３】最終的に、pAMY1113からの1.6kbのSacIINo
tI断片、pTPIP1104からの0.3kbのNotIXbaI断片およびpA
ST113からの1.5kbのXbaISse8387I断片を、SacIIおよびS
se8387Iで消化したpTPITG1120にライゲートした。制限
酵素解析の結果、5つの試験した形質転換体すべてが正
しい構造を有することが確認され、そのうちの1つをそ
の後の試験のために選択した（pAATG123）。

【０１５４】4）β-カロテン生産Phaffia rhodozymaに
おけるアスタキサンチン生産の回復 AST遺伝子の発現プラスミド（pAATG123）をβ-カロテン
生産Phaffia rhodozyma ATCC96815に形質転換した。バ
イオリスティック法による形質転換を、実施例3に記載
のとおりに実施した。赤色に着色した2つのジェネチシ
ン耐性コロニーを回収し、その後の試験のために選択し
た。P. rhodozyma染色体上のAMY遺伝子座における組込
みを確認するために、PCRプライマーを合成した（配列
を表14に示す）。

【０１５５】

【表１４】P. rhodozyma染色体上のAMY遺伝子座におけ
る発現プラスミドの組込みを確認するためのPCRプライ
マー

【０１５６】これらの形質転換体から染色体を調製し、
PCRの鋳型に用いた。PCR条件は以下のとおりであった：
94℃15秒、55℃30秒、72℃2分を25サイクル。ExTaqポリ
メラーゼ（宝酒造株式会社）をPCRポリメラーゼとして
用いた。赤色形質転換体から得た染色体を鋳型DNAとし
て用いたPCR反応において、陽性の2.0kb PCRバンドが得
られた。宿主株P. rhodozyma ATCC96815由来の染色体を
PCRの鋳型として用いたPCR反応混合物には、PCRバンド
は認められなかった。

【０１５７】5）組換えAST遺伝子がβ-カロテン生産P.
rhodozymaの染色体上に組み込まれた組換え体によるフ
ラスコ発酵 アスタキサンチンの生産性をフラスコ発酵で評価した。
フラスコ発酵のための培地の組成は以下のとおりであ
る。

【０１５８】

【表１５】フラスコ発酵のための播種培地組成 グルコース 30.0g/l NH₄Cl 4.83g/l KH₂PO₄ 1.0g/l MgSO₄-7H₂O 0.88g/l NaCl 0.06g/l CaCl₂-2H₂O 0.2g/l フタル酸水素カリウム 20.0g/l FeSO₄-7H₂O 28mg/l クエン酸-1H₂O 15.0mg/l ZnSO₄-7H₂O 40.0mg/l CuSO₄-5H₂O 0.75mg/l MnSO₄-4,5H₂O 0.6mg/l H₃BO₃ 0.6mg/l Na₂MoO₄-2H₂O 0.6mg/l KI 0.15mg/l ミオイノシトール 60.0mg/l ニコチン酸 3.0mg/l D-パントテン酸Ca 3.0mg/l ビタミンB1（塩酸チアミン） 3.0mg/l p-アミノ安息香酸 1.8mg/l ビタミンB6（塩酸ピリドキシン） 0.3mg/l ビオチン 0.048mg/l 7ml／試験管（直径21mm）

【０１５９】

【表１６】フラスコ発酵のための培地組成 MgSO₄-7H₂O 2.1g/l CaCl₂-2H₂O 0.865g/l (NH₄)₂SO₄ 3.7g/l FeSO₄-7H₂O 0.28g/l グルコース（別に滅菌済み） 22g/l KH₂PO₄（別に滅菌済み） 14.25g/l クエン酸-1H₂O 0.21g/l ZnSO₄-7H₂O 70.14mg/l CuSO₄-5H₂O 10.5mg/l MnSO₄-4,5H₂O 8.4mg/l H₃BO₃ 8.4mg/l Na₂MoO₄-2H₂O 8.4mg/l KI 2.1mg/l ミオイノシトール 0.374g/l ニコチン酸 18.7mg/l D-パントテン酸Ca 28.05mg/l ビタミンB1（塩酸チアミン） 18.7mg/l p-アミノ安息香酸 11.22mg/l ビタミンB6（塩酸ピリドキシン） 1.87mg/l ビオチン 1.122mg/l CaCO₃ 10g/l

【０１６０】各フラスコにActcol（武田薬品工業株式会
社、日本、大阪）1滴を加えた。 50ml（5%の接種材料を含む最終容量）／500mlバッフル
付きフラスコ

【０１６１】7日間の発酵後、発酵液から細胞を回収
し、実施例4に記載のとおり、HPLCによって細胞のアス
タキサンチンおよびβ-カロテン蓄積について分析し
た。結果を表17にまとめている。

【０１６２】

【表１７】AST遺伝子が組み込まれた組換え体によるア
スタキサンチン生産の回復。（データはP. rhodozyma A
TCC96815によって蓄積されたβ-カロテンの収量に対す
るアスタキサンチンおよびβ-カロテンの相対収量で示
している）

【０１６３】ATCC96815::pAATG123によるアスタキサン
チン生産の部分的回復により、TPIプロモーターによる
プロモーター強度がアスタキサンチン生産の完全な回復
に十分ではないことが明らかにされた。

【発明の効果】本発明により、β-カロテンからアスタ
キサンチンへのアスタキサンチン生合成経路の最終段階
に関与する遺伝子および酵素が提供される。アスタキサ
ンチンシンターゼ活性を有するポリペプチド、アスタキ
サンチンシンターゼをコードするDNA断片、組換え生物
などの、β-カロテンからアスタキサンチンへの調製に
有用な遺伝物質が提供され、これらの新規な遺伝物質は
Phaffia rhodozyma由来のものであり得る。またアスタ
キサンチンの製造方法も提供された。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. HOFFMANN-LA ROCHE. AG <120> Improvement of astaxanthin production and biological material therefor <130> RC-A0006 <150> EP 99104668.1 <151> 1999-03-09 <150> EP 00101666.6 <151> 2000-02-01 <160> 31 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 557 <212> PRT <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> TRANSIT <222> (1)..(26) <400> 1 Met Phe Ile Leu Val Leu Leu Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe 1 5 10 15 Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg 20 25 30 Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr 35 40 45 Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala 50 55 60 Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala 65 70 75 80 Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val 85 90 95 Met Lys Glu Ala Tyr Asp Tyr Pro Lys Pro Gly Met Ala Ala Arg Val 100 105 110 Leu Arg Ile Ala Thr Gly Asp Gly Val Val Thr Ala Glu Gly Glu Ala 115 120 125 His Lys Arg His Arg Arg Ile Met Ile Pro Ser Leu Ser Ala Gln Ala 130 135 140 Val Lys Ser Met Val Pro Ile Phe Leu Glu Lys Gly Met Glu Leu Val 145 150 155 160 Asp Lys Met Met Glu Asp Ala Ala Glu Lys Asp Met Ala Val Gly Glu 165 170 175 Ser Ala Gly Glu Lys Lys Ala Thr Arg Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp 180 185 190 Val Lys Asp Trp Val Gly Arg Ala Thr Leu Asp Val Met Ala Leu Ala 195 200 205 Gly Phe Asp Tyr Lys Ser Asp Ser Leu Gln Asn Lys Thr Asn Glu Leu 210 215 220 Tyr Val Ala Phe Val Gly Leu Thr Asp Gly Phe Ala Pro Thr Leu Asp 225 230 235 240 Ser Phe Lys Ala Ile Met Trp Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Thr Met 245 250 255 Lys Arg Arg His Glu Ile Pro Leu Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Arg 260 265 270 Arg Val Gly Ile Glu Leu Met Glu Gln Lys Lys Gln Ala Val Leu Gly 275 280 285 Ser Ala Ser Asp Gln Ala Val Asp Lys Lys Asp Val Gln Gly Arg Asp 290 295 300 Ile Leu Ser Leu Leu Val Arg Ala Asn Ile Ala Ala Asn Leu Pro Glu 305 310 315 320 Ser Gln Lys Leu Ser Asp Glu Glu Val Leu Ala Gln Ile Ser Asn Leu 325 330 335 Leu Phe Ala Gly Tyr Glu Thr Ser Ser Thr Val Leu Thr Trp Met Phe 340 345 350 His Arg Leu Ser Glu Asp Lys Ala Val Gln Asp Lys Leu Arg Glu Glu 355 360 365 Ile Cys Gln Ile Asp Thr Asp Met Pro Thr Leu Asp Glu Leu Asn Ala 370 375 380 Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe Val Lys Glu Ser Leu Arg Leu Asp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Pro Tyr Ala Asn Arg Glu Cys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile 405 410 415 Pro Leu Ala Glu Pro Val Ile Gly Arg Asp Gly Ser Val Ile Asn Glu 420 425 430 Val Arg Ile Thr Lys Gly Thr Met Val Met Leu Pro Leu Phe Asn Ile 435 440 445 Asn Arg Ser Lys Phe Ile Tyr Gly Glu Asp Ala Glu Glu Phe Arg Pro 450 455 460 Glu Arg Trp Leu Glu Asp Val Thr Asp Ser Leu Asn Ser Ile Glu Ala 465 470 475 480 Pro Tyr Gly His Gln Ala Ser Phe Ile Ser Gly Pro Arg Ala Cys Phe 485 490 495 Gly Trp Arg Phe Ala Val Ala Glu Met Lys Ala Phe Leu Phe Val Thr 500 505 510 Leu Arg Arg Val Gln Phe Glu Pro Ile Ile Ser His Pro Glu Tyr Glu 515 520 525 His Ile Thr Leu Ile Ile Ser Arg Pro Arg Ile Val Gly Arg Glu Lys 530 535 540 Glu Gly Tyr Gln Met Arg Leu Gln Val Lys Pro Val Glu 545 550 555 <210> 2 <211> 1932 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> CDS <222> (33)..(1706) <220> <221> polyA_site <222> (1871) <220> <221> mRNA <222> (14)..(1891) <400> 2 gaattcggca cgaggccacc tactttctcc at atg ttc atc ttg gtc ttg ctc 53 Met Phe Ile Leu Val Leu Leu 1 5 aca ggt gct tta ggc ctg gct gct ttc tca tgg gca tcc ata gcg ttc 101 Thr Gly Ala Leu Gly Leu Ala Ala Phe Ser Trp Ala Ser Ile Ala Phe 10 15 20 ttc agt ctt tac ctc gct ccg agg cga tct tca ctg tat aac ctt cag 149 Phe Ser Leu Tyr Leu Ala Pro Arg Arg Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Gln 25 30 35 ggc ccg aat cat acc aac tac ttt aca ggc aat ttt tta gac atc ctc 197 Gly Pro Asn His Thr Asn Tyr Phe Thr Gly Asn Phe Leu Asp Ile Leu 40 45 50 55 tca gct cgt aca ggt gaa gag cat gcg aag tac aga gaa aaa tac gga 245 Ser Ala Arg Thr Gly Glu Glu His Ala Lys Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly 60 65 70 agc acc ctc cgg ttt gct ggg atc gct gga gca ccc gtc ttg aac tcg 293 Ser Thr Leu Arg Phe Ala Gly Ile Ala Gly Ala Pro Val Leu Asn Ser 75 80 85 acc gat ccg aaa gtc ttc aac cat gtg atg aaa gaa gcc tac gac tat 341 Thr Asp Pro Lys Val Phe Asn His Val Met Lys Glu Ala Tyr Asp Tyr 90 95 100 ccg aaa cct ggt atg gcc gct cga gtg ctc aga att gct acc gga gat 389 Pro Lys Pro Gly Met Ala Ala Arg Val Leu Arg Ile Ala Thr Gly Asp 105 110 115 ggt gtt gtt acg gcg gaa ggt gaa gct cat aag cga cat cga agg atc 437 Gly Val Val Thr Ala Glu Gly Glu Ala His Lys Arg His Arg Arg Ile 120 125 130 135 atg atc ccc tct ctg tcc gct cag gcc gtt aag tcg atg gtc cca att 485 Met Ile Pro Ser Leu Ser Ala Gln Ala Val Lys Ser Met Val Pro Ile 140 145 150 ttc tta gaa aaa ggt atg gaa ctt gtc gac aag atg atg gag gat gcg 533 Phe Leu Glu Lys Gly Met Glu Leu Val Asp Lys Met Met Glu Asp Ala 155 160 165 gct gag aag gat atg gcc gtg gga gag tcg gcc ggt gaa aag aag gca 581 Ala Glu Lys Asp Met Ala Val Gly Glu Ser Ala Gly Glu Lys Lys Ala 170 175 180 acc aga ctc gag acc gaa gga gtc gat gta aag gat tgg gtc ggt cga 629 Thr Arg Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp Val Lys Asp Trp Val Gly Arg 185 190 195 gct act ctg gac gtc atg gct ctt gca gga ttt gac tat aag agc gac 677 Ala Thr Leu Asp Val Met Ala Leu Ala Gly Phe Asp Tyr Lys Ser Asp 200 205 210 215 tcg ctc cag aac aag acc aat gag ctc tat gtc gct ttt gtc gga ctt 725 Ser Leu Gln Asn Lys Thr Asn Glu Leu Tyr Val Ala Phe Val Gly Leu 220 225 230 acc gat ggg ttt gct cct acc ttg gac tcg ttc aag gct atc atg tgg 773 Thr Asp Gly Phe Ala Pro Thr Leu Asp Ser Phe Lys Ala Ile Met Trp 235 240 245 gat ttt gta cct tac ttc cga act atg aaa cgg aga cat gag ata cct 821 Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Thr Met Lys Arg Arg His Glu Ile Pro 250 255 260 ttg act caa gga tta gca gtt tcc cga cga gtt ggg atc gag ctt atg 869 Leu Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Arg Arg Val Gly Ile Glu Leu Met 265 270 275 gag caa aag aag cag gcc gtg ctt ggc tca gct tcc gat cag gct gtt 917 Glu Gln Lys Lys Gln Ala Val Leu Gly Ser Ala Ser Asp Gln Ala Val 280 285 290 295 gat aaa aag gat gtt caa ggt cgg gat atc cta agt ctc cta gtg aga 965 Asp Lys Lys Asp Val Gln Gly Arg Asp Ile Leu Ser Leu Leu Val Arg 300 305 310 gca aac atc gcc gcc aac ctg cct gaa tct caa aag ctg tcc gat gag 1013 Ala Asn Ile Ala Ala Asn Leu Pro Glu Ser Gln Lys Leu Ser Asp Glu 315 320 325 gag gta ctc gct cag atc agt aac ctg tta ttt gct gga tat gaa act 1061 Glu Val Leu Ala Gln Ile Ser Asn Leu Leu Phe Ala Gly Tyr Glu Thr 330 335 340 tct tcg aca gtc ttg aca tgg atg ttt cac cga ctc tca gaa gac aaa 1109 Ser Ser Thr Val Leu Thr Trp Met Phe His Arg Leu Ser Glu Asp Lys 345 350 355 gcc gtt cag gat aaa ctt cga gaa gaa att tgt cag atc gac acg gat 1157 Ala Val Gln Asp Lys Leu Arg Glu Glu Ile Cys Gln Ile Asp Thr Asp 360 365 370 375 atg cct acg cta gac gaa ctt aat gcg ttg cct tat ctc gaa gcg ttt 1205 Met Pro Thr Leu Asp Glu Leu Asn Ala Leu Pro Tyr Leu Glu Ala Phe 380 385 390 gtt aag gag tct ctt cgt cta gac cct cct agt ccg tat gct aac cgt 1253 Val Lys Glu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Pro Ser Pro Tyr Ala Asn Arg 395 400 405 gaa tgc tta aag gat gaa gac ttc atc cca ctt gcc gag cct gtc att 1301 Glu Cys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile Pro Leu Ala Glu Pro Val Ile 410 415 420 ggt cga gat ggg tcg gtc atc aac gag gtc cgg atc acg aaa gga acg 1349 Gly Arg Asp Gly Ser Val Ile Asn Glu Val Arg Ile Thr Lys Gly Thr 425 430 435 atg gtc atg ctt ccg ttg ttc aac atc aat cgt tca aag ttc att tat 1397 Met Val Met Leu Pro Leu Phe Asn Ile Asn Arg Ser Lys Phe Ile Tyr 440 445 450 455 gga gaa gat gca gaa gaa ttc aga ccg gag agg tgg ctt gag gac gta 1445 Gly Glu Asp Ala Glu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Trp Leu Glu Asp Val 460 465 470 aca gac tcg ctc aac agt att gaa gca ccc tat gga cac cag gcg agc 1493 Thr Asp Ser Leu Asn Ser Ile Glu Ala Pro Tyr Gly His Gln Ala Ser 475 480 485 ttt atc tct gga ccc aga gct tgc ttt ggt tgg cga ttt gct gtc gcc 1541 Phe Ile Ser Gly Pro Arg Ala Cys Phe Gly Trp Arg Phe Ala Val Ala 490 495 500 gag atg aag gcc ttc ttg ttt gtc act ctc cgt cgg gtc cag ttc gag 1589 Glu Met Lys Ala Phe Leu Phe Val Thr Leu Arg Arg Val Gln Phe Glu 505 510 515 ccc atc atc tct cat cca gag tac gag cac atc acc ttg atc att tcc 1637 Pro Ile Ile Ser His Pro Glu Tyr Glu His Ile Thr Leu Ile Ile Ser 520 525 530 535 cgt cct cga atc gtt ggt aga gag aag gag ggg tac cag atg cgt ttg 1685 Arg Pro Arg Ile Val Gly Arg Glu Lys Glu Gly Tyr Gln Met Arg Leu 540 545 550 cag gtc aag ccg gtc gaa tga gttgattctt catatgttaa gagaagttct 1736 Gln Val Lys Pro Val Glu 555 atatctgaga atgtgtgact aggacaatgc cttctttgta tcgatttgtt tctcataccc 1796 gggcaggcgc tatgacttct acgtcgtcta tcgtcgctct ggactctctt cttaccctat 1856 atattattcc atccgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagcggc cgctcgagcc 1916 ggctcgtgccgaattc 1932 <210> 3 <211> 3969 <212> DNA <213> Phaffia rhodozyma <220> <221> 5'UTR <222> (517)..(518) <223> EXPERIMENTAL <220> <221> exon <222> (535)..(652) <220> <221> intron <222> (653)..(734) <220> <221> exon <222> (735)..(783) <220> <221> intron <222> (784)..(898) <220> <221> exon <222> (899)..(1015) <220> <221> intron <222> (1016)..(1087) <220> <221> exon <222> (1088)..(1179) <220> <221> intron <222> (1180)..(1302) <220> <221> exon <222> (1303)..(1517) <220> <221> intron <222> (1518)..(1600) <220> <221> exon <222> (1601)..(1634) <220> <221> intron <222> (1635)..(1723) <220> <221> exon <222> (1724)..(1866) <220> <221> intron <222> (1867)..(1939) <220> <221> exon <222> (1940)..(1999) <220> <221> intron <222> (2000)..(2081) <220> <221> exon <222> (2082)..(2181) <220> <221> intron <222> (2182)..(2257) <220> <221> exon <222> (2258)..(2354) <220> <221> intron <222> (2355)..(2431) <220> <221> exon <222> (2432)..(2542) <220> <221> intron <222> (2543)..(2618) <220> <221> exon <222> (2619)..(2652) <220> <221> intron <222> (2653)..(2742) <220> <221> exon <222> (2743)..(2814) <220> <221> intron <222> (2815)..(2962) <220> <221> exon <222> (2963)..(3050) <220> <221> intron <222> (3051)..(3113) <220> <221> exon <222> (3114)..(3171) <220> <221> intron <222> (3172)..(3247) <220> <221> exon <222> (3248)..(3321) <220> <221> intron <222> (3322)..(3398) <220> <221> exon <222> (3399)..(3423) <220> <221> intron <222> (3424)..(3513) <220> <221> exon <222> (3514)..(3700) <220> <221> polyA_site <222> (3865)..(3866) <223> EXPERIMENTAL <400> 4 cggaccgaag cctcgccagc agttgatcaa gcgaaccaag ccgaacaatc ctggcgcgcc 60 tggaggagcg ggagcgggag gagcagcagg tgatgcatcg ggtggacaga atcagtagtg 120 tgtgtgtatg tgtgtagtgt agttgggttg tcccatgtgc ttcttcttat catcatcatt 180 tctttaaaat ctctacattg aatgtttacc ggaacgggct ttgatgatac tacggaccac 240 gttgtgtaac cagttcgatt gagattacga ttagatagcc gatccgtcga tcagatctcg 300 atctagagcg acatctggct cgatcggtcc ttgccgaaaa tcagggcacc gatcagggca 360 gaggaacgcc gaggccgaac gagacagaca caccatcatc atcagccatg tcttttttgt 420 gatcgttttt acatactacc cgtcgattct aaccttcttt cttcttctct tgccatcttt 480 gcattctcta tctcgtgtaa catcgatccg attcttgcca cctactttct ccat atg 537 ttc atc ttg gtc ttg ctc aca ggt gct tta ggc ctg gct gct ttc tca 585 tgg gca tcc ata gcg ttc ttc agt ctt tac ctc gct ccg agg cga tct 633 tca ctg tat aac ctt cag g gtaagaattg agctctggaa tcatgcttgt 682
gtaaatccta taatctcatt catcctattc ctcttcttca tcctctcttc ag gc ccg 739 aat cat acc aac tac ttt aca ggc aat ttt tta gac atc ctc tc 783 gtgagttttc atcattggct cagtcgtcca atcttaacga tcatcgctaa cgacctttcg 843 gacgcgttct tctttctatg tgaaatctga tctttggttt gttacgagag cacag a 899 gct cgt aca ggt gaa gag cat gcg aag tac aga gaa aaa tac gga agc 947 acc ctc cgg ttt gct ggg atc gct gga gca ccc gtc ttg aac tcg acc 995 gat ccg aaa gtc ttc aac ca gtttgtccat ccgaaccctc atcctcctct 1045 gctgatcaat tcaactgtag ttaacgcact ttgaatggac ag t gtg atg aaa gaa 1100 gcc tac gac tat ccg aaa cct ggt atg gcc gct cga gtg ctc aga att 1148 gct acc gga gat ggt gtt gtt acg gcg gaa g gtgcttttca agttctctta 1199 tatcacatct aatccactcg gcgcgattga actcaacatt tctgacgagc ctgtcacctt 1259 gttttcactt catggtctcg gtgcatcttg tctcatctca tag gt gaa gct cat 1313 aag cga cat cga agg atc atg atc ccc tct ctg tcc gct cag gcc gtt 1361 aag tcg atg gtc cca att ttc tta gaa aaa ggt atg gaa ctt gtc gac 1409 aag atg atg gag gat gcg gct gag aag gat atg gcc gtg gga gag tcg 1457 gcc ggt gaa aag aag gca acc aga ctc gag acc gaa gga gtc gat gta 1505 aag gat tgg gtc gtgagtaccc gcctattcct tcaccttgat ggacgaagca 1557 tatcaaggaa aggttcattg actgacaaac actatcttac cag ggt cga gct act 1612 ctg gac gtc atg gct ctt gca g gtcagtctac tctctcttat aaatgctcca 1664 catatgtatg catgtactga catgctcttc ctatattcga tacgacgtca tatgtccag 1723 ga ttt gac tat aag agc gac tcg ctc cag aac aag acc aat gag ctc 1770 tat gtc gct ttt gtc gga ctt acc gat ggg ttt gct cct acc ttg gac 1818 tcg ttc aag gct atc atg tgg gat ttt gta cct tac ttc cga act atg 1866 gtatgtctgc cattctttga tatccaaaga ttatggatag gttacttgct aaaatttcac 1926 ctatcgtgaa cag aaa cgg aga cat gag ata cct ttg act caa gga tta 1975 gca gtt tcc cga cga gtt ggg atc gtaagtgcca gatcaagcct ctctgaatat 2029 tcttggtcat catcttaacc tcctaggctc attcatccat ggtgcgcaat ag gag ctt 2087 atg gag caa aag aag cag gcc gtg ctt ggc tca gct tcc gat cag gct 2135 gtt gat aaa aag gat gtt caa ggt cgg gat atc cta agt ctc cta g 2181 gttagtaacg tttttaaacg tatatacaga gcggcgacat tctttccctg acaactgtca 2241 acatgctcgt tactag tg aga gca aac atc gcc gcc aac ctg cct gaa tct 2292 caa aag ctg tcc gat gag gag gta ctc gct cag atc agt aac ctg tta 2340 ttt gct gga tat ga gtgtgtatcc tttcccctct ctatccttag ctgattaaaa 2394 gcactaatag aggtctttat gtttcctgtt tgatcag a act tct tcg aca gtc 2447 ttg aca tgg atg ttt cac cga ctc tca gaa gac aaa gcc gtt cag gat 2495 aaa ctt cga gaa gaa att tgt cag atc gac acg gat atg cct acg ct 2542 gtgaggatgt ttttgatgct aaattacttc ttcttgcaaa tgactaaaac ggccttccat 2602 tcttgatcca ttttag a gac gaa ctt aat gcg ttg cct tat ctc gaa gcg 2652 gttggttctc gattcttggt cttgtcttcc aaatacaata cggattattg ctcatctgat 2712 ttgcgtctac gggctgtgga atttaactag ttt gtt aag gag tct ctt cgt cta 2766 gac cct cct agt ccg tat gct aac cgt gaa tgc tta aag gat gaa gac 2814 gtatgttggc ttcatcacgc ataattttca tttcatattc ctttgtacat acgcatacag 2874 gctgaccgag ctcaaattcc ggcttcctct tctgtgcttc tttttctggc ctttcttatc 2934 ttcattcttc aaccaaaatt tgtcacag ttc atc cca ctt gcc gag cct gtc 2986 att ggt cga gat ggg tcg gtc atc aac gag gtc cgg atc acg aaa gga 3034 acg atg gtc atg ctt c gtaagttttc ctttatttca tctcgtccat gaaatagttt 3090 ctgatagacg cggaccaatt cag cg ttg ttc aac atc aat cgt tca aag ttc 3142 att tat gga gaa gat gca gaa gaa ttc ag gtacaattcg ttttctttta 3191 aaagccaatc ggtttcgtat cgtaattgac cgggctctct tttaatttct cgaaag a 3248 ccg gag agg tgg ctt gag gac gta aca gac tcg ctc aac agt att gaa 3296 gca ccc tat gga cac cag gcg agc t gtatgtttta ttgattttat 3341 ctttgtgaat tttgcaaaac gttgaacttc gcgcttccct tgttgttgaa atcccag tt 3400 atc tct gga ccc aga gct tgc tt gtaagtttct tctcatctgg cgccttagca 3453 gtatccgatc agccatctag ttctttgtac gattgtttct gactctctcg actttcgcag 3513 t ggt tgg cga ttt gct gtc gcc gag atg aag gcc ttc ttg ttt gtc act 3562 ctc cgt cgg gtc cag ttc gag ccc atc atc tct cat cca gag tac gag 3610 cac atc acc ttg atc att tcc cgt cct cga atc gtt ggt aga gag aag 3658 gag ggg tac cag atg cgt ttg cag gtc aag ccg gtc gaa tga 3700 gttgattctt catatgttaa gagaagttct atatctgaga atgtgtgact aggacaatgc 3760 cttctttgta tcgatttgtt tctcataccc gggcaggcgc tatgacttct acgtcgtcta 3820 tcgtcgctct ggactctctt cttaccctat atattattcc atccgtctgt atatttgtct 3880 atcacgacgt ctgtgtcgtc aactcaatat tcagcctctt catgcttctg tgtctccata 3940 gatgtgatct tcatgtttgt cgactgcag 3969 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for expresion of AST gene in E. coli <400> 4 gttcaaagtt catttatgga 20 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for expression of AST gene in E. coli <400> 5 ggatcctcag tggtggtggt ggtggtgttc gaccggcttg acctgca 47 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' sense primer for expression of modified AST gene in E. coli <400> 6 catatgcacc accaccacca ccacctgtat aaccttcagg ggccc 45 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 5' antisense primer for expression of modified AST gene in E. coli <400> 7 gtaacaacac catctccggt 20 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 3' antisense primer for expression of modified AST gene in E. coli <400> 8 ggatcctcaa ctcattcgac cggctt 26 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: genome walking primer for cloning of AST gene <400> 9 tagagagaag gaggggtacc agatgc 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for cloning of terminator region of AST gene <400> 10 ccccggattg tggagaaact 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for cloning genomic AST gene <400> 11 atgttcatct tggtcttgct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for cloning genomic AST gene <400> 12 acgtagaagt catagcgcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for RT-PCR of AST gene <400> 13 tttgactcaa ggattagcag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for RT-PCR of AST gene <400> 14 tgtcttctga gagtcggtga 20 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerate sense primer for cloning of TPI gene <400> 15 mgnacnttyt tygtnggngg naay 24 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerate antisense primer for cloning of TPI gene <400> 16 gcnccnccna cnarraancc rtcnacrtc 29 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primary walking primer for cloning of TPI terminator <400> 17 gcttacctcg cttccaacgt ttcccag 27 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: nested walking primer for cloning of TPI terminator <400> 18 ggatctgtct ctgcctccaa ctgcaag 27 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primary walking primer for cloning og TPI promoter <400> 19 gggtcaatgt cggcagcgag aagccca 27 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: nested walking primer for cloning of TPI promoter <400> 20 atgtactcgg tagcactgat caagtag 27 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for construction of TPI promoer cassette <400> 21 gcggccgcat ccgtctcgcc atcagtct 28 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for construction of TPI promoter cassette <400> 22 cctgcaggtc tagagatgaa taaatataaa gagt 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for construction of TPI terminator cassette <400> 23 cctgcaggta aatatatcca gggattaacc ccta 34 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for construction of TPI terminator cassette <400> 24 ggtacccgtg cgcagtcgac cgagacat 28 <210> 25 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerate sense primer for cloning of AMY gene <400> 25 gaytayathc arggnatggg nttyrmngcn athtg 35 <210> 26 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: degenerate antisense primer for cloning of AMY gene <400> 26 tgytcngtnc crtartadat datnggdatn ccrtc 35 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for construction of a partial AMY cassette <400> 27 ccgcggcatt gatacctcta ccccgt 26 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for construction of a partial AMY cassette <400> 28 gcggccgcct gcaatcctgg atccaccg 28 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for construction of AST cassette <400> 29 tctagaatgt tcatcttggt cttgctca 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense primer for construction of AST cassette <400> 30 cctgcaggtc attcgaccgg cttgacct 28 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sense primer for confirmation of integration at AMY locus by PCR analysis <400> 31 ctctcctgtt cacaaaaaca 20

【図面の簡単な説明】

【図１】アスタキサンチンを生産する細菌系、P.rhodoz
ymaにおけるアセチルCoA（GGPP）からアスタキサンチン
への生合成経路を示す図である。

【図２】Phaffia rhodozyma由来AST遺伝子の機能分析に
用いた部分ゲノムAST遺伝子を有するプラスミドpR16の
制限地図を示す図である。これらのプラスミドのベクタ
ー基本骨格はpUC-G418であった。Eで示す制限酵素はEco
RIである。

【図３】AST遺伝子の膜貫通ドメイン除去時にそのアミ
ノ末端に6xHisを加えた、AST遺伝子の大腸菌における発
現試験を示す図である。培養液0.1mlからの細胞を10%ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（SDS-PAGE）にかけた。レーン1：分子量マーカー
（上から105kDa、82.0kDa、49.0kDaおよび33.3kDa、Bio
-RAD、米国リッチモンド）、レーン2：大腸菌（BL21（D
E3）（pLysS）（pAST315）IPTGなし）、レーン3：大腸
菌（BL21（DE3）（pLysS）（pAST315）および1.5mM IPT
G）、レーン4：分子量マーカー）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 瀬戸口 豊 神奈川県藤沢市片瀬山４−27−２

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 好ましくはP. rhodozymaにおけるβ-カ
   ロテンからアスタキサンチンへの反応を触媒するアスタ
   キサンチンシンターゼ活性を有する酵素をコードするヌ
   クレオチド配列を含む単離DNA。
2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列が（i）配列番
   号：3に記載のヌクレオチド配列、（ii）遺伝コードの
   縮退のために、ヌクレオチド配列（i）によってコード
   されるアミノ酸配列と同じ配列を有するアスタキサンチ
   ンシンターゼをコードするヌクレオチド配列、または
   （iii）標準的なハイブリダイゼーション条件下でi）も
   しくはii）からのヌクレオチド配列相補鎖にハイブリダ
   イズするヌクレオチド配列であることを特徴とする、請
   求項１記載の単離DNA。
3. 【請求項３】 請求項１または２記載の単離DNAを含む
   ベクターまたはプラスミド。
4. 【請求項４】 請求項１または２記載の単離DNAまたは
   請求項３記載のベクターもしくはプラスミドによって形
   質転換またはトランスフェクションされた宿主細胞。
5. 【請求項５】 請求項１または２記載の単離DNAによっ
   てコードされるポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項４記載の形質転換された宿主細胞
   を前記酵素の生産を導く条件下で培養する段階を含む、
   アスタキサンチンシンターゼ活性を有するポリペプチド
   の製造方法。
7. 【請求項７】 請求項１または２記載の単離DNAの一つ
   または複数を適当な宿主生物に導入する段階と、得られ
   た生物をアスタキサンチンの生産を導く条件下で培養す
   る段階と、培養物からアスタキサンチンを回収する段階
   とを含む、アスタキサンチンの生物学的製造方法。
8. 【請求項８】 適当な再構成膜を含む適当な反応混合物
   中、適当な電子供与体存在下で、アスタキサンチンシン
   ターゼ活性を有するポリペプチドにβ-カロテンを接触
   させる段階を含む、アスタキサンチンの製造方法。