KR20010062070A - 카로티노이드, 특히 아스탁산틴의 재조합 생산 - Google Patents
카로티노이드, 특히 아스탁산틴의 재조합 생산 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자를 위한 유전자가 상기 유전자에 특이적인 붕괴 카세트에 의해 실질적으로 붕괴된 유전자를 갖는 재조합 유기체를 배양하고, 이러한 배양물로부터 카로티노이드를 회수하는 방법 및 이러한 방법에 유용한 유전자 물질, 예를 들어 카로티노이드를 생산가능한 재조합 유기체, 붕괴 카세트, 재조합 DNA 서열, 재조합 DNA 분절 및 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
Description
본 발명은 카로티노이드, 특히 아스탁산틴의 재조합 생산, 및 여기에 유용한 생물학적 물질에 관한 것이다.
아스탁산틴은 다양한 유기체, 예를 들어 동물(예: 홍학 및 붉은색 따오기와 같은 조류, 및 송어(rainbow trout) 및 연어과 같은 어류), 말류 및 미생물에 분포되어 있는 것으로 공지되어 있다. 아스탁산틴 뿐만 아니라 대부분의 카로티노이드는 활성 산소에 대해 강한 산화방지능을 보유하여, 이들은 암과 같은 일부 질환에 대해 살아있는 세포를 보호하기 위한 약학적인 용도로 적용되는 것이 예상됨이 알려져 있다. 또한, 산업적인 용도의 견지에서, 연어와 같은 양식 어류 산업에서 착색제로서의 아스탁산틴에 대한 수요가 특히 증가하고 있으며, 이는 아스탁산틴이 동물에게 특유의 주홍색 색상을 부여하여 시장에서 소비자에게 관심을 끌도록 하기 때문이다.
파피아. 로도자이마(Phaffia rhodozyma)는 특히 아스탁산틴을 생산하는 카로티노겐계 균주로서 공지되어 있다. 그밖의 카로티노겐계, 즉 로도토룰라(Rhodotorula) 종과는 상이하게, 파피아. 로도자이마는 D-글루코즈와 같은 일부 당을 발효시킬 수 있다. 이것은 산업적인 용도의 견지에서 중요한 특성이다. 최근의 분류학적 연구에서, 파피아. 로도자이마의 성주기가 밝혀졌고, 이들의 테레모르픽 상태(telemorphic state)가 크산토필로마이세스 덴드로로스(Xanthophyllomyces dendrorhous)라는 명칭으로 지정되었다(골루베브(W. I. Golubev)의 문헌[Yeast 11, 101-110, 1995] 참고). 파피아. 로도자이마로부터 아스탁산틴의 과다생산자(hyper producer)를 수득하기 위한 일부 균주의 개량에 대한 연구가 수행되어 왔지만, 이러한 노력은 최근 20년 동안 종래의 돌연변이 유발법 및 원생생물 융합법을 사용하는 것으로 한정되어 왔다. 최근, 웰리(Wery) 등이, 비-복제성 플라스미드를 사용하여 다중 복제내 리보좀 DNA의 로커스에서 파피아. 로도자이마의 게놈으로 통합되도록 하는, 파피아. 로도자이마를 사용하는 호스트 벡터 시스템을 개발하였다(웨리 등의 문헌[Gene, 184, 89-97, 1997] 참고). 그리고, 베르도스(Verdoes) 등은 파피아. 로도자이마의 형질전환체를 수득하기 위한 보다 개량된 벡터 및 게라닐게라닐 피로포스페이트로부터 베타-카로틴으로의 반응을 촉매작용하는 효모를 코딩하는 이들의 3종의 카로티노rps계 유전자를 보고하였다(국제특허공개공보 제 WO 97/23633 호). 파피아. 로도자이마의 균주 개량 연구에 있어서의 유전 공학법의 중요성은, 종래의 방법에 의해 달성된 생산성을 능가하는 가까운 미래에 증가할 것이다.
전술한 바와 같이, 아스탁산틴은 산화방지 특성을 가지고, 이러한 특성은 살아있는 세포에서 끊임없이 발생하는 O2·, H2O2및 OH·와 같은 활성 산소 종으로부터의 보호를 위해 생체내에서 중요한 역할을 할 것으로 보인다. 안(An, G-H) 등은 종래의 화학적인 돌연변이 유발 이후에 안티마이신-민감성 균주를 선택함으로써 파피아. 로도자이마로부터 아스탁산틴의 과다생산자를 수득하였다(안 등의 문헌[Appl. Env. Microbiol., 55(1), 116-124, 1989] 참고). 안티마이신은 사이토크롬 b와 C1사이의 호흡 사슬의 억제제로 공지되어 있고(루치니(Lucchini, G) 등의 문헌[Mol. Gen. Genet., 177, 139, 1979] 참고), 이러한 안티마이신-민감성 돌연변이체에 대한 착색을 개선시킨다. bc1착체에서의 제 1 호흡 사슬의 방해로 인해 발생되는 활성 산소 종은 카로티노이드 형성을 자극하였다(안 등의 문헌[Appl. Env. Microbiol., 55, 116-124, 1989] 참고). 실로, O2·발생자, 두로퀴논을 생장 배지에 첨가하면, 활성 산소 종-억제 인자인 만니톨이 이러한 효과를 역전시킴에도 불구하고, 전체 카로티노이드 함량(주된 카로티노이드는 아스탁산틴임) 뿐만 아니라 파피아. 로도자이마내에 존재하는 크산토필의 상대적인 함량이 증가하였다(문헌[Schroeder, W. A. et al., J. Gen. Microbial., 139, 907-912, 1993] 참고). 이러한 결과는, 저자로 하여금 파피아. 로도자이마내 아스탁산틴의 산화방지 특성을 추측하게 하였다. 실로, 아스탁산틴의 생산은, 호흡 활성이 완전히 유도된 경우 후-대수증식기에서 자극된다. 또한, 에탄올과 같은 호흡 기질을 배지에 첨가하면, 파피아. 로도자이마내의 아스탁산틴의 생산이 개선되었다(구(Gu, W-L) 등의 문헌[J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 19, 114-117, 1997] 참고). 슈뢰더(Schroeder) 등이, 모 균주(parent strain)와 아스탁산틴의 안티마이신-민감성 과다생산자 사이의 차이점을 비교함으로써, 아스탁산틴의 생산성에 대한 파피아. 로도자이마내의 천연 활성 산소 종-억제 인자로서 작용하는 카탈라제와 과산화물 디스무타제(SOD)의 활성간의 관계를 측정하기 위해 노력하였지만, 시험관내에서의 활성에 대한 직접적인 상관성은 관찰되지 않았다.
본 발명은 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 특이적인 붕괴 카세트에 의해 실질적으로 붕괴된 재조합 유기체를 배양하고, 배양물로부터 카로티노이드를 회수하는 단계를 포함하는 생물학적으로 카로티노이드를 생산하는 신규한 방법을 제공하고자 하였으며, 이러한 방법에서 사용하기 위해서 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 특이적인 붕괴 카세트에 의해 실질적으로 붕괴된 카로티노이드를 생산가능한 재조합 유기체; 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드합성에 효과적인 활성 산소 종 억제 인자를 코딩하는 유전자를 붕괴시키기 위한 붕괴 카세트; 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드 합성에 효과적인 활성 산소 종 억제 인자를 코딩하는 재조합 DNA 서열; 미토콘드리아내에 목적 단백질을 배치하기 위한 방법; 및 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드 합성에 효과적인 활성 산소 종 억제 인자에 대한 유전자를 클로닝하기 위한 폴리뉴클레오티드를 제공하고자 하는 것이다.
도 1은 ATCC 96594 및 이들의 SOD 돌연변이체로부터 수득된 세포-부재 추출물을 사용함으로써 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후의 과산화물 디스뮤타제에 대한 염색 활성도를 나타낸다. 제 1 레인은 파피아. 로도자이마 ATCC 96594이고, 레인 2는 파피아. 로도자이마 ATCC 96594::pSOD/G717(SOD1 붕괴물)이고; 제 3 레인은 파피아. 로도자이마 ATCC 96594::pSOD/G828(SOD2 붕괴물)이고; 제 4 레인은 파피아. 로도자이마 ATCC 96594이다.
본 발명에 따르면, 카로티노이드, 특히 아스탁산틴 생산 방법의 개선에 유용한 생물학적 물질인, 카탈라제 및 SOD와 같은 활성 산소 종-억제 인자를 위한 효모 및 유전자가 제공된다. 본 발명은 미토콘드리아 SOD, 세포질 SOD, 및 카탈라제를 코딩하는 유전자의 클로닝법 및 결정법을 포함한다. 또한, 본 발명은 파피아. 로도자이마내 유전자의 붕괴 결과에 의한 효소 특징화를 포함한다. 카로티노이드합성에 대한 이들의 붕괴 효과는, 적당한 배양 조건하에서 적당한 배지하에서 이러한 형질전환체를 배양함으로써 확인할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 대해 특이적인 붕괴 카세트에 의해 의해 실질적으로 붕괴된, 재조합 유기체를 배양하고, 배양액으로부터 카로티노이드를 회수함을 포함하는 카로티노이드의 제조 방법을 포함한다. 상기 재조합 유기체의 호스트 유기체는 모네라(Monera)계, 원생생물계 또는 균류계에 속할 수도 있다. 상기 재조합 유기체의 보다 바람직한 호스트 유기체는 에르위니아(Erwinia), 로도박테르(Rhodobacter), 믹소코쿠스(Myxococcus), 플라보박테르(Flavobacter), 파라코쿠스(Paracoccus), 시네쵸코쿠스(Synechococcus), 시네쵸시스티스(Synechocystis), 아그로박테리움(Agrobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 하에마토코쿠스(Haematococcus), 듀날리엘라(Dunaliella), 파피아(Phaffia), 크산토필로마이세스(Xanthophyllomyces), 뉴로스포라(Neurospora), 로도토룰라(Rhodotorula), 블라케슬레아(Blakeslea) 또는 피코마이세스(Phycomyces) 종에 포함될 수 있다. 보다 바람직하게는, 상기 호스트 유기체가 파피아. 로도자이마 균주이다.
활성 산소 종-억제 인자는 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제이다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 대해 특이적인 붕괴 카세트의 도입에 의해 보조되어 실질적으로 붕괴됨을 특징으로 하는, 카로티노이드를 생산가능한 재조합 유기체를 제공한다. 붕괴될 활성 산소 종-억제 인자는 민토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제이다.
추가로, 본 발명은 카로티노이드를 생산가능한 유기체내에서 효과적인 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 유전자를 붕괴하기 위해서 본 발명의 상기 재조합유기체를 제조하는데 사용할 수 있는 붕괴 카세트를 제공하며, 이는 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 DNA 서열의 일부분과 실질적으로 동일한 부분 뉴클레오티드 서열 및 선택성 마커 유전자를 포함한다. 붕괴 카세트의 구조화에 있어서, 목적 유기체가 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속할 수 있고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세스에 속할 수 있다. 붕괴될 활성 산소 종-억제 인자는 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열(A)가 다른 서열 B에 대해 75% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 예를 들어 95% 이상 동일한 경우, 상기 서열 (A)가 다른 서열(B)와 실질적으로 동일하다고 한다.
추가로, 본 발명은 카로티노이드를 생산가능한 유기체에서 유용한 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 재조합 DNA 서열을 제공한다. DNA 서열은 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속하는 유기체로부터 비롯되고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세스 종에 속하는 유기체로부터 비롯될 수 있다. 특히 바람직한 유기체는 파피아. 로도자이마이다. 재조합 DNA 서열에 의해 코딩되는 활성 산소 종-억제 인자는, 미토콘드리알 과산화물 디스뮤타제, 세포질 과산화물 디스뮤타제 및/또는 카탈라제일 수 있다.
미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제를 코딩하는 재조합 DNA 서열은, 서열번호 1 또는 서열번호 4와 동일할 수 있거나, 서열번호 1 및 서열번호 4의 서열 둘다와 재조합하기에 충분하도록 서열번호 1 또는 서열번호 4의 서열에 대해 고도의 상동성을 가질 수도 있다. 세포질 과산화물 디스뮤타제를 코딩하는 재조합 DNA 서열은, 서열번호 2 또는 6와 동일할 수 있거나, 서열번호 2 및 서열번호 6의 서열과 재조합하기에 충분하도록 서열번호 2 또는 서열번호 6의 서열에 대해 고도의 상동성을 가질 수도 있다. 또한, 카탈라제를 코딩하는 재조합 DNA 서열은, 서열번호 3 또는 서열번호 8과 동일할 수 있거나, 서열번호 3 및 서열번호 8의 서열과 재조합하기에 충분하도록 서열번호 3 또는 서열번호 8의 서열에 대해 고도의 상동성을 가질 수도 있다.
본 발명에서, 상동성 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해서, 하기 하이브리드화 및 세척 조건의 임의의 조합을 적당하게 사용할 수 있다:
고도로 엄격한 하이브리드화:
6X SSC
0.5% SDS
100㎍/㎖의 변성 연어 정자 DNA
50% 포름아미드
42℃에서 밤새 부드럽게 흔들면서, 밤새 배양한 배양물;
고도로 엄격한 세척:
15분 동안 상온에서 2X SSC, 0.5% SDS에서 세척하고, 그다음 15분 동안 상온에서 0.1X SSC, 0.5% SDS으로 다시 세척함;
낮은 엄격한 하이브리드화:
6X SSC
0.5% SDS
100㎍/㎖의 변성 연어 정자 DNA
50% 포름아미드
37℃에서 밤새 부드럽게 흔들면서, 밤새 배양한 배양물;
낮은 엄격한 세척:
15분 동안 상온에서 0.1X SSC, 0.5% SDS에서 세척함
보통의 엄격한 조건은, 하이브리드화 반응이 수행되는 온도 및/또는 전술한 바와 같은 세척 조건을 변화시킴으로써 수득될 수도 있다.
따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 서열 (A)가 고도의 엄격한 조건(즉, 전술한 바와 같은 고도의 엄격한 하이브리드화 및 세척 조건)하에서 서열 B에 대해 하이브리드화하고, 서열 A에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 분절이 서열 (B)에 의해 코딩된 폴리펩티드와 동일한 활성을 가지는 경우, 서열 (A)가 다른 서열 (B)에 대해 "고도의 상동성"을 가지는 것으로 지칭된다.
본 발명은 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제일 수 있는 목적 단백질의 코딩 영역 업스트림에 전이 펩티드 코딩 영역을 포함하는 재조합 DNA 분절을 제공한다.이러한 재조합 DNA 분절의 발현은 미토콘드리아내에 목적 단백질을 배치시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은, 적당한 재조합 호스트 유기체내의 목적 단백질의 코딩 영역 업스트림에 전이 펩티드 코딩 영역을 포함하는 재조합 DNA 분절을 발현시킴을 포함하는, 미토콘드리아내 목적 단백질을 배치하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제, 세포질 과산화물 디스뮤타제 및 카탈라제와 같은, 활성 산소 종-억제 인자의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는, 유전자의 상동성을 기본으로 하여 카로티노이드를 생산가능한 다른 유기체에서 효과적인 활성 산소 종-억제 인자를 위한 유전자를 클로닝하기 위한 프로브 또는 프라이머로서의 용도를 제공한다.
전술한 바와 같이 간단히 설명하면, 본 발명의 목적은 생물학적으로 카로티노이드를 생산하는 신규한 방법에 관한 것이다. 신규한 방법은 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 특이적인 붕괴 카세트에 의해 실질적으로 붕괴된 재조합 유기체를 배양하고, 배양물로부터 카로티노이드를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해서, 미토콘드리아 SOD 또는 세포질 SOD와 같은 효소일 수 있는 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 개방 리딩 프레임을 함유하는 재조합 DNA 서열을 제공하는 것이다. 재조합 DNA 서열은 카탈라제 유전자를 코딩하는 부분 절편을 함유할 수도 있다. 특이적으로 유전자를 붕괴하기 위해서는 상기 효소를 위한 천연 유전자과 재조합가능해야하기 때문에, 상기 재조합 DNA 서열은 상기붕괴 카세트를 구조화하는데 유용하다.
상기 재조합 DNA 서열은 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속할 수 있고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세스에 속하는 생물로부터 유도된 것일 수 있다. 특히 바람직한 유기체는 파피아. 로도자이마이다. 재조합 DNA 서열에 의해 코딩되는 활성 산소 종-억제 인자는 미토콘드리아 SOD, 세포질 SOD 및/또는 카탈라제일 수 있다. 재조합 DNA 서열의 특이적인 예로는, 파피아. 로도자이마의 유전자로부터 유도되고 (i) 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표현되는 DNA 서열; (ii) 서열번호 4 또는 서열번호 6과 동일시되는 이들의 cDNA; (iii) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표현되는 DNA 서열에 대해 이소코딩(isocoding) 또는 대립유전자 변이체; 및 (iv) 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가부, 삽입부, 삭제부 및/또는 치환부를 갖는, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 4 또는 서열번호 6으로 표현되고 상기 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 유도체중에서 선택된다. 상기 재조합 DNA 서열은 (a) 이것이 서열번호 5 및 서열번호 7에서 기술한 것으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 상기 효소를 코딩하거나, (b) (i) 대립유전자 변이체, 및 하나 이상의 아미노 산의 부가부, 삽입부, 삭제부 및/또는 치환부를 가지고 기술된 효소 활성을 갖는 효소중에서 선택된 상기 효소의 변이체를 코딩함을 특징으로 할 수도 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "대립유전자 변이체"란 파피아. 로도자이마, 크산토필로마이세스 덴드로로우스와 같은 두배수체 유기체에서의 2개의 대립유전자중 하나에서 하나 이상의 돌연변이체를 갖는 변이체를 의미한다. 정해진 유전자의 대립유전자는 둘다 동일한 형질 또는 특성과 관련되지만, 특정한 대립유전자에 의해 코딩된 생성물 또는 작용은 상기 유전자의 다른 대립유전자에 의해 코딩된 것과 정량적 및/또는 정성적으로 상이하다. 대립유전자 변이체는 자연적으로 발생하거나 화학적 돌연변이 유발법으로 인공적으로 발생할 수 있다. 야생형 대립유전자는 정해진 유기체의 야생형의 균주에서 발견되는 특정한 표현형 특성을 코딩하는 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "이소코딩 변이체"란, 정해진 유전자의 뉴클레오티드 서열의 번역 생성물(즉, 아미노산 서열)이 야생형 단백질의 것과 동일하지만, 정해진 유전자의 뉴클레오티드 서열이 야생형 유전자의 서열과 상이한 변이체를 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 'DNA 서열의 유도체'는, 상응하는 서열번호의 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하지만, 1 내지 20개, 바람직하게는 1 내지 10개, 예를 들어 1 내지 5개의 뉴클레오티드의 첨가부, 삽입부, 삭제부 및/또는 치환부에 의해 상기 DNA 서열과 상이한 DNA 서열이다.
전술한 특히 구체적인 재조합 DNA 서열은, 파피아. 로도자이마의 유전자로부터 유도될 수 있고, (i) 서열번호 3으로 표현되는 DNA 서열, (ii) 서열번호 8과 동일시되는 cDNA; (iii) 서열번호 3 또는 서열번호 8로 표현되는 DNA 서열을 위한 이소코딩 변이체 또는 대립유전자 변이체; 및 (iv) 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가부, 삽입부, 삭제부 및/또는 치환부를 갖는, 서열번호 3 또는 서열번호 8로 표현되고 상기 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열의 유도체중에서 선택된 것을 수 있다. 상기 재조합 DNA 서열은, (a) 이것이 서열번호 9에서 기술한 것으로 구성된 군중에서 선택된 부분 아미노산 서열을 갖는 상기 효소를 코딩하거나, (b) 이것이 (i) 대립유전자 변이체, 및 (ii) 하나 이상의 아미노산의 첨가부, 삽입부, 삭제부 및/또는 치환부를 가지고 전술한 효소 활성을 가지는 효소중에서 선택된 상기 효소의 변이체를 코딩함을 특징으로 할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 서열은 벡터의 형태인 것이 바람직하다:
본 발명은, 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 특이적인 붕괴 카세트의 도입으로 보조되어 실질적으로 붕괴된 유기체를 수득하기 위하여, 호스트 유기체를 형질전환시키기 위한 상기 재조합 DNA 서열의 용도를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 코딩하는 폴리펩티드의 활성이 비-붕괴된 유전자에 비해 감소되는 경우, 유전자가 '붕괴되거나' '실질적으로 붕괴된 것이다' 바람직하게는, 활성은 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 예를 들어 75% 이상, 보다 바람직하게는 90% 내지 100%으로 감소된다. 재조합 DNA 서열의 편리한 형태는 벡터일 수 있다. 재조합 DNA을 사용하여 수득된 재조합 유기체는, 미토콘드리아 SOD, 세포질 SOD 또는 카탈라제를 코딩하는 이들의 DNA 서열이 붕괴된다. 재조합 DNA으로 형질전환된 호스트 유기체는 카로티노이드, 특히 아스탁산틴의 생산 방법의 개선에서 유용하다. 따라서, 본 발명은 이러한 재조합 유기체를 제공한다.
카로티노이드의 이러한 생물학적 생산 방법은 카로티노이드, 특히 아스탁산틴의 생산성을 개선시킬 수 있다. 따라서, 카로티노이드의 생산을 유발하는 조건하에서 전술한 재조합 유기체를 배양함을 특징으로 하는 카로티노이드의 제조 방법은, 본 발명의 한가지 양태이다. 이러한 방법은 아스탁산틴의 생물학적 생산에 적용될 수 있다.
다수의 연구자들은, 활성 산소 종이 공지된 카로티노이드계 유기체에서의 카로티노이드 생산을 자극한다는 것을 지적하고 있다. 하에마토코쿠스 플루비아리스(Haematococcus Pluvialis)의 포낭 세포에서의 카로티노이드의 생물학적 합성은 주변의 산화 스트레스에 의해 개선된다(고바야시(Kobayashi) 등의 문헌[Appl. Env. Microbiol., 59, 867-876, 1993]). 카로티노이드 생물학적 합성은 활성 산소 종에 의해 유발되고, 축적된 카로티노이드는 두날리엘라 바르다윌(Dunaliella bardawil)의 산화 스트레스 손상에 대한 보호제로서 작용한다(샤시(Shaish) 등의 문헌[Planta, 190, 363-368, 1993] 참고). 파피아. 로도자이마의 아스탁산틴 제조가 활성 산소 종의 발생을 개질시키는 다양한 배양 조건하에서 생체내에서 연구되었지만, 발생한 활성 산소와 카로티노이드 생산가능성 사이의 상관관계는 명확하게 밝혀지지 않았고, 이것은 천연 활성 산소 종-억제 인자가 여전히 이러한 시험과정중에 존재하여 어느 정도까지 카로티노이드 생산에 대한 활성 산소 종의 효과를 유지시키기 때문일 것이다(슈뢰더(Schroeder, W. A.) 등의 문헌[J. Gen. Microbiol., 139, 907-912, 1993] 참고).
본 발명에서, 파피아. 로도자이마내 천연 활성 산소 종-억제 인자의 존재가 아스탁산틴 생산에 대한 활성 산소의 긍적적인 효과를 저지할 수 있다는 가능성을 배제하기 위해서, 유전자 붕괴 플라스미드를 구성 및 도입함으로써 이들의 발현을 붕괴시키기 위해서, SOD 및 카탈라제와 같은 이러한 천연 활성 산소 종-억제 인자가 파피아. 로도자이마로부터 클로닝되었다. 아스탁산틴이 파피아. 로도자이마중에서 산화방지 역할을 수행한다는 가정하에서, 천연 활성 산소 종-억제 인자의 부재로 인한 생체내의 비교적 증가된 활성 산소 종이 활성 산소 종을 저지하는 선택적 작용자인 아스탁산틴의 생산을 자극하기 때문에, 아마도 천연 활성 산소 종-억제 인자의 불활성화가 카로티노이드 생산에 영향을 미칠 수 있다.
활성 산소 종은 단백질 또는 핵산과 같은 세포간 분자에 산화 손상을 입힘으로써 살아있는 세포에 독성을 나타낸다. 최근 연구에서, 파리(fruit fly) 및 선충류에서의 증가된 과산화물 디스뮤타제 활성, 증가된 일생, 및 감소된 산화 손상간의 상관 관계를 증명함으로써, 노화가 산화 손상에 의해 유발된다는 것을 밝혔다(아가월[Agarwal, S.] 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A., 91, 12332-12335, 1994]; 라센(Larsen)의 문헌[P.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 8905-8909, 1993]; 소할(Sohal, R. S.) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 270, 15671-15674, 1995] 참고). SOD 및 관련 산화방지 효소, 및 이들의 유전자는 원생생물 및 진핵세포에서 연구되었다.
대부분의 진핵세포와 같은 효모, 에스. 세레비시아에 (S. cerevisiae)는 세포질내의 Cu/ZnSOD(SOD1 유전자의 생성물) 및 미토콘드리아내의 MnSOD(SOD2 유전자의 생성물)를 함유한다. 이러한 효소는 O2의 불균등화 반응, 및 O2및 H2O2의 생산을 촉매작용한다. 글루타티온 및 아스코베이트와 같은 작은 분자 산화제; 카탈라제 및 퍼옥시다제와 같은 다른 산화방지 효소; 및 메탈로티온닌과 같은 금속 킬레이트 단백질과 함께, 이들은 산화 손상을 최소화함으로써, 호기성 균류가 O2하에서 생존할 수 있도록 한다. 세포질 SOD의 중요성은, SOD가 없는 에스. 세레비시아에 및 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)에서 제시된 이산소(dioxygen)에 대한 고도의 민감성에 의해 설명되었다. 두가지의 유기체에서, SOD의 활성이 손실되면 보다 높은 돌연변이율 및 특이적 생합성 결함과 함께, 호기성 조건하에서 성장이 느려진다(sod1-효모는 호기성 세균의 성장을 위해 리신 및 메티오닌을 필요로 하는 반면, sod-이.콜라이는 분지된 아미노산을 필요로 한다). 일부 경우, 이러한 효과는 철 황 클러스터 단백질에 대한 과산화물의 억제 효과로 인한 것으로 공지되어 있다(가드너(Gardner, P. R.) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 266, 19328-19333,. 1991]; 쿠오(Kuo, C. F.) 등의 문헌[J. Biol. Chem., 262, 4724-4727., 1987]). 에스. 세레비시아에의 sod2의 돌연변이체는, 탄소 공급원으로서 글루코즈를 사용하면서 공기중에서 성장하는 경우 거의 영향을 받지 않는다. 그러나, 이들은 산소 과잉에 민감하고, 이들의 대사를 위해 호흡이 필요한 탄소 공급원내의 일가산소하에서 불량하게 성장한다.
SOD 및 카탈라제를 코딩하는 유전자는 다른 종으로부터 클로닝되었기 때문에, 파피아. 로도자이마의 상응하는 유전자는 변성 PCR 방법으로 클로닝될 수 있다. 우선, 전술한 방법을 사용하여 SOD 유전자 및 CAT 유전자의 일부분을 함유하는 부분 유전자 분절을 클로닝하였다. 상기 변성 PCR은, 동일하거나 유사한 작용을 갖는 다른 종으로부터의 공지된 효소에 대해 아미노산 서열의 높은 상동성을 갖는, 관심있는 유전자를 클로닝하는 방법이다. 변성 PCR에서 프라이머로서 사용되는 변성 프라이머는, 상응하는 뉴클레오티드(변성)에 대한 아미노산 서열을 역번역함으로써 디자인되었다. 이러한 변형 프라이머에서, 임의의 A, C, G 또는 T으로 구성된 혼합 프라이머, 또는 다의성 코드에서 이노신을 함유하는 프라이머가 일반적으로 사용된다. 이러한 발명에서, 이러한 혼합된 프라이머는 변성 프라이머가 전술한 유전자를 클로닝하기 위해 사용되었다. 사용된 PCR 조건은 전술한 바와 같이 프라이머 및 클로닝할 유전자에 따라 변화된다. 본 발명에서, 서열이 서로 상이한 SOD 유전자의 2개의 종은 변성 PCR에서 동일한 PCR 밴드로부터 클로닝되고, SOD1 및 SOD2 유전자로 지칭되었다.
프로모터 또는 터미네이터와 같은 조절 영역 뿐만 아니라 인트론과 함께, 코딩 영역을 함유하는 전체 유전자는, 라벨링한 후, 프로브로서 전술한 바와 같이 변성 PCR에 의해 수득된 부분 DNA 절편을 사용함으로써, 적당한 호스트에서 파지 벡터 또는 플라스미드 벡터내에서 구조화된 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 크로모좀으로부터 클로닝될 수 있다. 일반적으로, 호스트 균주로서 이.콜라이, λ파지 벡터와 같은 이. 콜라이 벡터, 파지 벡터, 또는 pUC 벡터와 같은 플라스미드 벡터가 종종 라이브러리 구조화, 및 서열화, 제한적인 분해, 라이게이션 등과 같은 유전자 조작법에서 사용된다. 본 발명에서, 파피아. 로도자이마의EcoRI 유전자라이브러리는 삽입부 크기에 따라 λ 벡터, λZAPII 및 λDASHII의 유도체에서 구조화되었다. 임의의 길이의 삽입부가 클로닝되어야 하기 때문에, 삽입부의 크기는 라이브러리를 구성하기 전에 각각의 유전자에 대한 사우던 블롯 하이브리드화(Southern blot hybridization)에 의해 결정되었다. 본 발명에서, 프로브로서 사용되는 DNA는, 종래의32P 라벨 대신에, 공급자(독일 만하임 소재의 뵈링거-만하임(Boehringer-Mannheim))에 의해 제조된 프로토콜을 따라 디콕시게닌(DIG), 스테로이드 햅텐으로 라벨링하였다. 파피아. 로도자이마의 크로모좀으로부터 구조화된 게놈 라이브러리는, 프로브로서 관심있는 유전자의 일부를 포함하는 DIG-라벨링된 DNA 분절을 사용함으로써 스크리닝되었다. 하이브리드화 플라크를 수집하고, 추가의 연구를 위해 사용하였다. λDASHII(삽입부 크기는 9kb 내지 23kb임)를 사용하는 경우, 제조된 λDNA는EcoRI에 의해 분해되고, 그다음EcoRI 삽입부를, pUC19 또는 PBluescriptII SK+와 같은 플라스미드 벡터에 클로닝함으로써 제조되었다. λZAPII가 게놈 라이브러리의 구조화에 사용되는 경우, 단일 스트랜드된 M13 파지, EX 어시스트 파지(미국 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))의 유도체를 사용함으로써 플라스미드 벡터로의 클로닝의 연속적인 단계를 위해서, 생체내 절단 프로토콜을 편리하게 사용하였다. 이렇게 수득된 플라스미드 DNA를 서열화를 위해 검사하였다. 본 발명에서, SOD1 및 SOD2 유전자는 각각 독립적으로 λZAPII 라이브러리로부터 수득되고, 카탈라제(CAT) 유전자는 λDASHII 라이브러리로부터 클로닝되었다.
본 발명에서, 대부분의 서열에서 Taq DNA 폴리머라제가 사용되는 오토사이클 서열화 프로토콜을 사용하는 자동화 형광 DNA 배열순서분석기, ALFred 시스템(스웨덴 업살라 소재의 파마시아(Phamacia))를 사용하였다.
본 발명에서, 발명자는 SOD1 유전자 또는 SOD2 유전자의 개방 리딩 프레임 뿐만 아니라 이들의 프로모터 및 터미네이터 서열을 함유하는 게놈 서열을 결정하였다. 서열 분석으로부터, SOD1은 아미노산 말단에서 전이 펩티드의 존재로부터 미토콘드리아 SOD를 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, SOD2는 이러한 전이 펩티드 서열이 없으며, 이러한 사실은 SOD2가 세포질 SOD를 코딩함을 제안한다. 발명자는 또한 CAT 유전자에 대한 개방 리딩 플레임의 부분 게놈 서열을 결정하였다.
전이 펩티드는 핵 유전자 생성물을 이동시키는 신호 서열로서, 이것은 크로모좀상에서 코딩하며, 이들의 번역 단백질은 미토콘드리아에서, TCA 사이클에 내포되는 효소와 같은 단백질의 미토콘드리아내의 배치에 영향을 미친다. 미토콘드리아에서 일부 단백질을 발현하기 위해서, 아미노 말단 단부에 전이 펩티드를 첨가하는 것이 유용하다.
본 발명에서, SOD1, SOD2 및 CAT 유전자의 붕괴 플라스미드는 유전자의 양쪽 단부를 포함하지 않는 전술한 유전자의 부분 분절을, 자멸 벡터에, 약제 내성 유전자로 라이게이션함으로써 구조화되고, 이들은 자율적인 복제 서열의 부족으로 인하여 파피아. 로도자이마내에서 자발적으로 복제할 수 없다. 독성 항생물질의 존재하에서 호스트 자멸가능한 효소를 코딩하는 약제 내성 유전자가 종종 선택성 마커로서 사용되었다. pPR2T에 잠복된 G418 내성 유전자(베르도스(Verdoes) 등의 국제특허 공개공보 제 97/23633 호)는 약제 내성 유전자의 예이다. 이러한 자멸 벡터는 자체로는 복제할 수 없고, 벡터와 크로모좀 사이의 상동성 서열을 사용하는 단일-크로싱 재배합의 결과로서 호스트의 크로모좀에 일체화된 형태로만 존재할 수 있다. 관심있는 유전자로 재조합되는 경우, 이러한 유전자 서열은 유전자의 양쪽 단부의 부족으로 인하여 호스트 균주의 크로모좀상에 재구성될 수 없고, 결과적으로, 관심있는 유전자는 이렇게 수득된 재조합 균주에서 붕괴될 수 있다. 붕괴 플라스미드의 다른 예는 플라스미드 타입에 대한 2중-크로싱이다. 붕괴 플라스미드의 이러한 타입은 붕괴될 목적 유전자의 상이한 부분 분절 2개를 함유하고, 이러한 약제 내성 유전자로서의 선택적인 마커 유전자가 이러한 두 개의 분절 사이에 삽입된다. 유전자의 2개의 상동한 부분에서 수용체 세포의 크로모좀 및 공여체 플라스미드 DNA 사이의 재조합 후에, 공여체 DNA에 의한 크로모좀 서열의 치환이 발생하고, 선택적 마커 유전자가 분괴될 목적 유전자로 삽입된다. 일반적으로, 2중-크로싱 형태의 플라스미드는 단일 크로싱 형태의 벡터 보다 더 낮은 재조합 빈도수를 갖는다.
본 발명에서, 발명자는 상응하는 유전자를 붕괴시킴으로써 관심있는 효소를 비활성화시켰다. 관심있는 유전자 생산물의 효과를 평가하기 위한 다른 방법은, 유전 공학 방법으로 이들의 발현을 감소시키는 것이다. 이러한 목적을 위해서, 일부 방법이 활용되었다. 이러한 방법중 하나는 안티-센스(antisense) 방법이다. 안티-센스 방법은 서열이 관심있는 유전자 서열과 상보적인 인공 유전자 분절을 도입함으로써 관심있는 유전자의 발현을 감소시키는 방법이다. 이러한 안티-센스 유전자 분절은 생체내에서 목적 유전자의 성숙한 mRNA 분절과 착체를 형성하고, 결과적으로 mRNA로부터의 효과적인 번역을 억제한다.
다른 방법은 프로모터 영역을 돌연변이시키는 것이다. 일반적으로, 유전자는 각각 상이한 작용을 가지는 다수의 부분으로 구성된다. 진핵세포에서, 상응하는 단백질을 코딩하는 유전자는 리보좀 RNA(rRNA)), 작은 핵 RNA(snRNA) 및 전이 RNA(tRNA)와는 상이한 미성숙 메신저 RNA(pre-mRNA)로 전사된다. RNA 폴리머라제 II(PolII)가 이러한 전사 과정에서 중요한 역할을 하지만, PolII는 프로모터를 함유하는 업스트립 영역 및 업스트립 활성화 서열(UAS)를 덮고 있는 시스 요소 및 트랜스-활성 단백질 인자 없이는 단독으로 전사를 개시할 수 없다. 우선, 다수의 염기성 단백질 성분으로 구성되어 있는 전사 개시 착체는 발현될 유전자의 5'-인접 영역에서 프로모터 서열을 인식한다. 이러한 과정에서, 열-쇼크 반응과 같은 일부 특이적 조절하에서 또는 영양소 부재 상태로의 적용 등에서 발현하는 유전자의 경우에는, 일부 부가적인 참여자가 요구된다. 이러한 경우, UAS는 프로모터 서열 주변의 5'-미번역 업스트림 영역내에 존재할 필요가 있고, 일부 양성 또는 음성 조절자 단백질은 UAS를 인식하고 UAS에 결합한다. 프로모터 서열으로의 전사 개시 착체의 결합 강도는 프로모터 주변의 트랜스-활성 인자의 결합에 의해 영향을 받고, 이것은 전사 활성을 조절할 수 있다.
포스포릴화에 의해 전사 개시 착체를 활성화시킨 후, 전사 개시 착체가 전사 개시 부위로부터 전사를 개시한다. 전사 개시 착체의 일부분은 프로모터 영역으로부터 유전자의 3'-방향으로 연장화 착체로서 탈착되고(이러한 단계는 프로모터 제거 과정으로 지칭됨), 연장화 착체는, 이것이 유전자의 3'-인접 다운스트림 영역내에 위치하는 종결화 서열에 도달할 때까지 계속 전사한다.
관심있는 유전자의 발현을 감소시키기 위해서, 종래의 화학적 돌연변이 유발법 또는 전술한 UAS 서열을 함유하는 목적 유전자의 프로모터 영역내의 유전자 부위-관련 돌연변이 유발법이 종종 사용되었다. 관심있는 효소의 발현이 감소된 돌연변이체 균주는, 이러한 돌연변이된 프로모터 영역을 갖는 재조합 DNA를 포함하는 호스트 균주를 형질전환함으로써 수득될 수 있다. 전술한 바와 같이, 유전자의 발현을 감소시키고자 하는 이러한 시도가 사용되었고 살아있는 유기체내의 현상에 대한 유전자 생성물의 영향을 측정하기 위한 유전자 붕괴법이 사용되었다.
형질전환 방법으로서, LiCl 방법(웨리(Wery) 등의 문헌[Yeast, 12(7), 641-651, 1996] 참고) 및 전기천공법(웨리 등의 문헌[Gene, 184, 89-97, 1997] 참고)이, 파피아. 로도자이마를 형질전화시키기 위해서 적용되지만, 이러한 조건하에서의 형질전환의 효율은 여전히 낮다. 본 발명에서, 바이오리스틱(Biolistic) 형질전환법(존슨(Johnston) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology, 53: 147-153, 1996] 참고)이 파피아. 로도자이마를 형절전환시키기 위해서 적용되었다. 바이오리스틱 방법은 간단하고 신뢰성 있는 프로토콜로서, 이 방법에서는 금 또는 텅스텐 입자상에 피복된 공여체 DNA를 고압 헬륨 기체에 의해 직접적으로 살아있는 세포로 넣는다. 이러한 형질전환 프로토콜은 바시스디오마이세튜스(Basisdiomycetous) 효모 뿐만 아니라 파피아. 로도자이마에 속하고 종래의 형질전환 방법으로는 형질전환시키는 것이 어려운 크립토코쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에 성공적으로 적용되었다(토팔레티(Toffaletti) 등의 문헌[J. Bacteriol., 175(5), 1405-1411, 1993] 참고). 본 발명에서, 이러한 바이오리스틱 방법은 파피아. 로도자이마 세포를 형질전환하는데 성공적으로 사용되었다.
유전자 붕괴 과정은 효소 특징화로 직접적으로 확인되고, 이렇게 수득된 형질전이체로부터 수득된 크로모좀을 사용하여 PCR 또는 사우던 블롯 하이브리드화에 의한 유전자 분석으로 확인할 수 있다. 본 발명에서, SOD 붕괴에 대한 직접적인 확인은, 염색 활성도에 의해 수행되고, 카탈라제 붕괴의 특징화는 박테리아 형태학에서 종종 사용되는 카탈라제 시험과 같은 시각적인 관찰에 의해 수행되었다.
이러한 유전공학적 파피아. 로도자이마는 적당한 배지하에서 배양되고, 이들의 아스탁산틴 생성성에 대해 평가하였다.
본 발명은 첨부된 도면과 함께 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
하기 물질 및 방법이 하기 실시예에서 사용되었다.
균주
파피아. 로도자이마 ATCC 96594(부다페스트 조약에 따라 1998년 4월 8일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁번호 ATCC 74438로 재기탁됨)
배지
파피아. 로도자이마 균주는 YPD 배지의 한천 플레이트(미국 디트로이트 소재의 DIFCO)상에서 일상적으로 유지된다. 이. 콜라이 균주는 LB 배지(1리터당 10g의 바코-트립톤, 5g의 효모 추출물(DIFCO), 및 5g의 NaCl)에서 유지되었다. NZY 배지(1리터당 5g의 NaCl, 2g의 MgSO4-7H2O, 5g의 이스트 효모 추출물(DIFCO), 10g의 NZ 아민 형태 A(일본 오사카 소재의 와코(WAKO)))를, 부드러운 한천(0.7% 한천(와코))내의 λ 파지 증식을 위해 사용하였다. 한천 배지가 제조되는 경우, 1.5%의 한천(와코)을 보충하였다.
방법
분자 유전학의 기법에 대한 일반적인 방법은 문헌[Molecular cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]의 방법에 따랐다. 제한 효소 및 T4 DNA 라이가제는 일본 소재의 다카라 스조(Takara Shuzo)에서 구입하였다.
파피아. 로도자이마로부터의 크로모좀 DNA의 분리는, 제조자가 공급하는 프로토콜을 따라 QIAGEN 게놈 키트(독일 힐덴 소재의 키아겐(Qiagen))을 사용함으로써 수행하였다. 형질전환된 이. 콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 소량의 준비 과정은 자동화 DNA 분리 시스템(일본 오사카 소재의 크라보 캄파니 리미티드(Kurabo Co. Ltd.); PI-50)으로 수행되었다. 이. 콜라이로부터의 플라스미드 DNA의 중간량의 준비 과정은 QIAGEN 컬럼(키아겐)을 사용하여 수행되었다. λ DNA의 분리는 제조자에 의해 준비된 프로토콜을 따라 위저드 람다 프렙 DNA 정제 시스템(Wizard lambda preps DNA purification systems; 미국 매디슨 소재의 프로메가)에 의해 수행되었다. DNA 분절은 QIA퀵(QIAquick) 또는 QIAEX II(키아겐)을 사용함으로써 아가로제로부터 단리되고 정제되었다. λ 파지 유도체의 취급법은 제조자(스트라타진)에 의해 준비된 프로토콜을 따랐다.
파피아. 로도자이마로부터의 전체 RNA의 분리는 이소겐(일본 도야마 소재의 니폰 진(Nippon Gene))을 사용함으로써 페놀 방법에 의해 수행되었다. mRNA는mRNA 분리 키트(미국 팔로 알토 소재의 크론테크(Clonteck))를 사용함으로써 수득된 전체 RNA로부터 정제하였다. cDNA는 캡파인더 cDNA 구조화 키트(크론테크)를 사용함으로써 합성하였다.
기가팩 III 골드 패키징 추출물(Gigapack III gold packaging extract; 스트라타진)을 사용하여 시험관내 패키징을 수행하였다.
폴리머라제 쇄 반응(PCR)은 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 모델 2400의 열 순환기에 의해 수행되었다. 각각의 PCR 조건은 실시예에 기술되어 있다. PCR 프라이머는 상업적인 공급자로부터 구입하거나 DNA 합성기(일본 유라야스 소재의 퍼킨 엘머, 모델 392)에 의해 합성되었다. DNA 서열화를 위한 형광 DNA 프라이머는 파마시아로부터 구입하였다. DNA 서열화는 자동화 형광 DNA 서열기(ALFred, 파마시아)에 의해 수행되었다.
이. 콜라이 DH5α의 수용능력있는 세포는 토요보(Toyobo, 일본)에서 구입하였다.
파피아. 로도자이마의 바이오리스틱 형질전환을 위한 기기 및 시약은 니폰 바이오-라드 래버러토리(Nippon Bio-Rad Laboratories; 일본 도쿄 소재)에서 구입하였다.
실시예 1: 파피아. 로도자이마로부터의 mRNA의 단리 및 cDNA 라이브러리의 구조화
파피아. 로도자이마의 cDNA 라이브러리를 구조화하기 위해서, 세포 붕괴후에, 전체 RNA를 페놀 추출법으로 단리시키고, 파피아. 로도자이마 ATCC96594 균주로부터의 mRNA를 mRNA 분리 키트(클론덱)을 사용하여 정제하였다.
우선, YPD 배지에서의 2일간 배양물 10㎖로부터의 ATCC 96594 균주의 세포를 원심분리(10분 동안 1500×g)하여 수확하고, 추출용 완충액(0.7M KCl를 함유하는 Na-시트레이트/HCl(pH 6.2) 10mM)로 세척하였다. 2.5㎖의 추출용 완충액에서 현탁시킨 후, 1500 ㎏f/㎠로 세포를 프렌치 프레스 균일화기(French Press homogenizer; 일본 도쿄 소재의 오타케 웍스 코포레이션(Ohtake Works Corp.))으로 붕괴시키고, 곧바로 제조자가 명시한 방법을 따라 2배의 체적의 이소겐(니폰 진( Nippon gene))과 혼합하였다. 이러한 단계에서, 전체 RNA 400㎍이 회수되었다.
그다음, 이러한 전체 RNA는 제조자가 명시한 방법에 따라 mRNA 분리 키트(클론텍)을 사용하여 정제하였다. 최종적으로, 파피아. 로도자이마 ATCC 96594로부터의 mRNA 16㎍을 수득하였다.
파피아. 로도자이마로부터 cDNA 종을 수득하기 위해서, 제조자가 명시한 방법에 따라 CapFinder PCR cDNA 구조화 키트(클론텍크)를 사용하였다. 정제된 mRNA의 1㎍을 제 1 스트랜드 합성에 적용된 후, PCR 증식에 적용하였다. PCR에 의한 이러한 증식 후, 1㎎의 cDNA 풀(pool)이 수득되었다.
실시예 2: 파피아. 로도자이마로부터의 2종의 부분적 SOD 유전자의 클로닝
파피아. 로도자이마로부터의 부분적 SOD 유전자를 클로닝하기 위해서, 변성 PCR 방법을 활용하였다. 다른 종으로부터의 공지된 과산화물 디스뮤타제 유전자의 일반 서열을 기준으로, 표 1에서 제시한 바와 같이 뉴클레오티드 서열이 디자인되고 합성된 2개의 혼합 프라이머.
| Sod 1:aarcaycayc aracntaygt naa (센스 프라이머; 서열번호 10) |
| Sod 4:gcccanccng anccytgnac ncc (안티-센스 프라이머; 서열번호 11) |
| (R = A 또는 G; Y = C 또는 T; N = A, C, G 또는 T) |
DNA 폴리머라제로서 ExTaq(다카라 스조)를 사용하고 템플릿으로서 실시예 1에서 수득한 cDNA 풀을 사용하여, 15초 동안의 94℃, 30초 동안의 46℃, 및 15초 동안의 72℃의 25회 사이클의 PCR 방법을 수행한 후, 반응 혼합물을 아가로제 겔 전기전공법에 적용시켰다. 목적하는 길이를 갖는 PCR 밴드를 회수하고 제조자에 의한 방법에 따라 QIA퀵(키아겐)으로 정제한 후, 그다음 pCR2.1-TOPO(인비트로겐(invitrogen))에 라이게이션하였다. 수용력있는 이. 콜라이 TOP 10을 형질전환한 후, 백색 콜로니를 선택하고, 플라스미드를 자동 DNA 분리 시스템(큐라보(Kurabo) PI-50)에 의해 단리시켰다. 서열화 결과로서, 2개의 클론이 서로 상이한 서열을 가지고, 이들의 유추 아미노산 서열이 공지된 SOD 유전자와 독립적으로 유사함이 발견되었다. 이러한 단리된 cDNA 클론을 pSOD614 #2 및 pSOD614 #3으로 지정하고 추가의 연구를 위해 사용하였다.
실시예 3: 파피아. 로도자이마로부터의 게놈 DNA의 단리
파피아. 로도자이마로부터의 게놈 DNA를 단리시키기 위해서, 제조자에 의해 명시된 방법에 따라 QIAGEN 게놈 키트를 사용하였다.
우선, YPD 배지에서의 밤샘 배양물 100㎖로부터의 파피아. 로도자이마 ATCC96594 균주의 세포를 원심분리(10분 동안 1500×g)하여 수확하고, 1mM EDTA를 함유하는 TE 완충액(10mM Tris/HCl (pH 8.0))으로 1회 세척하였다. QIAGEN 게놈 키트의 Y1 완충액 8㎖에서 현탁시킨 후, 라이티카제(lyticase, 시그마(Sigma))를 2㎎/㎖의 농도로 첨가하여, 효소성 변성에 의해 세포를 붕괴시키고, 반응 혼합물을 30℃에서 90분 동안 배양 한 후, 그다음 추출 단계를 수행하였다. 최종적으로, 20㎍의 게놈 DNA를 수득하였다.
실시예 4: 프로브로서 pSOD614 #2 및 pSOD614 #3을 사용함에 의한 사우던 블롯 하이브리드화
사우던 블롯 하이브리드화는 파피아. 로도자이마로부터의 SOD 유전자를 함유하는 게놈 분절을 클로닝하기 위해 수행되었다. 게놈 DNA 2㎍은EcoRI에 의해 분해되고, 아가로제 겔 전기천공법에 적용된 후, 산 처리 및 알칼리 처리를 수행하였다. 변성 DNA는 1시간 동안의 트랜스블롯(transblot)(일본 토쿄 소재의 조토 리카(Joto Rika))를 사용하여 나일론 막(아메샴 소재의 하이본드(Hybond) N+)으로 이동시켰다. DNA는 나일론 막으로 이동되어 열 처리(80℃, 90분)으로 고정되었다. DIG 다중프라이머화 방법(뵈링거 만하임)으로 템플릿 DNA(EcoRI 분해된 pSOD614 #2 및 pSOD614 #3)을 라벨링하여 프로브를 준비하였다. 제조자에 의해 명시된 방법으로 하이브리드화를 수행하였다. 결과적으로, 하이브리드화 밴드가 pSOD614 #2로부터 제조된 프로브에 대해 7.5 킬로베이트(kb)의 길이로 가시화되고, pSOD614 #3에서 제조된 프로브에 대해서는 8.0 킬로베이트(kb)의 길이로 가시화되었다.
실시예 5: 서열이 서로 상이한 SOD 유전자를 함유하는 게놈 분절의 클로닝
게놈 DNA 4㎍을EcoRI로 분해하고, 아가로제 겔 전기천공법에 적용시켰다. 그다음, 길이가 7 내지 9 kb인 DNA를 투석막을 사용함으로써 종래의 용리 방법에 의해 회수하였다. 정제 DNA를 1㎍의EcoRI-분해되고 16℃에서 CIAP(calf intestine alkaline phosphatase)-처리된 λZAPII(스트라타진)에 라이게이션시키고, 기가팩 III 골드 패키징 추출물(스트라타진)로 팩키징하였다. 팩키징된 추출물을E.coliXL Blue MRF 균주에 감염시키고, LB 한천 배지상에 쏟아놓은 NZY 배지로 덮었다. 약 6000개의 플라크를, 프로브로서EcoRI-분해된 pSOD614#2 및 pSOD614#3을 사용하여 스크리닝하였다. 6개의 플라크는 라벨링된 pSOD614#2 프로브에 하이브리드화하였고, 2개의 플라크는 라벨링된 pSOD614#3 프로브에 하이브리드화하였다. 그다음, 하이브리드화 플라크를 제조자(스트라타진)에서 명시한 방법에 따라 생체내 절단 프로토콜에 적용하였다. 6개의 pSOD614#2-하이브리드화 플라크로부터 단리된 플라스미드 하나는 sod1 및 sod4 프라이머를 사용하여 PCR 분석한 결과로서 pSOD614#2와 동일한 분절을 가지는 것을 발견하였다. 이러한 플라스미드는 pSOD703으로 명명되었다. 2개의 pSOD614#3-하이브리드화 플라크로부터 단리된 플라스미드 2개는, sod1 및 sod4 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 한 결과, pSOD614 #3의 것과 동일한 분절을 가지는 것으로 발견되었다. 플라스미드중 하나는 pSOD626으로 명명하고, 추가적인 연구를 위해 사용되었다.
실시예 6: 파피아. 로도자이마로부터 수득된 2종의 MnSOD 유전자의 서열 분석
완전한 뉴클레오티드 서열은 프라이머-워킹(primer-walking) 공정으로pSOD703 및 pSOD626을 서열화함으로써 결정되었다. pSOD703에 잠복한SOD1유전자 및 pSOD626상에 잠복한SOD2유전자에 대한 뉴클레오티드 및 이들의 유추 아미노산 서열은, 서열 목록 리스트에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 5 및 서열번호 7로 목록화하였다.
SOD1및SOD2유전자의 유추 아미노산 서열 둘다는, BLAST 분석 결과, 다른 종으로부터 수득된 공지된 MnSOD와 일치하였지만, Cu/ZnSOD 또는 FeSOD와는 일치하지는 않았다(알철(Altschul, S. F.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990] 참고).
SOD1유전자는 7개의 인트론 및 8개의 엑손을 가졌다. 그리고, 이들의 유추 개방 리딩 프레임은 223개의 아미노산으로 구성되었다. 한편,SOD2유전자는 10개의 인트론 및 11개의 엑손을 가지고, 이들의 유추 개방 프레임은 199개의 아미노산으로 구성되어 있다. 2개의 단리된 SOD 유전자 사이의 가장 큰 차이점은, 아미노 말단 단부에서의SOD1유전자의 연장 영역으로, 이들의 서열은 미토콘드리아로의 전이 펩티드로서 작용해야만 한다.
사실상, 슈뢰더(Schreoder) 등은 2종의 SOD가 파피아. 로도자이마내의 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기천공(PAGE)의 염색도에서 KCN- 및 H2O2-내성 SOD로서 검출되었음을 보고하였다. 이들은, 2종의 MnSOD가 응집체 또는 이소자임(isozyme)으로서 나타났지만, 이들의 정확한 특성 및 이들의 세포하부적 위치에 대해서는 언급하고 있지 않다고 평하고 있다. 하기 부분에서 기술하는 바와 같이, 2종의 이러한KCN- 및 H2O2-저항 SOD(즉, MnSOD)는SOD1및SOD2유전자의 생성물임을 명확히 하고 있다. '발명의 구성'편에서 기술한 바와 같이, 대부분의 진핵세포는 이들의 세포내부 위치에서 상이한 종의 SOD를 갖는다(미토콘드리아 분절내 MnSOD 및 세포질 분절내 Cu/ZnSOD). 2종의 MnSOD가 상이한 세포하부 위치에서 작용하는 것이 첫 번째 예이다.
실시예 7:
SOD1
및
SOD2
유전자에 대한 붕괴 플라스미드의 구조화
'발명의 구성' 부분에서 기술한 바와 같이, 약제 내성 마커 카세트가 잠복해있는 플라스미드는, G418 내성 구조 유전자를 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로제나제(GAP)의 터미네이터 및 프로모터 유전자 사이에 삽입하고,KpnI- 및HindIII-분해된 pUC19에 라이게이션시킴으로써 구조화되었다. 이러한 플라스미드는 pUC-G418로 명명하고, 추가의 연구를 위해서 사용되었다. 동일한 재조합을 위해 사용된 유전자 분절로서,SOD1및SOD2유전자의 부분적 분절이 서열이 표 2에 제시되어 있는 PCR 프라이머를 사용하는 PCR 방법에 의해 시험관내에서 합성되었다.
| sod 14: ggtacctccg atgataggaa tgtgag (센스 프라이머)(서열번호 12) |
| sod 15: gaattcagtt caacggagga ggacac(안티센스 프라이머)(서열번호 13) |
| sod 47: gaattcggag gaggacacat caaccg(센스 프라이머)(서열번호 14) |
| sod 48: ggtacctgta ctggaggtag aaagcg(안티센스 프라이머)(서열번호 15) |
PCR 조건은 하기와 같다: 15초 동안의 94℃, 30초 동안의 50℃ 및 15분 동안의 72℃로 25회 사이클. 템플리트로서, 실시예 3에서 수득한 게놈 DNA 0.1㎍을 사용하였고, DNA 폴리머라제로서 ExTaq를 사용하였다. 프라이머로서 sod14 및 sod15를 사용한 PCR로부터 수득된 SOD1의 부분 분절, 및 sod47 및 sod48를 사용한 PCR로부터 수득될 수 있는 부분적 SOD2를 각각 증폭시켰다. 각각 증폭된 분절 0.65kb을 회수하고, 제조자가 명시한 프로토콜에 따르는 pCR2.1-TOPO(인비트론)에서 클로닝하였다. 이.콜라이 TOP10 형질전환체의 백색 콜로니로부터의 6개의 독립적 클론을 선택하고, 플라스미드를 이러한 형질전환체로부터 제조하였다. 제한 분석 및 서열화의 결과로서, 부분적SOD1유전자를 갖는 클론 1개를 추가의 연구를 위해 선택하고, pSOD715로서 명명하였다. 유사한 방법으로, 부분적SOD2유전자를 갖는 클론 1개를 선택하고 pSOD826으로 명명하였다.
그다음, pSOD715 및 pSOD826를EcoRI 및KpnI으로 분해하고, 수득된 분절 0.65kb을 QIA퀵 프로토콜을 사용하여 정제하고,EcoRI- 및KpnI-분해된 pUC19-G418에 라이게이션시켰다. 이. 콜라이 DH5α형질전환체의 암피실린 내성 콜로니로부터의 6개의 독립적 클론을 선택하고, 이러한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하였다. 제한 분석 및 서열화의 결과로서, 부분적SOD1이 G418 내성 카세트에 융합된 클론 1개를 수득하고, pSOD/G717으로 명명하였다. 유사한 방법에서, 부분적SOD2가 G418 내성 카세트에 융합된 클론 1개가 수득되었고, pSOD/G828로 명명하였다.
실시예 8: 바이오리스틱 방법에 의한 파피아. 로도자이마 ATCC96594의 형질전환
형질전환 프로토콜은 존슨(Johnston) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology, 53; 147-153, 1996]에 기술된 방법을 따랐다. 호스트 균주로서, 파피아.로도자이마 ATCC 96594를 YPD 배지에서 정지상에 배양시켰다. 육즙을 원심분리시킨 후, 멸균수로 세포를 10배가 되도록 하고, 200㎕의 세포 현탁액을 100㎍의 제네시튼 및 0.75M의 만니톨 및 소르비톨을 함유하는 YPD 배지에 분사하였다. pSOD/G717 및 pSOD/G828의 원형 DNA 5㎍을 0.9㎛의 금 입자 1.5㎎상에 코팅시키고, 바이오리스틱 형질전환법을 위한 공여체 DNA로서 사용하였다. 100개의 제네티신-재성 클론을 20℃에서 1주일 동안 배양한 후 수득하였다. 이러한 형질전환체중 4개를 선택하고, 이로부터 크로모좀을 제조하였다. 형질전환체중 하나는 PCR 및 사우던 블롯 하이브리드화 분석에 의해 크로모좀SOD1또는SOD2유전자의 붕괴된 구조를 가지는 것으로 확인되었고, 추가의 연구를 위해서 사용하였다.
실시예 9:
SOD1
및
SOD2
붕괴체를 위한 후보자로부터 수득한 조질의 추출물을 사용함에 의한 천연 PAGE의 염색 활성도
ATCC96594의 바이오리스틱 형질전환법으로부터 수득된 ATCC96594 균주 및 후보자를 2일동안 YPD 배지에서 배양시키고, 4℃에서 3000×g으로 10분 동안 원심분리하여 수확하였다. 트리스-HCl 완충액(10mM/pH 8.0)로 세척한 후, 세포를 동일한 완충액으로 10배가 되도록 하였다. 1500㎏/㎠에서 프렌치 프레스 균질화기(오타케 웍스)로 세포를 붕괴시키고, 균질화된 분획을 15000rpm으로 미세원심분리(토미( TOMY), MRX150)하여, 조질의 추출물을 제조하였다.
이렇게 수득된 조질의 추출물의 단백질 농도는 피어스(PIERCE, 미국 락포드 소재)의 BCA 단백질 분석 시약으로 측정하였다. 단백질 300㎍에 상응하는 조질의 추출물의 체적을 슈뢰더 등의 문헌[J. Gen. Microbiol., 139, 907-912, 1993]에서기술한 방법에 따라 천연 PAGE에 적용하였다. 염색 활성도의 방법은 플로헤(Flohe) 등의 문헌[Methods in Enzymology, 105, 93-104, 1984]의 방법을 참고하였다.
염색 활성도의 결과는 하기 도 1에 묘사하였다. 모 균주, ATCC96594의 추출액에서, 두 개의 밴드가 어두운 배경에서 SOD 활성을 갖는 형질전환체 밴드와 같이 관찰되었다. 대조적으로,SOD1 유전자가 붕괴된 ATCC96594::pSOD/G717 균주는 천연 PAGE내의 고도의 유동성을 갖는 활성 밴드가 결핍되어 있고,SOD2 유전자가 붕괴된 ATCC96594::pSOD/G828 균주는 천연 PAGE내의 낮은 유동성을 갖는 활성 밴드가 결핍되어 있다. 이러한 결과로부터, 파피아. 로도자이마의 조질의 추출물내에 존재하는 2종의 MnSOD가SOD1 및SOD2 유전자의 생성물이고, 천연 PAGE내의 고도의 유동성 및 낮은 유동성을 갖는 SOD 종이 각각SOD1 및SOD2 유전자의 생성물에 상응함이 발견되었다.
실시예 10: 파피아 로도자이마로부터의 부분적 카탈라제(CAT) 유전자의 클로닝
파피아. 로도자이마로부터 부분적 CAT 유전자를 클로닝하기 위해서, 변성 PCR 방법이 활용되었다. 그밖의 종으로부터의 공지된 카탈라제 유전자의 일반적인 서열을 기준으로 하는 경우, 표 3에서 도시한 바와 같이, 뉴클레오티드 서열이 디자인되고 합성된 2개의 혼합 프라이머.
| Cat2: mgnttytcna cngtnggngg nga(센스 프라이머)(서열번호 16) |
| Cat 5: ckrtgnckyt gngtrtcngg rta(안티센스 프라이머)(서열번호 17) |
| (M = A 또는 C; N = A, C, G 또는 T; Y = C 또는 T; K = G 또는 T; R = A 또는 G) |
DNA 폴리머라제로서 ExTaq(타카라 스조)를 사용하고 템플릿트로서 실시예 3에서 수득한 게놈 DNA를 사용하며, 15초 동안 94℃, 30초 동안 45℃ 및 15 초 동안 72℃의 25회 사이클의 PCR 반응한 후에, 반응 혼합물을 아가로제 겔 전기천공법에 적용하였다. 길이가 1.0 kb인 PCR 밴드를 회수하고 제조자에 의한 방법에 따르는 QIA퀵(키아겐)으로 정제하고, 그다음 pCR2.1-TOPO(인비트로겐)에 라이게이션시켰다. 수용능력있는 이.콜라이 TOP10을 형질전환시킨 후, 6개의 백색 콜로니를 선택하고, 플라스미드를 자동화 DNA 분리 시스템으로 단리시켰다. 서열화의 결과로서, 2개의 클론이, 유추 아미노산이 공지된 CAT 유전자와 유사한 서열을 갖는 것을 발견하였다. 이러한 단리된 DNA 크론중 하나를 pCAT702으로 지정하고 추가의 연구를 위해 사용하였다.
실시예 11: CAT 유전자를 함유하는 게놈 분절의 클로닝
실시예 4와 유사한 방법에서, 프로브로서 pCAT702를 사용하여 사우던 블롯 하이브리드화 연구를 수행하였다. 결과로서, 크기가 9kb 내지 23 kb인 하이브리드화 밴드가 관찰되었다. 그다음, 4㎍의 게놈 DNA를EcoRI로 분해시키고, 아가로제 겔 전기천공법에 적용시켰다. 그다음, 투석막을 사용함으로써 종래의 용리 방법으로 길이가 9 내지 23 kb인 DNA를 회수하였다. 정제된 DNA를 16℃에서 밤새EcoRI-분해되고 CIAP(Calf intestine alkaline phosphatase) 처리된 λDASHII(스트라타진) 1㎍에 라이게이션시키고, 기가팩 III 골드 팩키징 추출물(스트라타진)으로 팩키징하였다. 패키징한 추출물을 이.콜라이 XL1Blue MRA(P2) 균주에 감염시키고, LB 한천 배지상에 쏟은 NZY 배지로 덮었다. 프로브로서EcoRI-분해된 pCAT702를사용하여, 약 8000개의 플라크를 스크리닝하였다. 6개의 플라크를 라벨링 pCAT702 프로브에 하이브리드화시켰다. λDNA를 각각의 λ 클론으로부터 제조하고, Cat2 및 Cat5 프라이머를 사용한 PCR 및 서열 분석의 결과로서, 6개의 클론중 4개가 pCAT702의 삽입부에 대해 동일한 분절을 함유함을 발견하였다. CAT 유전자에 대한 부분적 뉴클레오티드 및 이들의 유추 아미노산 서열은, 서열 목록 리스트에서 서열번호 3 및 서열번호 9번으로 목록화하였다.
실시예 12: CAT 유전자에 대한 붕괴 플라스미드의 구조화
실시예 7와 유사한 방법에서, CAT 유전자를 위한 붕괴 플라스미드를 구조화하였다. 우선, SacI 연결기를 pUC19-G418의HindIII 부위에 삽입하고, 여기서 G418 내성 카세트의 터미네이터 영역을 배치하고, 제한 분석 결과, G418-한정 카세트의 단부에 SacI 부위를 갖는 pUC19-G418Sa가 수득되었다. 그다음, pUC19-G419Sa로부터 유도된KpnI- 및SacI-분절을KpnI- 및SacI-분해된 pCAT702에 라이게이션시키고, 부분적 게놈CAT유전자가 G418-내성 카세트에 융합된 pCAT/G706을 수득하였다.
실시예 13: 공여체 플라스미드로서 pCAT/G706을 사용함에 의한 파피아. 로도자이마 ATCC96594의 형질전환
실시예 8과 동일한 방법으로, 파피아. 로도자이마 ATCC96594를CAT-붕괴 플라스미드, pCAT/G706으로 형질전환시켰다. 20℃에서 1주일 동안 배양한 후, 100개의 제네티신-내성 클론을 수득하였다. 이러한 형질전환체중 4개를 선택하고, 크로모좀을 이들로부터 제조하였다. 형질전환체중 하나는 PCR 및 사우던 하이브리드화분석에 의해 크로모좀 CAT 유전자의 붕괴된 구조를 가지는 것으로 확인되었고, 추가의 연구를 위해 사용되었다.
그다음, CAT 붕괴체를 위한 2개의 후보자를, 박테리아 형태학 연구에서 종종 사용되는 카탈라제 시험으로 특징화하였다. 파피아. 로도자이마의 세포 덩어리를 3%의 H2O2에 침지시키고, 그다음 이산소의 발생을 관찰하였다. O2발포화가 곧 발생하는 것은, ATCC 96594 세포가 이러한 카탈라제 시험에 적용되는 경우에 확인되었지만, ATCC 96594::pCAT/G706 돌연변이체를 H2O2용액에 침지시키는 경우에는, 오랜 시간 지연된 후 O2발포화되었다. 이러한 결과로부터, CAT 유전자의 붕괴가 확인되었고, 잔류하는 약한 활성은 파피아. 로도자이마내에 퍼옥시다제와 같은, H2O2를 제거하는 반응을 촉매작용하는 다른 작용자의 존재를 나타낸다.
실시예 14: 이들의 아스탁산틴 제조를 위한 파피아. 로도자이마로부터 유도된
SOD
1,
SOD
2 및 CAT 붕괴체의 평가
아스탁산틴 제조에 대한SOD1,SOD2 및 CAT 유전자의 유전자 붕괴 효과는, 플라스크를 와동시키면서 YPD 배지내에서 배양함으로써 평가되었다. YPD 한천상에서 성장한 세포를 YPD 배지에서 현탁시키고, 일부분의 세포 현탁액을 500㎖ 들이의 차폐 플라스크내의 YPD 배지 50㎖에 접종하였다. 세포는 84시간 동안 20℃에서 200 rpm으로 성장시켰다. 적당한 시간 간격 후에, 3㎖의 육즙을 취하여 세포 수율, 글루코즈의 소모량 및 아스탁산틴 함량에 대해 분석하였다.
0.45㎛ 셀룰로즈 아세테이트+니트로셀룰로즈 막(HAWP04700, 미국 베드포드소재의 밀리포어(Millipore))을 통해 여과하고 80℃에서 밤새 가열한 후에 세포의 중량을 측정함으로써, 세포 수율을 660nm의 광학 밀도 및 건조 세포 중량으로서 측정하였다. 파피아. 로도자이마의 아스탁산틴 함량은, 유리 비드에 의한 붕괴에 의해 파피아. 로도자이마의 세포로부터 카로티노이드를 추출한 후에 HPLC 방법에 의해 측정하였다. 추출한 후, 내부 표준물질로서 5㎖의 아세톤/BHT/적당한 농도의 비신 함유수를 첨가하였다. 하기 HPLC 시스템에 따라, 아스탁산틴 함량에 대해 상청액을 평가하였다.
HPLC 컬럼; YMC-Pak ODS-A(6㎜, 150㎜)
온도; 상온
용리액; 아세토니트릴/메탄올/이소프로판올(85/10/5)
주입량; 10㎕
유동 속도; 2.0㎖/분
검출; 471㎚에서의 UV
84시간 배양액으로부터 수득한 결과를 하기 표 4에 요약함.
| 균주 | 총 카로티노이드(㎎/g-건조-세포) | 아스탁산틴(㎎/g-건조-세포) |
| ATCC 96594 | 0.169 | 0.111 |
| ΔSOD1 | 0.259 | 0.146 |
| ΔSOD2 | 0.202 | 0.129 |
| ΔCAT | 0.229 | 0.144 |
SOD1 및SOD2 붕괴체는 이들의 호스트 균주인 ATCC 96594에 비해 전체 카로티노이드 뿐만 아니라 아스탁산틴에 대한 높은 생산량을 나타내었다. 특히,SOD1 붕괴체는 각각 53.3% 및 31.5%로 카로티노이드 및 아스탁산틴 생산도가 상당히 증가함이 관찰되었다.
SOD1은 아미노 말단 단부에서 유추 전이 펩티드 서열로부터 판단된 미토콘드리아 효소인 것으로 보이고, 과산소 라디칼, 즉 미토콘드리아에서 호흡 사슬 동안 발생하는 일종의 활성 산소 종을 제거하는 작용을 해야만 한다. 이러한 결과는, 아스탁산인 생산이 세포내 활성 산소종의 발생에 의해 자극되어, 활성 산소 종-억제 인자의 천연 작용자, 즉SOD1의 부족을 보상한다는 것을 제안하였다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 붕괴된 재조합 유기체를 제조함으로써, 카로티노이드, 특히 아스탁산틴을 대량으로 생산할 수 있게 된다.
Claims (28)
- 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 대해 특이적인 붕괴 카세트(disruption cassette)의 보조에 의해 실질적으로 붕괴된 재조합 유기체를 배양하고, 배양물로부터 카로티노이드를 회수함을 포함하는 카로티노이드의 제조 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 재조합 유기체의 호스트 유기체가 모네라(Monera)계, 원생생물계 또는 균류계에 속하는 방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,상기 재조합 유기체의 호스트 유기체가 에르위니아(Erwinia), 로도박테르(Rhodobacter), 믹소코쿠스(Myxococcus), 플라보박테르(Flavobacter), 파라코쿠스(Paracoccus), 시네쵸코쿠스(Synechococcus), 시네쵸시스티스(Synechocystis), 아그로박테리움(Agrobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 하에마토코쿠스(Haematococcus), 듀날리엘라(Dunaliella), 파피아(Phaffia), 크산토필로마이세스(Xanthophyllomyces), 뉴로스포라(Neurospora), 로도토룰라(Rhodotorula), 블라케슬레아(Blakeslea) 또는 피코마이세스(Phycomyces) 종에 속하는 방법.
- 제 3 항에 있어서,상기 재조합 유기체의 호스트 유기체가 파피아. 로도자이마(P. rhodozyma) 균주인 방법.
- 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자가 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제인 방법.
- 하나 이상의 활성 산소 종-억제 인자에 대한 유전자가 상기 유전자에 대해 특이적인 붕괴 카세트의 도입에 의해 실질적으로 붕괴된 것을 특징으로 하는, 카로티노이드를 생산가능한 재조합 유기체.
- 제 6 항에 있어서,재조합 유기체의 호스트 유기체가 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속하고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세스의 종에 속하는 재조합 유기체.
- 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,붕괴될 활성 산소 종-억제 인자가 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제인 재조합 유기체.
- 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 DNA 서열의 일부분과 실질적으로 동일한 부분적 핵산 서열 및 선택성 마커 유전자를 포함하는, 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드합성에 효과적인 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 유전자를 붕괴하기 위한 붕괴 카세트.
- 제 9 항에 있어서,상기 유기체가 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속하고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세스의 종에 속하는 붕괴 카세트.
- 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,붕괴될 활성 산소 종-억제 인자가 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제인 붕괴 카세트.
- 제 9 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 부분적 뉴클레오티드 서열이, 붕괴 카세트가 도입되는 유기체의 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 DNA 서열의 적어도 일부분과 동일한 붕괴 카세트.
- 제 12 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 DNA 서열의 일부분에 실질적으로 동일한 부분적 뉴클레오티드 서열이, 상응하는 작용성 유전자에 비해 하나 이상의 삭제부 및/또는 변이부를 포함하는 붕괴 카세트.
- 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드합성에 효과적인 활성 산소 종-억제 인자를 코딩하는 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항에 있어서,상기 유기체가 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속하는 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,상기 종이 모네라계, 원생생물계 또는 균류계에 속하고, 보다 바람직하게는 에르위니아, 로도박테르, 믹소코쿠스, 플라보박테르, 파라코쿠스, 시네쵸코쿠스, 시네쵸시스티스, 아그로박테리움, 스트렙토마이세스, 하에마토코쿠스, 듀날리엘라, 파피아, 크산토필로마이세스, 뉴로스포라, 로도토룰라, 블라케슬레아 또는 피코마이세 스의 종에 속하는 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서,파피아. 로도자이마의 유기체에 근원을 둔 서열인 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자가 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제인 재조합 DNA 서열.
- 제 18 항에 있어서,서열이 서열번호 1 또는 서열번호 4와 동일할 수 있거나, 서열번호 1 및 서열번호 4의 서열 둘다와 재조합하기에 충분하도록 서열번호 1 또는 서열번호 4의 서열에 대해 높은 상동성을 가지는 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자가 세포질 과산화물 디스뮤타제인 재조합 DNA 서열.
- 제 20 항에 있어서,서열이 서열번호 2 또는 서열번호 6과 동일할 수 있거나, 서열번호 2 및 서열번호 6의 서열 둘다와 재조합하기에 충분하도록 서열번호 2 또는 서열번호 6의 서열에대해 높은 상동성을 가지는 재조합 DNA 서열.
- 제 14 항 내지 제 17 항중 어느 한 항에 있어서,활성 산소 종-억제 인자가 카탈라제인 재조합 DNA 서열.
- 제 22 항에 있어서,서열이 서열번호 3 또는 서열번호 8과 동일할 수 있거나, 서열번호 3 및 서열번호 8의 서열 둘다와 재조합하기에 충분하도록 서열번호 3 또는 서열번호 8의 서열에 대해 높은 상동성을 가지는 재조합 DNA 서열.
- 목적 단백질의 코딩 영역 업스트림에 전이 펩티드 코딩 영역을 포함하는 재조합 DNA 분절.
- 제 24 항에 있어서,목적 단백질이 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제인 재조합 DNA 분절.
- 적당한 재조합 호스트 유기체내에서 제 24 항 또는 제 25 항에 따른 재조합 DNA 분절을 발현시킴을 포함하는, 미토콘드리아내에 목적 단백질을 배치하기 위한 방법.
- 카로티노이드를 생산가능한 유기체내의 카로티노이드합성에 효과적인 활성 산소종-억제 인자에 대한 유전자를 클로닝하기 위해 프로브 또는 프라이머로서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드.
- 제 27 항에 있어서,활성 산소 종 억제 인자가 미토콘드리아 과산화물 디스뮤타제(SOD), 세포질 과산화물 디스뮤타제(SOD) 및/또는 카탈라제인 폴리뉴클레오티드.
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