WO2004022586A2 - Tubulysin-biosynthese-gene - Google Patents

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WO2004022586A2
WO2004022586A2 PCT/EP2003/009780 EP0309780W WO2004022586A2 WO 2004022586 A2 WO2004022586 A2 WO 2004022586A2 EP 0309780 W EP0309780 W EP 0309780W WO 2004022586 A2 WO2004022586 A2 WO 2004022586A2
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Rolf Mueller
Florenz Sasse
Axel Sandmann
Helmut Bloecker
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring

Definitions

  • tubulysins have a cytostatic or antimitotic effect on fungi, human tumors or cancer cell lines and other animal cell cultures (see “ Table " ). They lead to a rapid breakdown of the microtubule scaffold in the cells. The actin skeleton is retained. Adherent growing L929 mouse - Cells increase their cell volume under the influence of the tubulysins without dividing and develop large cell nuclei, which then disintegrate in an apoptical process. Wirkunsspektrum
  • Agar diffusion test 20 ⁇ g per test sheet 6 mm in diameter
  • the invention relates to an ss-DNA molecule selected from the following group:
  • ss-DNA molecule which with an ss-DNA molecule according to (i) with respect to its nucleotide number or its nucleotide sequence to 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, respectively , Is 99 or 100% homologous, but differs from the ss-DNA molecule according to (i) with regard to its nucleotide number and / or its nucleotide sequence in at least one nucleotide; and
  • the invention further relates to a ds-DNA molecule composed of an ss-DNA molecule according to the invention and a strand complementary thereto.
  • the invention relates to an ss-DNA molecule selected from the following group: (i) ss-DNA molecule with a sequence of positions 3,308 to 1 (ORF 16) of the sequence according to FIG. 1;
  • (xxiv) ss-DNA molecule, which with a molecule according to (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), (xix), (xx), (xxi), (xxii) or (xxiii ) can be hybridized under stringent conditions and in particular has the same number of bases; and
  • (xxv) ss-DNA molecule which with an ss-DNA molecule according to (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), (xix), (xx), (xxi ), (xxii) or (xxiii) is 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100% homologous with respect to its nucleotide number or its nucleotide sequence, but from this ss DNA molecule deviates in at least one nucleotide with regard to its nucleotide number and / or its nucleotide sequence; and
  • (xxvi) ss-DNA-molecule with a sequence that corresponds to the sequence of a molecule according to (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), (xix), (xx), (xxi ), (xxii), (xxiii), (xxiv) or (xxv) is complementary.
  • the invention further relates to a ds-DNA molecule composed of such an ss-DNA molecule according to the invention and a strand complementary thereto.
  • the invention relates to an ss-DNA molecule selected from the following group: ( ⁇ ) ss DNA molecule with a sequence of positions 35747 to 36769 (domain C of the tubB gene) of the sequence according to Figure 1;
  • (xxxi) ss-DNA molecule which with a molecule according to (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), (xiv), (xx), (xxi), (xxii), (xxiv), (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix) or (xxx) can be hybridized under stringent conditions and in particular has the same number of bases; (xxxii) ss-DNA molecule, which with a molecule according to (i), (ii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xvii),
  • (xxxiii) ss-DNA molecule with a sequence that corresponds to the sequence of a molecule according to (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii), (ix), (x), (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv), (xvi), (xvii), (xviii), (xiv), (xx), (xxi ), (xxii ), (xxiv), (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix), (xxx), (xxxi) or (xxxii) is complementary.
  • the invention further relates to a ds-DNA molecule comprising such a ss-DNA molecule and a strand complementary thereto.
  • the invention further relates to variants or mutants which result from a substitution, insertion or deletion of nucleotides or an inversion of nucleotide segments of an ss-DNA molecule according to the invention or of a ds-DNA molecule according to the invention, these variants and mutants being enzyme variants or encode enzyme mutants for the production of secondary substance (s) with the properties described above and characteristic of tubulysins, in particular with the cytostatic effect.
  • the expert is familiar with mass screening.
  • the invention further relates to RNA
  • the invention relates to a recombinant vector, in particular an expression vector with a DNA molecule according to the invention.
  • the invention relates to a cell, in particular for expression, into which a DNA molecule according to the invention or a vector according to the invention is integrated.
  • the cell according to the invention can be derived from cultivable bacteria such as Myxobacteria such as Angiococcus, in particular A. disciformis, Archangium, in particular A. gephyra, Escherichia coli, Pseudomonads or Actimomycetes.
  • Myxobacteria such as Angiococcus, in particular A. disciformis, Archangium, in particular A. gephyra, Escherichia coli, Pseudomonads or Actimomycetes.
  • the invention relates to the use of a vector according to the invention for the transformation of cells or organisms for the transient or permanent expression of one or more proteins (expression product (s)) which encode (s) by a DNA (ssDNA or dsDNA) of the vector will become) .
  • the invention relates to the use of a cell according to the invention for enzymatic , "". " ⁇
  • tubulysin A, B, C, D, E and / or F Biosynthesis, mutasynthesis or partial synthesis of a tubulysin, in particular tubulysin A, B, C, D, E and / or F.
  • the invention relates to an expression product of a DNA molecule according to the invention or a vector according to the invention or a cell according to the invention.
  • the present invention particularly relates to a polynucleotide that contains a sequence as defined in SEQ ID NO: 1, 18, 33 or 36, or a fragment thereof.
  • SEQ ID NO: 1 and 18 describe the (+) and (-) strand of the tubulysin biosynthesis cluster from Angiococcus disciformis.
  • SEQ ID NO: 33 is a sequence that contains several overlapping genes of the cluster.
  • SEQ ID NO: 36 describes a mutant Angiococcus disciformis. Surprisingly, it was found that this mutant showed a multiple of the wild-type tubulysin D production.
  • tubulysin overexpression in relation to the total effect of all tubulysin derivatives is even higher than that of tubulysin D, which was not to be expected in any way.
  • the genes of SEQ ID NO: 36 appear to be involved in the negative regulation of tubulysin expression. Due to the increased expression of all tubulysins, this mutant is particularly suitable for the production of the polypeptides according to the invention.
  • Antibodies against the wild-type expression products of this sequence can be used in order to minimize their negative influence on tubulysin production in other strains as well.
  • Antisense RNA or RNAi techniques which interact with the wild-type sequence of the negative regulatory genes, have a similar effect.
  • the fragments of the polynucleotide can have any partial sequence and length, but those fragments which encode proteins are preferred.
  • the polynucleotides of the present invention also include, but are not limited to, a polynucleotide that hybridizes to the complementary strand of the disclosed nucleotide sequences under moderately stringent or stringent conditions; a polynucleotide that is an allele variant of any of the polynucleotides described above; a polynucleotide encoding a species homolog of any of the proteins disclosed herein; or a polynucleotide encoding a polypeptide that has an additional specific domain or a truncation or truncation of the disclosed proteins.
  • CDS denotes a sequence of nucleotides which corresponds to the sequence of amino acids in a protein, that is to say the sequence regions coding for amino acids, including the respective start and stop codons.
  • the polynucleotide according to the invention is a fragment which is a CDS defined in the sequence listing.
  • the present invention further relates to a vector containing a polynucleotide as described above.
  • Vectors for various purposes are known in the art, as are the techniques for subcloning polynucleotides into such vectors. These are described, for example, in the new edition of Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover ed., 1985); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (FM Ausubel et al., Eds.); Recombinant DNA Methodology (R. Wu ed., Academic Press) or "A Practical Guide To Molecular Cloning". Examples of vectors can be found in Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (JH Miller and MP
  • the vector is preferably an expression vector, that is to say generally a plasmid, a phage, a virus or a vector for expressing a polypeptide from a DNA (RNA) sequence.
  • An expression vector can comprise a transcription unit which has an arrangement of the following: (1) a genetic element or elements with a regulatory role in gene expression, for example promoters or enhancers, (2) a structural sequence or coding sequence which transcribes into mRNA and into a protein is translated and (3) appropriate transcription start and termination sequences.
  • Structural units intended for use in yeast or eukaryotic expression systems preferably include a leader sequence that enables extracellular secretion of a translated protein by a host.
  • a recombinant protein may include an N-terminal methionine residue. This residue can, but need not subsequently, be cleaved from the expressed recombinant protein in order to obtain the end product.
  • the present invention further relates to a cell which contains such a vector.
  • the vector can be made using known techniques such as transfection, electroporation, Lipofection etc. are introduced into the cell. Infection is also possible with viral vectors.
  • the cells can be eukaryotic as well as prokaryotic cells. The methods for the selection and propagation of the cells which contain the vector are also known to the person skilled in the art. Examples of the cultivation of cells of animal origin can be found, inter alia, in Culture Of Animal Cells (RI Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987).
  • polypeptide that contains at least one sequence as defined in SEQ ID NO: 2 to 17, 19 to 32, 34, 35, 37 and / or 38 and / or contains a fragment and / or derivative thereof.
  • the polypeptide can be provided by expression of a polynucleotide as well as by chemical synthesis.
  • amino acid sequences of the present invention also encompass all sequences which differ from the sequences disclosed here by amino acid insertions, deletions and substitutions.
  • Amino acid substitutions are preferably the result of replacing an amino acid with another amino acid with similar structural and / or chemical properties, i.e. conservative amino acid substitutions.
  • Amino acid substitutions can be made based on similarity in polarity, charge, solubility, Hydrophobicity, hydrophilicity and / or the amphipathic nature of the residues included, for example, non-polar (hydrophobic) amino acids include alanine, leucine, isoleucine, valine, proline, phenylalanine, tryptophan and methionine; polar neutral amino acids include glycine, serine, threonine, cysteine . Tyrosine, asparagine and glutamine; positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine and histidine; and negatively charged (acidic) amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • “Inserts” or “deletions” typically range from 1-3 amino acids. The allowed variation can be determined experimentally by systematically inserting, deleting or substituting amino acids in a polypeptide molecule using recombinant DNA techniques and examining the resulting recombinant variants for their activity. For this, the person skilled in the art does not need more than to carry out routine experiments.
  • polypeptide can also be in the form of a chimeric polypeptide, encoded by a fusion gene, which contains at least one further sequence.
  • This additional sequence can e.g. serve to facilitate the purification of the expression product or to give the expression product an additional function.
  • tags which are known to the person skilled in the art, such as the his-day.
  • the present invention also relates to the use of at least one polynucleotide as defined in SEQ ID NO: 1, 18, 33 and / or 36 and / or at least one fragment thereof and / or at least one polypeptide as in SEQ ID NO: 2 to 17, 19 to 32, 34, 35, 37 and / or 38 defined and / or at least one fragment thereof for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of unwanted cell growth or proliferation in an individual.
  • the composition can contain, for example, a suitable vector, together with auxiliary factors, which enable the expression of a tubulysin, preferably in the unwanted cells, and thereby prevent further growth or further multiplication of these cells.
  • the composition can also contain cells according to the invention which have been transfected with a vector, for example a tubulysin-expressing vector.
  • the unwanted cell growth or proliferation is a tumor.
  • the tumor can be both a benign and a malignant tumor.
  • the undesired cell growth is a pathogenic infection.
  • the pathogen can be both unicellular and multicellular. This also includes infections with fungi, such as Candida or Aspergillus, and infections with parasites, such as trypanosomes or schistosomes. In a preferred embodiment of the use, the pathogenic infection is a mycosis, malaria or a parasitic disease.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition containing at least one polynucleotide as defined in SEQ ID NO: 1, 18, 33 and / or 36 and / or at least one fragment thereof and / or at least one polypeptide as in SEQ ID NO: 2 to 17 , 19 to 32, 34, 35, 37 and / or 38 and / or at least one fragment thereof.
  • the compositions contain a therapeutically effective amount or dose of the respective active ingredient.
  • a therapeutic effective dose refers to the amount of the compound sufficient to provide symptom relief, e.g. treatment, healing, prevention or amelioration of such conditions, particularly inhibition or prevention of undesired cell growth and proliferation in a patient.
  • Suitable routes of administration include, for example, parenteral administration, including intramuscular and subcutaneous injections, as well as intrathecal, directly intraventricular, intravenous, intraperitoneal injections.
  • this pharmaceutical composition contains at least one pharmaceutically acceptable carrier.
  • a composition may further contain (in addition to the ingredient and the carrier) diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers and other materials which are well known in the art.
  • pharmaceutically acceptable means a non-toxic material that does not interfere with the effectiveness of the biological activity of the active ingredient (s).
  • the properties of the vehicle depend on the route of administration.
  • the therapeutic composition can furthermore contain further agents or active substances which improve or facilitate the activity or effectiveness or application during treatment. Such additional factors and / or agents can be included in the therapeutic composition to produce a synergistic effect or to minimize side effects.
  • the present invention also relates to a method for producing tubulysins and tubulysin biosynthesis proteins, comprising the steps:
  • expression takes place in prokaryotic or eukaryotic cells and / or by in vitro expression.
  • Expression of polypeptides in prokaryotic or eukaryotic cells is a commonly used method and is generally accomplished using an expression vector as described above. Vectors have also already been described for in vitro expression. These and the necessary factors are commercially available in the form of kits, for example from BioRad, Stratagene, Invitrogen and Clontech.
  • the invention provides a method for finding genes which are involved in the biosynthesis of tubulysins.
  • the process includes the following steps:
  • the hybridization can be carried out under different stringent conditions.
  • the stringency of hybridization as used herein relates to conditions under which polynucleotide duplexes are stable.
  • the stability of a double strand is a function of sodium ion concentration and temperature (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2 nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). those used for hybridization can easily be modified by a person skilled in the art.
  • weakly stringent hybridization denotes conditions that hybridize in 10% formamide, 5 x Denhart's solution, 6 x SSPE, 0.2% SDS at 42 ° C, followed by washing in 1 x SSPE, 0.2% SDS are equivalent at 50 ° C.
  • DenharA's solution and SSPE are well known to those skilled in the art, as are other suitable hybridization buffers.
  • Moderately stringent hybridization means conditions that allow DNA to bind to a complementary nucleic acid that has approximately 60% identity, preferably approximately 75% identity, particularly preferably approximately 85% identity to this DNA; where an identity of more as about 90% is particularly preferred to this DNA.
  • Moderately stringent conditions are preferably conditions that hybridize in 50% formamide, 5 x Denhart's solution, 5 x SSPE, 0.2% SDS at 42 ° C followed by washing in 0, 2 x SSPE, 0.2% SDS at 65 ° C are equivalent.
  • Highly stringent hybridization means conditions that allow hybridization only of those nucleic acid sequences that form stable double strands in 0.018 M NaCl at 65 ° C (ie, if a double strand is not stable in 0.018 M NaCl at 65 ° C, it is among those described here / defined highly stringent conditions not stable).
  • nucleic acid hybridization techniques can be used to identify and recover a nucleic acid encompassed by the present invention.
  • any nucleic acid with some homology to a sequence or fragment thereof disclosed in this invention can be used as a probe to identify a similar nucleic acid by hybridization under moderately stringent to highly stringent conditions.
  • Such similar nucleic acids can then be isolated, sequenced and analyzed to determine if they are encompassed by the present invention.
  • the present invention also provides a kit for the production of tubulysins containing:
  • tubulins are also suitable as disinfectants, which can break down or prevent contamination with tubulin-containing cells.
  • the invention therefore also relates to the use of a composition comprising at least one polypeptide as defined in SEQ ID NO: 2 to 17, 19 to 32, 34, 35, 37 and / or 38 and / or at least one biologically active fragment or derivative thereof as a disinfectant .
  • other disinfectant substances can also be contained in the disinfectant as long as they do not inhibit the action of the polypeptide according to the invention.
  • the disinfectant can contain other auxiliaries such as buffers, water, dyes, fragrances, stabilizers, carriers, etc.
  • the composition is liquid or powder. , "”. " ⁇
  • the invention also relates to disinfectants as defined above.
  • the tubulysin biosynthesis cluster was identified by creating a transposon mutant bank from Angiococcus disciformis An d48 using pMycoMar. Rubin & Mekalanos (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96 (1999), 1645-1650) developed the plasmid pMycoMar from the marine element Himarl, which is a simple transposition system that efficiently infects bacteria in vivo and generates insertion mutants can.
  • This plasmid contains the mini transposon magellan, in which the Tn5 kanamycin resistance gene and the oriR6K are flanked by the inverted repeats of the Himarl.
  • the Himarl transposase was cloned into the mycobacterial temperature-sensitive replicon pPR23 under the transcriptional control of the T6 promoter.
  • the pMycoMar also encodes a gentamycin resistance gene.
  • the Himarl is characterized by a TA dinucleotide recognition sequence during transposition. Therefore, it can randomly integrate into a host genome and statistically turn off all active genes through an insertion mutation. Due to this fact, a mutant bank should be generated from An d48 and the tubulysin biosynthesis cluster should be identified by a knockout mutant.
  • disciformis culture is cultivated up to 2 * 10 8 cells / ml at 30 ° C. Based on a generation time of 6 hours, this culture was inoculated on the previous day so that this cell density is calculated. The culture is centrifuged at 20 ° C (20 min; 4000 rpm) and the cells in the same volume of wash buffer (5 mM HEPES / NaOH, 0.5 M CaCl 2; pH '7.2).
  • Electroporation conditions After renewed centrifugation, resuspended in 25 ml buffer and centrifuged again. Before this centrifugation step, the absolute cell number within the 25 ml is determined, so that arithmetically 1 * 10 9 cells / 40 ⁇ l are resuspended. Electroporation conditions:
  • DNA and 40 ⁇ l cell suspension are mixed and placed in an electroporation cuvette (0.1 cm) cooled on ice.
  • the electroporation is carried out at 200 ⁇ , 25 mF and 0.85 kV / cm.
  • 1 ml tryptone medium is added. After transfer into 50 ml tryptone medium, the cells are shaken for 6 h at 30 ° C. for phenotypic expression. The culture is then centrifuged off (20 min, 4000 rpm, 20 ° C.) and resuspended in 1 ml tryptone. Starting from a 100% survival rate of the cells, a dilution series is made and 1 * 10 8 - 1 * 10 4 cells are plated with 3 ml tryptone soft agar on kanamycin-containing (50 ⁇ g / ml) tryptone plates. These plates are incubated at 30 ° C and after 5 - 8 days the first clones can be seen.
  • Electroporation is carried out at 400 ⁇ , 25 ⁇ F and 0.65kV / cm. Immediately after electroporation, 1 ml tryptone medium is added and shaken in a 1.5 ml Eppendorf test tube for 6 h at 30 ° C. Starting from a 100% survival rate of the cells, a dilution series is prepared and 1 * 10 8 - 1 * 10 4 cells are plated with 3 ml tryptone soft agar on kanamycin-containing (50 ⁇ g / ml) tryptone plates. These plates are incubated at 30 ° C and after 5 - 8 days the first clones / mutants can be seen, which were picked using an inoculation loop.
  • the mutants were in 96-well microtiter plates in 200 ⁇ l M7 medium (5 g probion; 1 g CaCl 2 ; 1 g MgS04 4 ; 1 g yeast extract; 5 g starch; 10 g HEPES; 0.1% vitamin B12 [10 ng / ml] on 1 1 medium; pH 7.4) at 32 ° C and after 10 days a copy of the entire bank was made. For this, 50 ul culture of each mutant was transferred to new microtiter plates with 100 ul M7 medium. After a further seven days of incubation, a copy was frozen at -80 ° C. as permanent cultures. The remaining copy of the bank was extracted and the extract was tested for generated tubulysin knockout mutants using a toxicity test.
  • the mini-cultures from the 96 'microtiter plates were dried on a heating block at 37 ° C. after cultivation by nitrogen gassing.
  • the cell pellets were then resuspended in 100 ⁇ l of methanol for 2 h and 10 ⁇ l each was used for the following toxicity test in order to be able to detect tubulysin production by the respective mutant.
  • L929 cells are cultivated in DMEM medium (Invitrogen, Groningen) at 37 ° C and then carefully harvested using a cell scraper. This cell suspension is then diluted 1:10 with DMEM and 120 ⁇ l distributed per opening of a 96 'microtiter plate. These are then mixed with the 10 ⁇ l cell extract of the individual transposon mutants and incubated at 37 ° C. for five days. After this incubation period, the L929 cells are examined microscopically for nuclear fragmentation, which is a sign of tubulysin exposure. In cells that showed no nuclear fragmentation, the corresponding mutants were identified as putative tubulysin knockout mutants.
  • DMEM medium Invitrogen, Groningen
  • DH5 ⁇ / ⁇ pir cells are incubated on Kanamycin-containing LB plates at 37 ° C. Only those E. coli cells that contain a plasmid with the magellan4 and thus the Tn5 kanamycin resistance gene can grow on these plates. Such a plasmid contains chromosomal DNA from An d48 at the ends of the transposon. These plasmids can be found in E. replicate coli cells DH5 ⁇ / ⁇ pir because the oriR6K is located within the transposon sequence. The transposon was isolated from the respective genome and sequenced with the primers K388 and K389.
  • NRPS non-ribosomal peptide synthetases
  • Isolate chromosomal DNA according to standard protocols from 50 ml tryptone medium culture of each A. disciformis An d48 mutant. 5 ⁇ g of this DNA are used for the subsequent cloning of the transposon by first carrying out a restriction.
  • the enzymes Notl and BamHl were used, which have no restriction site within the magellan and should statistically cut relatively frequently in GC-rich DNA.
  • the entire restriction mixture of 30 ul is mixed with 1 vol. Chloroform / phenol and for 10 min. centrifuged (13,200 rpm; 20 ° C). The supernatant is transferred to a new reaction vessel and 1/10 vol. 3 M NaOAc and 2.5 vol. 100% EtOH are added. It will cut down the DNA Incubate reaction tube for 1 h at -20 ° C and then for 30 min. centrifuged (13,200 rpm; 4 ° C). The supernatant is discarded and the pellet washed three times with 70% EtOH, each time 5 min. centrifuged (13,200 rpm; 20 ° C). After discarding the supernatant, the pellet is dried at 37 ° C. and resuspended in 15 ⁇ l H 2 0. The entire 15 ⁇ l of the precipitated DNA are used for the subsequent ligation.
  • the transposon plasmid pMutT794 / WotI contains 52985 bp chromosomal DNA from Angiococcus disciformis An d48. Together with the Himarl mini transposon magellanA (2199 bp), which is integrated into the plasmid at base pair 37317 bp, 55184 bp were sequenced. A total of 21760 bp come from coding genes of the tubulysin gene cluster and 31219 bp from other coding genes. Some of these ORFs are regulatory genes that can influence the expression of tubulysin.
  • the sequence contains the start of the tubulysin gene cluster with three NRPS modules (tubA-C), a gene encoding cyclodeaminase (tUbZ) and a PKS module (tubD). Furthermore, an anion transporter-coding gene (ORF1), which serves to transport the tubulysin out of the cell and another ORF (ORF2) are located within the gene cluster.
  • ORF1 anion transporter-coding gene
  • ORF2 an anion transporter-coding gene
  • ORF2 an anion transporter-coding gene
  • A adenylation domains
  • NMT methyl transferase domains
  • PCP adenylation and thiolation domain
  • A A8 and A9 within the adenylation domain
  • TubA encodes an incomplete one Condensation domain that is theoretically not required for biosynthesis.
  • PKS polyketide synthase
  • KS ketoacyl synthase
  • AT acyl transferase
  • KR ketoreductase
  • tubD The remaining sequence of the tubulysin biosynthetic gene cluster was identified from a cosmid bank of An d48 (deposited with the DSMZ) under standard conditions.
  • the PKS module (tubD) ending in the first half of the sequence is continued by the KS, AT and KR domains already mentioned and also contains an enoyl reductase (ER) and an acyl carrier protein (ACP).
  • ER enoyl reductase
  • ACP acyl carrier protein
  • the following sequence of tubD encodes an NRPS that carries a heterocyclization (HC), adenylation (A) and peptidyl carrier protein (PCP) domain.
  • HC heterocyclization
  • A adenylation
  • PCP peptidyl carrier protein
  • tubE and tubF also follow.
  • the gene tu E encodes an NRPS with the domains C, A and PCP.
  • a PKS is encoded on tubF with the following domain arrangement: ketoacyl synthase (KS), acyltransferase (AT), ketoreductase (KR), C-methyltransferase (CMT), dehydratase (DH), enoyl reductase (ER), acyl carrier protein (ACP ) and finally a thioesterase, which cleaves the finished tubulysin in the form of a free acid from the multienzyme complex.
  • the insertion site of the transposon ma gellanA is for the MutT176 at base pair 54579 within the biosynthetic gene cluster.
  • the mutT524 mutant is not located on the gene cluster sequence known to us.
  • the insertion site lies within a gene coding for an acyltransferase, which is downstream of the tubulysin biosynthesis gene cluster and has a post-translational function for modifying the tubulysin.
  • cosmid bank from A. disciformis An d48 was created using the Gigapack II XL packaging kit (from Stratagene) in E. coli SURE. Within this bank, cosmids should be identified that have a longer overlap with the tubulysin biosynthesis gene cluster downstream from tubF. For this purpose, two primer pairs were derived from the known sequence of the tubulysin gene cluster and the PCR amplificates were used as probes for the subsequent hybridization of the cosmid bank. The first pair of primers ASTlslA-IB provides an 889 bp DNA fragment and is 1 kb before the NotI restriction site in tubD.
  • the second primer pair ASTls2A-2B generates a 700 bp fragment that is 11 kb upstream in the known cluster end in tubC.
  • the PCR was carried out at 54 ° C annealing temperature. Different cosmids could be identified by this hybridization. Using PCR and restriction analysis, they were examined for the size of their overlap with the known cluster sequence. For this purpose the primer pairs ASTlslA / B and ASTls2A / B were used at an annealing temperature of 58 ° C.
  • Various enzymes were used in the restriction in single and double restrictions.
  • cosmids F7 and F13 showed a similarly large overlap with the first part of the cluster after the restriction analyzes, one of these cosmids carries the necessary genetic information in order to be able to identify the genes immediately bound to the cluster.
  • restriction enzymes were selected which cut as rarely as possible and at the end of the known gene cluster sequence.
  • the selected enzymes were del and Nsil, which cut at positions 39306 bp and 39430 bp, respectively. Furthermore, both enzymes cut only once more in the known sequence.
  • the cosmid gene bank should now be "screened” with a generated probe (primer pair Tls up / on) that binds behind these sections directly at the end of the known cluster sequence.
  • the cosmids were hydrolyzed in various double restriction batches and on an agarose gel (0 , 8%)
  • the enzymes BamHI, .EcoRI, and Notl were selected in addition to Ndel and Nsil, and the combination with £ coRI and Notl was to achieve that the hybridization is used to identify a fragment which up to the End of each Cosmid inserts are enough. If this fragment should be too large for a subsequent cloning, BamHI was also used in order to obtain possibly shorter fragments.
  • Hybridization was carried out at 42 ° C and washing was carried out under very stringent conditions (68 ° C).
  • connection sequence in smaller fragments (as Ndel / Notl and Notl / N ⁇ tl fragments) are cloned and sequenced.
  • the BamHI / Nsil double restriction approach yielded a total of five fragments.
  • the cosmid F7 was cut in a double restriction batch with the restriction endonucleases Nsil and EcoRI (2 h; 37 ° C.). After the restriction mixture had been separated using a 0.8% agarose gel, the corresponding band was cut out of the gel and extracted with the NucleoSpin kit (from Macherei-Nagel). The isolated fragment was labeled with Notl trimmed to check whether the hybridization results obtained are confirmed. In addition, it was checked whether further Notl recognition sequences are within the 12 kb connection sequence in order to be able to determine the number of partial fragments to be cloned. The restriction resulted in a 4.2 (Nsil / No1 fragment) and 8 kb fragment (Notl / Notl fragment) after separation on a 0.8% agarose gel.
  • the 12.2 kb Nsil / EcoRI fragment, as well as the 4.2 kb (Nsil / Notl) and 8 kb (Notl / Notl) fragments were cloned into the vector pUC18.
  • the vector was cut with PstI / EcoRI or PstI / Notl and Notl for the following ligation.
  • PstI and Nsil have a compatible cutting pattern, so that after successful cloning, these interfaces are no longer available.
  • the 12 kb insert can be cut out of the pUC18 derivative in a double restriction.
  • the clones obtained were checked for correctness using these restriction approaches.
  • One of these clones (ASpUC12) was used for a subsequent in vitro transposition with GPS TM - 1 Genome Priming System (New England Biolabs ⁇ .nc ).
  • This mixture is mixed well and mixed with 1 ⁇ l TnsABC transposase (again mix).
  • the entire reaction mixture is for 10 min. incubated at 37 ° C so that the transposase mixes in the reaction mixture before the actual reaction.
  • the reaction mixture is incubated for one hour at 37 ° C. During this time, the transposon is transferred to the target DNA.
  • the reaction is then carried out by incubation at 75 ° for 10 min C. From this approach, 2 ⁇ l were transformed into E. coli DH10B and plated out on medium containing kanamycin, and a total of approximately 2000 clones grew after an overnight incubation at 37 ° C.
  • the residual sequence of the tubulysin biosynthesis gene cluster obtained is 12,219 bp long and has an overlap with the previously identified sequence of 133 bp. Sequence sections in which there was only a simple cover were sequenced double-stranded by re-sequencing specific clones. In this sequence, base pair 6416-6898 encodes an acyltransferase (position 76,787-77,545 bp in total sequence). The other ORFs identified also have a role in tubulysin biosynthesis. The total sequence is thus 82,868 bp.
  • the transposon insertion location within the respective mutant was determined by means of "transposon recovery” and subsequent sequencing of the flanking regions (see 1.4).
  • the sequences obtained were examined against the library for homlogies to known genes and showed high similarities to regulatory elements / Genes from bacterial organisms.
  • the entire mutant library was examined for mutants overproducing tubulysin.
  • the existing toxicity test (see 1.3) was optimized. Multiple dilutions of the mutant extract used in the toxicity test resulted in one Thinning of the tubulysin is achieved and the characteristic effect on L929 cells is no longer detectable after a certain dilution.
  • mutants were identified that require significantly higher dilutions in order to no longer be able to determine any effect. This means that the respective mutant has an increased production of the tubulysin.
  • the mutant Mutl58 was identified, which showed a fourfold increase in tubulysin D production. This result was shown both by growing the mutant in 50 ml cultures via HPLC-MS tests and by several kinetics with the following optimized toxicity test against the wild type. The toxicity test even identified an eightfold overproduction of tubulysins. The total effect of all tubulysin derivatives is detected, and not only that of tubulysin D. The mutant 158 therefore surprisingly shows overexpression of further tubulysins compared to the wild type of A. disciformis. This was not to be expected in any way. The genomic region was cloned directly at the insertion point of the transposon and the sequencing was carried out as described under 1.4.
  • the sequence of the gene concerned shows high similarities to a protein kinase (from Stigma tella aurantiaca), the insertion site of the transposon relating to the promoter region of this gene. Without being committed to this mechanism of action, this gene has a negative regulatory function for tubulysin formation, which is why inactivation of the gene leads to increased production.
  • the total sequence includes 2,200 bp, the protein kinase being encoded from base pair 1.228-20 and having a total size of 1.209 bp.
  • the upstream ORF encodes a tubulysin biosynthesis protein and is 933 bp in size.
  • K-388 5A3 ' 5' TGG GAA TCA TTT GAA GGT TGG 3 ' SEQ ID NO: 39
  • Primer pair ASTlslA / B was derived from tubO and results in a
  • Primer pair ASTls2A / B was derived from tubC and results in a
  • Primer pair Tls up / Tls d0 wn was derived from tubF and results in a 125 bp fragment
  • ACP acyl carrier protein
  • NMT N-methyltransferase
  • PCP peptidyl carrier protein

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein ss-DNA-Molekül, ein ds-DNA-Molekül, eine RNA, einen Vektor, dessen Verwendung sowie eine Zelle, insbesondere zur Expression von Tubulysin-Genen.

Description

Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH
Tubulysin-Biosynthese-Gene
Tubulysine sind bereits als eine neue, auf das Tubulin-Skelett wirkende Substanzfamilie aus Myxobakterien in Irsee vorgestellt worden; vgl. PCT/EP 97/05095 und DE 100 08 089.8 und die darin angeführte Literatur. Im Gegensatz zu den Epothilonen zeigen diese eine mikrotubuli-abbauende Wirkung sowie die vermehrte Ausbildung von Zentrosomen. Mit einer Cytotoxizität von IC5o = 10 - 500 pg sind die Tubulysine als potentielle Cytostatika von besonderem Interesse.
Die Tubulysine haben eine cytostatische oder antimitotische Wirkung auf Pilze, humane Tumore oder Krebszellinien und andere tierische Zellkulturen (vgl." Tabelle) . Sie führen in den Zellen zu einem raschen Abbau des Mikrotubuli-Gerüsts. Das Aktinskelett bleibt erhalten. Adhärent wachsende L929-Maus-Zellen vergrößern unter dem Einfluß der Tubulysine ihr Zellvolumen, ohne sich zu teilen, und entwickeln große Zellkerne, die dann in einem apoptischen Vorgang zerfallen. Wirkunsspektrum
Pilze Hemmhof [mm]
Tubulysin A Tubulysin B
Äspergillus niger 20 18 Botrytϊs cineria 23 18 Coprinus cinereus 20 Pythinum debaryanum 20
Agardiffusiontest : 20 μg pro Testblättchen 6 mm Durchmesser
Humane Krebszellinine IC50 [ng/ml]
Tubulysin A Tubulysin B Tubulysin C
KB-3-1 0,01 0,02 0,1 (DSM ACC 158)
K-562 0,1 0,2 1,5 (ATCC CCL 243;
HL-60 0,04 0,0ϊ 0,4 (ATCC-CCL 240;
Tierische Zellinien
L929, Maus 0,2 0,4 (ATCC CCL1)
Pt K2, Potorous tri - dactylis 0,2 0,2
(ATCC CCL 56) Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein ss-DNA- Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
(i) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz gemäß Figur 1;
(ii) ss-DNA-Molekül, das mit einem ss-DNA-Molekül gemäß (i) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zu jeweils 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von dem ss-DNA-Molekül gemäß (i) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und
(iii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz, die zur Sequenz eines ss-DNA-Moleküls gemäß (i) oder (ii) komplementär ist .
Ferner betrifft die Erfindung ein ds-DNA-Molekül aus einem erfindungsgemäßen ss-DNA-Molekül und einem dazu komplementären Strang.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein ss-DNA-Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (i) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 3.308 bis 1 (ORF 16) der Sequenz gemäß Figur 1;
(ii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 4706 bis 3453 (ORF 15) der Sequenz gemäß Figur 1;
(iii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 5719 bis 7164 (ORF 14) der Sequenz gemäß Figur 1; (iv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 9557 bis 7317 (ORF 13) der Sequenz gemäß Figur 1;
(v) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 12193 bis 10550 (ORF 12) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 12841 bis 13881 (ORF 11) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 14833 bis 13835 (ORF 10) der Sequenz gemäß Figur 1;
(viii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 14942 bis 15586 (ORF 9) der Sequenz gemäß Figur 1;
(ix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 15847 bis 16983 (ORF 8) der Sequenz gemäß Figur 1;
(x) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 21154 bis 18809 (ORF 7) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 22366 bis 23532 (ORF 6) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 24591 bis 26513 (ORF 5) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 26597 bis 27517 (ORF 4) der Sequenz gemäß Figur 1; (xiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 29858 bis 30400 (ORF 3) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 31220 bis 32392 (TubA) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 33056 bis 32397 (ORF 2) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 34195 bis 33074 (TubZ) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 35422 bis 34205 (ORF 1) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 35522 bis 40147 (TubB) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 40144 bis 48021 (TubC) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 48011 bis 58558 (TubD) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 58551 bis 62096 (TubE) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 62103 bis 70616 (TubF) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiv) ss-DNA-Molekül, das mit einem Molekül gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv), (v) , (vi), (vii) , (viii) , (ix), (x) , (xi) , (xii) , (xiii) , (xiv) , (xv) , (xvi) , (xvii) , (xviii) , (xix) , (xx) , (xxi) , (xxii) oder (xxiii) unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und insbesondere dieselbe Anzahl von Basen aufweist; und
(xxv) ss-DNA-Molekül, das mit einem ss-DNA-Molekül gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv) , (v) , (vi) , (vii) , (viii) , (ix), (x) , (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii) , (xviii) , (xix) , (xx) , (xxi) , (xxii) oder (xxiii) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zu jeweils 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von diesem ss-DNA-Molekül hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und
(xxvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz, die zur Sequenz eines Moleküls gemäß (i), (ii) , (iii), (iv) , (v) , (vi) , (vii), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii), (xiv) , (xv) , (xvi) , (xvii) , (xviii) , (xix) , (xx) , (xxi), (xxii), (xxiii), (xxiv) oder (xxv) komplementär ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein ds-DNA-Molekül aus einem derartigen erfindungsgemäßen ss-DNA-Molekül und einem dazu komplementären Strang.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein ss-DNA-Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (ι) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 35747 bis 36769 (Domäne C des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(n) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 37184 bis 39817 (Domäne A des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(m) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 38369 bis 39730 (Domäne NMT des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1 ;
(iv) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 39818 bis 40069 (Domäne PCP des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(v) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 40372 bis 41397 (Domäne C des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vi) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 41824 bis 43215 (Dom ne A des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vn) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 43216 bis 43461 (Domäne PCP des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(viii) ss-DNA-Molekul mit einer Sequenz der Positionen 43552 bis 44574 (Domäne C des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (ix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 44980 bis 47631 (Domäne A des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1 ;
(x) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 46153 bis 47547 (Domäne NMT des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 47632 bis 47868 (Domäne PCP des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 48011 bis 49321 (Domäne KS des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 49622 bis 50584 (Domäne AT des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 51473 bis 52309 (Domäne KR des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 53066 bis 53980 (Domäne ER des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 54158 bis 54460 (Domäne ACP des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (xvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 54461 bis 55870 (Domäne HC des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 56000 bis 57412 (Domäne A des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 57413 bis 57643 (Domäne PCP des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 58689 bis 59714 (Domäne C des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 60156 bis 61697 (Domäne A des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 61698 bis 61967 (Domäne PCP des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 62127 bis 63320 (Domäne KS des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 63711 bis 64676 (Domäne AT des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (xxv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 64959 bis 65882 (Domäne KR des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 65985 bis 67061 (Domäne CMT des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 67242 bis 67829 (Domäne DH des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 68247 bis 69128 (Domäne ER des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 69360 bis 69605 (Domäne PCP des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 69759 bis 70586 (Domäne TE des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxxi) ss-DNA-Molekül, das mit einem Molekül gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv), (v) , (vi), (vii), (viii), (ix), (x) , (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii), (xiv), (xx) , (xxi), (xxii), (xxiii), (xxiv) , (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix) oder (xxx) unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und insbesondere dieselbe Anzahl von Basen aufweist; (xxxii) ss-DNA-Molekül, das mit einem Molekül gemäß (i), (ii), (iii), (iv) , (v) , (vi) , (vii), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii) , (xiv) , (xx) , (xxi) , (xxii) , (xxiii) , (xxiv) , (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix) oder (xxx) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zur jeweils 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von diesem ss-DNA-Molekül hinsichtlich seiner Nucleotid- Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und
(xxxiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz, die zur Sequenz eines Moleküls gemäß (i), (ii), (iii), (iv) , (v) , (vi), (vii), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii), (xiv), (xx) , (xxi), (xxii), (xxiii), (xxiv), (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix), (xxx), (xxxi) oder (xxxii) komplementär ist.
Ferner betrifft die Erfindung ein ds-DNA Molekül aus einem derartigen ss-DNA-Molekül und einem dazu komplementärem Strang.
Ferner betrifft die Erfindung Varianten oder Mutanten, die aus einer Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden oder einer Inversion von Nucleotid-Segmenten eines erfindungsgemäßen ss-DNA-Moleküls oder eines erfindungsgemäßen ds-DNA-Moleküls resultieren, wobei diese Varianten und Mutanten Enzym-Varianten oder Enzym-Mutanten für die Produktion von Sekundärstoff (en) mit den eingangs geschilderten und für Tubulysine charakteristischen Eigenschaften codieren, insbesondere mit der cytostatischen Wirkung. Der Fachmann ist mit Massenscreening vertraut. Ferner betrifft die Erfindung RNA
(a) mit einer Sequenz entsprechend der eines erfindungsgemäßen ss-DNA-Moleküls oder
(b) mit einer Sequenz einer RNA gemäß (a) , aber in Gegenrichtung (anti-sense) , oder
(c) mit einer Sequenz einer RNA gemäß (a) oder (b) und mit einem dazu komplementären Strang, jeweils gegebenenfalls als Element eines rekombinanten Vektors.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen rekombinanten Vektor, insbesondere Expressionsvektor mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Zelle, insbesondere zur Expression, in die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül oder ein erfindungsgemäßer Vektor integriert ist.
Die erfindungsgemäße Zelle kann sich von kultivierbaren Bakterien wie Myxobakterien wie Angiococcus, insbesondere A. disciformis, Archangium, insbesondere A. gephyra, Escherichia coli, Pseudomonaden oder Actimomyceten herleiten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors für die Transformation von Zellen oder Organismen zur transienten oder permanenten Expression eines oder mehrerer Proteine (Expressionsprodukt (e) ) , das (die) durch eine DNA (ssDNA oder dsDNA) des Vektors codiert wird (werden) .
Gemäß eine weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Verwendung einer erfindungsgemäßen Zelle zur enzy atischen , „„.„^
WO 2004/022586
13
Biosynthese, Mutasynthese oder Partial-Synthese eines Tubulysins, insbesondere Tubulysin A, B, C, D, E und/oder F.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Expressionsprodukt eines erfindungsgemäßen DNA-Moleküls oder eines erfindungsgemäßen Vektors oder einer erfindungsgemäßen Zelle.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Polynucleotid, das eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 oder 36 definiert, oder ein Fragment davon enthält. SEQ ID NO: 1 und 18 beschreiben den (+)- bzw. den (-) -Strang des Tubulysin Biosynthese-Clusters von Angiococcus disciformis. SEQ ID NO: 33 ist eine Sequenz, die mehrere sich überlappende Gene des Clusters enthält. SEQ ID NO: 36 beschreibt eine Mutante von Angiococcus disciformis. Überraschenderweise wurde gefunden, dass diese Mutante ein Vielfaches der Tubulysin D-Produktion des Wildtyps zeigte. Die Tubulysin-Überexpression ist auf die Gesamtwirkung aller Tubulysin-Derivate bezogen sogar noch höher als die von Tubulysin D, was in keinsterweise zu erwarten war. Die Gene der SEQ ID NO: 36 sind offenbar an der negativen Regulation der Tubulysin Expression beteiligt. Diese Mutante ist auf Grund der erhöhten Expression aller Tubulysine besonders geeignet zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide. Antikörper gegen die Wildtyp-Expressionsprodukte dieser Sequenz können eingesetzt werden, um deren negativen Einfluss auf die Tubulysin Produktion auch in anderen Stämmen zu minimieren. Einen ähnlichen Effekt hben auch antisense-RNA bzw RNAi- Techniken, die mit der Wildtyp Sequenz der negativen Regulatorgene interagieren. Die Fragmente des Polynucleotid können jede beliebige Teilsequenz und Länge haben, bevorzugt sind jedoch solche Fragmente, die Proteine codieren. Die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung schließen ebenfalls ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Polynucleotid, das an den komplementären Strang der offenbarten Nucleotidsequenzen unter moderat stringenten oder stringenten Bedingungen hybridisiert; ein Polynucleotid, das eine Allel-Variante irgendeines oben beschriebenen Polynucleotids ist; ein Polynucleotid, das ein Spezies-Homolog irgendwelcher der hier offenbarten Proteine codiert; oder ein Polynucleotid, das ein Polypeptid codiert, das eine zusätzliche spezifische Domäne oder eine Trunkierung bzw. Verkürzung der offenbarten Proteine aufweist.
Der Begriff "CDS" bzeichnet eine Sequenz von Nucleotiden, die der Sequenz von Aminosäuren in einem Protein entspricht, also die Aminosäuren-codierenden Sequenzbereiche, inklusive des jeweiligen Start- und Stoppcodons .
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Polynucleotid ein Fragment, das eine im Sequenzprotokoll definierte CDS ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor, der ein Polynucleotid wie oben beschrieben enthält. Vektoren für verschiedene Zwecke sind im Stand der Technik bekannt, ebenso die Techniken zur Subklonierung von Polynucleotiden in solche Vektoren. Diese werden beispielsweise in der neuen Ausgabe von Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook et al . , (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds . ) ; Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (F. M. Ausubel et al . , eds.); Recombinant DNA Methodology (R. Wu ed., Academic Press) oder "A Practical Guide To Molecular Cloning" beschrieben. Beispiele für Vektoren finden sich unter anderen in Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory).
Bei dem Vektor handelt es sich vorzugsweise um einen Expressionsvektor, also im Allgemeinen ein Plasmid, einen Phagen, ein Virus oder einen Vektor zum Exprimieren eines Polypeptids aus einer DNA (RNA) Sequenz. Ein Expressionsvektor kann eine Transkriptionseinheit umfassen, die eine Anordnung des Folgenden aufweist: (1) ein genetisches Element oder Elemente mit einer regulatorischen Rolle in der Genexpression, beispielsweise Promotoren oder Enhancer, (2) eine Struktursequenz oder codierende Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird und (3) geeignete Transkriptionsstart- und -terminationssequenzen. Struktureinheiten, die zur Verwendung in Hefen oder eukaryontischen Expressionssystemen vorgesehen sind, schließen vorzugsweise eine Leadersequenz ein, die die extrazelluläre Sekretion eines translatierten Proteins durch einen Wirt ermöglicht. Es kann alternativ, wenn ein rekombinantes Protein ohne eine Leader- oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methionin-Rest einschließen. Dieser Rest kann, muss aber nicht anschließend von dem exprimierten rekombinanten Protein abgespalten werden, um das Endprodukt zu erhalten.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die einen solchen Vektor enthält. Der Vektor kann über die bekannten Techniken wie beispielsweise Transfektion, Elektroporation, Lipofektion usw. in die Zelle eingebracht werden. Bei viralen Vektoren ist auch eine Infektion möglich. Bei den Zellen kann es sich um eukaryotische als auch prokaryotische Zellen handeln. Auch die Methoden zur Selektion und Propagierung der Zellen, die den Vektor enthalten sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für die Kultivierung von Zellen tierischen Ursprungs sind u.a. in Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987) zu finden.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Polypeptid, das wenigstens eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder ein Fragment und/oder Derivat davon enthält. Das Polypeptid kann sowohl durch Expression eines Polynucleotids als auch durch chemische Synthese bereitgestellt werden.
Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen ebenfalls alle Sequenzen, die sich von den hier offenbarten Sequenzen durch Aminosäureinsertionen, -deletionen und - Substitutionen unterscheiden.
Aminosäure- „Substitutionen" sind vorzugsweise das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, das heißt konservative Aminosäure-Austausche. Aminosäure- Substitutionen können auf der Grundlage einer Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipatischen Natur der einbezogenen Reste vorgenommen werden. Beispielsweise schließen unpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein; polare neutrale Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein; positiv geladene (basische) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein; und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein.
"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen sich typischerweise im Bereich von 1-3 Aminosäuren. Die erlaubte Variation kann experimentell bestimmt werden, indem systematisch Insertionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter Verwendung von DNA- Rekombinationstechniken vorgenommen und die sich ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer Aktivität untersucht werden. Dazu ist für den Fachmann nicht mehr als die Durchführung von Routineexperimenten erforderlich.
Beispielsweise kann das Polypeptid auch in Form eines Chimären Polypeptids, codiert durch ein Fusionsgens, vorliegen, dass wenigstens eine weitere Sequenz enthält. Diese zusätzliche Sequenz kann z.B. dazu dienen, die Aufreinigung des Expressionsprodukts zu erleichtern oder dem Expressionsprodukt eine zusätzlich Funktion zu verleihen.
Beispiele für zusätzliche Sequenzen, die die Aufreinigung erleichtern sind sogenannte Tags, die dem Fachmann bekannt sind, wie z.B. das his-tag.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem die Verwendung wenigstens eines Polynucleotids wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens eines Fragments davon und/oder wenigstens eines Polypeptids wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von unerwünschtem Zellwachstums oder unerwünschter Zellvermehrung in einem Individuum. Die Zusammensetzung kann beispielsweise einen geeigneten Vektor enthalten, zusammen mit Hilfsfaktoren, die die Expression eines Tubulysins, vorzugsweise in den unerwünschten Zellen, ermöglichen und dadurch ein weiteres Wachstum bzw. eine weiter Vermehrung dieser Zellen verhindern. Die Zusammensetzung kann auch erfindungsgemäße Zellen enthalten, die mit einem Vektor, beispielweise einen Tubulysin-exprimierenden Vektor, transfiziert wurden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das unerwünschte Zellwachstum oder die unerwünschte Zellvermehrung ein Tumor. Der Tumor kann sowohl eine gutartige als auch eine bösartige Geschwulst sein.
In einer weiteren Ausführungsform ist das unerwünschte Zellwachstum eine pathogene Infektion. Das Pathogen kann hierbei sowohl einzellig als auch mehrzellig sein. Dies schließt auch Infektionen mit Pilzen, wie beispielsweise Candida oder Aspergillus, und Infektionen mit Parasiten, wie beispielweise Trypanosomen oder Schistosomen ein. In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung ist die pathogene Infektion eine Mykose, Malaria oder eine parasitäre Erkankung.
Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend wenigstens ein Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens ein Fragment davon und/oder wenigstens ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens ein Fragment davon. Die Zusammensetzungen enthalten eine therapeutisch wirksame Menge bzw. Dosis des jeweiligen Wirk- bzw. Inhaltsstoffes. Eine therapeutisch wirksame Dosis betrifft diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Linderung der Symptome, beispielsweise eine Behandlung, Heilung, Prävention oder Linderung derartiger Zustände, insbesondere die Hemmung oder Verhinderung von unerwünschtem Zellwachstum und Zellvermehrung in einem Patienten zu ergeben. Geeignete Verabreichungswege schließen beispielsweise eine parenterale Verabreichung, einschließlich intramuskulärer und subkutaner Injektionen, ebenso wie intrathekaler, direkt intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer Injektionen ein.
In einer weiteren Ausführungsform enthält diese pharmazeutische Zusammensetzung wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff. Eine solche Zusammensetzung kann weiterhin (zusätzlich zum Inhaltsstoff und dem Träger) Verdünnungsmittel, Füllmittel, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Lösungsvermittler und andere Materialien enthalten, die im Stand der Technik wohl bekannt sind. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein nicht-toxisches Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoff (der aktiven Inhaltsstoffe) nicht stört. Die Eigenschaften des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Die therapeutische Zusammensetzung kann weiterhin weitere Mittel bzw. Wirkstoffe enthalten, die die Aktivität bzw. Wirksamkeit oder Anwendung bei Behandlung verbessern bzw. erleichtern. Solche zusätzlichen Faktoren und/oder Mittel können in der therapeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um eine synergistische Wirkung zu erzeugen oder um Nebenwirkungen zu minimieren.
Techniken zur Formulierung, Zubereitung und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, neueste Ausgabe, zu finden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung von Tubulysinen und Tubulysin-Biosynthese Proteinen, umfassend die Schritte:
(a) exprimieren von wenigstens einem Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon und/oder wenigstens einem Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon, und
(b) aufreinigen der Expressionsprodukte.
Methoden zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können der einschlägigen Literatur entnommen werden, beispielweise aus Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.) oder Recombinant DNA Methodology (R. Wu ed., Academic Press) . Für das Aufreinigen von Expressionsprodukten sind dem Fachmann eine Vielzahl von Methoden bekannt. Neben chromatographischen Methoden wie beispielsweise Affinitätschromatographie oder HPLC können auch immunologische Verfahren wie beispielsweise immobilisierte Antikörper gegen ein Epitop auf dem Expressionsprodukt, z.B. einem His-tag, zum Aufreinigen der Produkte verwendet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und/oder durch in vitro Expression. Die Expression von Polypeptiden in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ist ein häufig angewandtes Verfahren und wird im Allgemeinen mittels eines Expressionsvektors, wie oben beschrieben, erreicht. Für die in vitro Expression sind ebenfalls bereits Vektoren beschrieben. Diese und die notwendigen Faktoren sind kommerziell in Form von Kits erhältlich, beispielsweise von BioRad, Stratagene, Invitrogen und Clontech.
Desweiteren stellt die Erfindung ein Verfahren zum Auffinden von Genen, die an der Biosynthese von Tubulysinen beteiligt sind, bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
(a) hybridisieren von wenigstens einem Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon mit DNA, RNA, und/oder cDNA einer Spezies, die nicht mit Angi ococcus disciformis identisch ist, und
(b) isolieren und charakterisieren der hybridisierten DNA, RNA, und/oder cDNA.
Die Hybridisierung kann unter unterschiedlich stringenten Bedingungen durchgeführt werden.
Die Stringenz der Hybridisierung, wie hierin verwendet, betrifft Bedingungen, unter denen Polynucleotid-Doppelstränge stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die Stabilität eines Doppelstranges eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)). Die Stringenzniveaus, die zur Hybridisierung verwendet werden, können vom Fachmann leicht abgewandelt werden.
Der Begriff „schwach stringente Hybridisierung" bezeichnet Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10 % Formamid, 5 x Denharts Lösung, 6 x SSPE, 0,2 % SDS bei 42°C, gefolgt von Waschen in 1 x SSPE, 0,2 % SDS bei 50°C äquivalent sind. DenharAs Lösung und SSPE sind dem Fachmann genauso wie andere geeignete Hybridisierungspuffer wohl bekannt.
Eine „moderat stringente Hybridisierung" bedeutet Bedingungen, die es der DNA erlauben, an eine komplementäre Nucleinsäure zu binden, die ungefähr 60 % Identität, vorzugsweise ungefähr 75 % Identität, besonders bevorzugt ungefähr 85 % Identität zu dieser DNA aufweist; wobei eine Identität von mehr als ungefähr 90 % zu dieser DNA besonders bevorzugt wird. Moderat stringente Bedingungen sind vorzugsweise Bedingungen, die eine Hybridisierung in 50 % Formamid, 5 x Denharts Lösung, 5 x SSPE, 0,2 % SDS bei 42°C gefolgt von Waschen in 0,2 x SSPE, 0,2 % SDS bei 65°C äquivalent sind.
Hochstringente Hybridisierung bedeutet Bedingungen, die die Hybridisierung nur von solchen Nucleinsäuresequenzen ermöglichen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabile Doppelstränge bilden (d.h., wenn ein Doppelstrang in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, ist er unter den hier beschriebenen/definierten hochstringenten Bedingungen nicht stabil) .
Weiterhin können Nucleinsäure-Hybridisierungstechniken verwendet werden, um eine Nucleinsäure zu identifizieren und zu gewinnen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst ist. Kurz gesagt kann jede Nucleinsäure mit einer gewissen Homologie zu einer in dieser Erfindung offenbarten Sequenz oder einem Fragment davon, als Sonde zur Identifizierung einer ähnlichen Nucleinsäure durch Hybridisierung unter moderat stringenten bis hochstringenten Bedingungen verwendet werden. Solche ähnlichen Nucleinsäuren können dann isoliert, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie von der vorliegenden Erfindung umfasst werden. Die vorliegende Erfindung stellt außerdem einen Kit zur Herstellung von Tubulysinen, enthaltend:
(a) wenigstens ein Polynucleotid, enthaltend eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 oder 36 definiert oder ein Fragment davon und/oder wenigstens einen Vektor der ein solches Polynucleotid enthält oder
(b) geeignete Medien und Puffer zur Vermehrung von Zellen, die eine Expression des Polynucleotids und/oder Vektors erlauben, und
(c) geeignete Mittel zum Aufreinigen des/der Expressionsprodukte (s) bereit .
Auf Grund ihrer Wirkung auf das Tubulin-Skelett und ihrer Cytotoxizität, insbesondere bei Pilzen, eignen sich Tubuline auch als Desinfektionsmittel, das eine Kontamination mit Tubulin-enthaltenden Zellen abbauen bzw. verhindern kann. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend wenigstens ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon als Desinfektionsmittel. Neben dem oben definierten Polypeptid können im Desinfektionsmittel auch andere desinfizierend wirkende Stoffe enthalten sein, solange sie die Wirkung des erfindungsgemäßen Polypeptids nicht inhibieren. Außerdem kann das Desinfektionsmittel weitere Hilfsstoffe wie beispielsweise Puffer, Wasser, Farbstoffe, Duftstoffe, Stabilisatoren, Trägerstoffe usw. enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung flüssig oder pulverförmig. , „„.„^
WO 2004/022586
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Entsprechend betrifft die Erfindung auch Desinfektionsmittel wie oben definiert.
Soweit keine anderen Definitionen angegeben sind, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise vom Fachmann auf dem Gebiet, an den sich diese Erfindung wendet, verstanden werden. Alle Veröffentlichungen, Patentanmeldungen, Patente und anderen hierin erwähnten Referenzen sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen. Im Falle eines Konfliktes wird jedoch die vorliegende Beschreibung einschließlich der Definitionen entscheiden. Zusätzlich sind die Materialien, Methoden und Beispiele lediglich veranschaulichend und sollen nicht als einschränkend aufgefasst werden.
1. Identifizierung des Tubulysin-Biosyntheseclusters in Angiococcus disciformis An d48 durch mariner Transposon- Mutagenese mittels pMycoMar
Die Identifizierung des Tubulysin-Biosyntheseclusters wurde durch die Erstellung einer Transposon-Mutantenbank aus Angiococcus disciformis An d48 mittels pMycoMar durchgeführt. Rubin & Mekalanos (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96 (1999), 1645 - 1650) entwickelten aus dem mariner Element Himarl das Plasmid pMycoMar, welches ein einfaches Transpositonssystem darstellt, das effizient Bakterien in vivo infizieren und Insertions- Mutanten generieren kann. Dieses Plasmid enthält das Mini- Transposon magellan , bei dem das Tn5 Kanamycin-Resistenzgen und der oriR6K von den inverted repeats des Himarl flankiert sind. Zusätzlich ist die Himarl Transposase unter der transkriptionalen Kontrolle des T6 Promotors in das mycobakterielle Temperatur-sensitive Replicon pPR23 kloniert worden. Das pMycoMar codiert ebenfalls ein Gentamycin- Resistenzgen.
Das Himarl zeichnet sich bei der Transposition durch eine TA Dinucleotid-Erkennungssequenz aus. Daher kann es zufällig in ein Wirts-Genom integrieren und statistisch gesehen alle aktiven Gene durch eine Insertions-Mutation ausschalten. Aufgrund dieser Tatsache sollte eine Mutantenbank aus An d48 generiert und das Tubulysin-Biosynthesecluster durch eine Knockout-Mutante identifiziert werden.
Alternativ kann man auch von Archangium gephyra DSM 11092 ausgehen und nach einem Protokoll von Biozym Diagnostic (Oldendorf, DE; Katalog TSM99K2; pEZ : : TN<KAN-2> Tnp Transposome- Kit) arbeiten. 1.1 Generierung der Mutantenbank
Für eine Elektrotransformation von A . disciformis An d48 wurden zwei verschiedene Protokolle verwendet. Diese Protokolle wurden für die Myxobakterien Stigma tella aurantiaca (Stamm & Plaga, Arch . Mircobiol., 172 (1995), 483 - 494) und Myxococcus xanthus (Kashefi & Hartzeil, Mol. Microbiology, 15 (1995) 483 - 494) etabliert. Die beiden Methoden zeigten in der Transformationseffizienz des A. disciformis An d48 keinen Unterschied, so dass die Elektrotransformation zur Erstellung der Transposonbank nach dem Protokoll für Stigma tella aurantiaca durchgeführt wurde. Im folgenden sind die beiden Protokolle aufgeführt.
l.l.l. Elektrotransformation von Angiococcus disciformis An d48 nach Stigmatella. auranfciaσa-Protokoll
Eine in 50 ml Tryptonmedium (10 g Trypton; 2 g MgS042; 0,1 % Vitamin B12 [10 ng/ml] ; 0,2 % Glucose auf 1 1 Medium; pH7,2) gewachsene A . disciformis Kultur wird bis 2 * 108 Zellen / ml bei 30 °C kultiviert. Ausgehend von einer Generationszeit von 6 Stunden, wurde diese Kultur am Vortag so angeimpft, dass rechnerisch diese Zelldichte erreicht wird. Die Kultur wird bei 20°C abzentrifugiert (20min; 4000rpm) und die Zellen im gleichen Volumen Waschpuffer (5 mM HEPES/NaOH, 0,5 M CaCl2; pH '7,2) resuspendiert. Nach erneuter Zentrifugation wird in 25 ml Puffer resuspendiert und erneut abzentrifugiert. Vor diesem Zentrifugationsschritt wird die absolute Zellzahl innerhalb der 25 ml bestimmt, so dass rechnerisch 1 * 109 Zellen/ 40 μl resuspendiert werden. Elektroporationsbedingungen :
1-3 μg DNA und 40 μl Zellsuspension werden gemischt und in eine auf Eis gekühlte Elektroporationsküvette (0,1 cm) gegeben. Die Elektroporation wird bei 200 Ω, 25 mF und 0,85 kV / cm durchgeführt .
Direkt nach der Elektroporation wird 1 ml Tryptonmedium zugegeben. Nach Transfer in 50 ml Tryptonmedium werden die Zellen für eine phänotypische Expression 6 h bei.30°C geschüttelt. Danach wird die Kultur abzentrifugiert (20 min, 4000 rpm, 20°C) und in 1 ml Trypton resuspendiert. Ausgehend von einer 100 %-igen Überlebensrate der Zellen wird eine Verdünnungsreihe erstellt und 1*108 - 1*104 Zellen werden mit 3 ml Trypton-Softagar auf Kanamycin haltigen (50 μg / ml) Tryptonplatten plattiert. Diese Platten werden bei 30 °C inkubiert und nach 5 - 8 Tagen sind die ersten Klone zu sehen.
1.1.2. Elektrotransformation von Angiococcus disciformis An d48 nach Myxococcus xant us-Protokoll
Die Wachstumsbedingungen der Vor- und Hauptkultur sowie Zentrifugationen und das abschließende Einengen der Zellzahl wurden genauso durchgeführt wie unter l.l.l. angegeben ist. Dies ist abweichend vom Standardprotokoll für Myxococcus xanthus optimiert worden.
Elektroporationsbedingungen :
1-3 μg DNA und 40 μl Zellsuspension werden gemischt und in eine auf Eis gekühlte Elektroporationsküvette (0,1 cm) gegeben. Die
Elektroporation wird bei 400 Ω, 25 μF und 0,65kV / cm durchgeführt. Direkt nach der Elektroporation wird 1 ml Tryptonmedium zugegeben und in einem 1,5 ml Eppendorf-Reagenzgefäß für 6 h bei 30°C geschüttelt. Ausgehend von einer 100%-igen Überlebensrate der Zellen wird eine Verdünnungsreihe erstellt und 1*108 - 1*104 Zellen mit 3 ml Trypton-Softagar auf Kanamycin haltigen (50 μg / ml) Tryptonplatten plattiert. Diese Platten werden bei 30°C inkubiert und nach 5 - 8 Tagen sind die ersten Klone / Mutanten zu sehen, die mittels Impföse gepickt wurden.
1.2 Kultivierung der Transposonmutanten
Die Mutanten wurden in 96'er Mikrotiter-Platten in 200 μl M7- Medium (5 g Probion; 1 g CaCl2; 1 g MgS044; lg Hefeextrakt; 5 g Stärke; 10 g HEPES; 0,1 % Vitamin B12 [10 ng / ml] auf 1 1 Medium; pH7,4) bei 32 °C inkubiert und nach 10 Tagen eine Kopie der gesamten Bank erstellt. Dafür wurden 50 μl Kultur jeder Mutante in neue Mikrotiter-Platten mit 100 μl M7-Medium transferiert. Nach weiteren sieben Tagen Inkubation wurde eine Kopie bei -80 °C als Dauerkulturen eingefroren. Die verbleibende Kopie der Bank wurde extrahiert, der Extrakt mittels Toxizitätstest auf generierte Tubulysin Knockout-Mutanten untersucht .
Bei der Identifizierung von Mutanten, die in dieser Analytik Veränderungen zum Wildtyp zeigten (keine Zellkernfragmentierung) , wurden diese aus der Dauerkultur rekultiviert. Zur Kontrolle der erzielten Ergebnisse sollten 50 ml M7-Medium Großkulturen der entsprechenden Mutanten erneut getestet werden. Bei eventuellen Tubulysin Knockout-Mutanten wurden die Extrakte zunächst über einen HPLC-Lauf fraktioniert und anschließend die Fraktionen mittels Toxizitätstest auf Tubulysin untersucht. Durch die vorhergehende Fraktionierung wird eine Maskierung der Tubulysin-Wirkung durch Myxothiazol vermieden. Da die beiden Sekundärmetabolite verschiedene Retentionszeiten bei der Elution von einer C-14 Säule besitzen, liegen beide im folgenden Toxizitätstest in unterschiedlichen Fraktionen vor.
1.3 Toxizitätstest
Die Mini-Kulturen aus den 96 'Mikrotiterplatten wurden nach Kultivierung durch Stickstoff-Begasung auf einem Heizblock bei 37 °C eingetrocknet. Danach wurden die Zellpellets über 2 h in lOOμl Methanol resuspendiert und jeweils 10 μl für den folgenden Toxizitätstest eingesetzt, um eine Tubulysin-Produktion der jeweiligen Mutante detektieren zu können.
Für diesen Test werden L929 Zellen in DMEM-Medium (Invitrogen, Groningen) bei 37 °C kultiviert und danach mittels Zellschaber vorsichtig geerntet. Diese Zellsuspension wird anschließend 1 : 10 mit DMEM verdünnt und 120 μl pro Öffnung einer 96 'Mikrotiterplatte verteilt. Diese werden anschließend mit den 10 μl Zellextrakt der einzelnen Transposon-Mutanten versetzt und für fünf Tage bei 37 °C inkubiert. Nach dieser Inkubationszeit werden die L929 Zellen mikroskopisch auf Zellkernfrakmentierung untersucht, was ein Zeichen für Tubulysineinwirkung ist. Bei Zellen, die keine Zellkernfragmentierung zeigten, wurden die entsprechenden Mutanten als mutmaßliche Tubulysin Knockout- Mutanten identifiziert. Die Extrakte dieser Mutanten wurden in 50 ml M7-Medium ( + 1ml Absorber-Harz XAD-16 von Rohm & Haas) angezogen und die Zellkerne der L929-Zellen nach durchgeführtem Toxizitätstest zusätzlich durch eine Anfärbung des Chromosoms mittels DAPI-Färbung auf eine Zellkernfragmentierung bzw. Tubulysin-Produktion untersucht. 1.4 Bestimmung des Integrationsgenortes der Tubulysin Knockout- Mutanten in der An d48 mariner vermittelten Mutantenbank mittels Transposon-recovery
In der generierten Mutantenbank konnten mittels Toxizitätstest fünf Mutanten identifiziert werden (MutT176, 524, 781, 794 und 929), die kein Tubulysin produzierten. Dieses Ergebnis konnte nach Rekultivierung der Mutanten aus der Dauerkultur und erneuter Analyse bestätigt werden. Um Informationen zu erhalten, in welchen Bereich des Genoms das Himarl Element transponiert ist, wurde ein Transposon-recovery durchgeführt. Bei dieser Methodik wird die chromosomale DNA der jeweiligen Mutante mit verschiedenen Restriktionsenzymen geschnitten, die nicht innerhalb der bekannten magellan4 Sequenz schneiden. Die restringierte DNA wird ligiert, nach Transformation in
DH5α/λpir-Zellen wird auf Kanamycin haltigen LB-Platten bei 37 °C inkubiert. Auf diesen Platten können nur solche E. coli Zellen wachsen, die ein Plasmid mit dem magellan4 und somit dem Tn5 Kanamycin-Resistenzgen enthalten. Solch ein Plasmid enthält an den Enden des Transposons chromosomale DNA aus An d48. Diese Plasmide können in den E . coli Zellen DH5α/λpir replizieren, da innerhalb der Transposon Sequenz der oriR6K sitzt. Das Transposon wurde so aus dem jeweiligen Genom isoliert und mit den Primern K388 und K389 ansequenziert. Die erhaltenen Sequenzen wurden dann gegen die Genbank auf Homlogien zu bekannten Genen hin untersucht und zeigten dabei hohe Ähnlichkeiten zu nicht ribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) aus bekannten Sekundärmetabolit-Biosynthesegenclustern wie denen des Myxothiazols, Nostopeptolids und Saframycins. Diese Analysen waren eindeutige Hinweise dafür, dass es sich dabei um Sequenzfragmente aus dem gesuchten Tubulysin-Gencluster handet . Durch Restriktions- und Southernanalysen wurde die Größe der einzelnen Transposon-Plasmide und ihre relativen Integrationsorte zueinander (innerhalb des Genclusters) bestimmt .
1.4.1. Transposon-recovery
Isolieren chromosomaler DNA nach Standardprotokollen aus 50 ml Tryptonmedium-Kultur jeder A . disciformis An d48 Mutante. Von dieser DNA werden 5 μg für die folgende Ausklonierung des Transposons verwendet, indem zunächst eine Restriktion durchgeführt wird. Dabei wurden die Enzyme Notl und BamHl verwendet, die keine Restriktionsstelle innerhalb des magellan haben und statistisch relativ häufig in GC-reicher DNA schneiden sollten.
Verdau der genomischen DNA mit Notl bzw. BamRl :
5 μg DNA + 3 μl 10 x NEB Puffer + 3 μl 100 x BSA
+ 10 U Restriktionsenzym (BamHI bzw. Notl) + x μl dest. H20
30 μl Ansatz für 3 h bei 37 °C inkubieren => wiederum 10 U
Enzym zu den Restriktionsansätzen zugeben und weitere 2 h bei 37 °C inkubieren.
Fällen der restringierten DNA und folgende Ligation
Der gesamte Restriktionsansatz von 30 μl wird mit 1 Vol. Chloroform/Phenol versetzt und für 10 min. zentrifugiert (13.200 rpm; 20°C). Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 1/10 Vol. 3 M NaOAc und 2,5 Vol. 100% EtOH versetzt. Zum fällen der DNA wird das Reaktionsgefäß für 1 h bei -20°C inkubiert und anschließend für 30 min. zentrifugiert (13.200 rpm; 4°C). Der Überstand wird verworfen und das Pellet dreimal mit 70% EtOH gewaschen, wobei man jeweils 5 min. zentrifugiert (13.200 rpm; 20°C). Nach dem Verwerfen des Überstandes wird das Pellet bei 37 °C getrocknet und in 15 μl H20 resuspendiert. Für die anschließende Ligation werden die gesamten 15 μl der gefällten DNA verwendet.
Ligationsansatz : 15 μl DNA
+ 4 μl 5 x Ligasepuffer (NEB) + 1 μl NEB Ligase
20 μl Ansatz über Nacht bei 16°C inkubiert
= wiederum 1 μl Ligase zu den Ligationsansätzen und ÜN bei 16°C inkubieren.
Elektrotransformation der Ligationsansätze in den E. coli • Stamm DH5α-λpir
1-3 μl der Ligationsansätze und 50 μl DH5α-λpir Zellen werden gemischt und in eine auf Eis gekühlte Elektroporationsküvette (0,1 cm) gegeben. Die Elektroporation wird bei 200 Ω, 25 mF und l,25kV / cm durchgeführt. Die Zellen werden danach in 1 ml LB- Medium (10 g Trypton; 10 g NaCl; 5 g Hefeextrakt auf 1 1 Medium) aufgenommen und für 1 h bei 37 °C inkubiert. Danach werden sie auf Kanamycin-haltigen (50 μg / ml) LB-Platten ausplattiert. Nach einem Tag Inkubation bei 37 °C können die Klone gepickt werden. Dabei können nur Zellen anwachsen, die ein Transposon- Plasmid beinhalten und damit eine Tn5-KanR vermittelte Resistenz besitzen. 1.5 Sequenzauswertung des Tubulysin Biosynthese-Genclusters aus pMutT794/NotI
Das Transposon-Plasmid pMutT794/WotI enthält 52985 bp chromosomale DNA aus Angiococcus disciformis An d48. Zusammen mit dem Himarl Minitransposon magellanA (2199 bp) , das bei Basenpaar 37317 bp in das Plasmid integriert ist, wurden 55184 bp sequenziert. Insgesamt 21760 bp stammen aus codierenden Genen des Tubulysin-Genclusters und sowie 31219 bp weitere codierende Gene. Bei diesen ORF's handelt es sich zum Teil um Regulatorgene, die die Expression des Tubulysins beeinflussen können. Sequenzvergleiche mit den Transposon-Plasmiden der anderen Tubulysin Knockout-Mutanten zeigten, dass das magellanA bei den Mutanten MutT781 (36975bp) und MutT929 (36197 bp) innerhalb von 1658 bp zu MutT794 in das Biosynthese-Gencluster transponiert sind.
Auf der Sequenz ist der Start des Tubulysin-Genclusters mit drei NRPS-Modulen ( tubA-C ), einem Cyclodeaminase codierendem Gen (tUbZ) und einem PKS-Modul ( tubD) enthalten. Desweiteren liegen innerhalb des Genclusters ein Anionentransporter codierendes Gen (ORF1), das zum Austransport des Tubulysins aus der Zelle dient und ein weiterer ORF (ORF2) . Die grundsätzliche Anordnung der Gene, sowie der einzelnen Domänen mit einer N-Methyltransferase innerhalb der Adenylierungsdomänen (A) von tu B und tubC, entsprechen dem typischen Aufbau des Genclusters und der damit verbundenen Tubulysin-Biosynthese. Die Methyltransferase-Domänen (NMT) sind aber im Gegensatz zu bekannten Genclustern-Strukturen nicht zwischen der Adenylierungs- und Thiolierungs-Domäne (PCP) lokalisiert, sondern zwischen A8 und A9 innerhalb der Adenylierungs-Domäne (A) (hoch konservierte Regionen innerhalb der Adenylierungs-Dömanen von NRPS; Konz & Marahiel, Chem. Biology, 6 (1999) R39 - R48). TubA, codiert eine unvollständige Kondensationsdomäne, die für die Biosynthese theoretisch nicht benötigt wird. Die am Ende der bekannten Sequenz liegende Polyketidsynthase (PKS) enthält eine Ketoacylsynthase- (KS) , Acyltransferase- (AT) und Ketoreduktase- (KR) Domäne.
Die restliche Sequenz des Tubulysin-Biosynthesegenclusters wurde aus einer Cosmidbank von An d48 (hinterlegt bei der DSMZ) unter Standardbedingungen identifiziert. Das auf der ersten Hälfte der Sequenz endende PKS-Modul (tubD) wird fortgesetzt von den schon erwähnten KS, AT und KR-Domänenund beeinhaltet weiterhin eine Enoylreduktase (ER) und ein Acyl Carrier Protein (ACP) . In der folgenden Sequenz von tubD wird eine NRPS codiert, die eine Heterozyklisierungs- (HC) , Adenylierungs- (A) und Peptidyl Carrier Protein- (PCP) Domäne trägt. Des weiteren folgen die Gene tubE und tubF. Das Gen tu E codiert eine NRPS mit den Domänen C, A und PCP. Auf tubF wird eine PKS mit der folgenden Domänen-Anordnung codiert: Ketoacylsynthase (KS) , Acyltransferase (AT) , Ketoreduktase (KR) , C-Methyltransferase (CMT) , Dehydratase (DH) , Enoylreduktase (ER) , Acyl Carrier Protein (ACP) und schließlich eine Thioesterase, die für die Abspaltung des fertigen Tubulysins in Form einer freien Säure vom Multienzymkomplex sorgt. Der Insertionsort des Transposons ma gellanA liegt bei der MutT176 bei Basenpaar 54579 innerhalb des Biosynthesegenclusters . Der Insertionsort der Mutante MutT524 liegt nicht auf der uns bekannten Gencluster-Sequenz . Wir postulieren daher, dass der Insertionsort innerhalb eines für eine Acyltransferase codierenden Genes liegt, das downstream vom Tubulysin-Biosynthesegencluster liegt und eine posttranslationale Funktion zur Modifikation des Tubulysins hat. 2. Identifizierung der Anschlusssequenz des Tubulysin- Biosynthese-Genclusters aus Angiococcus disciformis An d48
2.1 Identifizierung und Charakterisierung von Cosmiden, die eine überlappenede Sequenz downstream zum Tubulysin-Biosynthese- Genσluster tragen
Im vorhergehenden Beispiel wurde beschrieben wie die erste Hälfte des Tubulysin-Biosynthese-Genclusters zusammen mit weiteren an der Biosynthese beteiligten Genen mittels mariner basierender Transposon-Mutagenese und anschließendem Transposon- recovery identifiziert und annotiert wurde. Da innerhalb dieser Sequenz sowohl codierende Gene für Monooxigenasen als auch Acyltransferasen fehlen, sollte noch weitere Sequenz downstream von dieser identifiziert und charakterisiert werden. Innerhalb dieser Sequenz sollten oben angegebene Gene codiert vorliegen, da sie für die Biosynthese des Tubulysins erforderlich sind. Das Biosynthese-Gencluster sollte auf diesem Weg vollständig identifiziert werden.
Hierfür wurde eine Cosmidbank aus A. disciformis An d48 mittels Gigapack II XL packaging-kit (Fa. Stratagene) in E. coli SURE erstellt. Innerhalb dieser Bank sollten Cosmide identifiziert werden, die einen längeren Überlapp mit dem Tubulysin- Biosynthese-Gencluster downstream von tubF besitzen. Dafür wurden aus der bekannten Sequenz des Tubulysin-Genclusters zwei Primerpaare abgeleitet und die PCR-Amplifikate als Sonden für die folgende Hybridisierung der Cosmidbank eingesetzt. Das erste Primerpaar ASTlslA-lB liefert ein 889 bp großes DNA-Fragment und liegt 1 kb vor der Notl-Restriktionsschnittstelle in tubD . Das zweite Primerpaar ASTls2A-2B generiert ein 700 bp Fragment, das 11 kb upstream im bekannten Cluster-Ende entfernt in tubC liegt. Die PCR wurde bei 54 °C Annealing-Temperatur durchgeführt. Durch diese Hybridisierung konnten verschiedene Cosmide identifiziert werden. Mittels PCR- und Restriktionsanalytik wurden sie auf die Größe ihrer Überlappung mit der bekannten Cluster-Sequenz untersucht. Hierfür wurden wiederum die Primerpärchen ASTlslA/B und ASTls2A/B bei einer Annealing-Temperatur von 58 °C eingesetzt. Bei der Restriktion wurden verschiedene Enzyme in Einzel- und Doppelrestriktionen eingesetzt.
Da die Cosmide F7 und F13 nach den Restriktionsanalysen einen ähnlich großen Überlapp mit dem ersten Teil des Clusters zeigten, trägt eines dieser Cosmide die nötigen genetischen Informationen, um die unmittelbar clustergebundenen Gene identifizieren zu können.
2.1.1 Southern-Analytik der Cosmide F7 und F13
Für die Identifizierung des richtigen Cosmids wurden zunächst Restriktionsenzyme ausgewählt, die möglichst selten und am Ende der bekannten Genclustersequenz schneiden. Die ausgewählten Enzyme waren del und Nsil , die an den Positionen 39306 bp bzw. 39430 bp schneiden. Des weiteren schneiden beide Enzyme nur ein weiteres Mal in der bekannten Sequenz. Mit einer generierten Sonde (Primerpaar Tlsup/on) die hinter diesen Schnitten direkt am Ende der bekannten Cluster-Sequenz bindet, sollte nun die Cosmid-Genbank „gescreent" werden. Die Cosmide wurden dafür in verschiedenen Doppelrestriktionsansätzen hydrolisiert und auf einem Agarosegel (0,8 %) aufgetrennt. Für die Doppelrestriktion wurden neben Ndel und Nsil die Enzyme BamHI , .EcoRI, und Notl ausgewählt. Durch die Kombinationen mit £coRI und Notl sollte erreicht werden, dass mittels der Hybridisierung ein Fragment identifiziert wird, welches bis an das Ende des jeweiligen Cosmid-Inserts reicht. Falls dieses Fragment für eine nachfolgende Klonierung zu groß sein sollte, wurde ebenfalls BamHI verwendet, um eventuell kürzere Fragmente zu erhalten. Die Hybridisierung wurde bei 42 °C durchgeführt, und es wurde unter höchst stringenten Bedingungen gewaschen (68°C).
Das Ergebnis dieser Analytik war, dass in dem .EcoRI / Ndel- Restriktionsansatz des Cosmids F7 ein 12 kb Fragment detektiert wurde. Dieses Fragment enthält die restliche Sequenz des Tubulysin-Genclusters und reicht bis zum Ende der Insert-Sequenz des Cosmids. Diese Schlussfolgerung wurde aus den Restriktionsanalysen und der charakterisierten Überlappung mit der Tubulysin-Genclustersequenz geschlossen. Das detektierte Notl / Ndel - Fragment ergab eine Größe von 4,2 kb. Daher muss innerhalb der 12 kb Insertsequenz von F7 - zwischen Anfang (Ndel Restriktionsstelle) und Vektor (scos) - mindestens eine weitere Notl-Schnittstelle liegen. Somit kann die
Anschlusssequenz in kleineren Fragmenten (als Ndel / Notl - und Notl / Nσtl-Fragmente ) kloniert und sequenziert werden. Der BamHI / Nsil Doppelrestriktionsansatz lieferte insgesamt fünf Fragmente .
2.1.2. Klonierung der restlichen Tubulysin-Genclustersequenz aus Cosmid F7
Das Cosmid F7 wurde in einem Doppelrestriktionsansatz mit den Restriktionsendonucleasen Nsil und EcoRI geschnitten (2 h; 37 °C). Nach einer Auftrennung des Restriktionsansatzes mittels 0,8 %igem Agarosegel, wurde die entsprechende Bande aus dem Gel ausgeschnitten und mit dem NucleoSpin kit (Fa. Macherei-Nagel) extrahiert. Das isolierte Fragment wurde mit Notl nachgeschnitten, um zu überprüfen, ob die erzielten Hybridisierungsergebnisse bestätigt werden. Zusätzlich wurde überprüft ob weitere Notl-Erkennungssequenzen innerhalb der 12 kb Anschlusssequenz liegen, um die Anzahl der zu klonierenden Teilfragmente bestimmen zu können. Die Restriktion ergab nach einer Auftrennung auf einem 0,8%igem Agarosegel ein 4,2 (Nsil / No l-Fragment) und 8 kb großes Fragment (Notl / Notl-Fragment ) .
Zum einen konnte somit das Hybridisierungsergebnis bestätigt werden und beide Fragmente konnten für eine Klonierung eingesetzt werden. Zum anderen wurde bestätigt, dass es sich um das richtige Fragment handelt, das die Sequenz downstream des Clusters trägt.
Kloniert wurden das 12,2 kb große Nsil / EcoRI - Fragment, sowie die 4,2 kb (Nsil / Notl ) und 8 kb ( Notl / Notl ) großen Fragmente in den Vektor pUC18. Der Vektor wurde für die folgende Ligation mit PstI / EcoRI bzw. PstI / Notl und Notl geschnitten. PstI und Nsil besitzen ein kompatibles Schnittmuster, so dass nach erfolgreicher Klonierung, diese Schnittstellen nicht mehr vorhanden sind. Mittels HindiII bzw. Ndel und EcoRI kann in einer Doppelrestriktion das 12 kb Insert wieder aus dem pUC18 - Derivat herausgeschnitten werden.
Die erhaltenen Klone wurden mittels dieser Restriktionsansätze auf ihre Richtigkeit hin überprüft. Einer dieser Klone (ASpUC12) wurde für eine folgende in vi tro Transposition miteis GPS™ - 1 Genome Priming System (Fa. New England Biolabsτ.nc) eingesetzt.
2.1.3. In vitro Transposition mit GPS - 1™ Genome Priming System Durch das GPS - 1 System sollte mittels einer auf Tn7 basierenden in vi tro Transposition das klonierte Nsil / Notl Fragment sequenziert werden. Bei diesem „kit" wird eine TnsABC Transposase verwendet, die das Transposon (Transprimer™) zufällig in die Zielsequenz inseriert. Durch spezifische Sequenzierprimer (PrimerN / PrimerS) , die aus den flankierenden Enden des Transposons „herauslesen", können die anliegenden Bereiche des DNA-Inserts sequenziert werden. Da das Transposon zufällig in die Zielsequenz inseriert wird, kann durch Sequenzieren einer bestimmten Anzahl generierter Transposon- Mutanten die gesamte Zielsequenz charakterisiert werden.
Durchführung der in vitro Transposition
2 μl 10 x GPS-Puffer + 1 μl pGPS 1.1 (vermittelt KanR) + 0,2 μl Ziel - DNA (entsprechen 80 ng ASexp7) + 14, 8 μl dH20
18 μl Ansatz
Dieser Ansatz wird gut durchmischt und mit 1 μl TnsABC Transposase versetzt (wiederum durchmischen) . Der gesamten Reaktionsansatz wird für 10 min. bei 37°C inkubiert, damit sich die Transposase vor der eigentlichen Reaktion im Reaktionsansatz vermischt. Nach der Zugabe von 1 μl „start solution" wird der Reaktionsansatz für eine Stunde bei 37°C inkubiert. In dieser Zeit kommt es zum Strangtransfer des Transposons in die Ziel- DNA. Danach wird die Reaktion durch Inkubation für 10 min. bei 75 °C abgestoppt. Von diesem Ansatz wurden 2 μl in E. coli DH10B transformiert und auf Kanamycin-haltigem Medium ausplattiert. Insgesamt sind ca. 2000 Klone nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C gewachsen. Von diesen Klonen wurden 20 daraufhin überprüft, in welchem Verhältnis das Transposon in das Insert oder den Vektor inseriert ist. Dafür wurden diese Klone in einem Doppelrestriktionsansatz mit den Endonukleasen EcoRI und HindiII hydrolisiert. Die Restriktionsanalyse ergab, dass bei 75% der Klone das Transposon in das Insert inseriert waren. Somit wurden 192 Klone sequenziert, wodurch eine ca. 12 fache Abdeckung der Sequenz erreicht wurde (bei 500 bp Lauflänge je Sequenzierung) .
2.2 Sequenzanalyse und Annotieren der 12 kb Anschlusssequenz
Die erhaltene Restsequenz des Tubulysin-Biosynthese-Genclusters ist 12.219 bp lang und hat eine Überlappung mit der vorher identifizierten Sequenz von 133 bp. Sequenzabschnitte, bei denen nur eine einfache Abdeckung vorlag, wurden durch erneute Sequenzierungen spezifischer Klone doppelsträngig sequenziert. In dieser Sequenz ist von Basenpaar 6416 - 6898 eine Acyltransferase (Position 76.787 - 77.545 bp in Gesamtsequenz) codiert. Die anderen identifizierten ORFs haben ebenfalls eine Funktion in der Tubulysin-Biosynthese. Die Gesamtsequenz beträgt somit 82.868 bp .
3. Identifizierung einer Tubulysin überproduzierenden Mutante innerhalb der mariner-Transposon Mutantenbank
Um die Mutanten der Transposonbank auf weitere auffällige Phänotypen gegenüber dem Wildtypen zu untersuchen, wurde eine HPLC-Analytik durchgeführt. Dabei wurde überprüft, ob die Insertion des Transposons in chromosomale Bereiche von Biosynthese-Genclustern anderer, exprimierter Sekundärstoffe stattgefunden hat. Bei diesen Vergleichen gegenüber einem Extrakt des Wildtypen sollten dann nicht produzierende Mutanten der jeweiligen Metabolite identifiziert werden. Zu diesen Metaboliten gehören das Myxothiazol (Gerth et al . 1980 J Antibiot (Tokyo) 33 (12) : 1474-1479 und Silakowski et al. 1999 J Biol Chem. 274 (52) : 37391-9, Myxochelin (Gerth et al. 1983 J Antibiot (Tokyo) 36 ( 9) : 1150-6. und Silakowski et al. 2000 Eur J Biochem. 267 (21) : 6476-85) und Angiolam (Kunze et al. 1985, J Antibiot (Tokyo) 38 (12) : 1649-54) .
Bei den Auswertungen der 1.200 HPLC-Läufe fielen Extrakte einiger Mutanten auf, bei denen eine erhöhte Myxothiazol- Produktion gemessen werden konnte. Zur Kontrolle der erzielten Ergebnisse wurden 50 ml M7-Medium Kulturen der entsprechenden Mutanten erneut getestet und Zeitkinetiken zur Myxothiazol- Produktion über mehrere Tage gegenüber dem Wildtypen, erstellt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten eine deutlich erhöhte Produktion des Myxothiazols in den verschiedenen Mutanten bezogen auf den An d48 Wildtypen.
Die Bestimmung des Transposon-Insertionsortes innerhalb der jeweiligen Mutante erfolgte mittels „Transposon-recovery" und anschließender Sequenzierung der flankierenden Bereiche (siehe 1.4). Die erhaltenen Sequenzen wurden gegen die Genbank auf Homlogien zu bekannten Genen hin untersucht und zeigten hohe Ähnlichkeiten zu regulatorischen Elementen / Genen aus bakteriellen Organismen. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die gesamte Mutantenbank auf Tubulysin überproduzierende Mutanten hin untersucht. Dafür wurde der bestehende Toxizitätstest (siehe 1.3) optimiert. Durch mehrfache Verdünnungen des jeweilig eingesetzten Mutanten-Extraktes im Toxizitätstest wird eine Ausdünnung des Tubulysins erreicht und somit ist die charakteristische Wirkung auf L929 Zellen ab einer bestimmten Verdünnung nicht mehr detektierbar . Anhand dieser Verdünnungsreihen (aus der gesamten Mutantenbank) wurden Mutanten identifiziert, bei denen signifikant höhere Verdünnungen benötigt werden, um keine Wirkung mehr feststellen zu können. Dies bedeutet, dass die jeweiligen Mutante eine erhöhte Produktion des Tubulysins aufweist.
Es konnte die Mutante Mutl58 identifiziert werden, die eine vierfach erhöhte Tubulysin D-Produktion zeigte. Dieses Ergebnis wurde sowohl durch die Anzucht der Mutante in 50 ml Kulturen über HPLC-MS Untersuchungen, als auch mehreren Kinetiken mit folgendem, optimiertem Toxizitätstest gegenüber dem Wildtypen gezeigt. Mittels des Toxizitätstest wurde sogar eine achtfache Überproduktion von Tubulysinen ermittelt. Dabei wird die Gesamtwirkung aller Tubulysin-Derivate detektiert und nicht nur die von Tubulysin D. Die Mutante 158 weist somit völlig überraschend noch Überexpression von weiteren Tubulysinen gegenüber dem Wildtypen von A. disciformis auf. Dies war in keinster Weise zu erwarten gewesen. Die Ausklonierung des genomischen Bereichs unmittelbar an der Insertionsstelle des Transposons und die Sequenzierung erfolgte wie unter 1.4 beschrieben.
Die Sequenz des betroffenen Gens zeigt hohe Ähnlichkeiten zu einer Proteinkinase (aus Stigma tella aurantiaca ) , wobei der Insertionsort des Transposons die Promotorregion dieses Genes betrifft. Ohne auf diesen Wirkmechanismus festgelegt zu werden, besitzt dieses Gen eine negativ regulatorische Funktion für die Tubulysin-Bildung, weshalb eine Inaktivierung des Gens zu einer erhöhten Produktion führt. Die Gesamtsequenz beinhaltet 2.200 bp, wobei die Proteinkinase von Basenpaar 1.228 - 20 codiert wird und insgesamt 1.209 bp groß ist. Der upstream liegende ORF codiert ein Tubulysin-Biosynthese Protein und ist 933 bp groß.
PrimerSequenzen:
Sequenzierprimer für das Himarl Mini-Transposon magellanA
K-388: 5A3' 5'TGG GAA TCA TTT GAA GGT TGG3' SEQ ID NO: 39
K-389: 3A5' 5'TGT GTT TTT CTT TGT TAG ACC G3' SEQ ID NO: 40
Primerpaar ASTlslA/B wurde abgeleitet aus tubO und ergibt ein
889 bp Fragment
ASTlslA 5'CAC CCG GAC CTG CCT GGA TTC3' SEQ ID NO: 41
ASTlslB 5'TGC TCG GCT GGC GCT ACT CAC3' SEQ ID NO: 42
Primerpaar ASTls2A/B wurde abgeleitet aus tubC und ergibt ein
700 bp Fragment
ASTls2A 5'GCT CCC GGG CCA CGT GGT TGA AGA3' SEQ ID NO: 43 ASTls2B 5CCG CGG GCC GTG GCA GTG GTG TA3' SEQ ID NO: 44
Primerpaar Tlsup / Tlsd0wn wurde abgeleitet aus tubF und ergibt ein 125 bp Fragment
Tlsup 5'TGG CAG CCA GCC CGA GC3' SEQ ID NO: 45
Tlsdown 5-CCG CGG GTG CCC TCT CAT C 3' SEQ ID NO: 46
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KS: Ketoacylsynthase
AT: Acyltransferase
KR: Ketoreduktase
DH: Dehydratase
ER: Enoylreduktase
ACP: acyl carrier protein / Acyl-Trägerprotein
CMT: C-Methyltransferase
NMT: N-Methyltransferase
A: Adenylierungsdomäne
C: Kondensationsdomäne
PCP: peptidyl carrier protein / Peptidyl-Trägerprotein
TE: Thioesterase
bp: Basenpaare
Da: Dalton

Claims

Patentansprüche
1. ss-DNA-Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
(i) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz gemäß Figur 1;
(ii) ss-DNA-Molekül, das mit einem ss-DNA-Molekül gemäß (i) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zu jeweils 90, 91, 92, 93, 94 , 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von dem ss-DNA-Molekül gemäß (i) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und (iii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz, die zur Sequenz eines ss-DNA-Moleküls gemäß (i) oder "(ii) komplementär ist.
2. ds-DNA-Molekül aus einem ss-DNA-Molekül gemäß Anspruch 1 und einem dazu komplementären Strang.
3. ss-DNA-Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
(i) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 3.308 bis 1 (ORF 16) der Sequenz gemäß Figur 1;
(ii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 4706 bis 3453 (ORF 15) der Sequenz gemäß Figur 1;
(iii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 5719 bis 7164 (ORF 14) der Sequenz gemäß Figur 1;
(iv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 9557 bis 7317 (ORF 13) der Sequenz gemäß Figur 1;
(v) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 12193 bis 10550 (ORF 12) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 12841 bis 13881 (ORF 11) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 14833 bis 13835 (ORF 10) der Sequenz gemäß Figur 1;
(viii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 14942 bis 15586 (ORF 9) der Sequenz gemäß Figur 1; (ix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 15847 bis 16983 (ORF 8) der Sequenz gemäß • Figur 1;
(x) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 21154 bis 18809 (ORF 7) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 22366 bis 23532 (ORF 6) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 24591 bis 26513 (ORF 5) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 26597 bis 27517 (ORF 4) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 29858 bis 30400 (ORF 3) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 31220 bis 32392 (TubA) der Sequenz gemäß Figur 1/
(xvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 33056 bis 32397 (ORF 2) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 34195 bis 33074 (TubZ) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 35422 bis 34205 (ORF 1) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 35522 bis 40147 (TubB) der Sequenz gemäß Figur 1; (xx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 40144 bis 48021 (TubC) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 48011 bis 58558 (TubD) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 58551 bis 62096 (TubE) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 62103 bis 70616 (TubF) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiv) ss-DNA-Molekül, das mit einem Molekül gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv), (v) , (vi), (vii), (viii), (ix), (x) , (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii), (xix), (xx) , (xxi), (xxii) oder (xxiii) unter stringenten Bedingungen hybridisierbar ist und insbesondere dieselbe Anzahl von Basen aufweist; und
(xxv) ss-DNA-Molekül, das mit einem ss-DNA-Molekül gemäß (i), (ii), (iii), (iv) , (v) , (vi) , (vii), (viii), (ix), (x) , (xi), (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii) , (xviii) , (xix) , (xx) , (xxi) , (xxii) oder (xxiii) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zu jeweils 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von diesem ss-DNA-Molekül hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und (xxvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz, die zur Sequenz eines Moleküls gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv) , (v) , (vi), (vii), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii), (xix), (xx) , (xxi) , (xxii) , (xxiii) , (xxiv) oder (xxv) komplementär ist.
4. ds-DNA-Molekül aus einem ss-DNA-Molekül gemäß Anspruch 3 und einem dazu komplementären Strang.
5. ss-DNA-Molekül, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
(i) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 35747 bis 36769 (Domäne C des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(ii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 37184 bis 39817 (Domäne A des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(iii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 38369 bis 39730 (Domäne NMT des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(iv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 39818 bis 40069 (Domäne PCP des tubB-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(v) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 40372 bis 41397 (Domäne C des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (vi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 41824 bis 43215 (Domäne A des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(vii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 43216 bis 43461 (Domäne PCP des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(viii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 43552 bis 44574 (Domäne C des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(ix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 44980 bis 47631 (Domäne A des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(x) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 46153 bis 47547 (Domäne NMT des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 47632 bis 47868 (Domäne PCP des tubC-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 48011 bis 49321 (Domäne KS des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 49622 bis 50584 (Domäne AT des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (xiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 51473 bis 52309 (Domäne KR des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 53066 bis 53980 (Domäne ER des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 54158 bis 54460 (Domäne ACP des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 54461 bis 55870 (Domäne HC des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 56000 bis 57412 (Domäne A des tubD-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 57413 bis 57643 (Domäne PCP des tubD-Gens) der Sequenz gemäß
Figur 1;
(xx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 58689 bis 59714 (Domäne C des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 60156 bis 61697 (Domäne A des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (xxii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 61698 bis 61967 (Domäne PCP des tubE-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 62127 bis 63320 (Domäne KS des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxiv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 63711 bis 64676 (Domäne AT des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxv) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 64959 bis 65882 (Domäne KR des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxvi) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 65985 bis 67061 (Domäne CMT des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxvii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 67242 bis 67829 (Domäne DH des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxviii) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 68247 bis 69128 (Domäne ER des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1;
(xxix) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 69360 bis 69605 (Domäne PCP des tubF-Gens) der Sequenz gemäß Figur 1; (xxx) ss-DNA-Molekül mit einer Sequenz der Positionen 69759 bis 70586 (Domäne TE des tubF-Gens) "der Sequenz gemäß Figur 1;
Figure imgf000061_0001
(xxxii) ss-DNA-Molekül, das mit einem Molekül gemäß (i) , (ii) , (iii), (iv), (v) , (vi) , (vii), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii), (xiv), (xv) , (xvi), (xvii), (xviii) , (xiv) , (xx) , (xxi) , (xxii) , (xxiii) , (xxiv) , (xxv), (xxvi), (xxvii), (xxviii), (xxix) oder (xxx) hinsichtlich seiner Nucleotid-Anzahl oder seiner Nucleotid-Sequenz zur jeweils 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 oder 100% homolog ist, jedoch von diesem ss-DNA-Molekül hinsichtlich seiner Nucleotid- Anzahl und/oder seiner Nucleotid-Sequenz in mindestens einem Nucleotid abweicht; und
(xxxiii) ss-DNA-Moolleekküüll mmiitt eeiinneerr SSeeqquueennzz,, ddiiee zzuurr SSeeqquueenn∑z eines Molleekk"ül1s~
Figure imgf000061_0002
,
(vi), (viiii)), (viii), (ix), (x) , (xi) , (xii), (xiii),
(xiv) , (xKvV)) ,, ((:xvi), (xvii), (xviii), (xiv), (xx) ,
(xxi), (xxxxiiii)),, ((xxxxiiiiii)),, ((xxxxiivv)),, ((xxxxvv)),, ((xxxxvvii)),,
(xxvii), (xxviii), (xxix), (xxx), (xxxi) oder (xxxii) komplementär ist.
6. ds-DNA Molekül aus einem ss-DNA-Molekül gemäß Anspruch 5 und einem dazu komplementärem Strang.
7. Varianten oder Mutanten, die aus einer Substitution, Insertion oder Deletion von Nucleotiden oder einer Inversion von Nucleotid-Segmenten eines ss-DNA-Moleküls gemäß Anspruch 1, 3 oder 5 oder eines ds-DNA-Moleküls gemäß Anspruch 2, 4 oder 6 resultieren, wobei diese Varianten und Mutanten Enzym-Varianten oder Enzym-Mutanten für die Produktion von Sekundarstoff (en) mit für Tubulysine charakteristischen Eigenschaften codieren.
8. RNA
(a) mit einer Sequenz entsprechend der eines ss-DNA-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 1, 3, 5 oder 7 oder
(b) mit einer Sequenz einer RNA gemäß (a) , aber in Gegenrichtung (anti-sense) , oder
(c) mit einer Sequenz einer RNA gemäß (a) oder (b) und mit einem dazu komplementären Strang, jeweils gegebenenfalls als Element eines rekombinanten Vektors.
9. Rekombinanter Vektor, insbesondere Expressionsvektor mit einem DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7.
10. Zelle, insbesondere zur Expression, in die ein DNA-Molekül gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche oder einen Vektor gemäß Anspruch 8 oder 9 integriert ist.
11. Zelle nach Anspruch 10, wobei sich die Zelle von kultivierbaren Bakterien, insbesondere Myxobakterien, vorzugsweise Angiococcus, insbesondere A. disciformis, Archangium, insbesondere A. gephyra, Escherichia coli, Pseudomonaden oder Actinomyceten herleitet.
12. Verwendung eines Vektors gemäß Anspruch 8 oder 9 für die Transformation von Zellen oder Organismen zur transienten oder permanenten Expression eines oder mehrerer Proteine (Expressionsprodukt (e) ) , das (die) durch eine DNA (ssDNA oder dsDNA) des Vektors codiert wird (werden) .
13. Verwendung einer Zelle gemäß Anspruch 10 oder 11 zur enzymatischen Biosynthese, Mutasynthese oder Partial-Synthese eines Tubulysins, insbesondere Tubulysin A, B, C, D, E und/oder F.
14. Expressionsprodukt eines DNA-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eines Vektors gemäß Anspruch 8 oder 9 oder einer Zelle gemäß Anspruch 10 oder 11.
15. Polynucleotid enthaltend eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 oder 36 definiert, oder ein Fragment davon.
16. Polynucleotid nach Anspruch 15, wobei das Fragment eine im Sequenzprotokoll definierte CDS ist.
17. Vektor enthaltend ein Polynucleotid nach Anspruch 15 oder 16.
18. Zelle enthaltend einen Vektor nach Anspruch 17.
19. Polypeptid enthaltend wenigstens eine Sequenz wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder ein Fragment und/oder Derivat davon.
20. Verwendung wenigstens eines Polynucleotids wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens eines Fragments davon und/oder wenigstens eines Polypeptids wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens eines Fragments davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von unerwünschtem Zellwachstums oder unerwünschter Zellverinehrung in einem Individuum.
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das unerwünschte Zellwachstum oder die unerwünschte Zellvermehrung ein Tumor ist.
22. Verwendung nach Anspruch 20, wobei das unerwünschte Zellwachstum eine pathogene Infektion ist.
23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die pathogene Infektion eine Mykose, Malaria oder eine parasitäre Erkrankung ist.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend wenigstens ein Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens ein Fragment davon und/oder wenigstens ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens ein Fragment davon.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, die weiterhin wenigstens einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthält.
26. Verfahren zur Herstellung von Tubulysinen und Tubulysin- Biosynthese Proteinen, umfassend die Schritte:
(a) exprimieren von wenigstens einem Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon und/oder wenigstens einem Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17, 19 bis 32, 34, 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon, und (b) aufreinigen der Expressionsprodukte.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und/oder durch in vitro Expression erfolgt.
28. Verfahren zum Auffinden von Genen, die an der Biosynthese von Tubulysinen beteiligt sind, umfassend die Schritte:
(a) hybridisieren von wenigstens einem Polynucleotid wie in SEQ ID NO: 1, 18, 33 und/oder 36 definiert und/oder wenigstens einem Fragment davon mit DNA, RNA, und/oder cDNA einer Spezies, die nicht mit Angiococcus disciformis identisch ist, und
(b) isolieren und charakterisieren der hybridisierten DNA, RNA, und/oder cDNA.
29. Kit zur Herstellung von Tubulysinen, enthaltend:
(a) wenigstens ein Polynucleotid nach Anspruch 15 oder 16 und/oder wenigstens einen Vektor nach Anspruch 17 oder
(b) geeignete Medien und Puffer zur Vermehrung von Zellen, die eine Expression des Polynucleotids und/oder Vektors erlauben und
(c) geeignete Mittel zum Aufreinigen des/der Expressionsprodukte (s) .
30. Verwendung einer Zusammensetzung enthaltend wenigstens ein Polypeptid wie in SEQ ID NO: 2 bis 17 , 19 bis 32 , 34 , 35, 37 und/oder 38 definiert und/oder wenigstens ein biologisch aktives Fragment oder Derivat davon als Desinfektionsmittel .
31. Verwendung nach Anspruch 30, wobei die Zusammensetzung flüssig oder pulverförmig ist .
32. Desinfektionsmittel wie in Anspruch 30 oder 31 definiert .
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