TWI279441B - Recombinant production of carotenoids, particularly astaxanthin - Google Patents

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1279441 A7 五、發明說明（1 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ::明係關於類胡蘿葡素’特別是蝦黃素的重组產製， 及其有用的生物物質。 已知蝦黃素分部在各U樣的生物中，像是動物（例如鳥 ;广紅鹤和朱鷺，以及魚類，像是虹鱒魚和經魚)，藻 j和微生物。亦承認蝦黃素具有對抗活性氧㈣抗氧化性 二並預期大邵份的類胡蘿萄素，應用在藥學用途上，保 ^活細胞對抗一些疾病，像是癌症。此外，從工業應用的 觀點來看，特別是在諸如經魚之類的養殖魚業上，對於做 馬著色劑之蝦黃素的需求正持續增加，因爲蝦黃素賦與動 物特殊的橘紅色，並在市場上引起消費者的興趣。 已知紅峰法菲亞酵母㈣affla rh〇d〇zy叫是產生胡蘿荀素 的酵母菌品系，其特別產生蝦黃素。與其他產生胡蘿剪素 的酵母菌不同，紅酵母屬（Rh〇d〇t〇rula)，、红酶法菲亞酵母 可使一些諸如D-葡萄糖之類的糖類發酵。從工業應用的 點來看，這是一個很重要的特徵。在最近的分類學研究 ，揭露了紅酶法菲亞酵母的有性周期，並將其遠距刺激^ 形的狀態命名爲枝狀葉黃素黴（Xanth〇phyll〇myces dendr二 rhous)(W.I· Golubev; Yeast 11，1〇1-110, 1995)。已經經營 些攸紅酶法菲亞酵母中獲得瑕黃素之高生產者的品系 良研究’但這類努力在最近十年中，已經受到使用傳統 突變生成作用和原生質體融合之方法的限制。最近，Wery 等人發展出使用紅酶法菲亞酵母的宿主載體系統，其中 多副本之方式’在核糖體DNA的地方，使用不可-複製的 體’接合到紅酶法菲亞酵母的基因組上（Wery等人 觀 中 變 了 改 的 以 質 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441

Gene，184，89-97 *- ------------ (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁> 載體，獲得紅酶法菲亞酵:Verd°_人報告了更多改良的 «素的基因==的轉化物’以及其三個產生胡 ,^,,.，、、届馬傕化從焦磷酸拢牛兒基拢牛兒酯至 胡維μ之反應的酵素（_專利w_在不久 的將來，將增加请值 、 、 堤傳私万法對紅酶法菲亞酵母之品系改 艮研冗的重要性，突破由傳統方法達到的生產力。 i同上述’蝦頁素具有抗氧化的特性，且該特徵似乎在 活體内，對於保護對抗活性氧物種，像是在活細胞中持續 產生：02.、H2〇2和0Η·，具有重要的角色。入時人從紅 酶法菲亞酵母中，藉著在傳統的化學突變生成作用之後， 砥'睪抗霉素-敏感性品系，而獲得蝦黃素的高生產者…，〜 Η·等人，Appl. Env. Microbiol·，55(1)，116-124，1989)。已知 .¾. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 抗霉素爲在細胞色素間的呼吸鏈之抑制劑（Lucc_ him，G·等人，Mol Gen Genet，177，139_，197力，並在這 類抗霉素-敏感性突變種中增強色素化作用。因爲在複合 物刺激類胡蘿蔔素形成時，阻斷主要的呼吸鏈，而導致活 性氧物種產生（An，G-Η等人，Appl. Env· Microbiol.，55, 116·124，1989)。確實，在生長培養基中加入〇2 ·生產者， 杜酿（duroquinone)，增加了總類胡蘿蔔素的内含量（主要的 類胡蘿蔔素是蝦黃素），以及出現在紅酶法菲亞酵母中之葉 1C素的相對含量，同時活性氧物種_猝滅因子甘露糖醇揭露 了 该效應（Schroeder，W.A.等人，J. Gen. Microbiol.，139 907 -912，1993)。這些結果促使作者推測在紅酶法菲亞酵母中 ，蝦黃素的抗氧化劑特性。事實上，是在指數生長期之後 5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 """ B7 五、發明說明（3 ) ’當完全謗發呼吸活性時，便刺激蝦黃素產生。此外，在 培養基中加入呼吸受酶質，如乙醇，在紅酶法菲亞酵母中 增強了瑕黃素的產製（Gu，W-L·等人，j Ind Micr〇M〇i

Biotechnol.，19, 114-117, 1997)。雖然 Schroe-der 等人嘗試藉 著比較在親代品系和蝦黃素之抗霉素_敏感性高生產者之間 的差異，來決定超氧物歧化酶（S0D)活性與過氧化氫酶的相 互關係，該過氧化氫酶係在紅酶法菲亞酵母中做爲天然的 活性氧物種-猝滅因子，但並未觀察到在活體外活性的直接 關連。 根據本發明，提供活性氧物種_猝滅因子（群）的基因和酵 素，像是SOD和過氧化氫酶，其爲可用來改善類胡蘿蔔素 ，特別是蝦黃素之產製方法的生物物質。本發明涉及選殖 並定出編碼粒線體和細胞質S0Ds和過氧化氫酶的基因。本 發明亦涉及足出在紅酶法菲亞酵母中導致基因中斷的酵素 特徵。可藉著在適當的培養基中，在適當的培養條件下Y 培養這類轉化物，證實其對中斷胡蘿蔔素產生作用的影響。 更特定而言，本發明提供產製類胡蘿蔔素的方法，^括 培養重組的生物，其一或多個活性氧物種_猝滅因子（群）的 基因，藉著對該基因有專一性之中斷卡匣的幫助，實質上 已將其中斷，並從該培養物中回收類胡蘿蔔素。該生 物的宿主生物，屬於無核原蟲類（M〇nera)、原生生物類 (Prohsta)或眞菌類（Fungi)。該重組生物的較佳宿主生物， 可屬於歐又氏菌屬（Erwinia)、紅色桿菌屬（Rh〇d〇bacter)、 黏液菌屬（Myxococcus)、黃样菌屬（Flav〇bacter)、副球菌屬 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 -----------------I--—旬· I —------ (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) -6 - 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（4 ) (Paraco-ccus)、赛内奇球菌屬（Synech〇coccus)、赛内奇囊球 菌屬（Synecho-cystis)、土壤捍菌屬（Agrobacterium)、鏈黴 囷屬（Streptomyces)、血液球菌屬（Haematococcus)、多納利 菌屬（Dunaliella)、法菲亞酵母菌屬（phaff⑷、葉黃素黴屬 (Xanthophyllomyces)、鏈抱黴屬（Neur〇sp〇ra)、紅酵母屬 (Rhodotorula)、布拉黴屬（Blakeslea)或藻狀菌屬（phyc卜 myces)。最佳的是，該宿主生物爲紅酶法菲亞酵母之品系。 活性氧物種-猝滅因子（群）是粒線體超氧物歧化酶（s〇D)， 細胞質超氧物歧化酶（SOD)，及/或過氧化氳酶。 本發明亦提供可產製類胡蘿蔔素的重組生物，其特徵在 於藉著導入對該基因有專一性之中斷卡匣的幫助，實質上 使至少一個活性氧物種-猝滅因子中斷。該被中斷的活性氧 物種-猝滅因子（群）爲粒線體超氧物歧化酶（g 0D)，細胞質超 氧物歧化酶（SOD)，及/或過氧化氫酶。 本發明更提供可用來製備本發明之重組生物的中斷卡匣 ’其使編碼在可產製類胡蘿蔔素之生物中有效率的活性氧 物種-猝滅因子的基因中斷，該中斷卡匣包括實質上與編碼 活性氧物種-猝滅因子之DNA序列的一部份相同的部份核甞 酸，以及可選擇標記。爲了建構該中斷卡匣，標靶生物可 屬於播核原蟲類、原生生物類或眞菌類，較佳的是歐文氏 菌屬、紅色桿菌屬、黏液菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、赛 内奇球菌屬、赛内奇囊球菌屬、土壤捍菌屬、鏈黴菌屬、 血液球菌屬、多納利菌屬、法菲亞酵母菌屬、葉黃素黴屬 、鏈抱黴屬、紅酵母屬、布拉黴屬或藻狀菌屬。該被中斷 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) • n i amee mmMM n mime I ·ϋ n n II ϋ I ♦ A7

1279441 五、發明說明（5 ) 的活性氧物種-猝滅因子（群）爲粒線體超氧物歧化酶（s〇D)， 細胞質超氧物歧化酶(S〇D)，及/或過氧化氫酶。 田在本文中説多核菩酸或多肽序列（A)與另一個序列（^)爲 只％上相同的時’則序列（A)與序列至少有75%相同，較 佳的是85%相同，像是與序列（B)至少有％。〆。相同。 此外，本發明提供在可產製類胡蘿蔔素之生物中有效率 <編碼活性氧物種-猝滅因子的重組DNA序列。該DNA序列 可以起源自屬於無核原蟲類、原生生物類或眞菌類的生物 ，較佳的是歐文氏菌屬、紅色样菌屬、黏液菌屬、黃样菌 屬、副球菌屬、赛内奇球菌屬、赛内奇囊球菌屬、土壤桿 菌屬、鏈Μ菌屬、血液球菌屬、多納利菌屬、法菲亞酵母 菌屬、葉黃素黴菌、鏈抱黴屬、紅酵母屬、布拉黴屬或藻 狀菌屬。特佳的生物是紅酶法菲亞酵母。由該重組DNΑ序 列編碼之活性氧物種·猝滅因子，可以是粒線體超氧物歧化 酶，細胞質超氧物歧化酶，及/或過氧化氫酶。 可藉著序列識別1或4號確認編碼粒線體超氧物歧化酶的 重組DNA序列，或其可與序列識別1或4號之序列具有高度 的同種性’足以與序列識別1和4號之序列重組。可藉著序 列識別2或6號來確認編碼細胞質超氧物歧化酶的重組dna 序列，或其可與序列識別2或6號之序列具有高度的同種性 ，足以與序列識別2和6號之序列重組。亦可藉著序列識別3 或8號來確認編碼過氧化氫酶的重組dnA序列，或其可與序 列識別3或8號之序列具有高度的同種性，足以與序列識別3 和8號之序列重組。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 丨丨丨—如 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 0 1 一五、發明說明（） 在本發明中，可適切地使用下列雜交和沖洗條件的任何 組合，來確認同種的多核誓酸序列： 高嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖動。 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖洗i 次I5分鐘，接著在室溫下以〇1χ SSC，0.5% SDS沖洗另一次15分鐘。 低嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/ ¾升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在37°C下培養過夜，並溫和地搖動。 低嚴格度沖洗： 在室溫下以0.1X SSC，0.5% SDS沖洗 1次15分鐘。 可藉著改變進行雜X反應的溫度及/或上述的沖洗條件， 獲得中等嚴格度的條件。 因此，當在本文中説序列（A)對另一個序列（B)具有”高同 ,種性"時，則該序列A與序列B在高嚴格度的條件下雜交（也 就是上述的高嚴格度雜交和沖洗條件），且由該序列A編碼 之多肽或多肽片段具有與由B編碼之多肽相同的活性。 本發明更k供重組的DN A片段，其包括目標蛋白質之密 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ί請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁}

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五、發明說明（8 ) ，像是粒線體SOD或細胞質S0D。該重組wDna序列u本 有編碼過氧化氫酶基因的_部份片段。可使用這些序2 建構該中斷卡E，因爲它們能夠與該酵素之天㈣基群來 重組，而得以專一地中斷該基因（群）。 該重組的DNA序列可以是衍生自屬於無核原蟲類、原生 生物類或眞菌類之生物的DNA序列，較佳的是歐文氏菌屬 、、紅色杯菌屬、黏液菌屬、黃桿菌屬、副球菌屬、赛内奇 球菌屬、㈣奇囊球菌屬、土壤桿菌屬、鍵徽菌屬、血液 球Μ、多納利菌屬、法菲亞酵母菌屬、葉黃素黴屬、鏈 孢黴屬、紅酵母屬、布拉黴屬或藻狀菌屬。特佳的生物是 紅酶法菲亞酵母。由該重組DNA序列編碼的活性氧物種-猝 減因子，可以是粒線體S0D、細胞質SOD及/或過氧化氫酶 重組DNA序列的特定實例，係衍生自紅酶法菲亞酵母的 基因，並選自（i)在序列識別號中陳述的DnA序列；（ii) 由序列識別4或6號確認的那些cDnaS ; (iii)在序列識別i、2 、4或6號中陳述之⑽八序列的同類編碼（is〇c〇ding)或對偶基 因變體；以及（iv)在序列識別1、2、4或6號中陳述之DNA序 列’帶有一或多個核苷酸（們）添加、插入、刪除及/或取代 ’並編碼具有該酵素活性之多肽的衍生物。該重組的DNA 序列亦可具有下列特徵：（a)其所編碼之酵素，具有選自包 括在序列識別5和7號中描述之那些的胺基酸序列，或（b)其 編碼該酵素之變體，選自⑴對偶基因變體，和（Η)具有一或 多個胺基酸添加、插入、刪除及/或取代，並具有所陳述之 酵素活性的酵素。 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵G x 297公楚） -----------AW (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂i Φ. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 五、發明說明（9 :在2中使用"對偶基因變體"時，意 個對偶基因中的任-個上，具有至少一個突變， 像疋紅酶法菲亞酵母、枝 〃、素锨及其類似物。特定基 =兩個對偶基因，與相同的特性和特徵有關，但是由特 殊f偶基因所編碼的產物或功能，在^性及/或^量上，與 由：基因之其他對偶基因所編碼的不同。對偶基因變體可 以是天然存在的，或藉著化學突變生成作用，以人工方式 產生。野外型對偶基因，是編碼在特定生物之野外型品系 中找到的特殊表現型特徵的對偶基因。 §在本文中使用”同類編碼變體"時，意指其中之特定基因 的核替酸序列，與得自野外型基因之序列不同的變體，雖 然其轉譯產物（也就是胺基酸序列）與得自野外型蛋白質的相 同。這係藉著遺傳密碼的簡併，以及在各種生物中，使用 不相同之密碼子的差異而引起。 當在本文中使用”DNA序列的衍生物”時，其爲編碼具有相 對應之序列識別號的活性之多肽DNA序列，但與該DNA序 列之差異爲1-20個，較佳的是1-1〇個核苷酸，像是u個核 站酸的添加、插入、刪除及/或取代。 在上文之陳述中特別指出的重組DNA序列，可以是衍生 自紅酶法菲亞酵母之基因的重組DN A序列，並選自⑴在序 列識別3號中陳述的DNA序列；（ii)由序列識別8號確認之 cDNA ; (iii)在序列識別3或8號中陳述之DNA序列的同類編 碼或對偶基因變體；以及（iv)在序列識別3或8號中陳述之 DNA序列，帶有一或多個核甞酸（們）的添加、插入、刪除及 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ----~ ?!______ 五、發明說明（1〇 ) 或取代’並編碼具有孩酵素活性之多肽的衍生物。該重組 ❹NA序列亦可具有下列特徵：⑷其所編碼之酵素，具有 選自G括在序列識別9號中描述之那些的一部份胺基酸序列 且或（b)其編碼該酵素之變體，選自⑴對偶基因變體，和（ii) 八有或夕個胺基酸添加、插入、刪除及/或取代，並具有 所陳述之酵素活性的酵素。這類重組的DNA序列最好是以 載體的形式。 本發明亦提供使用該重組的DNA序列，轉化宿主生物， 而得以後得一種生物，其至少一個活性氧物種-猝滅因子的 基因，藉著導入對該基因有專一性之中斷卡匣的幫助，實 質上已將其中斷。如果相對於未_中斷之基因，該基因所編 碼之多肽的活性已經降低，在本文中便使用該基因”被中斷 或實質上將其中斷”來描述之。較佳的是，使活性降低 10°/。’更佳的是至少5〇%，像是例如降低至少75%，更佳的 是降低至少90%至100%。重組DNA序列的便利形式可以是 載體。藉著使用在其編碼粒線體SOD、細胞質SOD或過氧 化氫酶之DNA序列中被中斷的重組DNA，而獲得重組的生 物。以重組DNA轉化的宿主生物，可用來改善類胡蘿蔔素 ，特別是蝦黃素的產製方法。因此本發明亦提供這類重組 的生物。 類胡蘿蔔素的生物產製方法，可改善類胡蘿蔔素，特別 是蝦黃素的生產力。因此，產製類胡蘿蔔素的方法，其特 徵在於在可傳導類胡蘿蔔素之產製的條件下，培養上述的 重組生物，爲本發明的一項觀點。該方法亦可應用於蝦黃 -13- t

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公H —------tr--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 Β7 五、發明說明（11 ) 素的生物產製上。 許多研咒者指出活性氧物種，在已知產生胡蘿蔔素的生 物中’可刺激類胡蘿蔔素的產製。藉著環境的氧壓迫，增 強了在多雨血液球菌（Haematococcus pluvialis)之囊胞細胞 (Cyst cell)中類胡蘿蔔素的生物合成（K〇bayashi等人，Appl Env· Mkobiol·，59, 867-873，1993)。在巴朵多納利菌 (DunaHella bardawil)中，可藉著活性氧物種謗發類胡蘿葡 素的生物合成，且堆積的類胡蘿蔔素具有做爲對抗氧壓迫 傷害之保護劑的功能（Shaish等人，planta，19〇，363_368, 1993)。雖然在活體内，進行了在改變活性氧物種之產生的 各種培養條件下，在紅酶法菲亞酵母中產製蝦黃素的研究 ，但並未明確地定出在所產生之活性氧和類胡蘿蔔素生產 力之間的相關性，或許是因爲在這類實驗中仍存有天然的 活性氧物種-猝滅因子，並解救活性氧物種對類胡蘿萄素產 製的影響至某種程度（Schr〇eder，w A等人，】

Microbiol.，139, 907-912, 1993) 〇 在本發明中，排除了出現在紅酶法菲亞酵母中之天然、、舌 性氧物種猝滅因子的可能性，其可藉著活性氧使對嘏i素 產製<正面影響猝滅，可藉著建構並導入基因中斷質體， 從紅酶法菲亞酵母中選殖諸如咖和過氧化氫酶之痛的^ 類天然的活性氧物種_猝滅因子，使其表現中斷。在礙黃素 將在紅酶法菲亞酵母中扮演抗氧化劑之角色的假定之下，,、 天然活性氧物種-猝減因子的失活作用可能影響類胡蘿葡+ 的屋製’或許是因爲在活體内由於缺乏天然活性氧物種·摔 ---------------—----訂 i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國㈣丰（道M4規袼⑵Q χ撕公爱了 1279441 A7 B7 五、發明說明（12 滅因子而導致活性氧物種相對上的增加，故刺激瑕黃素的 產製，做爲使活性氧物種猝滅的另一個選手。 活性氧物種經由對諸如蛋白質或核酸之類細胞間分子的 氧化傷害，而對活細胞具有毒性。目前的研究藉著在果繩 和，蟲中/證實在增加超氧物歧化酶活性、增加壽命和降

低氧化傷害之間的關連性，而顯示老化是由於氧化傷害引 起（Aganval，S.等人，Pr〇c _ Acad ^ u s a，口％ 12332-12335，1994，Larsen，p.l· Proc. Acad Sci U.S.A·，90，8905-8909，1993，Sohal，R.S·等人，j.Biol

Chem·’ 270, 15671_15674, 1995)。在原核生物和眞核生物中 已徹底研究SOD和相關的抗氧化劑酵素，及其基因。

智 慧 財 產 局 員 費 合 作 社 印 製 酵母菌，酒酵母菌（S· cerevisiae)，就像大多數的眞核生 物一樣，在細胞溶質中含有Cu/ZnS〇D (s〇D1基因之產物） ，並在粒線體中含有MnSOD (S0D2基因之產物）。這些酵素 催化A ·的歧化，產生A和H2〇2。與小分子的抗氧化劑， 像是穀胱甘肽和抗壞血酸鹽；其他的抗氧化劑酵素，像是 過氧化氫酶和過氧化酶；以及金屬螯合蛋白質，像是金屬 硫肤一起，它們容許需氧生物在A下存活，或許是藉著使 氧化傷害減至最少。藉著由缺乏SOD之酒酵母菌和大腸桿 菌（Escherichia coli)對二氧顯示出高敏感性，證實了細胞質 SOD的重要性。在這兩種生物中，s〇D活性的喪失與在需 氧條件下的緩慢生長有關，具有較高的突變率和特定的生 物合成缺陷。（sodl_的酵母菌爲了需氧生長，需要離胺酸和 甲硫胺酸，而sod·的大腸桿菌則需要分支的胺基酸）。在一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) -15- 1279441 A7 --------一 五、發明說明（13 ) 些情況下，已知這些影響是因爲超氧物對鐵硫集群蛋白質 的抑制影響（Gardner，RR·等人，j. Bl〇1 Chem，266, 19328_ 阳33, 199i，Kuo, c.f.等人，j. Bl〇1 Chem，加，__ 4727, 1987)。當在空氣中生長，利用葡萄糖做爲碳來源時 ，酒酵母菌的S〇d2突變種較不受影響。然而，它們對於氧 過多是鬲度敏感的，並在正常氧（n〇m〇xia)中，在需要呼吸 以便進行其代謝的碳來源中，是生長不佳的。 因爲已經從其他的物種中選殖編碼s〇D和過氧化氫酶的 基因，故可利用簡併PCR方法，從紅酶法菲亞酵母中選殖 相對應的基因。首先，我們使用以上的方法，選殖含有一 部份SOD基因和CAT基因的部份基因片段。該簡併pcR是選 殖感興趣基因的方法，該基因對已知得自其他物種，具有 相同或類似功能的酵素，具有高的胺基酸序列同種性。在 簡併PCR中用來做爲引子的簡併引子，藉著胺基酸序列對 相對應之核甞酸（”簡併的”）的反轉譯作用來設計。在這類簡 併引子中，混合的引子包括任一個A、c、〇或丁，或通常使 用在雙關密碼子處含有肌苷的引子。在本發明中，使用這 潁的此合引子做爲簡併引子，來選殖上述的基因。所使用 的PCR條件，依據引子和待選殖的基因而有所改變，如同 在後又中的描述。在本發明中，以簡併pCR&相同的pCR譜 帶中選殖兩種SOD基因，其序列彼此不同，並稱爲5〇〇1和 S0D2基因。 可藉著使用如同上述藉著簡併PCR而獲得的部份DNA片段 做爲探針，在將其標記之後，篩選由在適當宿主中之噬菌 -16 - ^紙張尺度適用t賴家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮)--------- (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

-III — — — — ^ « — — — — — —I. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 __B7_ 14 五、發明說明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 體載體或質體載體構成的基因組庫，從染色體中選殖含有 帶有其插入序列之密碼區，及其調節序列，像是啓動基因 或終止序列的完整基因。一般而言，在建構庫和後續的遺 傳操縱中，如篩選、限制消化、連接及其類似者，通常使 用大腸桿菌做爲宿主品系，以及大腸样菌載體，噬菌體載 體，如；I噬菌體載體，或質體載體，如pUC載體。在本發明 中，依據插入的大小，在λ載體、λ ZAPII和；I DASHII的衍 生物中建構紅酶法菲亞酵母的EcoRI基因組庫。在建構庫之 前’藉著每個基因的南方墨點雜交作用，來決定插入的大 小，即必須選殖之插入物的長度。在本發明中，依據供應 商（Boehringer-Mannheim(Mannheim，Germany))準備的草案 ，利用毛地黃毒芸（DIG)來標示用來做爲探針的DNA，其爲 取代傳統32P標記的類固醇半抗原。藉著使用DIG-標示之 DNA片段，其具有做爲探針的一部份感興趣之基因，來篩 選從紅酶法菲亞酵母之染色體建構的基因組庫。挑選出雜 交斑點，並用於進一步的研究中。在使用几DASHII的案例 中（插入的大小是從9 kb到23 kb)，藉著eC0RI消化製備好的 λ DNA ’接著將EcoRI插入物選殖到諸如pUcl9或 pBluescdptll SK+之類的質體載體内。當在使用λΖΑρπ建 構基因組庫時，便利地使用藉著使用單股Μ 13噬菌體之衍 生物，Ex幫助噬菌體（Stratagene，La J〇ua，USA)選殖到質體 載體内的後繼步驟。爲了定序檢查如此而獲得的質體DN A 。在本發明中，從λ ZAPII庫中分別獲得s〇D1* s〇D2基因 ，並從几DASHII庫中選殖過氧化氫酶（CAT)基因。 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441

五、發明說明（15 ) 在本發明中，我們使用自動螢光DNA定序器，ALFred系 統（Pharmacia，UppSala，Sweden)，使用自動循環的定序草案 ’其中在大邵份的定序案例中，使用Taq DNA聚合酶。 在本發明中’發明者定出含有SOD 1基因或S0D2基因之打 開岔碼，以及其啓動基因和終止序列的基因組序列。從序 列分析中，發現S〇D1編碼粒線體SqD，係由在其胺基終端 出現過渡肽而知。相反的，s〇D2沒有這類過渡肽序列，而 孩事實暗示S0D2編碼細胞質S0D。發明者亦定出CAT基因 之打開密碼的部份基因組序列。 過渡肽爲運送核基因產物的信號序列，其在染色體上編 碼，而其轉譯蛋白質在粒線體中，對粒線體中蛋白質的所 在之處產生功能，像是涉及TCA循環的酵素。 在本發明中，藉著連接上述基因的部份片段，其不含任 一個基因末端，帶有對自殺載體的抗藥性基因，它因爲缺 乏自動複製序列而不會在紅酶法菲亞酵母中自動複製，來 建構SOD卜S0D2和CAT基因的中斷質體。通常使用編碼使 宿主能夠在有毒的抗生素中存活之酵素的抗藥性基因，做 爲可選擇標記。隱藏在pPR2T中的G418抗藥性基因（％卜 does等人（國際專利出版物，w〇97/23633))，爲抗藥性基因 的實例。這類自殺載體本身不能複製，而由於使用同種序 列，在載體與染色體之間之單…交叉重組作用的結果，僅 以整合形式出現在宿主的染色體上。在與感興趣之基因重 組的情況下，其遺傳序列不能在宿主品系的染色體上重新 組合，因爲缺乏任一個基因的末端，結果，在如此獲得之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公髮 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁】

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五、發明說明（ 組：系+，可中斷該感興趣的基因。中斷質體的其他實 :、’馬雙重互換類型的質體。這類型的中斷質體含有待中 k目標基因的兩個不同部份片段，以及插在這兩個片段 :間’渚如抗藥性之類的可選擇標記。基因的兩個同種部 份〈處，在接受者細胞的染色體與捐贈者質體DNA之間的 重、、且作用〈後，發生了以捐贈者之DNA£換染色體的事件 而私^:擇標記基因插人待中斷的目標基因内。通常，雙 重互換類型的質體具有比單—交叉類型之載體更低頻率的 重組作用。 在本發月中’發明者藉著中斷相對應的基因，使感興趣 :酵素失活。另_種評估感興趣基因之產製效果的方法， 是利用遺傳工程的方法，降低其表現。爲了該目的，開發 出.二方法。廷類方法之一是反義法。反義法爲藉著導入 人l的基因片& ’其序列與感興趣之基因互補，來降低感 :、趣之基因的表現。如&，反義基因片段與目標基因的成 二、RN A片&在活體内形成複合物，結果抑制了來自a 的有效轉譯作用。 /、他的方法爲啓動基因區的突變作用。一般而言，基因 由數個邵份組成，彼此具有不同的功能。在眞核生物中， 將編碼相對應蛋白質之基因轉錄至成熟前（premature)信使 RNA(前-mRNA)，與核糖體RNA(rRNA)、小核隨八㈣⑽八） 和轉移RNA(tRNA)的基因不同。雖然RNA聚合酶ΐΐ(ρ〇ιΠ)在 該轉錄事件中扮演主要的角色，但ΡοΙΠ不能沒有覆蓋上游 區，含有啓動基因和上游活化序列（UAS)，以及反式-作用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） •裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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白質因子的順式要素，單獨開始轉錄作用。首先，轉 後合物包括數個基本的蛋白質成份，其㈣在待表 現之基因5，·相鄰區中的啓動其 丁日J 口動基因序列。在該事件中， 些特殊規定下表現之基因的案彳 ^W甲，需要一些額外的選手 ’像是熱休克反應或適應營養叙餓等等。在這類案例中， 需要UAS出現在園繞啓動基因序列的5，_未轉譯上游區，而 —些正或負向調節的蛋白質’認識並與㈣結合。轉錄起 始複合物與啓動基因序列的結合強度，受繞著啓動基 因的這類反式作用因子之結合作用的影響，並得以調節轉 錄作用的活性。 …在藉著磷酸化作用活化轉錄起始複合物之後，轉錄起始 複泛物從轉錄起始位置開始轉錄作用。從啓動基因區往該 基因之3’的方向，將轉錄起始複合物的一些部份，以延伸複 合物 < 形式分開（該步驟稱爲啓動基因清除事件），而該延伸 禝合物繼續該轉錄作用，直到其達到位在該基因之3,-相鄰 下游區的終止序列爲止。 各乂降低感興趣之基因的表現，通常在含有上述之U as序 列的目標基因之啓動基因區中，使用傳統的化學突變生成 作用’或指定遺傳位置的突變生成作用。可藉著以具有這 類突變啓動基因區的重組DNA來轉化宿主細胞，而獲得其 中可能降低酵素表現的突變品系。如同上述，亦使用這類 丨牛低基因表現的嘗試，以及目標物的基因中斷作用，來決 定在活生物中，基因產物在現象上的影響。 關於轉化方法，應用LiCl法（Wery等人，Yeast，12(7)，641· -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21{) X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

^---1 I---I ^------I-- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -------^-----五、發明說明（18 ) 651，1996)和電穿透方法(Wery等人，_，184，89_” 1997)來轉化紅酶法菲亞酵母，但在這些條件下的轉化效率 似乎仍然很低。在本發明中，Bl〇Ustic轉化法（j〇hnst〇n等人 ，Methods ln Molecular Bi〇1〇gy，％ 147 153, η%)來轉化 紅酶法菲亞酵母。生物列舉法是簡單可靠的草案，其中利 用同壓的氦氣，私塗覆在金或鶏粒子上的捐贈者随A直接 射入活細胞中。該轉化草钱功地應用在屬於擔子菌綱 (baS1di〇mycetous)酵母菌的新型隱球菌（Crypt〇c〇ccus卿【随㈣ 和紅酶法菲亞酵母上，它們均不易以傳統轉化方法轉化 (Toffaletti等人，J. Bacteriol·, 175(5)，14〇5·1411，1993)。在 本發明中，成功地使用該生物列舉法來轉化紅酶法菲亞酵母。 可藉著it接/id?酵素特徵，並藉著遺傳分析，利用或 南方墨點雜父作用，藉著使用獲自如此獲得之轉化物的染 色體，來證實基因中斷的事件。在本發明中，藉著肉眼觀 察經常用於細菌分類學的類過氧化氯酶試驗，經營過氧化 虱酶中斷的活性染色並定出特徵，來進行_中斷的直接 確定。 將在遺傳學上如此設計的紅酶法菲亞酵母培養在適當的 培養基中，並評估其蝦黃素的生產力。 利用下述的實例並參考附圖，更進一步地解釋本發明。 實性 在下述的實例中使用下列的材料和方法。 品系 (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁)

裝---- 訂---------· _________ -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公楚) 1— -- 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 19 五、發明說明（） 紅酶法菲亞酵母 ATCC 96594(履行布達佩斯條約，於 1998年4月8日，以登錄編號ATCC 74438再存放） 大腸样菌 DH5 a : F·， φ 80d? lacZ Δ Μ15 Λ (lacZYA-argF)U169，hsd(rk·，mk+)，recAl，endAl，de〇R，thi_l， supE44，gyrA96，relAl(Toyobo，Osaka，Japan) 大腸桿菌 XLl-Blue MRF’ ： △ (mcrA)183， Δ (mcrCB- hsdSMR-mrr)173，endAl, supE445 thi-l? recAl? gyrA96 relAl，lac[F，proAB，lacIqZ △ M15，TnlO(tetr)](Stratagene

La Jolla，USA) 大腸桿菌 SOLR: el4-(mrcA)，△(mcrCB-hsdSMR-mnOni， sbcC，recB，recJ，umuC: : Tn5(kanr)，uvrC，lac，gryA96, relAl，thi-1，endAl， λ R，[F’proAB，lacIqZ △ M15] Su·(未 壓抑的）（Stra_tagene) 大腸样菌 XL1 MRA(P2) : △ (mcrA)183， Δ (mcrCB- hsdSMR-mrr) 173,endAl, supE44，thi-1，gyrA96，relAl， lac(P2溶素原）(Stratagene) 大腸桿菌 TOPIO : P，mcrA，A(mrr-hsdRMS-mcrBC)，0 80, Δ lacZ M15, △ lacX74，recAl，deoR，araD139，（ara- leu)7697，galU，galK，rpsL(Strr)，endAl，nupG(Invitrogen， Carlsbad, USA) 載體 λ ZAPII(Stratagene) λ DASHII(Stratagene) pBluescriptll SK+(Stratagene) -22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -裝—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

. 1279441 A7 B7 20 五、發明說明（） pCR2. lTOPO(Invitrogen) pUC19(Takara Shuzo，Otsu，Japan) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 培養基 例行地將紅酶法菲亞酵母維持在YPD培養基的瓊脂盤 (DIFCO，Detroit，USA)上。將大腸样菌維持在lb培養基（1〇 克細菌-胰蛋白腺，5克酵母萃取物（DIFC0)和5克NaCl每公 升）上。爲了在軟瓊脂（0.7%瓊脂（WAKO))上繁殖λ噬菌體， 使用ΝΖΥ培養基（5克NaCl，2克MgS04-7H20，5克酵母萃取 物（DIFC0)，10克NZ胺 A型（WAKO, Osaka，japan)每公升）。 在製備瓊脂培養基時，補充1.5%瓊脂（WAKC〇。 方法 分子过傳學技術的共同方法’根據在Molecular cloning: a Laboratory Manual，第 2 版（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中的方法。限制酵素和T4 DNA連接酶購自

Takara Shuzo(Japan) 〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 藉著使用 QIAGEN基因組套組（QIAGEN，Hilden，Germany) ，依據製造者提供的草案，進行從紅酶法菲亞酵母中分離 染色體DNA。利用自動DNA分離系統（PI-50，Kurabo，Co, Ltd·，Osaka，Japan)，進行從經過轉化之大腸样菌中，質體 DNA的迷你-製備作用。藉著使用qiaGEN管柱（QIAGEN)， 進行從大腸桿菌轉化物中，質體DNA的迷你·製備作用。藉 著Wizardλ製備DNA純化系統（pΓomega，Madison，USA)，依 據製造者準備的草案，進行；L DNA的分離。藉著使用 QIAquick或QIAEXII(QIAGEN)分離DNA片段，並從瓊脂糖 •23· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 21、 五、發明說明（） 中純化，依據由製造者準備的草案（Stratagene)，操縱λ嗤 菌體衍生物。 利用驗方法，藉著使用Isogen(Nippon Gene，Toyama, Japan)，進行從紅酶法菲亞酵母中分離總RNA。藉著使用 mRNA分離套組（Clontech，Palo Alto, USA)，從如此獲得的 總RNA中純化mRNA。藉著使用CapFinder cDNA建構套組 (Clontech)，合成cDNA。 藉著使用Gigapack III金包裝萃取（Stratagene)，進行在活 體外的包裝。 利用Perkin Elmer 2400型的熱循環器，進行聚合酶連鎖反 應（PCR) 〇在實例中分另|J描述每個PCR條件〇 PCR引子係購 自供應商，或利用DNA合成器（392型，Perkin Elmer，Japan， Urayasu，Japan)來合成。DNA定序的螢光DNA引子係購自 Pharmacia。利用自動的螢光DNA定序器（ALFred， Pharmacia)進行 DNA定序。 大腸样菌DH5 α的反應潛能細胞，係購自Toyobo(Japan)。 紅酶法菲亞酵母之生物列舉轉化作用的裝置和試劑，係 購自 Nippon Bio-Rad Laboratories(Tokyo, Japan)。 實例1 :從紅酶法菲亞酵母中分離mRNA，並建構cDNA庫 欲建構紅酶法菲亞酵母的cDNA庫，在細胞破裂之後立即 藉著驗萃取方法分離總RNA，並藉著使用mRNA分離套組 (Clontech)，純化得自紅酶法菲亞酵母 ATcc96594品系的 mRNA 〇 首先’藉著離心（1500xg 10分鐘）從1〇毫升在ypd培養基 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公复） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂丨丨丨 · 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 _ 五、發明說明（22 ) 中的兩天培養物中，收獲ATCC96594品系的細胞，並以萃 取緩衝溶液（10 mM檸檬酸鋼/HC1 (pH6.2)，含有0.7M KC1) 沖洗一次。在懸浮於2.5毫升萃取緩衝溶液中之後，藉著法 式壓搾均化器（French press homogenizer)(Ohtake Works Corp·，Tokyo，Japan)，以1500公斤力/平方公分，使細胞破 裂’並根據製造者指示的方法，立刻與兩倍體積的 Isogen(Nippon gene)混合。在該步驟中，回收400微克的總 RNA。 藉著使用mRNA分離套組（Clontech)，根據製造者指示的 方法，純化該總RNA。最後，從紅酶法菲亞酵母 ATCC 96594品系中獲得16微克的mRNA。 欲從紅酶法菲亞酵母中獲得cDNA物種，根據製造者指示 的方法，使用CapFinder PCR cDNA建構套組（Clontech)。爲 了第一股的合成，應用1微克經過純化的mRNA，接著進行 PCR擴大作用。在藉著PCR擴大之後，獲得1毫克的CDNA。 實例2 :從紅腌法菲亞酵母中選殖部份sop某因的雨個物種 欲從紅酶法菲亞酵母中選殖部份的S〇D基因，開發出簡 併PCR方法。兩個混合引子，按照在表1中所示，以得自其 他物種的已知超氧物歧化酶基因爲基礎，設計並合成其核 苷酸序列。 表1 用來選殖SOD 1和SOD2基因之引子的序列

Sodl ; AARCAYCAYCARACNTAYGTNAA(有意義引子）（序 列識別10號） 丨 -25 · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱1 " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明（23 ) S〇d4 ; GCCCANCCNGANCCYTGNACNCC(反義引子）（序歹丨J 識別11號） (R=A或 G ; Y=C 或 T ; N=A、C、G或 T) 在藉著使用ExTaq(Takara Shuzo)做爲DNA聚合酶，以及 在實例1中獲得的cDNA集合做爲模板，在94°C下15秒，46 °(：下30秒和72°C下15秒之25次循環的PCR反應之後，對該反 應混合物應用瓊脂糖凝膠電泳。回收具有想要長度的PCR 譜帶，並根據製造者的方法，藉著QIAquick(QIAGEN)純化 ，然後與pCR2.1_TOPO(Invitrogen)連接。在轉化反應潛能 的大腸桿菌TOP10之後，選出六個白色的菌落，並利用自 動DNA分離系統（Kurabo PI-50)分離質體。根據定序的結果 ，發現兩個純種系具有彼此不同的序列，其推衍的胺基酸 序列分別類似已知的SOD基因。將這些經過分離的cDNA純 種系分別命名爲PS0D614#2和pSOD614#3，並應用在進一 步的研究中。

實舛3 :從紅醃法菲亞酵母中分離基因組dn A 欲從紅酶法菲亞酵母中分離基因組DNA，根據製造者指 示的方法使用QIAGEN基因組套組。 首先，藉著離心（1500xg 10分鐘）從1〇〇毫升在YPD培養基 中的過夜培養物中，收獲紅酶法菲亞酵母ATCC 96594品系 的細胞，並以TE緩衝溶液（10 mM Tris/HCl (ρΗ8·0)，含有 1M EDTA)沖洗一次。在懸浮於8毫升QIAGEN基因组套組的 Y1中之後，以2毫克/毫升之濃度加入溶解酶（iyticase) (SIGMA)，藉著酵素降解作用使細胞破裂，並在30°C下培養 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

% 1279441 A7 _____B7 _ 五、發明說明（24 ) 該反應混合物90分鐘，然後前進至下一個萃取步驟。最後 ，獲得2〇微克的基因組DNA。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 實斜i 羞mi PSOD014#2和DSOD614#3做爲探針的南方 墨點雜交作用 執行南方墨點雜交作用，來選殖含有得自紅酶法菲亞酵 母之SOD基因的基因組片段。藉著ecori消化2微克的基因 組DNA，並使其接受瓊脂糖凝膠電泳，接著進行酸性和鹼 性處理。藉:¾'使用轉移墨點（transblot)(Joto Rika，Toyko, Japan)’ 將變性的DNA移至尼龍膜（Hybond N+，Amersham) 上1小時。將DNA移至尼龍膜上，並藉著熱處理（8〇°C，90 分鐘）固定。藉著以DIG多重加滿法（Boehringer Mannheim) 標示模板DNAs(以EcoRI消化過的pSOD614#2和pSOD614#3) ，來製備探針。利用製造者指示的方法來進行雜交作用。 結果，在對由？800614#2製備之探針，在7.5千鹼基（1^)的 長度處看到雜交譜帶，而對由PS0D614#3製備之探針，在 8.0千鹼基（kb)的長度處看到雜交譜帶。 免例5 殖含有SOD基因之基因組片段，其序列是彼此不 同的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 藉著EcoRI消化4微克的基因組DNA，並接受瓊脂糖凝膠 電泳。然後藉著傳統的洗脱方法，藉著使用透析膜，回收 長度在7至9 kb範圍内的DNAs。在16°C下將經過純化的DNA 與1微克以EcoRI和CIAP(牛小腸鹼性磷酸酶）處理過的几 ZAPII(Stratagene)連接過夜，並以Gigapacklll金包裝萃取 (Stratagene)包裝。將包裝好的萃取物感染至大腸桿菌 -27· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 ______B7_ 五、發明說明（25 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) XLlBlue MRF’品系，並在LB瓊脂培養基上以NZY培養基覆 蓋。藉著使用以EcoRI消化過的pSOD614#2和pSOD614#3做 爲探針，篩選出大約6〇〇〇個斑點。使六個斑點與經過標示 的pSOD614#2探針雜交，並使兩個斑點與經過標示的 pSOD614#3探針雜交。然後，使雜交的斑點接受在活體内 的刪除草案’根據製造者指示的方法（Stratagene)。由於 PCR分析的結果，藉著使用s〇dl和s〇d4引子，發現一個分離 自六個pSOD614#2_·交斑點的質體，具有與ps〇D614#2相 同的片段。將該質體命名爲pS〇D703。由於PCR分析的結果 ’藉著使用sodl和s〇d4引子亦發現兩個分離自兩個 pSOD614#3·雜交斑點的質體，具有與pS〇D614#3相同的 片段。將一個質體命名爲pS〇D626，並用在進一步的研究 中。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 實例θ ··獲自紅酶法菲亞酵母之兩種MnSOD基因的序列分析 藉著以引子-前進程序定出pS〇D7〇3和pSOD626的序列， 決定完整的核苷酸序列。在序列一覽表段落中，以序列識 別1號、序列識別2號、序列識別5號和序列識別7號，列舉 藏匿在PSOD703中之S0D1基因和藏匿在pSOD626中之SD02 基因的核苷酸序列及其推衍的胺基酸序列。 由 BLAST 分析（Altshul，S.F·等人，J· Mol. Biol. 215，403-410，1990)得知，SOD1和SOD2基因兩者的推衍胺基酸序列 ，與獲自其他物種的已知MnSODs是同種的，但與 Cu/ZnSODs或FeSOD不是同種的。 SOD 1基因具有七個插入序列和八個表現序列。且其推衍 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 _B7_ 五、發明說明（26 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的打開密碼由223個胺基酸組成。另一方面，S0D2基因具 有十個插入序列和十一個表現序列，且其推衍的打開密碼 由199個胺基酸組成。在兩個分離之SOD基因之間最大的差 異是S0D1基因在其胺基終端的延伸區，其序列可能擔任至 粒線體之過渡肽的作用。 事實上，Schroeder等人報告了兩種SODs，其在紅酶法菲 亞酵母中之天然聚丙烯醯胺凝膠電泳（PAGE)的活性染色中 ，以KCN-和H202-抵抗力SODs而被檢測到。他們以凝集或 同功酶來説明兩種MnSOD，而並未提及其正確性質及其亞 細胞位置。如同在以下段落中的説明，將明瞭這兩種KCN-和H202-抵抗力SODs(也就是MnSOD)是S0D1和D0S2基因的 產物。如同在’’發明説明”中的描述，大部份的眞核生物在 其細胞内場所，具有不同種類的SODs(MnSOD在粒線體溶 離份中，而Cu/ZnSOD在細胞質溶離份中）。這是其中兩種 MnSODs在不同的亞細胞位置具有功能的第一個實例。 實例7 :建構S0D1和S0D2基因的中斷質體 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 如同在’’發明説明'’中的描述，藉著將G4 18抗藥性結構基 因插入甘油醛-3-磷酸脱氫酶（GAP)的啓動基因和終止序列 基因之間，並連接到ΚρηΙ-和Hindlll·消化過的pUC19質體中 ，來建構藏匿有抗藥性標記卡匣的質體。將該質體命名爲 PUC-G418，並應用在進一步的研究中。因爲基因片段使用 同種重組作用，故在活體外，藉著PCR方法，使用在表2中 出示其序列的PCR引子，來合成S0D1和S0D2基因的部份片 -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（27 ) 表2

Sodl4 ; GGTACCTCCGATGATAGGAATGTGAG(有意義引子） (序列識別12號）

Sodl5 ; GAATTCAGTTCAACGGAGGAGGACAC(反義引子） (序列識別13號）

Sod47 ; GAATTCGGAGGAGGACACATCAACCG(有意義 子）（序列識別14號）

Sod48 ; GGTACCTGTACTGGAGGTAGAAAGCG(反義引子） (序列識別15號） PCR條件如下；94°C15秒，50°C30秒和72°C15分鐘的25次 循環。使用0.1微克在實例3中獲得的基因組DNA做爲模板 ，以及ExTaq做爲DNA聚合酶。分別擴大從使用s〇dl4和 sodl5做爲引子之PCR中獲得的SOD1部份片段，以及從使用 sod47和s〇d48做爲引子之PCR中獲得的SOD2部份片段。回 收每個擴大的0.65kb片段，並根據製造者指示的草案，在 pCR2.1_TOPT(Invitrogen)中選殖。從大腸捍菌TOP10轉化物 的白色菌落中選出六個獨立的純種系。根據限制分析和定 序的結果，選出一個具有一部份SOD1基因的純種系進行進 一步的研究’並命名爲pS〇D715。以類似的方式，選出一 個具有一部份SOD2基因的純種系，並命名爲pS〇D826。 然後，藉著EcoRI和ΚρηΙ消化pSOD715和pSOD826，並使 用QIAquick草案純化所產生的〇.65kb之片段，再與EcoRI-和 ΚρηΙ-消化過的puC19_G418連接。從大腸桿菌DH5a轉化物 的氨苄青黴素-抗藥性菌落中選出六個獨立的純種系，並從 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 裝： . 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制π A7 B7 28 五、發明說明（） 這些轉化物來製備質體。根據限制分析和定序的結果，獲 得一個其中部分的SOD L已經與G4 18抗藥性卡匣融合的純種 系，並命名爲PSOD/G717。以類似的方式，獲得一個其中 部分的S0D2已經與G418抗藥性卡匣融合的純種系，並命名 爲 pSOD/G828 〇 實例8 :以生物列舉法轉化紅酶法菲亞酵母ATCC96594 轉化草案係依據在 Methods in Molecular Biology(Johnston 等人，53; 147-153，1996)中描述的方法。將做爲宿主品系 的紅酶法菲亞酵母ATCC96594培養在YPD培養基中至停滯 期。在離心肉湯之後，利用滅菌的水將細胞濃縮10倍，並 將200微升細胞懸浮液播種在含有1〇〇微克選擇試劑（G418) 和0.75M甘露糖醇和山梨糖醇的YPD培養基中。將5微克 pSOD/G717和pSOD/G282的環狀DNA塗覆在1.5毫克之0.9um 的金粒子上，並用來做爲生物列舉轉化作用的捐贈者DNA 。在20°C下培養一週之後，產生數百個選擇試劑-抗藥性的 純種系。從這些轉化物中選出四個，並從其中製備染色體 。藉著PCR和南方墨點雜交分析，證實一個轉化物具有中 斷結構的染色體SOD 1或S0D2基因，並應用在進一步的研 究中。 9 : 使用獲自sodi和S0D2中斷之候選者的粗Μ萃 丞身’進ϋ天然PAGE的活性染色 在YPD培養基中培養ATC：C96594品系和獲自ATCC96594之 生物列舉轉化作用的候選者2天，並藉著在4°C下以3000xg 離心10分鐘收獲。在以丁士^^緩衝溶液（10 mM/pH8.0)沖 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -I --- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1279441 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（29 ) 洗之後，以相同的緩衝溶液將細胞濃縮10倍。利用法式壓 搾均化器（Ohtake Works)以1500公斤/平方公分使細胞破裂 ，並在以15000 rpm (TOMY，MRX150)微量離心均質化的溶 離份之後，製備粗製的萃取物。 利用由PIERCE(Rockford，U.S.A.)釋放的BCA蛋白質測定 試劑，定出如此製備之粗製萃取物的蛋白質濃度。根據由 SchroederW.A.等人（J. Gen. Microbiol.，139，907-912，1993) 描述的方法，使相當於300微克蛋白質之體積的粗製萃取物 ，接受天然PAGE。活性染色的方法，參照由Flohe等人 (Methods in Enzymology，105，93-104，1984)描述的方法0 在圖1中描述活性染色的結·果。在親代品系ATCC96594的 萃取物中，在暗背景中看到兩個透明的譜帶，其爲具有 SOD活性的譜帶。相反的，將其中之SOD1基因中斷，缺乏 活性譜帶的ATCC96594xpSOD/G717品系，在天然的PAGE 中具有高淌度，而將其中之SOD2基因中斷，缺乏活性譜帶 的ATCC96594“pSOD/G828品系，在天然的PAGE中具有低 淌度。從該結果得知，發現出現在紅酶法菲亞酵母之粗製 萃取物中的兩種MnSOD，爲SOD1和SOD2基因的產物，而 在天然的PAGE中具有高淌度和低淌度的SOD物種，分別相 當於SOD1和SOD2的基因產物。 實例10 :從紅酶法菲亞酵母中選殖部份的過氧化氫酶 欲從紅酶法菲亞酵母中選殖部份的CAT基因，開發出簡併 PCR方法。兩個混合引子，按照在表3中所示，以得自其他 物種的已知過氧化氫酶基因之共同序列爲基礎，設計並合 -32· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) %裝 a — — — — — — — —

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 B7 30 五、發明說明（） 成其核甞酸序列。 表3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用來選殖CAT基因之引子的序列

Cat2 ; MGNTTYTCNACNGTNGGNGGNGA(有意義引子）（序 列識別16號）

Cat5 ; CKRTGNCKYTGNGTRTCNGGRTA(反義引子）（序列識 別17號） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (M=A 或 C ; N=A、C、G 或 T ; Y=C 或 T ; K二G或 T ; R=A或 G) 在藉著使用ExTaq(Takara Shuzo)做爲DNA聚合酶，以及 在實例3中獲得的基因組DNA做爲模板，在94°C下15秒，45 °〇下30秒和72°C下15秒之25次循環的PCR反應之後，對該反 應混合物應用瓊脂糖凝膠電泳。回收具有l.Okb長度的PCR 譜帶，並根據製造者的方法，藉著QIAquick(QIAGEN)純化 ，然後與pCR2.1-TOPO(Invitrogen)連接。在轉化反應潛能 的大腸桿菌TOP10之後，選出六個白色的菌落，並利用自 動DN A分離系統分離質體。根據定序的結果，發現兩個純 種系所具有的序列，其推衍的胺基酸序列類似已知的CAT 基因。將這些經過分離的DNA純種系之一命名爲pCAT702 ，並應用在進一步的研究中。 實例11 :選殖含有CAT某因的基因組片段 以類似實例4之方式，藉著使用pCAT702做爲探針，進行 南方墨點雜交研冗。結果，看到具有從9kb至23kb之大小的 雜交譜帶。接下來藉著EcoRI消化4微克的基因組DNA，並 接受瓊脂糖凝膠電泳。然後藉著傳統的洗脱方法，藉著使 -33· t氏張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） ~ 1279441 A7 B7 五、發明說明（31 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用透析膜，回收其長度在9至23kb範圍内的DNAs。在16°C 下將經過純化的DNA與1微克以EcoRI和CIAP(牛小腸鹼性磷 酸酶）處理過的几DASHII(Stratagene)連接過夜，並以 Gigapacklll金包裝萃取（Stratagene)包裝。將包裝好的萃取 物感染至大腸样囷XLlBlue MRA(P2)品系’並在LB復脂培 養基上以NZY培養基覆蓋。使用以EcoRI消化過的pCAT7〇2 做爲探針，篩選出大約8000個斑點。使六個斑點與經過標 示的pCAT7〇2探針雜交。從每個；I純種系製備；I DN A，並由 於使用Cat2和Cat5引子的PCR，以及定序分析的結果，發現 六個純種系中的四個，含有與PCAT702之插入物相同的片 段。在序列一覽表段落中，以序列識別3號和序列識別9號， 列舉CAT基因的一部份核苷酸，及其推衍的胺基酸序列。 膏例12 :建構CAT基因的中斷質體 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 以類似實例7的方式，建構CAT基因的中斷質體。首先， 將SacI交聯劑插入其中設有G4 18-抗藥性卡匣之終止序列區 的pUC19-G418之Hindlll位置，並根據限制分析的結果，產 生pUC19-G418Sa，其在G418-抗藥性卡匣的末端具有SacI位 置。然後，將衍生自pUC19_G419Sa的ΚρηΙ-和SacI-片段， 與ΚρηΙ-和SacI-消化過的pCAT702連接，並產生pCAT/G706 ，其中部份的基因組CAT基因與G418-抗藥性卡匣融合。 實例13 :藉著使用PCAT/G706做爲捐贈者質體，來韓化紅 B每法菲亞酵母ATCC 96594 以與實例8相同的方式，以CAT-中斷質體pCAT/G706轉化 紅酶法菲亞酵母ATCC96594。在20°C下培養一週之後，產 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 五、發明說明（ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 生數百的選擇試劑·抗藥性純種系。從這些轉化物中選出四 ::，並從中製備染色體。藉著pCR和南方墨點雜交分析， 證實其中—個轉化物，具有中斷結構的染色體CAT基因， 並應用在進一步的研究中。 然後，利用過氧化氫酶試驗定出CAT中斷物之兩個候選者 的特徵，该試驗通常用在細菌的分類研究中。將一個全環 的紅酶法菲亞酵母細胞浸泡在3% Hah溶液中，然後觀察二 氧氣缸的發生。雖然在將ATCC96594細胞應用於該過氧化 氫酶4驗時，澄實〇2泡沫立刻發生，但在將兩種atcc 96594::pCAT/G706突變種浸泡在Η"〗溶液中時，在長時間 的延遲之後，才發生A泡沫。從這個結果，暗示CAT基因 的中斷，但剩下微弱的活性，表示出現其他催化ho:之消 失的選手，像是在紅酶法菲亞酵母中的過氧化酶。 :就其蝦黃素的淳，丄古衍生自紅胳法菲亞醏丹 的S0D1、S0D2彳口 CAT中斷物 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 藉著利用振盪燒瓶，在YPD培養基中培養，來評估3〇〇1 、S0D2和CAT基因之基因中斷對蝦黃素產製的影響。將在 YPD瓊脂上生長的細胞懸浮於丫叩培養基中，並將一部份 的細胞懸浮液接種於在500毫升折流燒瓶中的5〇毫升YpD培 養基中。利用200 rpm使細胞在2CTC下生長84小時。以適當 之間隔取回3毫升肉湯，並分析細胞產量、葡萄糖消耗和蝦 黃素内含量。 以在660毫微米處的光密度，以及在通過0.45微米乙酸纖 維素加硝基纖維素膜（HAWP04700，Millipore，Bedf^d -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 B7 33 五、發明說明（） U.S.A·)過濾，並加熱至80°C過夜之後，將細胞稱重的乾細 胞重，來測量細胞產量。在藉著利用玻璃小珠使細胞破裂 ，從紅酶法菲亞酵母的細胞中萃取類胡蘿蔔素之後，利用 HPLC方法測量紅酶法菲亞酵母的蝦黃素内含量。在萃取之 後，加入5毫升的丙酮/ΒΗΊ7水，其含有適當濃度的紅木素 ，做爲内部的標準。以下列HPLC系統分析上清液的蝦黃素 内含量。 HPLC 管柱：YMC-PakODS-A(6 釐米，150 釐米） 溫度；室溫 洗脱液；乙腈/甲醇/異丙醇（85/10/5) 注入體積；10微升 流速；2.0¾升/分鐘 檢測；UV，在471毫微米處 在表4中概述獲自84-小時培養的結果。 表4 SOD和CAT突變作用對紅腌法菲亞酵母之總類胡蘿蔔素 品系 和蝦黃素生產力的影響 總類胡蘿蔔素(¾克/克-乾-細胞）瑕黃素(亳克/克-乾-細胎Λ ATCC 96594 0.169 0.111 △ SOD1 0.259 0.146 △ SOD2 0.202 0.129 △ CAT 0.229 0.144 與其宿主品系ATCC96594相比較，SOD1和SOD2中斷物， 對於總類胡蘿蔔素以及蝦黃素，顯示出升高含量的生產力 -36· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼ — 裝________訂________^9! 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（34 ) 音：其：=1中斷物分別顯示出53·3%和3 1 ·5%的類胡蘿蔔 素和蝦更素產製之明顯增加。 口從在其胺基終端之推衍的過渡肽序列來判斷，麵似乎 疋粒線體的酵素’並可能具有清除超氧物基團，一種出現 j粒線&呼吸鏈中之活性氧物種的作用。這些數據暗示， 猎考細胞内活性氧的產生而刺激蝦黃素產生，以便補償活 性氧物種-猝滅因子之天然選手，s〇Du々缺乏。 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

1279441 A7 B7 五、發明說明（35 ) <11〇> <120> 序列一覽表： F. HOFFMANN-LA ROCHE AG類胡蘿蔔素及其生物物質之生物產製的改良 <130> SOD <140> <141> <160> 17 <170> Patentln Ver. 2.0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> • <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> 1 3632 DNA紅酶法菲亞酵母 5 'UTR (922) . . (923)實驗性的表現序列 (986) . . (1096)插入序列 (1097) . . (1306)表現序列 (1307) . . (1456)插入序列 (1457) ·. (1555)表現序列 (1556) .. (1589)，插入序列 -(1590) ·. (1694)表現序列 (1695)..(1799) 插入序列 (1800) .. (1920) 表現序列 (1921)..(1982) 插入序列 (1983).·(2076) -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <221> 表現序列 <222> (2077) . . (2140) <220> <221> 插入序列 <222> (2141) . . (2246) <220> <221> 表現序列 <222> (2247) . . (2272) <220> <221> 插入序列 <222> (2273) . . (2390) <220> <221> 表現序列 <222> (2391) . . (2507) <220> <221> 聚A-位置 <222> (26637. . (2564) <223> 實驗性的 <400> 1 1279441 A7 B7 五、發明說明（36 ) tcctgttgat aatctttcta acgccttgta ctttgaccaa ggcgtttgtc cgaaattttg 60 caaacttagt gtcggtcgca tggacggcct tcggatccag aactgacggc tcgccaataa 120 agtatgacga tggtagaggt gaaggaggga accacaggtt gaccagtctc aaagagtgct 180 gatgtgcgcg aggatttgtc attaaatggt gttgtatatg ctagagccaa gagaagacat 240 ttggttttgg ttttggtttt gcatttgatg agatgtgtca cgattgaaga cgggaggagg 300 ctcactaacc caagaagcca ggatcaggag gaatacctcc cccttttcat-Gaagatcttt 360 ctcacatcga acatttgaca ttctctttag tatccttcta tccttttctt ccaacttctc 420 cc^ttgtatc gactttgctc gacttgctct tcttatctct ga^gcagagat gggcattcca 480 atatcgaagg agcgacacaa gaccttggag tttgggtaac agatgaagag gagccgaggt 540 ggatggggct gtaggaagta gctgatcgat gagttcctgg atgatgatag gcgaaggaac 600 agacatagga tctctgtctc gtcctggaat tactgagtct tgtatccagc gtgttcttgt 660 ctcgaagaag ccttcaagat cgatgtaaga taagacaggc aatgaggacg gacgaacgaa 720

. I cgaacgaaaa gaacagaaga gctggtaagt cagtcagtca gtcagtcagt caatcaaaca 780 ctggtgtcta gagttatagc tcgacgcgac gcga.cgcgtt tgagacgcga tatgcttacg 840 taatacctgg cgtcatcccc ccagccgagg caagagccga gccgctcgtg aacgacaaaa 900 ttcaaaaggc tttctccatc ttaagctcat tctcatctaa ccgactcatc tcgttcccat 960 cattcccatc attctaccgc catcc atg tct gtt cga gca tcc etc tet tee 1012 gtg tct aga cag act ttc gtc get cct get get ttc cag ate agg gca 1060 aag cat acc ctg cct gag ett cct tac get tac gat gtaagacttt 1106 tccgtgttct cctattcgtc gctttcttgg tttttttcgt cttcgccctc tagetettet 1166 -39- 本紙張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱) " ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1279441 A7B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（37 ) •tcgtcctttc tgtcctgctc tttgctgttg atattcagct cgatagacta acccatctca 1226 tctcctggac attctrttac tggaaacgta tcttgtcctt ggtttttctt ggctttagtt 1286 gaaaatticct: ctccactcag gcc czg gag ccc tcc ate tee aag gag ate at:g 1339 ace ett cac cac dee aag cac cat cag act tat gtt aac ggc etc aac 1387 get gee gag gag age tac teg gcc get gtg ggc aag gag gat gta ett: 1435 acc cag gtt aag ett cag tet gtaegteega ccgttttttt atcgaccaga I486 acgcctggtg aggagggaga tgaagtttga tgagcgcrca tegtetagea cgttgacccg 1546 2·v-C〇·tSC3·三 〇C CtC 3.30 tΠC 3.3.C CSC 3.tZC S.d.tl C 15 8 9 creagtgata ttcttcaaac tettgergag caagtcaagt caagctgact gtttcgcttt 1549 gretergegg atctarctca teettgatrt ageatgatga aacag ac net ctg tee 1705 tgg aag aac ttg get ccc tat gga tee gag gag get acc etc tct.gaa 1753 gga cct ccc aag aag get: ate gag gas tet tet ggt tet ttc gag g 1799 ctccgticcat ctatcttcct attcagttgt grtitggttcc ggtatactca tctgttttgt 1859 tuccccacaa aataaaaata aaaatcttgt cctctccggg ggttcgactg cacgttcata 1919 5 cc ttc aag aag aag tee aac get gac acc get get gtc caa gga tee 1967 g5a tag ggc tgg ett gtatgtatca tatcctttcc atctcaaact cttctcagag 2022 tctttttcct tgagaettea aactgactat acatgtttct acaacaaaca acag ggc 2079 ttg aac ccg ett act aag aag ctg gaa gtc acc aeg acc gcc aac cag 2127 gac cct ctg ett a gtaagttgtt tctacatgat: tttctatctc aaegegatet . 2180 gcatgattcg tcactgattc actggattct ctcgtttcgc ttttctcggg atgatttcat 2240 aaacag ct cac att cct ate ate gga gtt gac gtgegtatet ttettgaata 2292 gtcgtagcgt ctgatcticgt: tttattgact: gacgtgttgc: ttctgtccaa atcattaaaa 2352 aaaatgaaaa caaataatcg attgaccgac gaaaacag ate tgg gag cac get ttc 2408 I tac ett cag tac aag aac gtc .aag cct gac tat etc get get gtt tgg 2456 I tee gtt ate aac tac aag gag gca gag gcc ega ttg cag get get etc 2504 I taa gcgggacgaa aagtaaegae atatgaaggg aggatcaaat atcgtttctt 2557 I cataaacaac tttegaggea gatgggagag tacgtacaag agaggtttgt atggagaatt 2617 I gagtttgttg acggttagca ggttatgata tatgtageta tagtetagte taaatctgaa 2677 I agaagagaac aagatggttt gteegaagag attgagagat caagcccggt catctgatgt 2737 I cgaacaaaca tgccctggtc tgccaacagt ttctagcaca ttatgaccat gttcatgtgt 2797 I aaattgggaa atgagccaga aaggtttatt atetaattea ttgattcatg cgactatgga 2857 I tacatatggg atttccagaa caaacagatg caacaaagca cggcattttc caaagatcga 2917 I gtcctcccac aagtatgegg caaggtttgt tgttaagaga tataaaagca gacgacaaaa 2977 -40- __ _____ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21G X 297公f

(請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---- I n H «ϋ 訂---------一 §. 1279441 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（38 ) caaatcgttt tagttgttgc gcagcgtcgc ttctctactt gacgttctca gaagaagatg taaaagtgtg aaaggaatgg acgaagcagt taggagagga gaagaagata atcgaccctg tgttcaaagg tgttcgggaa cttataggct agctgctgct tcgaaggcta acgagatgaa aggtgtcacc cggtggcctt gaaagagaag tgcgaagcaa tgcaccaaca agctccagac aagaaaaggc cttagctcaa tggaagcttt agggcgatga aatggagaaa ggccttccac agcctcgggc atgatgagat gacatacact ccgtgaccgt tggacgcttc aaaaaggaac gtcaactcac tccgagcttg aaagcacgaa agatgattcg ttcttgtact tcgtagatgc gtcaggatgc ttggaaagag ttgacgagtt caagcttcaa agagcgataa atgtctttgg ccagtaggtc gatattagct caccatcgac cctcaacgtt tgatgaaaca ttgcttcact cttgaaccat ggtagagttg 3037 caacttctcg 3097 gcatatgtga 3157 cggtaccgaa 3217 cctggttgga 3277 atcggcgcga 3337 gacctcgacc 3397 gacgaagatg 3457 caata§gtag 3517 gtagatggag 3577 tgtag 3632 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 <210> 2 <211> 3375 <212> DNA <213> 紅酶法菲亞酵母 <220> <221> 5'UTR <222> (974) . . (975) <223> 實驗性的rAL <220> <221>表蜆序列 <222> (1040)..(1063) <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> 插入序列 (1064) . . (1237) 表現序列 (1238)..(1280) 插入序列 (12Q1)..(1358) 表現序列 (13S9) · · (1402) 插入序列 (1403) . · (1483) ，現序列 (1484)·.(1589) 插入序列 (ΐ59〇)·.(1β74) _1 n ϋ* ϋ ·ϋ·-，，· ·ϋ 1··· n ϋ ϋ ammaB ι -νδ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑽χ 297 41 - 1279441 A7 B7 五、發明說明（39 ) <220> <221>表現序列 <222> (1675) . . (1826) <220> , <221>插入序列 <222> (1827) . . (1907) <220> … <221>表現序列 <222> (1908) . . (1922) <220> . <221>插入序列 <222> (1923) . · (1992) <220> … <221>表現序列 <222> (1993) . . (2056) <220> ' <221> _入序列 <222〉 （2057).·(2131) <220> ^ γ <221>表現序列 <222> (2132) . . (2157) <220> _ , <2 21>插入序列 <222> (2158) . . (2238) <220> .·，' <221>表現序列 <222> (2239) . . (2293) <220> . <221>插入序列 <222> (2294)..(2376) <220> <221>表現序列 <222> (2377)..(2426) <220> <221>插入序列 <222> (2427) . . (2524) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <220> <221>表現序列 <222> (2525) . . (2542) <220> <221> 聚人-爸置. <222> (2667Τ..(2668) <223 > 實驗性的.· <4 00 > 2 cttatccttc tgccgctggt ctctgtctgt cgagtgtgtg ggatggtttt ggatatgttc 60 ctatacgaaa ggtagcgcag agcaaagctg acagtattaa gcaagacaag agcttctttc 120 tgttgacaga tgaaaggacg aactatgaag ctgtccatgc tccccaaacc gattgacaca 180 ccgccgtcag gcaacgcaga atttctcact gcttcgacgt cacaccaaca tcgatcctcc 24 0 -42 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 B7 五、發明說明（4C) atacctaaaa gcagatcgag acacattgtt ggtcgccatg ttggatggat gtacatcaaa 300 cccacagcat atatcactca' catgtgagaa ctccgtagcc tctaccttct tgtctctcaa 360 tctgaatgtc tcgttgagag gtggaatgaa tgtttacagt ttgagaagac gaaagaaaga 420 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) aagagaagag aagagaggaa tacgtacgac gaagttatca tcgtatggga acttttctaa 480 aaaactgcct atagtagaga cgatctctgg aggaaagctc tgtagtatga tagtgaagag 540 cgagcaagtc tgggcaagtg catccttcgt ctacaagaaa gagaccagga aatgaaggag 600 agacgagtaa gcaggtacct accgatattg gatcgtucuc tctacccagc gatgccttca 660 ccacacgttc tatctcttct tgggatggca gatacatact taacgagagc aatctgatgt 720 ataccgaact tcgaacggaa tgatcccaga atcctcttga acccttgaac ccttgaaccc 780 tggaaccaag taccaaccga gcaacacgcc gatacggtcc acaccacaga accacacgcc 840 ctcgtcatta aaggtgggac gcgccgatgc tcgttacgtt cggcccaatc cggaagttac 900 cggcttggac gtgcctgtaa ccatgccctg acggtatttc gccttcagct aactccatct 960 catctttttc ctttactacc acaacccacc cttgaacctt ctitccccggc ttttttacta 1020 tatccatcta tcaatcatc atg get cct tac act ett ccc gac gtaagcttaa 1073 agtttgagct gtgtgtgctt atctcaatct tggagttgaa ctcaccgttt tttgtttttg 1133 cttcctggtt tttttatcgg catccctcct ttttttcccc tcgtggtcgc atatgatttg 1193 ctcatcaatc ggcgtttccc atgeatettt gtcatccgtt tcag ett cct tac get 1249 tac gat gee ttg gag cct tac ate tet aag g gtgagattet tagtca*gact 1300 gttgttccgg ttcgacacga tagetaateg tctctcgttc ctcaatatga acatgcaj 1358 aa ate atg ate ett cac cac tee aag cac cat'cag act tac gtc 1402 gtaegtaate taaaggtcat ctccgtctac ategeeggat caacttgctG atagatette 1462 cttctgttcg gegetaegta g acc aac etc aac gee get ate cag get ttc 1513 tee cag ac.c aat gac ate aag gee cag ate get ett cag age get etc 1561 aag ttc aac gga gga gga cac ate aac c gtacgatcat tctccctctt 1609 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ctggcttatc atatgtgttg cttgtcacta acacgcatgc aaccccggga tatctcaccc 1669 tgtag ac tee etc ttc tgg aag aac atg. get cct gee gac tet get gat 1718 gee aag etc acc gag gga teg etc aag act gee ate gac aag gac ttt 1766 gga tee ttc gag gag ttc aag aag aag ttc aac act get act etc ggt 1814 gtc cag gga tet gteagtatet cgtttgcttc gacatactct cagctttcct 1866 tccgtaaact gaegaatagt ttttcggaca tgtacttgta g gga tgg gga tgg etc 1922 gtgcgtttga cctttttcca ctttgaacat tagegatagt gatacctaac aactgtgaat 1982 tggaatatag gga tac aac acc get acc aag cac etc gag ate gee acc 2031 acc gee aac cag gat ccc ett ate a gtatgtgact tctctcgtgt 2076 -43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1279441 A7 B7 五、發明說明（41 ) ggtcaccata agccagttgc tgacacattt cgttcgctgt ctctcgactt cgtag ct 2133 ttg act ccc ate att ggt ett gac gttagtaatt etatetagtg attggagteg 2187 agttctgaac ttgcct.tgat ctcaaacgaa tgaatcaatt tcttttggta g ate tgg 2244 gag cac get .ttc tac etc cag tac aag aat gtc aag cct gat ：tac ett. g 2293 gtaegtaatt ctctattcgt ttgccccggt ttgatctttg actcactctt caaaatgttt 2353 ticgtttgta actttgaaaa acag cc get ttc tgg aac :gtc tgc aac ttt get 2405 gag get cac [ega agg ttt gat gtgagtacag gcgctacccc taeggaggaa 2456 gcgaaggtga gctgaccact ttttatcttc ctgatttgga atgaaegate cgatgatcaa 2516 acaaacag get get gtc aag get taa tggtcccatt tatctctttg attegaegge 2572 gatgaegget ttctcgcatc egaagaagge aaggctatga ttactgttat tctgccatgt 2632 tgcttgcttt getatgetet atgttctttt cttttgcctc tcttcaaagc caaggcgtta 2692 aggaaggccc ttcagtctgt tttacatatg cacatataca tgagaacata tcacggactc 2752 ggcggctggt ggtcctcttg agegtegget tcaagattag tgtccacacg tgaagcgttc 2812 ggtgccatcc aacctggtag gaatccccat cgggcgggaa tccaattatc aattggcggt 2872 cggccagatt egageteggg tatctcagaa gcgtcaagcg ggcgcatttc caggccttta 2932 agaggagcaa atttaatccg cctgggtgtt cagcgagaca cgaacagttt gaaacagagt 2992 ctgcttgtga gttactcggc gagatcactg aggactaaac tttctcagct cgtggacgaa 3052 aagaacgaac caaacggtct 'tccctgtatc tcgaccatct ccttctccat ctcttacaac 3112 acctcggatg aactccaagg ct-tgctttcc' aaagttcaaa caaactccgg gttgccatcc 3172 acctggtttg tetetaaega geegagggat atccatcgtt cggaacgttt gaacagactg 3232 gatggtaggt ggccggtcgc tteggaagee aatcataatg gtgggaatcg agagaaggaa 3292 tgattgggcc cagtgtttaa gacttgtgtt tgttggcaga gtaeggaegg aaagtaggac 3352 agacttaatc aaggcgagcc aag 3375 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝—---^ ·111111. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 3 <211> 951 <2i2> DNA <213: 紅酶法菲亞酵母 <220> <221>表現序列 <222> (1)..(34) <220> . <221>插入序列 <222> (35)..(115) <220> <221>表現序列 <222> (117)..(159) <220> ^ <221>插入序列 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 ΚΙ __Β7 _ 五、發明說明（42 ) <222> (160) . . (242) <220> . t <221> 表現序列 <222> (243) . . (363) <220> . . N ^ <221>插入序列 <222> (364)..(436) <220> , <221>表現序列 <222> (437)..(951) <400> 3 tcc gga age tea gat acc get ega gat cct ega g gtttgtgtgc 44 tttcgctttg ttcgcatgga tgaagctgtt aacttaaaaa aatcctcgtg tttctctttg 104 tttcaacata g gt ttc tet ett aag gtc aag acc tet gag gga aac tgg 153 gac ttt gtaegtatte ttatcgactg agtcatcaag ctcgttatcg ctctcttacc 209 ctcatccttt tgtgtctctg tctacacctc tag gtc gga aac aac act ccc ate 263 ttt ttc ttg aga gac cca gee aag ttt ccg ate ttc att cac acc cag 311 aag agg aac ccg cag aca aac tet aaa gac aag gac get ttc tgg gac 359 tac c gttegtata accttgtcac tccctgcgtg ccgctccgat tcatgttgac 412 cttgtctttg atataatttt atag ta tec caa aac ccc gag tec gtg cat cag 465 gtg ctg cac ctg ttc agt gat ega gga acc cct get tet tac ega cac 513 atg cat ggt tac tet gga cac acc ttc aag atg gtc aac agg aac ggt 561 gac.tgg aat tat gtc cag att cac atg ege acc gat cag ggt gtc aag 609 act cac acc aat gaa gag get teg aaa etc gac gee tec aat ccc gat 657 tca aac gac gac ttg ttc gac gca acc aag aat gga gac ttc cct 705 age tgg aeg gtt. cag gta cag gta atg tet cct gag cag gee cag aag 753 ttc aga tac aac att ctg gat etc acc aag gtc tgg tec cac aag gag 801 ttc cca ett agg aeg att gga aag ttc act ttg aac ega aac gtg gat 849 aac tat ttc gca gag gtt gaa cag etc gee ttt get cct tec cat ctg 897 cct cct gga ate gag ccc teg aac gat ccc gtc ett cag get ega eta 945 ttc tec 951

<210> 4 <211> 669 <212> DNA <213> 紅酶法菲亞酵母 <220> <221> CDS <222> (1)..(669) <400> 4 ____-45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝——II 訂·!—Sim i. 1279441 A7 B7 五、發明說明（ 43 M·濟部智慧財產局員工消費合作社印製 atg tct gtt cga gca tcc etc tct tee gtg tet aga cag act ttc gtc Met Ser Val Arg Ala Ser Leu Ser Ser Val Ser Arg Gin Thr Phe Val 1 5 10 15 get cct get get ttc cag ate agg gca aag cat acc ctg cct gag ett Ala Pro Ala Ala Phe Gin lie Arg Ala Lys His Thr Leu Pro Glu Leu 20 25 30 cct tac get tac gat gee ctg gag ccc tec ate tec aag gag ate atg Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro Ser lie Ser Lys Glu lie Met 35 40 45 acc ett cac cac acc aag cac cat cag act tat gtt aac ggc etc aac Thr Leu His His Thr Lys His His Gin Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn 50 55 60 get gee gag gag age tac teg gee get gtg ggc aag gag gat gtg ett Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ser Ala Ala Val Gly Lys Glu Asp Val Leu 65 7〇 75 80 acc cag gtt aag ett cag tct get etc aag ttc aac gga gga gga cac Thr Gin Val Lys Leu Gin Ser Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His 85 90 95 ate aat cac tct ccg ttc tgg aag aac ttg get ccc tat gga tec gag lie Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Gly Ser Glu 100 105 110 gag get acc etc tct gaa gga cct etc aag aag get ate gag gaa tct Glu Ala Thr Leu Ser Glu Gly Pro Leu Lys Lys Ala lie Glu Glu Ser 115 120 125 ttt agt tct ttc gag gee ttc aag aag aag ttc aac get gac acc get Phe Gly Ser Phe Glu Ala Phe Lys Lys Lys Phe Asn Ala Asp Thr Ala 130 135 140 get gtc caa gga tec gga tgg ggc tgg. ett ggc ttg aac ccg ett act .Ala Val Gin Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Leu Asn Pro Leu Thr 145 150 155 160 aag aag ctg gaa gtc acc aeg acc gee aac cag gac cct ctg ett act Lys Lys Leu Glu Val Thr Thr Thr Ala Asn Gin Asp Pro Leu Leu Thr 165 170 · 175 cac att cct ate ate gga gtt gac ate tgg gag cac get ttc tac ett His lie Pro lie lie Gly Val Asp lie Trp Glu His Ala Phe Tyr *Leu 180 185 190 cag tac aag aac gtc aag cct gac tat etc get get gtt tgg tec gtt Gin Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu Ala Ala Val Trp Ser Val 195 200 205 ate aac tac aag gag gca gag gee cga ttg cag get get etc taa lie Asn Tyr Lys Glu Ala Glu Ala Arg Leu Gin Ala Ala Leu 21〇 215 220 <210> 5 <211> 222 <212>蛋白質 <213>紅酶法菲亞酵母· <400> 5 Met Ser Val Arg Ala Ser Leu Ser Ser Val Ser Arg Gin Thr Phe Val 10 15 5 46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 669 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝 訂-------- 1279441 A7 B7 五、發明說明（44)

Ala Pro Ala Ala Phe Gin lie Arc Ala Lvs His Thr Leu Pro Glu Leu 20 25 30

Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu Glu Pro Ser lie Ser Lys Glu lie Met 35 40 45

Thr Leu His His Thr Lys His His Gin Thr Tyr Val Asn Gly Leu Asn 50 55 60

Ala Ala Glu Glu Ser Tyr Ser Ala Ala Val Gly Lys Glu Asp Val Leu 65 70 75 80

Thr Gin Val Lys Leu Gin Ser Ala Leu Lys Phe Asn Gly Gly Gly His 85 90 * 95 lie Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Leu Ala Pro Tyr Gly Ser Glu 100 105 110

Glu Ala Thr Leu Ser Glu Gly Pro Leu Lys Lys Ala lie Glu Glu Ser 115 120 125

Phe Gly Ser Phe Glu Ala Phe Lys Lvs Lys Phe Asn Ala Asp Thr Ala 130 135 * " 140

Ala Val Gin Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu Gly Leu Asn Pro Leu Thr 145 150 155 160

Lys Lys Leu Glu Val Thr Thr Thr Ala Asn Gin Asp Pro Leu Leu Thr 165 170 175

His lie Pro lie lie Gly Val Asp lie Trp Glu His Ala Phe Tyr Leu 180 185 190

Gin Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Τγζ Leu Ala Ala Val Trp Ser Val .195 200 205 工le.Asn Ty.r Ly*s Glu Ala Glu Ala Arg Leu Gl-n Ala Ala Leu ，210 215 220

<210> 6 <211〉 597 <212>.DNA <213 > 紅酶法菲亞酵母 <220> <221〉 CDS <222> (1) . . (597) <400> 6 atg get cct tac act ett ccc gac ett cct tac get tac gat gcc· ttg 48

Met Ala Pro Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr Ala Tyr Asp Ala Leu 1 5 10 . 15 gag cct tac ate tet aag gaa ate atg ate ett cac cac tcc aag cac 96

Glu Pro Tyr lie Ser Lys Glu lie Met: lie Leu His His Ser Lys His 20 25 30 cat cag act tac gtc acc aac etc aac gcc get ate cag get ttc tcc 144

His Gin Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala lie Gin Ala Phe Ser 3 5 4 0 45 cag acc aat gac ate aag gcc cag ate get ett cag age get etc aag 192

Gin Thr Asn Asp lie Lys Ala Gin lie Ala Leu Gin Ser Ala Leu Lys 50 55 60 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公髮） (清先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，裝i ——— --訂-------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（45 ) ttc aac gga gga gga cac ate aac cac tee etc ttc tgg aag aac atg 240

Phe Asn Gly Gly Gly His lie Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Met 65 70 75 80 get cct gee gac tet get gat gee aag etc acc gag gga teg etc aag 288

Ala Pro Ala Asp Ser Ala Asp Ala Lys Leu Thr Glu Gly Ser Leu Lys 85 90 95 act gee ate gac aag gac ttt gga tee ttc gag gag ttc aag aag aag 336

Thr Ala lie Asp Lys Asp Phe Gly Ser Phe Glu Glu Phe Lys Lys Lys 100 105 110 ttc aac act get act etc ggt gtc caa gga tet gga tgg gga tgg etc 384

Phe Asn Thr Ala Thr Leu Gly Val Gin Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu 115 120 125 gga tac aac acc get acc aag cac etc gag ate gee acc acc gee aac 432

Gly Tvr Asn Thr Ala Thr Lys His Leu Glu 工le Ala Thr Thr Ala Asn 130 135 140 cag gac ccc ett ate act ttg act ccc ate att ggt ett gac ate tgg 480

Gin Asp Pro Leu lie Thr Leu Thr Pro lie lie Gly Leu Asp lie Trp 145 ^ 150 155 160 gag cac get ttc tac etc cag tac aag aat gtc aag cct gat tac ett 528

Glu His Ala Phe Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu 165 170 * 175 gee get ttc tgg aac gtc tgc aac ttt get: gag get cag ega agg ttt 576

Ala Ala Phe Trp Asn Val Cys Asn Phe Ala Glu Ala Gin Arg Arg Phe 180 185 190 gat get get gtc aag get taa 597

Asp Ala Ala Val Lys Ala 195

<210> 7 <211〉 19S <212> 蛋白質 <213〉紅酶法菲亞酵母 <400> 7

Met Ala Pro Tyr Thr Leu Pro Asp Leu Pro Tyr. Ala Tyr Asp Ala Leu •1 5 10 15

Glu Pro Tyr lie Ser Lys Glu lie Met lie Leu His His Ser Lys His 20 25 30

Kis Gin Thr Tyr Val Thr Asn Leu Asn Ala Ala lie Gin Ala Phe Ser 35 40 45

Gin Thr Asn Asp He Lys Ala Gin He Ala Leu Gin Ser Ala Leu Lys 50 55 60 ?he Asn Gly Gly Gly His lie Asn His Ser Leu Phe Trp Lys Asn Met 65 70 75 80

Ala Pro Ala Asp Ser Ala Asp Ala Lys Leu Thr Glu Gly Ser Leu Lys 85 90 .95

Thr Ala He Asp Lys Asp Phe Gly Ser Phe Glu Glu Phe Lys Lys Lys 100 105 110

Phe Asn Thr Ala Thr Leu Gly Val Gin Gly Ser Gly Trp Gly Trp Leu 1_____-48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公f ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1279441 A7 B7 五、發明說明（46) 115 120 125

Gly Tyr Asn Thr Ala Thr Lys His Leu Glu He Ala Thr Thr Ala Asn 130 135 140

Gin Asp Pro Leu lie Thr Leu Thr Pro lie 工le Gly Leu Asp lie Trp 145 150 155 ^ 160

Glu His Ala Phe Tyr Leu Gin Tyr Lys Asn Val Lys Pro Asp Tyr Leu 165 " 170 ^ 175

Ala Ala Phe Trp Asn Val Cys Asn Phe Ala Glu Ala Gin Arg Arg Phe 180 185 190

Asp Ala Ala Val Lys Ala 195 <210> 8 <211> 714 <212 > ,DNA .， , <213> '紅酶法菲亞酵母. <220〉 <221> CDS <222> (1) . . (714) <400> 8 tcc gga age uca gau acc get ega gat cct ega ggt ttc tet ett aag 48

Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ala Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 gtc aag acc tet gag gga aac tgg gac ttt gtc gga aac aac act ccc 96

Val Lys Thr Ser Glu Gly Asn Trp Asp Phe Val Gly Asn Asn Thr Pro 20 25 30 ate ttt ttc ttg aga gac cca gcc aag ttt ccg ate ttc att 'cac acc 144 lie Phe Phe Leu Arg Asp Pro Ala Lys Phe Pro lie Phe lie His Thr .35 40 45 cag aag agg aac ccg cag aca aac tet aaa gac aag gac get ttc tgg 192

Gin Lys Arg Asn Pro Gin Thr Asn Ser Lys Asp Lys Asp Ala Phe Trp 50 55 60 gac tac eta tcc caa aac ccc gag tcc gtg cat cag gtg ctg cac ctg 240

Asp Tyr Leu Ser Gin Asn Pro Glu Ser Val His Gin Val Leu His Leu β5 70 75 80 ttc agt gat ega gga acc cct get tet tac ega cac atg cat ggt tac 288

Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Arg His Met His Gly Tyr 85 90 95 tet gga cac acc ttc aag atg gtc aac agg aac ggt gac tgg aat tat 336

Ser Gly Kis Thr Phe Lys Met Val Asn Arg Asn Gly Asp Trp Asn Tyr 100 105 · 110 gtc cag att cac atg ege acc gat cag ggt gtc aag act cac acc aat 384

Val Gin lie His Met Arg Thr Asp Gin Gly Val Lys Thr His Thr Asn 115 120 125 gaa gag get teg aaa etc gac gcc tcc aat ccc gat tea aac gga gac 432

Glu Glu Ala Ser Lys Leu Asp Ala Ser Asn Pro Asp Ser Asn Gly Asp 130 135 140 * gac ttg ttc gac gca ate aag aat gga gac ttc cct age tgg aeg gtt 480 !___ -49-_：__ ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1279441 A7 B7 五、發明說明（47 )

Asp Leu Phe Asp Ala lie Lys Asn Gly Asp Phe Pro Ser Trp Thr Val 145 150 155 160 cag gta cag gta atg tct cct gag cag gcc cag aag ttc aga tac aac 528

Gin Val Gin Val Met Ser Pro Glu Gin Ala Gin Lys Phe Arg Tyr Asn 165 170 175 att ctg gat etc acc aag gtc tgg tcc cac aag gag ttc cca ett agg 576 lie Leu Asp Leu Thr Lys Val Trp Ser His Lys Glu Phe Pro Leu Arg 180 185 * 190 aeg at仁 gga aag ttc act ttg aac ega aac gtg gat aac tat ttc gca 624

Thr lie Gly Lys Phe Thr Leu Asn Arg Asn Val Asp Asn Tyr Phe Ala 195 200 205 gag gtt gaa cag etc gcc ttt get cct tcc cat ctg cct cct gga ate 672

Glu Val Glu Gin Leu Ala Phe Ala Pro Ser Kis Leu Pro Pro Gly lie 210 215 220 gag ccc teg aac gat ccc gtc ett cag get ega eta ttc tcc 714

Glu Pro Ser Asn Asp Pro Val Leu Gin Ala Arg Leu Phe Ser ·， 225 230 235 <210> 9 <211> 238 <212>蛋白質 <213>紅酶法菲亞酵母 <400> 9

Ser Gly Ser Ser Asp Thr Ala Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ser Leu Lys 1 5 * 10 15

Val Lys Thr Ser Glu Gly Asn Trp Asp Phe Val Gly Asn Asn Thr Pro 20 25 30 lie Phe Phe Leu Arg Asp Pro Ala Lys Phe Pro lie Phe lie His Thr · 35 40 45

Gin Lys Arg Asn Pro Gin Thr Asn Ser Lys Asp Lys Asp Ala Phe Trp 50 55 ' * 60 *

Asp Tyr Leu Ser Gin Asn Pro Glu Ser Val Kis Gin Val Leu His Leu 65 70 75 . 80 '

Phe Ser Asp Arg Gly Thr Pro Ala Ser Tyr Arg His Met His Gly Tyr 85 90 95

Ser Gly His Thr Phe Lys Met Val Asn Arg Asn Gly Asp Trp Asn Tyr 100 105:. 110

Val Gin lie His Met Arg Thr Asp Gin Gly Val Lys Thr His Thr Asn 115 120 125

Glu Glu Ala Ser Lys Leu Asp Ala Ser Asn Pro Asp Ser Asn Gly Asp 130 135 140 *

Asp Leu Phe Asp Ala lie Lys Asn Gly Asp Phe Pro Ser Trp Thr Val 145 150 ^ 155 160

Gin Val Gin Val Met Ser Pro Glu Gin Ala Gin Lys Phe Arg Tyr Asn 165 170 175 lie Leu Asp Leu Thr Lys Val Trp Ser His Lys Glu Phe Pro Leu Arg 180 185 190 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---------訂-------- Φ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1279441 A7 B7 五、發明說明（48

Thr lie Gly Lys Phe Thr Leu Asn Arg Asn Val Asp Asn Tyr Phe Ala 195 200 205 Glu Val Glu Gin Leu Ala Phe Ala Pro Ser His Leu Pro Pro Gly lie 210 215 220 Glu Pro Ser Asn Asp Pro Val Leu Gin Ala Arg Leu Phe Ser 225 230 235 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213 人造的序列 <220： <223: 人造序列的説明：Sodl(選殖SOD基因的有意義引子） <400> 10 aarcavcavc aracntavgt naa <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213 > 人造的序列 iquence 23 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <220> <223> 人造序列的説明：Sod4(選殖SOD基因的反義引子） <400> 11 gcccanccng anccytgnac ncc 23 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> ‘人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：Sodl4(建構S0D1-中斷質體的有意義引于） <400> 12 ggtacctccg atgataggaa tgtgag 111^ 裝---1 I----訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 26 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213 >人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：(建構S0D1-中斷質體的反義引子） <400> 13 gaattcagtt caacggagga ggacac <210> 14 <211> 26 ^張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 x 297公釐厂 51 - 26 1279441 A7 B7 五、發明說明（ 49 :212> DNA :213> 人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：Sod47(建構S0D2-中斷質體的有意義引子） <400> 14 gaattcggag gaggacacat caaccg 6 2 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> 人造的序列 <220： <223: 人造序列的説明：Sod48(建構SOD2-中斷質體的反義引子） <400> 15 ggtacctgta ctggaggtag aaagcg 6 2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 人造序列的説明：Sod2(選殖CAT基因的有意義引子） <400> 16 , mgnttytcna cngtnggngg nga 3 2 H ϋ n ϋ I H ϋ 1 1 I ϋ ϋ *<210> 17 <211> 23 :<212> DNA <21'3>人造的序列 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <220> <223> 人造序列的説明：Cat5(選殖CAT基因的反義引子） <400> 17 ckrtgnckyt gngtrtcngg rta 3 2 -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1279伞M91252i8號專利申請案 中文申睛專利範圍替換太(的车〗〗日、 A8 B8 C8 D8 95,11· 2 7 修正 |年月日 六 、申請專利範園f 泰JL·:' .、食 1· 一種重組多核甞酸序列，其包括選自由序列識別丨和4號 組成之群之多梭苷酸，以及在以下高嚴格度雜交和沖洗 條件下·· 咼嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/亳升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 尚嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 〇·1Χ SSC，0·5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核甞酸，其中 «玄夕核芬酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（s〇D)活性之 多肽。 2.根據申請專利範圍第1項之重組多核誓酸序列，其中該 多核#酸包括序列識別丨號或序列識別4號。 3 ·根據申請專利範圍第2項之重組多核菩酸序列，其中該 多核苷酸為序列識別i號。 4·根據申請專利範圍第2項之重組多核菩酸序列，其中該 多核甞酸為序列識別4號。 5 · 種载體’其包括選自由序列識別1和4號組成之群之多 67640-951127.doc _ 1 本紙張尺度適用t關家鱗(CNS) Μ規格(21()χ297公爱) A8 B8 C8 T^Q

1279441 核甞酸，以及在以下高嚴格度雜交和沖洗條件下·· 尚嚴格度雜交：, 6X SSC 0.5% SDS 100微克/耄升變性的經精Dna 50%甲醯胺 在42 C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0· IX SSC’ 〇·5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核荅酸，其中 該多核甞酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（s〇D)活性之 多肽。 6·根據申請專利範圍第5項之載體，其中該多核苷酸包括 序列識別1號或序列識別4號。 7·根據申請專利範圍第5項之載體，其中該多核苷酸為序 列識別1號' 8_根據申請專利範圍第5項之載體，其中該多核菩酸為序 列識別4號。 9· 一種中斷卡匣，其中斷選自由序列識別1和4號組成之群 之多核苷酸，以及在以下高嚴格度雜交和沖洗條件下: 高嚴格度雜交： 6X SSC 67640-951127.doc -2-

A8 B8 C8 D8 1279441 六、申請專利範圍 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗·· 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0.1X SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 可與序列識別1或4號互補序列雜交，且編碼具有粒線 體超氧物岐化酶（SOD)活性之多肽之序列，其中該中斷 卡匣包括可選擇標記及該多核苷酸片段。 1〇·根據申請專利範圍第9項之中斷卡匣，其中該被中斷之 多核甞酸係位於屬於選自由無核原蟲（Monera)、原生生 物（Protista)和真菌(Fungi)組成之群之界之生物。 11 ·根據申請專利範圍第10項之中斷卡匣，其中該生物屬於 選自由歐文氏菌（Erwinia)、紅色桿菌（Rhodobacter)、黏 液菌（Myxococcus)、黃桿菌（Flavobacter)、副球菌 (Paracoccus)、赛内奇球菌（Synechococcus)、賽内奇囊 球菌（Synechocystis)、土 壤桿菌（Agrobacterium)、鏈黴 菌（Streptomyces)、血液球菌（Haematococcus)、多納利 菌(Dunaliella)、法菲亞酵母菌（Phaffia)、葉黃素黴 (Xanthophyllomyces)、鏈孢黴（Neurospora)、紅酵母 67640-951127.doc -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A8 B8 C8 D8

1279441 六、申請專利範園 (Rhodotorula)、布拉黴（Blakeslea)或藻狀菌 (Phycomyces)組成之群之屬。 12 ·根據申請專利範圍第9項之中斷卡匣，其中該多核芬㉟ 包括序列識別1號或序列識別4號。 13 ·根據申請專利範圍第12項之中斷卡匣，其中該多核菩酉& 為序列識別1號。. 14·根據申請專利範圍第12項之中斷卡匣，其中該多核菩酸 為序列識別4號。 15· —種載體，其包括根據申請專利範圍第9項之中斷卡 匣。 16· —種用於中斷微生物内多核甞酸之中斷卡匣，該中斷卡 匣包括可選擇標記和選自由序列識別1和4號組成之群之 多核甞酸片段，以及在以下高嚴格度雜交和沖洗條件 下： 高嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/亳升變性的鮭精DnA 50%甲醯胺 在42 C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗·· 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS冲 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0·1Χ SSC，0.5% SDS沖洗另一次 67640-951127.doc -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公釐）. 1279441

15分鐘； 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核甞酸，其中 該多核苷酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（s〇D)活性之 多肽。 ^ 一種用於產製類胡蘿蔔素的重組生物，其包括至少一為 對該多核甞酸有專一性之中斷卡匣所中斷之多核菩酸， 其中該重組生物屬於無核原蟲界、原生生物界或真菌 界，且該多棱苷酸係選自在以下高嚴袼度雜交和沖洗條 件下： 鬲嚴格度雜交·· 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 南嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0.1X SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 與序列識別1或4號互補之群，其中該多核芬酸編碼具 有粒線體超氧物岐化酶（SOD)活性之多肽。 18·根據申請專利範圍第17項之重組生物，其中該重組生物 屬於選自由歐文氏菌、紅色桿菌、黏液菌、黃桿菌、副 67640-951127.doc _5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐） 1279441

球菌、賽内奇球菌、賽内奇囊球菌、土炉 工碾杯着、鏈黴 19. 菌、血液球菌、，多納利菌、法菲亞酵母菌、葉黃素黴·’’ 鏈孢黴、紅酵母、布拉黴和藻狀菌組成之群之屬=(、 根據申請專利範圍第17項之重組生物 包括序列識別1號或序列識別4號。 其中該多核与:酸 2〇·根據申請專利範圍第19項之重組生物，其中該多核嘗妒 為序列識別1號。 ·文 21·根據申請專利範圍第19項之重組生物，其中該多梭誓酸 為序列識別4號。 22· —種用於產製類胡蘿蔔素的重組微生物，其包括至少一 為中斷卡E所中斷之多核菩酸，其中該多核芬酸係選自 由序列識別1和4號組成之群，以及在以下高嚴格度雜交 和沖洗條件下： 高嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0.1X SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘； -6 - 67640-951127.doc 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）. 1279441 六 、申請專利範園 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核甞酸，其中 該多核甞酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（s〇D)活性之 多肽。 23· -種用於產製類胡蘿蔔素的方法，纟包括於培養基中培 養可產製類胡蘿蔔素且具有至少一為對該多核荅酸有專 f生之中辦卡g所中斷之多核苷酸之重組生物，其中 該重組生物屬於無核原蟲界、原生生物界或真菌界，且 該多核菩酸係選自由序列識別丨和4號組成之群，以及在 以下兩嚴格度雜交和沖洗條件下： 高嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鯉精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 〇·1Χ SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘，· 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核甞酸，其中 該多核苷酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（s〇D)活性之 多肽，並從該培養物中回收類胡蘿蔔素。 24.根據申請專利範圍第23項之方法，其中該重組生物屬於 67640-951127.doc 1279441 ABCD 夂、申請專利範圍 選自由歐文氏菌、紅色桿菌、黏液菌、黃桿菌、副球 菌、赛内奇球菌、賽内奇囊球菌、土壤桿菌、鏈黴菌、 血液球菌、多納利菌、法菲亞酵母菌、葉黃素黴、鏈孢 撤、紅酵母、布拉黴和藻狀菌組成之群之屬。 25·根據申請專利範圍第24項之方法，其中該重組生物品系 為紅酶法菲亞酵母（P. rhodozyma：)。 26·根據申请專利範圍第25項之方法，其中該重組生物為紅 酶法菲亞酵母ATCC 98594。 27·根據申請專利範圍第23項之方法，其中該多核菩酸為序 列識別1號。 28·根據申請專利範圍第23項之方法，其中該多核答酸包括 序列識別1號或序列識別4號。 2 9.根據申凊專利範圍第2 3項之方法，其中該多核答酸為序 列識別4號。 3〇· —種用於產製類胡蘿蔔素的方法，其包括於培養基中培 養可產製類胡蘿蔔素且具有至少一為中斷卡匣所中斷之 多核謀酸之重組微生物，其中該多核甞酸係選自由序列 識別1和4號組成之群，以及在以下高嚴格度雜交和沖洗 條件下： 高嚴格度雜交·· 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的經精DNA 50%甲醯胺 67640-951127.doc -8- I紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公爱λ " ----- 1279441 六、申請專利範圍 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次1 5分鐘，接著在室溫下以 0.1X SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核甞酸，其中 該多核苷酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（SOD)活性之 多肽，並從該培養物中回收類胡蘿蔔素。 31. —種選殖編碼超氧物岐化酶（SOD)之多肽的方法，其包 括可用作探針或引子而選自由序列識別1和4號組成之群 之多核甞酸序列， 以及在以下高嚴格度雜交和沖洗條件 下： 高嚴格度雜交： 6X SSC 0.5% SDS 100微克/毫升變性的鮭精DNA 50%甲醯胺 在42°C下培養過夜，並溫和地搖 動； 高嚴格度沖洗： 在室溫下以2X SSC，0.5% SDS沖 洗1次15分鐘，接著在室溫下以 0.1X SSC，0.5% SDS沖洗另一次 15分鐘； 67640-951127.doc •9- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）. A8 1279441 g D8 六、申請專利範圍 可與序列識別1或4號互補序列雜交之多核苷酸，其中 該多核甞酸編碼具有粒線體超氧物岐化酶（SOD)活性之 多肽。 32·根據申請專利範圍第31項之方法，其中該多核甞酸包括 序列識別1號或序列識別4號。 33. 根據申請專利範圍第32項之方法，其中該多核甞酸為序 列識別1號。 34. 根據申請專利範圍第32項之方法，其中該多核甞酸為序 列識別4號。 67640-951127.doc - 10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐）·