MXPA00011816A - Produccion recombinante de carotenoides, en particular de astaxantina. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refere a la produccion recombinante de carotenoides, en particular de astaxantina, y alos materialoes biologicos para la misma.

Description

PRODUCCIÓN RECOMBINANTE DE CAROTENOIDES, EN PARTICULAR DE ASTAXANTINA Descripción de la Invención La presente invención se refiere a la producción recombinante de carotenoides, en particular de astaxantina, y a los materiales biológicos para la misma. Es conocido que la astaxantina está distribuida en una amplia variedad de organismos, tales como animales (p. e. aves como el flamenco y el ibis escarlata, y peces como la trucha arco iris y el salmón), algas y microorganismos. Es también reconocido que la astaxantina posee fuertes propiedades antioxidantes contra el oxígeno activo así como la mayoría de carotenoides, lo que se espera que corresponda en el uso farmacéutico a proteger células vivas contra algunas enfermedades como el cáncer. Además, desde el punto de vista de las aplicaciones industriales, está creciendo la demanda de astaxantina como agente colorante, especialmente en la industria del pescado de criadero, como el salmón, ya que la astaxantina confiere el típico color rojo-anaranjado a los animales y contribuye a la atracción del consumidor en el mercado. REF.: 125087 Phaffia Rhodozyma es conocida como cepa de levadura carotenogénica que produce específicamente astaxantina. A diferencia de las otras levaduras carotenogénicas, la especie Rhodotorula, phaffia rhodozyma es capa de fermentar algunos azúcares como la D-glucosa. Esta es una característica importante desde el punto de vista de la aplicación industrial. En un reciente estudio taxonómico, se puso de manifiesto un ciclo sexual de P. rhodozyma, y su estado telemórfico se designó con el nombre de Xanthophyllomyces dendrorhous (W. I. Golubev; Yeast 11,101-110,1995). Se han llevado a cabo algunos estudios de mejora de cepa para obtener hiper productores de astaxantina a partir de P. rhodozyma, pero estos esfuerzos se han limitado en esta década a emplear el método de mutagénesis convencional y la fusión de protoplastos. Recientemente, Wery et al . desarrollaron un sistema de vector huésped utilizando P. rhodozyma en que se utilizó un plásmido no replicable para integrarlo en el genoma de P. rhodozyma en el locus del ADN ribosomal en ulticopias (Wery et al . , Gene, 184, 89-97, 1997). Y Verdoes et al . describieron vectores mejorados para obtener un transformante de P. rhodozyma, así como sus tres genes carotenogénicos que codifican para las enzimas que catalizan las reacciones desde pirofosfato de geranilgeraniol a betacaroteno (Patente Internacional W097/23633) . La importancia de los métodos de ingeniería genética en el estudio de mejora de cepa de P. rhodozyma crecerá en un futuro próximo para romper con la productividad alcanzada por los métodos convencionales . Tal como se ha descrito anteriormente, la astaxantina posee propiedades antioxidantes y esta característica parece tener un papel importante in vivo para una protección contra especies oxigenadas activas como el 02#, H202 y OH«, que se generan continuamente en las células vivas, An et al . obtuvieron un hiperproductor de astaxantina a partir de P. rhodozyma mediante la selección de cepas sensibles a antimicina, tras mutagénesis química convencional (An, G-H et al . , Appl . Env. Microbiol . , 55(1), 116-124, 1989) . Se sabe que la antimicina es un inhibidor de la cadena respiratoria entre los citocromos b y Ci (Lucchini, G. et al . , Mol . Gen . Genet . , 1 77, 139- 1979) y potencia la pigmentación en un mutante sensible a la antimicina de este tipo. Las especies oxigenadas activas producidas debido a un bloqueo de la cadena respiratoria primaria en el complejo bci estimulaban la formación de caroteno (An, G-H et al . , Appl . Env. Microbiol . , 55, 116-124, 1989) 0. Efectivamente, la adición de un generador de Oz * , la duroquinona, al medio de cultivo incrementaba el contenido total de carotenoides (el principal carotenoide es la astaxantina) así como las cantidades relativas de xantofilas presentes en P. rhodozyma, mientras que el factor neutralizador de especies oxigenadas activas manitol producía el efecto inverso (Schroeder, W. A. et al . , J. Gen. Microbiol . , 139, 907-912, 1993) . Estos resultados llevaron a los autores a especular sobre las propiedades antioxidantes de astaxantina en P. rhodozyma . De hecho, la producción de astaxantina se estimula en el crecimiento post-exponencial, cuando la actividad respiratoria está completamente inducida. Además, la adición al medio de substratos respiratorios, como el etanol, potenciaba la producción de astaxantina en P. rhodozyma (Gu, WL. et al . , J. Ind. Microbiol . Biotechnol . , 19, 114-11 7, 1997) . Aunque Schroeder et al . intentaron determinar una relación entre las actividades superóxido dismutasa (SOD) y catalasa, que actúan como factores netralizantes de especies oxigenadas activas nativos en P. rhodozyma, con la productividad de astaxantina a través de la comparación entre la cepa progenitura y el hiperproductor de astaxantina sensible a antimicina, no pudo observarse una correlación directa de la actividad in vitro. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan los genes y enzimas para los factores neutralizantes de especies oxigenadas activas, como la SOD y catalana, que son materiales biológicos útiles en la mejora de la producción de carotenoides, en particular astaxantina. Esta invención comprende el clonaje y la determinación de los genes que codifican las SODs y catalanas mitocondrial y citoplasmática. Esta invención comprende además la caracterización enzimática como resultado de la interrupción de genes de la P. rhodozyma . Los efectos de su interrupción en la carotenogénesis pueden confirmarse por cultivo de estos transformantes en un medio adecuado y unas condiciones de cultivo apropiadas. Más en particular, la presente invención proporciona un proceso para producir carotenoides que comprende cultivar un organismo recombinante cuyo gen para uno o más factores neutralizantes de especies oxigenadas activas está sustancialmente interrumpido con ayuda de un cassette de interrupción específico para dicho gen, y recuperar los carotenoides a partir del cultivo. El organismo huésped o dicho organismo recombinante puede pertenecer a los reinos de Monera, Protista o Fungí . Más preferentemente el organismo huésped o dicho organismo recombinante puede pertenecer a los géneros Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus, Synechocystis , Agrobacterium, Streptomyces, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia,Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces . Más preferentemente dicho organismo huésped es una cepa de P. rhodozyma El factor (es) neutralizante de especies oxigenadas activas es (son) la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa. La presente invención proporciona también un organismo recombinante productor de carotenoides, caracterizado porque el gen de al menos un factor neutralizante de especies oxigenadas activas está sustancialmente interrumpido con ayuda de la introducción de un cassette de interrupción específico de dicho gen. Los factores neutralizantes de especies oxigenadas activas a interrumpir son la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa. La presente invención proporciona también un cassette de interrupción que puede usarse para preparar el dicho organismo recombinante de la presente invención para interrumpir un gen que codifique para un factor neutralizante de especies oxigenadas activas efectivo en un organismo que sea productor de carotenoides, que comprende una secuencia de nucleótidos parcial sustancialmente idéntica a una parte de la secuencia de ADN que codifica para un factor neutralizante de especies oxigenadas activas y un gen marcador seleccionable. Para la construcción del cassette de interrupción, los organismos diana pueden pertenecer a los reinos de Monera, Protista o Fungi , más preferentemente a los géneros Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus , Synechococcus , Synechocystis, Agrobacteri um, Streptomyces, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces , Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces . El factores) neutralizante de especies oxigenadas activas a interrumpir es (son) la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa.

Como se utiliza en la presente, se dice que un polinucleótido o una secuencia de polipéptidos (A) son sustancialmente idénticos a otra secuencia (B) si es que la secuencia A tiene por lo menos un 75% de identidad, preferiblemente un 85% de identidad, tal como por lo menos un 95% de identidad a la secuencia B. Además, la presente invención proporciona una secuencia de ADN reco binante que codifica un factor neutralizante de especies oxigenadas activas efectivo en un organismo productor de 'carotenoides. La secuencia de ADN puede originarse a partir de un organismo que pertenece a los reinos Monera, Protista o Fungi , mas preferentemente a los géneros Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus , Synechocystis , Agrobacterium, Streptomyces , Haematococcus , Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslear o Phycomyces . Un organismo particularmente preferido es P. rhodozyma . El factor neutralizante de especies oxigenadas activas codificado por el ADN recombinante puede ser la superóxido dismutasa mitocondrial, superóxido dismutasa citoplasmática y/o catalasa.

Una secuencia de ADN recombinante que codifica la superóxido dismutasa mitocondrial puede identificarse por SEC ID NO: 1 ó 4, o puede tener una homología con la secuencia de SEC ID NO: 1 6 4 lo suficientemente elevada para recombinar con cualquiera de la secuencias de SEC ID NOs: 1 y 4. Una secuencia de ADN recombinante que codifica superóxido dismutasa citoplasmática puede identificarse por SEC ID NO: 2 ó 6, o puede tener una homología con la secuencia de SEC ID NO: 2 ó 6 lo suficientemente elevada para recombinar con cualquiera de las secuencia de SEC ID NOs: 2 y 6. Además, una secuencia de ADN recombinante que codifica la catalasa puede identificarse por SEC ID NO: 3 ó 8, o puede tener una homología con la secuencia de SEC ID NO: 3 ó 8 lo suficientemente elevada para recombinar con cualquiera de las secuencia de SEC ID NOs: 3 y 8. En la presente invención, se puede usar cualquier combinación de las siguientes condiciones de hibridación y lavado, como sea apropiado, para identificar secuencias homologas de polinucleótidos: Hibridación de Al to Rigor: 6X SSC 0.5% SDS 100 ug/ml ADN desnaturalizado de salmón 50% formamida Incubar durante la noche con balanceo leve a 42°C durante la noche.

Lavado de Al to Rigor: 1 lavado en 2X SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido de otro lavado en 0. IX SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Hibridaci ón de Bajo Rigor: 6X SSC 0 . 5% SDS 100 ug/ml ADN desnaturalizado de salmón 50% formamida Incubar durante la noche con balanceo leve a 37°C durante la noche.

Lavado de Bajo Rigor: 1 lavado en 0. IX SSC, 0.5% SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Las condiciones moderadamente rigurosas se pueden obtener al variar la temperatura en la cual ocurre la reacción de hibridación y/o las condiciones de lavado como se indican anteriormente. Por lo tanto, como se utiliza en la presente, se dice que una secuencia (A) tiene una "alta homología" con otra secuencia (B) si es que la secuencia A se híbrida con la secuencia B bajo condiciones altamente rigurosas (es decir, condiciones altamente rigurosas de hibridación y de lavado como se definen anteriormente) , y si el polipéptido o el fragmento de polipéptido codificado por la secuencia A tiene la misma actividad que el polipéptido codificado por B. La presente invención proporciona también un fragmento de ADN recombinante que comprende una región que codifica un péptido de tránsito corriente arriba de la región que codifica una proteína objetivo que puede ser la superóxido dismutasa mitocondrial. La expresión de este fragmento de ADN recombinante permite localizar la proteína objetivo en la mitocondria. De esta forma, la presente invención proporciona también un método para localizar una proteína objetivo en la mitocondria que comprende expresar el fragmento de ADN recombinante que comprende una región que codifica un péptido de tránsito corriente arriba de la región que codifica una proteína objetivo, en un organismo huésped recombinante apropiado. Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención describe las secuencias de nucleótidos de factores neutralizantes de especies oxigenadas activas, como la superóxido dismutasa mitocondrial, superóxido dismutasa cito~ plasmática y catalasa. Estos polinucleótidos se proporcionan para su uso como sonda o iniciador para clonar genes de factores neutralizantes de especies oxigenadas activas efectivos en otro organismo productor de carotenoides sobre la base de la homología de los genes. La FIG. 1 muestra la unción por actividad para superóxido dismutasa tras una electroforésis en gel de poliacrilamida nativo utilizando extractos libres de células de ATCC 96594 y sus mutantes de SOD. Carril I, P rhodozyma ATCC 96594; Carril 2 P rhodozyma ATCC96594: :pSOD/G717 (interruptor de S0D1); Carril 3 R rhodozyma ATCC 96594 : :pSOD/G828 (interruptor de S0D2) ; Carril 4 P rhodozyma ATCC 96594. Como se ha explicado brevemente antes, el objeto de a presente invención es proporcionar un nuevo proceso para producir carotenoides biológicamente. El nuevo proceso comprende cultivar un organismo recombinante cultivar un organismo recombinante cuyo gen para uno o más factores neutralizantes de especies oxigenadas activas está sustancialmente interrumpido con ayuda de un cassette de interrupción específico para dicho gen, y recuperar los carotenoides del cultivo. Para el propósito de la presente invención, se proporciona también una secuencia de ADN recombinante que contiene un marco abierto de lectura que codifica un factor es) neutralizante de especies oxigenadas activas, el cual puede ser un enzima, tal como la SOD mitocondrial o la SOD citoplasmática. La secuencia de ADN recombinante puede contener un fragmento parcial que codifique el gen de la catalasa. Estas secuencias son útiles para construir dicho cassette de interrupción, ya que son capaces de recombinar con los genes nativos para dichos enzimas para interrumpir así de forma específica los genes. La citada secuencia de ADN recombinante puede ser la que deriva de un organismo que pertenece a los reinos de Moneraf Protista o Fungí , más preferentemente a los géneros Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus , Synechocystis, Agrobacteri um, Streptomyces, Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces , Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces . Un organismo particularmente preferido es R rhodozyma . El factor neutralizante de especies oxigenadas activas codificado por la secuencia de ADN recombinante puede ser SOD mitocondrial, SOD citoplasmática y/o catalasa. Un ejemplo específico de la secuencia de ADN recombínante deriva de un gen de Phaffia rhodozyma y se selecciona entre (i) una secuencia de ADN representada en SEC ID NO: 1 ó 2; (ii) aquellos cDNAs identificados por SEC ID NO: 4 ó 6; (iii) una variante isocodificante o alélica de la secuencia de ADN representada en SEC ID NO: 1, 2, 4 ó 6; y (iv) un derivado de una secuencia de ADN representada en SEC ID NO: 1/ 2, 4 ó 6 con adición, inserción, defección y/o sustitución de uno o más nucleótidos, y que codifica un polipéptido que posee la citada actividad enzimática. Dicha secuencia de ADN recombinante puede también caracerizarse por (a) codifica el citado enzima con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en los descritos en SEC ID Nos: 5 y 7, ó (b) codifica una variante de la citado enzima seleccionada entre (i) una variante alélica, y (ii) un enzima que tenga una o más adiciones, inserciones, delecciones, y/o sustituciones de aminoácidos y posea la citada actividad enzimática. Como se utiliza en la presente, una "variante alélica" significa la variante que tiene por lo menos una mutación en alguno de los dos alelos en el organismo diploide tal como la Phaffia rhodozyma, Xanthophillomyces dendrorhous y similares. Ambos alelos de un gen dado corresponden con 'la misma característica o rasgo, pero el producto o función que es codificado por un alelo en particular difiere, cuantitativamente y/o cualitativamente, de' los codificados por otros alelos de ese gen. La variante alélica puede ocurrir naturalmente o se puede generar artificialmente por medio de una mutagénesis química. Un alelo de tipo silvestre es uno que codifica para una característica fenotípica particular que se encuentra en la cepa silvestre de un organismo dado. Como se utiliza en la presente, una "variante isocodificadora" se refiere a la variante en la que la secuencia de nucleótidos de un gen dado, difiere de la secuencia del gen tipo silvestre aunque su producto traducido (es decir, su secuencia de aminoácidos) es idéntico al de la proteína tipo silvestre. Esto es causado por la degeneración del código genético y por la diferencia en la utilización de los codones que no es idéntica entre los diversos organismos. Como se utiliza en la presente, un "derivado de una secuencia de ADN" es una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido que tiene la actividad de la SEQ ID NO correspondiente, pero que difiere de esa secuencia de ADN desde 1-20, preferiblemente de 1-10, tal como de 1-5 adiciones, deleciones, inserciones, y/o sustituciones de nucleótidos . Secuencias de ADN recombinantes como las mencionadas antes especificadas en particular pueden ser las que derivan de un gen de Phaffia rhodozyma y se seleccionan entre (i) una secuencia de ADN representada en SEC ID NO: 3; (ii) CDNA identificado por SEC ID NO: 8; (iii) una variante isocodificante o alélica de la secuencia de ADN representada en SEC ID NO: 3 ó 8; y (iv) un derivado de una secuencia de ADN representado en SEC ID NO: 3 ó 8 con adición, inserción, delección y/o sustitución de uno o más nucleótidos, y que codifica un polipéptido que posee la citada actividad enzimática. Dicha secuencia de ADN recombinante puede también caracterizarse por (a) codifica para dicho enzima con una secuencia de aminoácidos parcial seleccionada del grupo consistente en las descritas en SEC ID NO: 9, ó (b) codifica una variante de dicho enzima seleccionada entre (i) una variante alélica, y (ii) un enzima que tenga una o más adiciones, inserciones, delecciones, y/o sustituciones de aminoácidos y posea la citada actividad enzimática. Una secuencia de ADN recombinante de este tipo puede estar preferentemente en forma de un vector. La presente invención proporciona también el uso de dicha secuencia de ADN recombinante para transformar un organismo huésped para obtener un organismo cuyo gen para al menos un factor neutralizante de especies oxigenadas activas esté sustancialmente interrumpido con ayuda de la introducción del citado cassette de interrupción específico para dicho gen. Como se utiliza en la presente, un gen se "interrumpe" o se "interrumpe sustancialmente" si la actividad del polipéptido al cual codifica se reduce en relación a un gen no interrumpido. Preferiblemente, la actividad se reduce en un 10%, de preferencia, por lo menos en un 50%, tal como por ejemplo, en un 75%, o más preferiblemente por lo menos en un 90% a 100%. Una forma conveniente de la secuencia de ADN recombinante puede ser un vector. El organismo reccmbinante obtenido mediante el uso del ADN recombinante tiene una interrupción en su secuencia de ADN que codifica la SOD mitocondrial, SOD citoplasmática o catalasa. El organismo huésped transformado con el ADN recombinante es útil en la mejora del proceso de producción de carotenoides, en particular astaxantína. Por tanto, la presente invención proporciona también un organismo recombinante de este tipo. Este método de producción biológica de carotenoides puede mejorar la productividad de carotenoides, en particular de astaxantina. Así, el método para producir in carotenoide, caracterizado porque un organismo recombinante como los descritos anteriormente se cultiva en condiciones ?í> que conduzcan a la producción del carotenoide, es uno de los aspectos de la presente invención. Este método puede aplicarse a la producción biológica de astaxantina. Muchos investigadores indicaron que la producción de especies oxigenadas activas puede estimular la producción de carotenoides en organismos carotenogénicos conocidos. La biosíntesis de carotenoides en células enquistadas de Haematococcus pluvialis se ve potenciada por el estrés oxidativo ambiental (Kobayashi et al., Appl . Env. Microbiol . , 59, 867-873, 1993) . La biosíntesis de carotenoides puede inducirse por las especies oxigenadas activas y los carotenoides acumulados pueden funcionar como un agente protector contra el daño por estrés oxidativo, Dunaliella bardawil (Shaish et al . , Planta, 190, 363-368, 1993) . Aunque la producción de astaxantina se estudió in vivo en varias condiciones de cultivo en que la generación de especies oxigenadas activas estaba alterada, no se determinó claramente una correlación entre oxígeno activo generado y productividad de carotenoides, probablemente porque estaba todavía presente el factor neutralizante de especies oxigenadas activas nativo en tales experimentos y rescataba hasta cierto punto los efectos de las especies oxigenadas activadas sobre la producción de carotenoides (Schroeder, W. A. et al . , 1 . Gen . Microbíol . , 139, 907912, 1993) . En esta invención, para excluir la posibilidad de que la existencia de factor neutralizante de especies oxigenadas activas nativo en P. rhodozyma, pueda contrarrestar el efecto positivo del oxígeno activo en la producción de astaxantina, los factores neutralizantes de especies oxigenadas activas nativos, como SOD y catalasa se clonaron a partir de P. rhodozyma para interrumpir su expresión por medio de la construcción e introducción de plásmidos de interrupción de genes. Asumiendo que la astaxantina juegue un papel antioxidante en P. rhodozyma, la inactivación de factores neutralizantes de especies oxigenadas activas puede afectar a la producción de carotenoides, probablemente porque la actividad relativamente incrementada de especies oxigenadas activas in vivo debido a la ausencia de factor neutralizante de especies oxigenadas activas nativo, estimule la producción de astaxantina como un actor alternativo para la neutralización de las especies oxigenadas activadas.

Las especies oxigenadas activadas tienen toxicidad para las células vivas a través del daño oxidativo a las moléculas intracelulares, como las proteínas o ácidos un~ cleicos. Estudios recientes han revelado que el envejecimiento está causado por daño oxidativo, al demostrar una correlación entre un aumento de la actividad de superóxido dismutasa, aumento de la esperanza de vida, y disminución del daño oxidativo en moscas de la fruta y nemátodos (Agar al, S. et al., Proc. Natl . Acad. Sci . U. S. A. , 91 , 1233212335, 1994, Larsen, P. L. Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A., 90, 8905-8909, 1993, Sohal, R. S. et al., J. Biol . Chem. , 270, 15671 -15674, 1995) . La SOD y enzimas antioxidantes relacionados están bien estudiados en procariotas y eucariotas. La levadura, S. cerevisiae, como la mayoría de eucariotas, contiene Cu/ZnSOD (producto del gen SOD1) en el citoplasma y MNSOD (producto del gen S0D2, en las mitocondrias. Estos enzimas catalizan la desproporción de 02 * , para producir 02 y H202. Junto con otros antioxidantes de bajo peso molecular como el glutation y ascorbato; otros enzimas o antioxidantes, como las catalasas y peroxidasas; y las proteínas quelantes de metales como la etalotioneina, permiten a los aerobios sobrevivir en presencia de Oz, presumiblemente minimizando el daño oxidativo . La importancia de la SOD citoplasmática se demostró por la elevada sensibilidad al dioxígeno mostrada por S . cerevisiae y Escherichia coli privados de SOD. En ambos organismos la falta de actividad SOD está asociada con un crecimiento lento en condiciones aeróbicas, con mayores velocidades de mutación y con defectos biosintéticos específicos. (La levadura so di" requiere lisina y metionina para el crecimiento aeróbico, mientras que sodZ E. coli requiere aminoácidos ramificados) En algunos casos, se sabe que estos efectos se deben al efecto inhibidos del superóxido sobre proteínas con grupo de cisteínas y hierro (Gardner, P. R. et al . , J. Biol . Chem. , 266, 19328-19333, 1991 , Kuo, C. F., et al., J. Biol . Chem. , 262, 4724-4727, 1987). Los mutantes de sod2 de S. cerevisiae son poco afectados cuando se cultivan en aire, con glucosa como fuente de carbono. Sin embargo, son altamente sensibles a hiperoxia y crecen mal en nomoxia en fuentes de carbono que requieren respiración para su metabolismo.

Puesto que los genes que codifican SOD y catalasa han sido clonados para otras especies, los genes correspondientes de P. rhodozyma podrían donarse por el método de la PCR degenerada. Inicialmente, clonamos un fragmento que contenía una porción de los genes SOD y CAT utilizando el método anterior. La citada PCR degenerada es un método para clonar un gen de interés que posee elevada homología de secuencia de aminoácidos con el enzima conocido de otra especie que tenga la misma o similar función. El iniciador degenerado, que se utiliza como iniciador en la PCR degenerada, se diseñó mediante una traducción inversa de la secuencia de aminoácidos a los correspondientes nucleótidos "degenerados". En un iniciador degenerado tal, se utiliza generalmente un iniciador mezcla que consiste en cualquiera de A, C, G, ó T, o un iniciador que contiene inosina en un codón de ambigüedad. En esta invención se utilizaron tales iniciadores mezcla se utilizaron como iniciadores degenerados para clonar los genes anteriores. Las condiciones de PCR utilizadas varía según los iniciadores; y genes a clonar, tal como se describirá más adelante. En esta invención, se clonaron dos especies de genes SOD, cuyas secuencias diferían entre sí, a partir de la misma banda de PCR en PCR degenerada, y se denominaron genes SOD1 y SOD2. Un gen completo conteniendo su región codificante con su intrón así como su región reguladora, tal como un promotor o terminador, puede clonarse a partir de un cromosoma por rastreo de una biblioteca genómica que se construye en un vector de tipo fago o plásmido en un huésped apropiado, utilizando un fragmento de ADN parcial, obtenido mediante PCR degenerada como se ha descrito antes, como sonda, tras marcarlo. Generalmente, se utilizan a menudo E. coli como cepa huésped y un vector de E. coli, un vector de tipo fago como el fago ?, o un vector plasmídico como el vector pUC, en la construcción de la biblioteca y las manipulaciones genéticas subsiguientes, como lea secuenciación, digestión por restricción, ligación y similares. En esta invención, se construyó una biblioteca genómica EcoRl de P. rhodozyma en los derivados del vector ?, ?ZAPII y ?DASHII dependiendo del tamaño del inserto. El tamaño de un inserto, que longitud de inserto debía clonarse, se determinó mediante el análisis por hibridación Southern blot para cada gen antes de la construcción de una genoteca. En esta invención, los ADN que se utilizaron como sonda se marcaron con digoxigenina (DIG) , un apteno eteroide, en lugar de la marca convencional con 32P, siguiendo el protocolo preparado por el suministrador (Boehringer-Mannheim (Mannheim, Alemania) ) . Se rastreó una biblioteca genómica de P. rhodozyma utilizando un fragmento de ADN marcado con DIG que tenía una porción de un gen de interés como sonda.. Se seleccionaron las calvas hibridadas y se utilizaron para su estudio posterior, En el caso de utilizar ?DASHII (el tamaño del inserto era de 9 kb a 23 kb) , el ADN preparado se digirió por EcoRI, seguido del clonaje del inserto EcoRI en un vector plasmídico como pUC19 ó pBluescriptII SK+ . Cuando se utilizó ?ZAPII en la construcción de la biblioteca genómica, se utilizó convenientemente el protocolo de excisión in vivo para el llevar a cabo con éxito el paso de clonaje en el vector plasmídico utilizando un derivado de fago M13 monohebra, el fago Ex assist (Stratagene, La Jolla, USA) . El ADN plasmídico así obtenido se examinó por secuenciación. En esta invención, los genes; SODl y S0D2 se obtuvieron a partir de la biblioteca en ?ZAPII de forma independiente entre sí y el gen de la catalasa (CAT) se clonó a partir de la biblioteca en ?DASHII. En esta invención, se utilizó el secuenciador automático de fluorescencia, ALFred system (Pharmacia, Uppsala, Sweden) , usando un protocolo de secuenciación de autociclo en que la polimerasa de Taq se emplea en la mayoría de casos de secuenciación. En esta invención, los inventores determinaron la secuencia genómica que contiene un marco abierto de lectura de los genes SODl o S0D2 , así como su secuencia promotora y terminadora. Del análisis de la secuencia, se encontró que SODl codifica la SOD mitocondrial, a juzgas por la presencia de un péptido de tránsito en su extremo amino terminal. Por el contrario, S0D2 no presenta una secuencia de péptido de tránsito, y este hecho sugirió que SOD2 codifica la SOD citoplasmática. Los inventores también determinaron una secuencia parcial de un marco abierto de lectura para el gen CAT. El péptido de tránsito es una secuencia señal para transferir los productos génicos del núcleo, que están codificados en los cromosomas, y cuyas proteínas traducidas funcionan en las mitocondrias, a la localización mitocondrial de las proteínas, tales como enzimas involucrados en el ciclo de los TCA. Para expresar algunas proteínas en mitocondria, es útil la adición de péptidos de tránsito en su extremo amino terminal. En esta invención, se construyeron los plásmidos de interrupción para los genes SODl , SOD2 y CAT mediante la ligación de fragmentos parciales de los genes anteriores, que no contienen ninguno de los dos extremos de los genes, con genes de resistencia a fármacos a un vector suicida, que no puede replicarse de forma autónoma en P. rhodozyma debido a la falta de una secuencia de replicación autónoma. Frecuentemente se utiliza un qen de resistencia a un fármaco que codifica la enzima que permite al huésped sobrevivir en presencia de un antibiótico tóxico cómo marcador seleccionable. El gen de resistencia 6418 incorporado en pPR2T (Verdoes et al. (Publicación de patente internacional, W097/23633) ) es un ejemplo de gen de resistencia a un fármaco. Un vector suicida de este tipo no puede replicar por si mismo y puede estar solo presente en forma integrada en el cromosoma del huésped como resultado de una recombinación de entrecruzamiento sencillo utilizando la secuencia homologa entre un vector y un cromosoma. En el caso de la recombinación con un gen de interés, su secuencia genética no puede reconstruirse en el cromosoma de la cepa huésped debido a la falta de los extremos del gen, y en consecuencia, el gen de interés puede estar interrumpido en la cepa recombinante así obtenida. Otro ejemplo de plásmido de interrupción es un plásmido de tipo doble entrecruzamiento. Este tipo de plásmido de interrupción contiene dos fragmentos parciales diferentes de los genes diana a interrumpir y un gen marcador selectivo tal como una resistencia a fármaco está insertado entre estos dos fragmentos. Después de la recombinación entre el cromosoma de las células receptoras y el ADN plasmídico donador en las dos partes homologas del gen, tiene lugar la sustitución de la secuencia cromosómica con la del ADN donador, y el gen marcador selectivo se inserta en el gen diana a interrumpir. En general, los plásmidos del tipo doble entrecruzamiento, tienen una frecuencia de recombinación menor que los vectores del tipo de entrecruzamiento sencillo. En esta invención, los inventores inactivaron los enzimas de interés a través de la interrupción de los correspondientes genes. La otra forma de evaluar el efecto de un producto génico es reducir su expresión mediante métodos de ingeniería genética. Con este fin, se aprovecharon algunos métodos. Uno de estos métodos es el método del antisentido. El método del anti-sentido es un método para reducir la expresión de un gen de interés por medio de la introducción de un fragmento de gen artificial, cuya secuencia es complementaria a la del gen de interés. Este fragmento anti-sentido forma complejo con el fragmento de ARJMm maduro del gen diana in vivo y en consecuencia inhibe una traducción eficaz a partir del ARNm. El otro método es una mutación de la región promotora. En general, el gen consta de varias partes que tienen funciones diferentes entre si. En los eucariotas, los genes que codifican proteínas correspondientes se transcriben a ARN mensajero premaduro (pre-ARNm) , a diferencia de los genes del ARN ribosomal (rRNA) , ARN pequeño nuclear (snRNA) y ARN de transferencia (ARNt) . Aunque la ARN polimerasa II (PolII) desempeña un papel central en este acontecimiento de transcripción, PolII no puede iniciar la transcripción por si sola sin elementos en cis que cubran una región corriente arriba que contiene el promotor y una secuencia de activación corriente arriba (UAS) , y un factor proteico actuando en trans . En primer lugar, un complejo de iniciación de la transcripción que consta de varias proteínas básicas componentes reconoce la secuencia promotora en la región 5 '-adyacente al gen a expresar. En este acontecimiento, se requieren algunos participantes adicionales en el caso de un gen que se exprese bajo alguna regulación específica, tal como la respuesta choque térmico, o la adaptación a un agotamiento nutricional, etc. En tal caso, es necesario que exista una UAS en la región 5' no traducida corriente arriba cerca de la secuencia promotora, y algunas proteínas reguladoras positivas o negativas que reconozcan y se unan a la UAS. La fuerza de unión del complejo de iniciación de la transcripción a la secuencia promotora está afectada por la unión de un factor que actúa en trans cerca del promotor, y esto permite la regulación de la actividad transcripcional. Tras la activación del complejo de : iniciación de la transcripción mediante fosforilación, el complejo de iniciación de la transcripción inicia la transcripción a partir del lugar de inicio de transcripción. Algunas partes del complejo de iniciación de la transcripción se separan a medida que el complejo de elongación a partir de la región promotora hacia la dirección 3' del gen (este paso se denomina un acontecimiento de liberación del promotor) y el complejo de elongación continua la transcripción hasta que alcanza una secuencia de terminación localizada en la región 3' adyacente corriente abajo del gen. Para reducir la expresión de genes de interés, se ha utilizado a menudo la mutación por mutagénesis química convencional, o la mutagénesis dirigida genética de la región promotora del gen diana que contiene la secuencia UAS descrita antes. Las cepas mutantes en que la expresión del enzima de interés puede disminuir, pueden obtenerse por transformación de una cepa huésped con un ADN recombinante que tenga una región promotora mutada de este tipo. Como se ha descrito anteriormente, se utiliza también un intento de reducir la expresión de un gen de este tipo, además de la interrupción del gen con el objetivo de determinar un efecto del producto génico en fenómenos en los organismos vivos . Como método de transformación se aplicaron el método del LiCl (Wery et al . , Yeast, 12 (7) , 641 -651 , 1996) y el método de electroporación (Wery et al . , Pene, 184 , 89-97, 1997) para transformar P. rhodozyma, pero la eficiencia de transformación es estas condiciones parecía ser todavía baja. En esta invención, se aplicó el método biolístico de transformación (Johnston et al . , Methods in Molecular Biology, 53; 147-153, 1996) para la transformación de P. rhodozyma . El método biolístico es un protocolo sencillo y fiable, en el que se dispara una partícula de oro o tungsteno recubierta con el ADN donador sobre las células vivas directamente con gas helio a presión elevada. Este protocolo de transformación se aplicó con éxito a Cryptococcus neoformans,' que pertenece a las levadura: basidiomicetas así como P. rhodozyma y resul tó difícil de transformar por el método convencional de transformación (Toffaletti, et al . , J. Bacteríol . , 1 75 (5) , 1405-141 1 , 1993) . En esta invención, este método biolístico se utilizó con éxito para transformar células de P. rhodozyma . El acontecimiento de una interrupción génica puede confirmarse directamente por caracterización enzimática y mediante análisis genético por PCR o hibridación Southern blot utilizando el cromosoma obtenido de los transformantes así obtenidos. En esta invención, la confirmación directa de una interrupción de SOD se llevó a cabo por tinción de actividad y la caracterización de la interrupción de la catalasa se realizó por observación visual; como el test de la catalasa utilizado a menudo en taxonomía bacteriana. La P. rhodozyma modificada por ingeniería genética se cultivará en un medio apropiado y se valuará su productividad en astaxantina. La presente invención se ilustra adicionalmente con los Ejemplos descritos a continuación haciendo referencia a las figuras adjuntas.

Ejemplo En el Ejemplo descrito a continuación se emplearon los siguientes materiales y métodos.

Cepas P. rhodozyma ATCC 96594 (re-depositada con el N° de acceso ATCC 74438 el 8 de Abril de 1998 de acuerdo con el Tratado de Budapest) E. coli DH5a: F~, f80d, lacZ?M15, ? (lacZYA-argF) U169, hsd (rK",mK+), recAl, endAl , cteoR, thi-1, supE44, gyrA96, relAl (Toyobo, Osaka, Japón) E. coli ¡ XLl-Blue MRF' : ?(mcrA)183, ? (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173, endAl , supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, lac[F'proAB, lacIqZ?M 15, TnlO (tetr) ] (Stratagene, La Jolla, USA) E. coli SOLR: el4~(mcrA), ? (mcrCB-hsdSMR-mrr) 171, sbcC, recB, recJ, umuC: : Tn5 (kanr) , uvrC, lac, gyrA96, relAl,thi-1, endAl, ?R, [F'proAB, lacIqZ?M15] Su" (no supresor) (Stratagene) E. coli XLl MRA (P2) : ?(mcrA)183, ? (mcrCB-hsdSMR- rr) 173, endAl, supE44, thi-1, gyrA96, relAl, lac(P2 lysogen) (Stratagene) E. coli TOP10: F", crA, ? (mrr-hsdRMS-mcrBC) , f80, ?lacZ M15, ?lacX74,recAl, deoR, araD139, (araleu) 7697, galU, galK, rpsL (Strr) , endAl, nupG (Invitrogen, Carlsbad, USA) Vectores ?ZAPII (Stratagene) ?DASHII (Stratagene) pBluescriptII SK+ (Stratagene) PCR2.1TOP0 (Invitrogen) pUC19 (Takara Shuzo, Otsu, Japón) Medios La cepa P. rhodozyma se mantiene rutinariamente en placa de agar de medio YPD (DIFCO, Detroit, USA) . La cepa de E. coli ¡ se mantiene en medio LB (10 g Bacto-triptona, 5 g extracto de levadura (DIFCO) y 5 g NaCl por litro) . El medio NZY (5 g NaCl, 2 g MgS04-7H20, 5 g extracto de levadura (DIFCO) , 10 g NZ amina tipo A (WAKO, Osaka, Japón) por litro se utiliza como para la propagación de fago ?, en agar blando (0.7% agar (WAKO) . Cuando se prepara un medio con agar, se añade 1.5 % de agar (WAKO).

Métodos Se utilizaron los métodos generales para las técnicas de genética molecular según los métodos de Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2a Edición (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Los enzimas cae restricción y la ADN ligasa de T4 se adquirieron a Takara Shuzo (Japón) . El aislamiento de ADN cromosómico de P. rhodozyma se realizó utilizando QIAGEN Genomic Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Las Mini-prep de ADN plasmídico de E. coli transformadas se realizaron con el Sistema de aislamiento automático de ADN (PI-50, Kurabo, Co. Ltd., Osaka, Japón). Las Midiprep de ADN plasmídico de E. coli transformadas se llevaron a cabo utilizando la columna QIAGEN (QIAGEN) . El aislamiento de ADN de ?, se realizó mediante el sistema de purificación de ADN Wizard lambda preps (Promega, Madison, USA) siguiendo el protocolo preparado por el fabricante. Los fragmentos de ADN se aislaron y purificaron de agarosa utilizando QIAquick ó QIAEX II (QIAGEN) . Para la manipulación de los derivados de fago ? se siguió el protocolo preparado por el fabricante (Stratagene) . El aislamiento de ARN total de P. rhodozyma se realizó por el método del fenol utilizando Isogen (Nippon Gene, Toyama, Japón) . El ARNm se purificó del ARN total así obtenido utilizando un kit de separación de ARNm (Clontech, Palo Alto, USA) . El ADNc se sintetizó utilizando el kit de construcción de ADNc CapFinder (Clontech) . El empaquetamiento in vi tro se realizó utilizando extracto de empaquetamiento Gigapack III gold (Stratagene) .La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se .llevó a cabo con el termociclador de Perkin Elmer modelo 2400. Cada una de las condiciones de PCR se describe en los ejemplos. Los iniciadores de PCR se adquirieron a un suministrador comercial o se sintetizaron con un sintetizador de ADN (modelo 392, Perkin Elmer, Japón, Urayasu, Japón) . Los iniciadores de ADN fluorescentes para la secuenciación de ADN se adquirieron a Pharmacia. La secuenciación de ADN se realizó con el secuenciador automático de ADN fluorescente (ALFred, Pharmacia) . Las células competentes de E. coli DHSa se adquirieron a Toyobo (Japón) . El aparato y reactivos para la transformación biolística de P. rhodozyma se adquirieron a Nippon Bio-Rad Laboratories (Tokyo, Japón) .

Ejemplo 1: Aislamiento de ARNm de R rhodozyma y constricción de una biblioteca de ADNc Para la construcción de una biblioteca de ADNc de P. rhodozyma, se aisló ARN total por el método de extracción con fenol inmediatamente después de la rotura de las células y se purificó el ARNm de P. rhodozyma cepa ATCC96594 utilizando un de kit de separación de ARNm (Clontech) . Inicialmente, las células de la cepa ATCC9694 obtenidas a partir 10 ml de cultivo de dos días en medio YPD se recogieron por centrifugación (1500 x g durante 10 min.) y se lavaron una vez con tampón de extracción (10 mM Nacurato / HCl (pH 6 , 2) conteniendo 0.7 M KCL) . Tras resuspenderlas en 2,5 ml de tampón de extracción, las células se rompieron mediante un homogeneizador de tipo prensa francesa (Ohtake Works Corp., Tokyo, Japón) a 1500 kgf/cmZ y se mezclaron inmediatamente con dos veces su volumen de isogen (Nippon gene) de acuerdo con el método especificado por el fabricante. En este paso, se recuperaron 400 pg de ARN total. A continuación este ARN total se purificó utilizando un kit de separación de ARNm (Clontech) de acuerdo con el método especificado por el fabricante. Finalmente, se obtuvieron 16 pg de ARNm de P. rhodozyma cepa ATCC 96594. Para obtener ADNc de P. rhodozyma, se utilizó el kit de construcción de ADNc por PCR CapFinder (Clontech) de acuerdo con el método especificado por el fabricante. Se aplicó un Vig de ARNm purificado para la síntesis de la primera cadena seguida de amplificación por PCR. Tras está amplificación por PCR, se obtuvo 1 mg de la mezcla de ADNc.

Ejemplo 2 : Clonaje de dos especies de gen SOD parcial de P. rhodozyma. Para clonar un gen SOD parcial de P. rhodozyma, se utilizó un método de PCR degenerada. Se diseñaron y sintetizaron dos iniciadores mezcla cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en la TABLA 1, sobre la base de la secuencia común de genes de superóxído dismutasa conocidos de otras especies.

TABLA 1 Secuencia de los iniciadores utilizados en el clonaje de los genes SO-DI y S0D2 Sodl; AARCAYCAYCAR.ACNTAYGTNAA (iniciador con sentido) (SEC ID NO: 10) Sod4; GCCCANCCNGANCCYTGNACNCC (iniciador antisentido) (SEC ID NO: 11) (R=A ó G; Y=C ó T; N=A, C, G ó T) . Tras una reacción de PCR de 25 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 46°C durante 30 segundos y 72 °C durante 15 segundos utilizando ExTaq (Takara Shuzo) como ADN polimerasa y la mezcla de ADNc obtenida en el ejemplo 1 como molde, la mezcla de reacción se sometió a electroforésis en gel de agarosa. Se recuperó y purificó una banda de PCR de la longitud deseada mediante QIAquick (QIAGEN) según el método del fabricante y a continuación se ligó a pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Después de la transformación de E. coli TOP10 competentes, se seleccionaron 6 colonias blancas y se aislaron los plásmidos con el sistema automático de aislamiento de ADN (Kurabo PI-50) . Como resultado de la secuenciación, se encontró que dos clones tenían secuencias diferentes entre sí, cuyas secuencias de aminoácidos deducidas eran similares de forma independiente a genes SOD conocidos. Estos clones de ADNc aislados se denominaron pSOD614 #2 y pSOD614 #3 y se utilizaron en el estudio posterior.

Ejemiplo 3: Aislamiento de ADN genómico de R rhodozyma Para aislar ADN genómico de P. rhodozyma , se utilizó el kit QIAGEN genómico de acuerdo con el método especificado por el fabricante. En primer lugar, las células de P. rhodozyma cepa ATCC 96594 de 100 ml de un cultivo de noche en medio YPD se recogieron por centrifugación (1500 x g durante 10 min.) y se lavaron una vez con tampón TE (10 mM Tris / HCl (pH 8,0) conteniendo 1 mM EDTA) . Tras resuspenderlas en 8 ml de tampón Yl del kit QIAGEN genómico, se añadió liticasa (SIGMA) a una concentración de 2 mg/ml para romper las células por degradación enzimática y la mezcla de reacción se incubó durante 90 minutos a 30 °C y a continuación se continuó con el siguiente paso de extracción. Finalmente, se obtuvieron 20 µg de ADN genómico.

Ejemplo 4: Hibridación Southern blot utilizando pSOD614#2 y pSOD614#3 como sondas La hibridación Southern blot se realizó para clonar el fragmento genómico que contiene los genes SOD de P. rhodozyma. Dos pg de ADN genómico se digirieron con EcoRI y se sometieron a electroforésis en gel de agarosa seguida de tratamiento ácido y alcalino. El ADN desnaturalizado se transfirió a una membrana de nylon (Hybond N+, Amersham) utilizando transblot (Doto Rika, Tokyo, Japón) durante una hora. El ADN se transfirió a una membrana de nylon y se fijó mediante tratamiento térmico (80°C, 90 minutos) . Se prepararon sondas por mareaje de los DNAs molde (pSOD614#2 y pSOD614#3 digeridos con EcoRI) por el método de la DIG con iniciación múltiple (Boehringer Mannheim) . La hibridación se realizó por el método especificado por el fabricante. Como resultado, se visualizaron bandas hibridadas de una longitud de 7,5 kilobases (kb) frente a la sonda preparada a partir de pSOD614#2, y de una longitud de 8, 0 kilobases (kb) frente a la sonda preparada a partir de pSOD614#3.

Ejemplo 5: Clonaje de fragmentos genómicos .aue contienen los genes .SOD cubas secuencias eran diferentes entre sí Cuatro µg de ADN genómico se digirió con EcoRl y se sometió a electroforésis en gel de agarosa. A continuación, los DNAs cuya longitud estaba en el intervalo de 7 a 9 kb se recuperaron mediante un método convencional de elución utilizando membrana de diálisis. El ADN purificado se ligó con 1 µg de ?ZAPII (Stratagene) digerido con EcoRI y tratado con CIAP (fosfatasa alcalina de intestino bovino) a 16 °C durante una noche, y se empaquetó con extracto de empaquetamiento Gigapack III gold (Stratagene) . El extracto empaquetado se infectó E. coli cepa XLIBlue MRF' y se extendió con medio con NZY vertido sobre medio LB-agar. Se rastrearon alrededor de 6000 calvas utilizando pSOD614#2 y pSOD614#3 digeridos con EcoRI como sondas. Seis calvas hibridaron con la sonda pSOD614#2 marcada y caos calvas hibridaron con la sonda pSOD614#3 marcada. A continuación, las calvas hibridadas se sometieron al protocolo de excisión in vivo de acuerdo con el método especificado por el fabricante (Stratagene) . Como resultado del análisis por PCR utilizando los iniciadores sodl y sod4, se encontró que un plásmido aislado de las seis calvas hibridadas con pSOD614#2 tenía los mismos fragmentos que los de pSOD614#2. Este plásmido se denominó pSOD703. Como resultado del análisis por PCR utilizando los iniciadores sodl y sod4, se encontró también que dos plásmidos aislados de dos calvas hibridadas con pSOD61 #3 tenían el mismo fragmento que pSOD614#3.Uno de estos plásmidos se denominó pSOD626 y se utilizó para el estudio posterior.

Ejemplo 6 : Análisis de la secuencia de dos especies de genes de MnSOD obtenidos de P rhodozyma La secuencia completa de nucleótidos se determinó por secuenciación de pSOD703 y pSOD626 con un procedimiento de paseo mediante iniciadores. Las secuencias de nucleótidos las secuencias de aminoácidos deducidas para el gen SODl incorporado en pSOD703 y para el gen SOD2 incorporado en PSOD626 se listan como SEC ID NO: 1, NO: 2, NO: 5 y NO: 7 en la sección de listado de secuencias. Como resultado del análisis por BLAST (Altschul, S.F. et al . , J. Mol . Biol . 215, 403-410, 1990), las dos secuencias de aminoácidos deducidas de los genes SODl y S0D2 resultaron homologas a MnSODs conocidas obtenidas de otras especies y no a Cu/ZnSODs o FeSOD. El gen SODl posee 7 intrones y 8 exones. Su marco abierto de lectura consta de 223 aminoácidos. Por su parte, el gen S0D2 posee 10 'intrones y 11 exones, y su marco abierto de lectura consta de 199 aminoácidos. La mayor parte de la diferencia entre los dos genes aislados consistía en una región extendida en el gen SODl en su extremo amino terminal, cuya secuencia podría actuar como un péptido de tránsito a mitocondria. De hecho, Schroeder et al . describieron dos especies de SODs que fueron detectadas como SODs resistentes a KCN y H202 en la tinción por actividad de geles de electroforésis en acrilamida nativos (PAGE) en P. rhodozyma . Comentaron que las dos especies de MnSOD indicaban agregados o isoenzimas y no se refirieron a su precisa naturaleza y su localización subcelular. Como se describirá en la sección siguiente, se clarificó que estas dos especies de SODs resistentes a KCN y H202, (esto es, MnSOD) eran productos de los genes SODl y SOD2. Como se describe en la sección "descripción detallada de la invención", la mayoría de eucariotas tienen especies de SODs diferentes en su localización intracelular (MnSOD en la fracción mitocondrial y Cu/ZnSOD en la fracción citoplasmática) . Este es el primer ejemplo en que dos especies de MnSOD funcionan en una localización subcelular diferente.

Ejemplo 7: Construcción de plásmidos de interrupción para los genes SODl v SOD2 Como se describe en la sección "descripción detallada de la invención", se construyó un plásmido que incorporaba un marcador de resistencia a fármaco insertando la estructura del gen de resistencia 6418 entre el promotor y el terminador de la gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP) y ligándolo en pUC19 digerido con Kpnl y HindIIl.

Este plásmido se denominó pUC-6418 y se utilizó en los estudios posteriores. Como fragmentos génicos que se utilizaron para la recombinación homologa, se sintetizaron in vitro fragmentos parciales de los genes SODl y SOD2 mediante el método de la utilizando iniciadores de PCR cuyas secuencias se muestran en la TABLA 2.

TABLA2 Sodl4; GGTACCTCCGATGATAGGAATGTGAG (iniciador con sentido) (SEC ID NO: 12) Sod 15; GAATTCAGTTCAACGGAGGAGGACAC (iniciador antisentido] (SEC ID NO: 13) Sod47; GAATTCGGAGGAGGACACATCAACCG (iniciador con sentido) (SEC ID NO: 14) Sod48; GGTACCTGTACTGGAGGTAGAAAGCG (iniciador antisentido) (SEC ID NO: 15) Las condiciones de PCR fueron las siguientes; 25 ciclos a 94 °C durante 15 segundos, 50 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 15 minutos. Se utilizó como molde, 0,1 µg de ADN genómico obtenido en el Ejemplo 3, y ExTaq como ADN polimerasa. Se amplificaron respectivamente un fragmento parcial de SODl, que pudo obtenerse de la PCR utilizando sodl4 y sodl5 como iniciadores, y un gen parcial S0D2 de la PCR utilizando sod47 y sod48 como iniciadores. Cada uno de los fragmentos amplificados de 0, 65 kB se recuperó y clonó en pCR2.1-T0P0 (Invitrogen) según el protocolo especificado por el fabricante. Se seleccionaron seis clones independeientes a partir de colonias blancas de transformantes de E. coli TOP 10 transformantes y se prepararon los plásmidos de estos transformantes. Como resultado del análisis de restricción y la secuenciación, se seleccionó un clon que tenía un gen SODl parcial para los estudio: posteriores y se denominó pSOD715. De forma similar, se seleccionó un clon que tenía un gen S0D2 parcial y se denominó pSOD826. A continuación, pSOD715 y pSOD826 se digirieron con EcoRI y Kpnl , y los fragmentos de 0, 65kb obtenidos se purificaron utilizando el protocolo QIAquick y se ligaron con pUC19-6418 digerido con EcoRl y Kpnl . Se seleccionaron seis clones independientes a partir de colonias de E. coli DHSa resistentes a ampicilina y se prepararon los plásmidos de estos transformantes. Como resultado del análisis de restricción y la secuenciación, se obtuvo un clon en que un SODl parcial estaba fusionado al cassette de resistencia 6418 y se denominó pSOD/G717. De forma similar, se obtuvo un clon en que un S0D2 parcial estaba fusionado al cassette de resistencia 6418 y se denominó pSOD/G828.

Ejemplo 8: Transformación de R. hodozyma ATCC96594 con el método biolístico Los protocolos de transformación se siguieron del método descrito en Métodos en Molecular Biology (Johnston et al., 53; 147-153, 1996). Como cepa huésped, se cultivó P. rhodozyma ATCC 96594 en medio YPD hasta fase estacionaria. Tras la centrifugación del caldo, se concentraron las células 10 veces con agua esterilizada y 200 µl de la suspensión de células se extendieron sobre medio YPD conteniendo 100 µg de geneticina, y 0,75 M de manitol y sorbitol. Cinco microgramos de ADN circular de pSOD/G717 y pSOD/G828 se utilizaron para recubrir 1,5 mg de partículas de oro de 0.9 µm, y se utilizaron como donador de ADN para la transformación biolística. Tras una semana de incubación a 20°C se obtuvieron cientos de clones resistentes a geneticina. Cuatro de estos transformantes se seleccionaron y se prepararon sus cromosomas. Se confirmó que uno de los transformantes tenía una estructura interrumpida del gen cromosómico SODl o del gen SOD2 mediante PCR y análisis de hibridación Southern blot, y se utilizó para los estudios posteriores.

Ejemplo 9: Tinción de actividad de PACE nativa utilizando extractos crudos obtenidos de candidatos para SODl y SOD2 interrumpidos La cepa ATCC96594 y los candidatos que se obtuvieron de la transformación biolística de ATCC96SS14 se cultivaron en medio YPD durante dos días y se recogieron por centrifugación durante 10 min. a 3000 x g a 4°C. Después de un lavado con tampón Tris-HCl (10 mM/ pH 8,0), se concentraron las células 10 veces con el mismo tampón. Las células se rompieron con un homogeneizador de tipo prensa de French (Ohtake Works) a 1500 kg/cm2 y el extracto crudo se preparó tras una microcentrifugación a 15000 rpm (TOMY, MRX150) de la fracción homogeneizada. La concentración de proteína del extracto crudo así preparado se determinó mediante el reactivo de ensayo de proteínas BCA de PIERCE (Rockford, U.S.A.). Un volumen de extracto crudo correspondiente a 300 yg de proteína se sometió PACE nativa de acuerdo con el método descrito por Schroeder W. A. et al . (J. Gen. Microbiol . , 139, 907-912, 1993) . El método de tinción por actividad se remitió al método de Flohé et al . (Methods in Enzymology, 105, 93104, 1984) . El resultado de la tinción por actividad se muestra en la FIG. 1. En el extracto de la cepa parental, ATCC96594, se visualizaron dos bandas con actividad SOD como bandas transparentes en el fondo oscuro. Por el contrario, la cepa ATCC96594: :pSOD/G717 en que el gen SODl está interrumpido, carece de la banda de actividad con movilidad alta en PAGE nativa y la cepa ATCC96594 : :pSOD/G828, en que el gen SOD2 está interrumpido carece de la banda de actividad con movilidad baja en PAGE nativa. De este resultado, se dedujo que las dos especies de MnSOD que estaban presentes en el extracto crudo de P. rhodoz~yma eran productos de los genes SODl y SOD2, y las especies SOD con movilidad alta y baja en PACE nativa correspondían a los productos de los genes SODl y S0D2 respectivamente.

Ejemplo 10: Clonaje de un gen parcial de catalasa (CAT de P. rhodozyma Para clonar un gen CAT parcial de P. rhodozyma , se utilizó un método de PCR degenerada. Se diseñaron y sintetizaron dos iniciadores mezcla cuyas secuencias de nucleótidos se muestran en la TABLA 3, sobre la base de la secuencia común de genes de catalasa conocidos de otras especies.

TABLA3 Secuencia de los iniciadores utilizados en el clonaje de genes CAT Cat2; MGNTTYTCNACNGTNGGNGGNGA (iniciador con sentido) (SEC ID NO: 16) Cat5; CKRTGNCKYTGNGTRTCNGGRTA (iniciador antisentido) (SEC ID NO: 17) (M=A ó C; N=A, C, G ó T; Y=C ó T; K=G ó T; R=A ó G) Tras una reacción de PCR de 25 ciclos a 9 °C durante 15 segundos, 45°C durante 30 segundos y 72 °C durante 15 segundos utilizando ExTaq (Takara Shuzo) como ADN polimerasa y el ADN genómico obtenido en el ejemplo 3 como molde, la mezcla de reacción se sometió a electroforésis en gel de agarosa. Se recuperó y purificó una banda de PCR de 1,0 kb de longitud mediante QIAquick (QIAGEN) según el método del fabricante y a continuación se ligó a pCR2.1-TOPO (Invitrogen) . Después de la transformación de E. culi TOP10 competentes, se seleccionaron 6 colonias blancas y se aislaron los plásmidos con el sistema automático de aislamiento de ADN. Como resultado de la secuenciación, se encontró que dos clones tenían secuencias, cuyas secuencias de aminoácidos deducidas eran similares a genes CAT conocidos. Uno de estos clones de ADN aislados se denominó pCAT702 y se utilizó en los estudios posteriores.

Ejemplo 11 Clonaje de fragmentos genómicos que contienen el gen CAT De forma similar al Ejemplo 4, se realizó un estudio de hibridación por Southern blot utilizando pCAT702 como sonda. Como resultado, se visualizó una banda hibridada que tenía un tamaño de 9 kb a 23 kb. A continuación, 4 µg de ADN genómico se digirieron con EcoRl y se sometieron a electroforésis en gel de agarosa. A continuación, los DNAs cuya longitud estaba en el intervalo de 9 a 13 kb se recuperaron mediante un método convencional de elución utilizando membrana de diálisis. El ADN purificado se ligó con 1 µg de ?DASHII (Stratagene) digerido con EcoRI y tratado con CIAP (fosfatasa alcalina de intestino bovino) a 16 °C durante una noche, y se empaquetó con extracto de empaquetamiento Gigapack III gold (Stratagene) . El extracto empaquetado se infectó E. coli cepa XLIBlue MRA(P2) y se extendió con medio con NZY vertido sobre medio LB-agar. Se rastrearon alrededor de 8000 calvas utilizando pCAT702 digerido con EcoRI como sonda. Seis calvas hibridaron con la sonda pCAT702 marcada. Se preparó ?ADN de cada uno de los clones de ? y se encontró que 4 de los 6 clones contenían el mismo fragmento que el inserto de pCAT702 como resultado de la PCR utilizando los iniciadores Cat2 y CatS, , y el análisis de secuenciación. Una secuencia parcial de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos para el gen CAT se listan como SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 9 en la sección de listado de secuencias.

Ejemplo 12 Construcción de un plásmido de interrupción para el gen CAT De forma similar al Ejemplo 7, se construyó un plásmido de interrupción para el gen CAT. En primer lugar, se insertó un engarce Sacl en la diana HindIII de pUC19- 6418, localizada en la región del terminados del cassette de resistencia 6418, y como resultado del análisis de restricción, se obtuvo pUC19-G418Sa, que tenía una diana Sacl al final del cassette de resistencia 6418. A continuación, el fragmento Kpnl -Sacl derivado de pUC19-G419Sa se ligó con pCAT702 digerido con Kpnl y Sacl proporcionando pCAT/G706, en el cual un gen CAT parcial genómico está fusionado al cassette de resistencia 6418.

Ejemplo 13 Transformación de P. rhodozyma ATCC 96594 utilizando pCAT/G706 como plásmido donador De la misma forma que en el Ejemplo 8, se transformó P. rhodozyma ATCC 96594 con el plásmido de interrupción de CAT, pCAT/G706. Tras una semana de incubación a 20°C se obtuvieron cientos de clones resistentes a geneticina. Cuatro de estos transformantes se seleccionaron y se prepararon sus cromosomas. Se confirmó que uno de los transformantes tenía una estructura interrumpida del gen cromosómico CAT1 mediante PCR y análisis de hibridación Southern blot, y se utilizó para los estudios posteriores. A continuación, dos candidatos para la interrupción de CAT se caracterizaron con el ensayo de la catalasa, que ha sido utilizado frecuentemente en el estudio taxonómico bacteriano. Células de P. rhodozyma se empaparon por medio de un asa en solución de H202 al 3% y se observó la aparición de dioxígeno gas. A pesar de que se confirmó la aparición inmediata de una espuma de 02 cuando se aplicaron células ATCC 96594 a este ensayo de catalasa, la aparición espuma de 02, no se observó hasta al cabo de un tiempo largo cuando se sumergieron en la solución de H202 los dos mutantes de ATCC 96594 : :pCAT/G706. Este resultado sugería la interrupción del gen CAT, pero la débil actividad remanente indicaba la presencia de otro factor capaz de catalizar la desaparición de H202, tal como la peroxidasa, en P. rhodozyma .

Ejemplo 14 Evaluación de las cepas con interrunciones de SODl, SOD2 y CAT derivadas de P. rhodozyma para la producción de astaxantina Se evaluó el efecto de la interrupción del gen de SODl , S0D2 y CAT en la producción de astaxantina mediante el cultivo en medio YPD en frascos agitados. Las células crecidas en YPD agar se resuspendieron en medio YPD y una porción de la suspensión celular se inoculó en 50 ml de medio YPD en un frasco de 500 ml con deflectores. Las células se cultivaron con 200 r.p.m. a 20 °C durante 84 horas. A intervalos apropiados, se retiraron 3 ml de caldo y se analizó el rendimiento celular, el consumo de glucosa y el contenido de astaxantina. El rendimiento celular se midió como densidad óptica a 660 nm y como peso celular seco por pesada de las células tras filtrar a través de acetato de celulosa de 0,45 µm y membrana de nitrocelulosa (HAWP04700, Millipore, Bedford, U.S.A.) y calentar a 80 °C durante una n.oche. El contenido de astaxantina P. rhodozyma se midió con un método de HPLC tras la extracción de carotenoides de las células de P. rhodozyma por rotura con bolas de vidrio. Tras la extracción, se añadieron 5ml de acetona /BHT/agua conteniendo la concentración apropiada de bixina como patrón interno. Se analizó el contenido de astaxantina del sobrenadante con el siguiente sistema de HPLC. Columna de HPLC; YMC-Pak ODS-A (6 mm, 150 mm) Temperatura; temperatura ambiente, eluyente; acetonitrilo/metanol/isopropanol (85/10/5) Volumen de inyección; 10 µl Caudal; 2,0 ml/minuto Detección; UV a 471 nm Los resultados obtenidos de un cultivo de 84 horas se resumen en la TABLA 4.

TABLA 4 Efecto de la mutación en SOD y CAT en la productividad de carotenoides totales y de astaxantina por R. -Rhodozyma Cepa Carotenoides Totales astaxantina (mg/g-célula seca) (mg/g-célula seca) ATCC 96594 0 . 169 0.111 dSODl 0 . 259 0.146 dS0D2 0 . 202 0.129 4CAT 0 . 229 0.144 Las cepas con interrupciones de SODl y 50D2 muestran un nivel de productividad superior de carotenoides, así como astaxantina, en comparación con su cepa huésped ATCC 96594. En especial la cepa con interrupción en SODl mostró un aumento significativo de producción de carotenoides y astaxantina del 53,3 y 31,5%, respectivamente.

SODl parece ser un enzima mitocondrial a juzgar por la secuencia de péptido de tránsito en su extremo amino terminal y podría actuar eliminando el radical superóxido, un tipo de especie oxigenada activa que se forma en la cadena respiratoria de las mitocondrias . Estos datos sugieren que la producción de astaxantina está estimulada por la generación de oxígeno activo intracelular para compensar la carencia del factor neutralizador de especies oxigenadas activas nativo, SODl.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma 'se refiere.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para la producción de carotenoides caracterizado porque comprende cultivar un organismo recombinante cuyo gen para uno o más factores neutralizantes de especies oxigenadas activas (s) está sustancialmente interrumpido con la ayuda de un cassette de interrupción específico para dicho gen, y recuperar los carotenoides del cultivo.

2. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el organismo huésped de dicho organismo recombinante pertenece a los reinos de Monera, Protista o Fungi .

3. Un proceso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el organismo huésped de dicho organismo ' recombinante pertenece al genus Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus, Synechocystis, Agrobacterium, Streptomyces , Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyll omyces, Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces.

4. Un proceso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el organismo huésped de dicho organismo recombinante es una cepa de P. rhodozyma .

5. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el factor (es) neutralizant (es) de especies oxigenadas activas es (son) la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa.

6. Un organismo recombinante productor de carotenoides, caracterizado porque el gen para por lo menos un factor neutralizante de especies oxigenadas activas está sustancialmente interrumpido con ayuda de la introducción de un cassette de interrupción específico para dicho gen.

7. Un organismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el organismo huésped de dicho organismo recombina te pertenece a los reinos de Monera, Protista o Fungi , preferentemente a los genus Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus, Synechocystis , Agrobacterium, Streptomyces , Haematococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces, Neurospora , Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces .

8. Un organismo recombinante de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque el ^factor (es) neutralizant (es) de especies oxigenadas activas a interrumpir es (son) la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa.

9. Un cassette de interrupción para interrumpir un gen que codifica un factor neutralizante de especies oxigenadas activas efectivo en la carotenogénesis en un organismo que es productor de carotenoides caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos parcial sustancialmente idéntica a una parte de la secuencia de ADN que codifica un factor neutralizante de especies oxigenadas activas y un gen marcador seleccionable.

10. Un cassette de interrupción de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque dicho organismo pertenece a los reinos de Monera, Protista o Fungi , más preferentemente a los genus Erwinia, Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus , Synechocystis , Agrobacterium, Streptomyces, Haema tococcus, Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces , Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces .

11. Un cassette de interrupción de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el factor (es) neutralizante (s) de especies oxigenadas activas a interrumpir es (son) superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa.

12. Un cassette de interrupción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos parcial que codifica un factor neutralizante de especies oxigenadas activas es idéntico a por lo menos una parte de la secuencia de ADN que codifica el factor neutralizante de especies oxigenadas activas del organismo en que va a introducirse el cassette de interrupción.

13. Un cassette de interrupción de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la secuencia de nucleótidos parcial sustancialmente idéntica a una parte de la secuencia de ADN que' codifica el factor neutralizante de especies oxigenadas activas comprende por lo menos una defección y/o mutación en comparación con el gen funcional correspondiente .

14. Una secuencia de ADN recombinante caracterizado porque codifica un factor neutralizante de especies oxigenadas activas efectivo en la carotenogénesis en un organismo productor de carotenoides .

15. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque dicho organismo pertenece a los reinos de Monera, Protista o Fungi .

16. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14 o 15, caracterizado porque dicho organismo pertenece a los reinos de Monera, Protista o Fungi , más preferentemente a los genus Erwinia , Rhodobacter, Myxococcus, Flavobacter, Paracoccus, Synechococcus, Synechocystis , Agrobacterium, Streptomyces, Haematococcus , Dunaliella, Phaffia, Xanthophyllomyces , Neurospora, Rhodotorula, Blakeslea, o Phycomyces .

17. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, caracterizado porque es una secuencia originada a partir de un microorganismo de P. rhodozyma .

18. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-17, caracterizado porque el factor neutralizante de especies oxigenadas activas es la superóxido dismutasa mitocondrial.

19. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la secuencia se identifica por SEC ID NO: 1 ó 4, o posee una homología suficientemente elevada con la secuencia de SEC ID NO: 1 ó 4 para recombinar con cualquiera de las secuencias SEC ID NOs : 1 y 4.

20. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14-17, caracterizado porque el factor neutralizante de especies oxigenadas activas es la superóxido dismutasa citoplasmática.

21. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la secuencia se identifica por SEC ID NO: 2 ó 6, o posee una homología suficientemente elevada con la secuencia de SEC ID NO: 2 6 6 para recombinar con cualquiera de las secuencias de SEC ID NOs: 2 y 6.

22. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 14-17, caracterizado porque el factor neutralizante de especies oxigenadas activas es la catalasa.

23. Una secuencia de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia se identifica por SEC ID NO: 3 ó 8, o posee una homología suficientemente elevada con la secuencia de SEC ID NO: 3 ó 8 para recombinar con cualquiera de las secuencias de SEC ID NOs: 3 y 8.

24. Un fragmento de ADN recombinante caracterizado porque comprende una región que codifica un péptido de tránsito corriente arriba de la región que codifica una proteína objetivo.

25. Un fragmento de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la proteína objetivo es la superóxido dismutasa mitocondrial.

26. Un método para localizar una proteína objetivo en las mitocondrias caracterizado porque comprende expresar el fragmento de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 24 ó 25 en un organismo huésped recombinante adecuado. 6Z-_

27. Un polinucleótido para utilizar como sonda o iniciador para donar genes para los factores neutralizantes de especies oxigenadas activas efectivos en la carotenogénesis en un organismo productor de carotenoides .

28. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el factor (es) neutralizante (s) de especies oxigenadas activas es (son) la superóxido dismutasa mitocondrial (SOD) , superóxido dismutasa citoplasmática (SOD) y/o catalasa.