JP3107402B2 - 環状プラスミド - Google Patents
環状プラスミドInfo
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- JP3107402B2 JP3107402B2 JP3754691A JP3754691A JP3107402B2 JP 3107402 B2 JP3107402 B2 JP 3107402B2 JP 3754691 A JP3754691 A JP 3754691A JP 3754691 A JP3754691 A JP 3754691A JP 3107402 B2 JP3107402 B2 JP 3107402B2
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- JP
- Japan
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- plasmid
- rhodococcus
- circular plasmid
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なプラスミドに関
し、更に詳しくはRhodococcus属に属する微生物に由来
する新規なプラスミドに関する。
し、更に詳しくはRhodococcus属に属する微生物に由来
する新規なプラスミドに関する。
【０００２】
【従来の技術】Rhodococcus属に属する微生物は、ニト
リル類を水和して対応するアミド類または酸を生産する
ための微生物触媒として知られており、またRhodococcu
s rhodochrous種に属する微生物が極めて高性能なニト
リル水和活性を有することが知られている。このような
状況下、Rhodococcus属の宿主ベクター系の開発が以前
から期待されていた。しかしながら、Rhodococcus属に
属する菌株についてはこれらの微生物を宿主とするに適
したベクターの開発は遅れており、Rhodococcus spにお
いてプラスミドの見い出された株はRhodococcus sp.H13
-A 株(J.Bacteriol.170,638-645(1988))や本発明者らが
さきに特許出願したRhodococcus rhodochrous ATCC 427
6 等（特願平２−２７０３７７）をはじめわずか数株に
すぎない。そのため、更にRhodococcus属に属する菌株
から工業的に利用し得る微生物を育種、改良するための
新しいベクターの開発が強く望まれている。
リル類を水和して対応するアミド類または酸を生産する
ための微生物触媒として知られており、またRhodococcu
s rhodochrous種に属する微生物が極めて高性能なニト
リル水和活性を有することが知られている。このような
状況下、Rhodococcus属の宿主ベクター系の開発が以前
から期待されていた。しかしながら、Rhodococcus属に
属する菌株についてはこれらの微生物を宿主とするに適
したベクターの開発は遅れており、Rhodococcus spにお
いてプラスミドの見い出された株はRhodococcus sp.H13
-A 株(J.Bacteriol.170,638-645(1988))や本発明者らが
さきに特許出願したRhodococcus rhodochrous ATCC 427
6 等（特願平２−２７０３７７）をはじめわずか数株に
すぎない。そのため、更にRhodococcus属に属する菌株
から工業的に利用し得る微生物を育種、改良するための
新しいベクターの開発が強く望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは上記事情
に鑑み、 Rhodococcus 属に属する菌株を用いて工業的
に有用な宿主−ベクター系を開発すべく鋭意研究を行っ
た結果、Rhodococcus 属に属する微生物から工業的に有
用な宿主−ベクター系におけるベクターとして利用可能
な新規な環状プラスミドを見い出し、本発明を完成し
た。
に鑑み、 Rhodococcus 属に属する菌株を用いて工業的
に有用な宿主−ベクター系を開発すべく鋭意研究を行っ
た結果、Rhodococcus 属に属する微生物から工業的に有
用な宿主−ベクター系におけるベクターとして利用可能
な新規な環状プラスミドを見い出し、本発明を完成し
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、そ
の大きさが約7.0kbであり、制限酵素切断部位数がSphI:
1,KpnI:2,BglII:2,SacI:3であることを特徴とする、Rho
dococcus属に属する微生物由来の環状プラスミドであ
る。本発明のプラスミドは、具体的には、例えば Rhodo
coccus rhodochrous ATCC 4001から得ることができ、大
きさが約7.0kbで且つ下記表１に示す制限酵素に対する
分解特性を有する新規な環状プラスミドである。以下こ
のプラスミドを、pRC010と称する。
の大きさが約7.0kbであり、制限酵素切断部位数がSphI:
1,KpnI:2,BglII:2,SacI:3であることを特徴とする、Rho
dococcus属に属する微生物由来の環状プラスミドであ
る。本発明のプラスミドは、具体的には、例えば Rhodo
coccus rhodochrous ATCC 4001から得ることができ、大
きさが約7.0kbで且つ下記表１に示す制限酵素に対する
分解特性を有する新規な環状プラスミドである。以下こ
のプラスミドを、pRC010と称する。
【０００５】
【表１】
【０００６】
【実施例】次に本発明を実施例により具体的に示す。
【０００７】
【実施例１】 プラスミドの分離精製法 Rhodococcus rhodochrous ATCC 4001 を４００ｍｌのＭ
Ｙ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス
０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％）に
て培養を開始する。ＯＤ660＝０．１５〜０．２の頃に
ペニシリンＧ ０．５Ｕ／ｍｌを加えた。ＯＤ660＝１．
０まで培養後、遠心により菌体を回収する。菌体を４０
ｍｌＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−
１０ｍＭ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄
後、１１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
−１２．５％ シュークロース−１００ｍＭ ＮａＣｌ−
１ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸濁し、３７℃にて３時間振
盪した。これに０．６ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２．
４ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、４．４ｍｌの４％ＳＤＳ−
０．７Ｍ ＮａＣｌを順次加え、緩やかに混合し氷上で
１８時間静置した。４℃にて６５，０００ｘｇ１時間遠
心し上清を得、これに５０％ポリエチレングリコール
６，０００を４．６ｍｌ加える。氷上で３時間静置し、
１，０００ｘｇ５分遠心する。沈澱物を５ｍｌのＴＥＳ
緩衝液に溶解し、ＣｓＣｌを７．５ｇ、１．５ｍｇ／ｍ
ｌ臭化エチジュウム−ＴＥＳ緩衝液を２ｍｌ加え混合し
た。この溶液を４２時間１３０，０００ｘｇの密度勾配
遠心分離にかけた。
Ｙ培地（ポリペプトン０．５％、バクトイーストエキス
０．３％、マルツエキス０．３％、グルコース１％）に
て培養を開始する。ＯＤ660＝０．１５〜０．２の頃に
ペニシリンＧ ０．５Ｕ／ｍｌを加えた。ＯＤ660＝１．
０まで培養後、遠心により菌体を回収する。菌体を４０
ｍｌＴＥＳ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）−
１０ｍＭ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液で洗浄
後、１１ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）
−１２．５％ シュークロース−１００ｍＭ ＮａＣｌ−
１ｍｇ／ｍｌリゾチームに懸濁し、３７℃にて３時間振
盪した。これに０．６ｍｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、２．
４ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌ、４．４ｍｌの４％ＳＤＳ−
０．７Ｍ ＮａＣｌを順次加え、緩やかに混合し氷上で
１８時間静置した。４℃にて６５，０００ｘｇ１時間遠
心し上清を得、これに５０％ポリエチレングリコール
６，０００を４．６ｍｌ加える。氷上で３時間静置し、
１，０００ｘｇ５分遠心する。沈澱物を５ｍｌのＴＥＳ
緩衝液に溶解し、ＣｓＣｌを７．５ｇ、１．５ｍｇ／ｍ
ｌ臭化エチジュウム−ＴＥＳ緩衝液を２ｍｌ加え混合し
た。この溶液を４２時間１３０，０００ｘｇの密度勾配
遠心分離にかけた。
【０００８】紫外線照射により検出されたプラスミド画
分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し臭化エチジュ
ウムを除いた。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析後、エ
タノール沈澱により精製プラスミド画分を得た。 これ
を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化
エチジュウムで染色することによりプラスミドの存在を
確認した。 プラスミドの分子量測定法 上記のように調製したプラスミドの一部を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動に供した。この際、サイズマーカー
として大腸菌プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＢＲ３２２（各々２．６９ｋｂ、３．１６ｋｂ、４．３
６ｋｂ）を同時に泳動した。Rhodococcus rhodochrous
ATCC 4001 から得られたプラスミドはｐＲＣ０１０と命
名され、アガロースゲル電気泳動から求められた大きさ
は約７．０ｋｂであった。 各種制限酵素による切断特異性 上記のように調製したプラスミドの一部を各種制限酵素
と反応させ、反応終了後、反応液を０．７％アガロース
ゲル電気泳動および５％アクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。サイズマーカーとしてはラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物およびＰｓｔＩ消化物を
用い、プラスミドの各制限酵素断片のサイズを算出し
た。ｐＲＣ０１０は表２のような制限酵素切断特性を示
した。
分を分取した後、ｎ−ブタノールで処理し臭化エチジュ
ウムを除いた。ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に対して透析後、エ
タノール沈澱により精製プラスミド画分を得た。 これ
を０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルを臭化
エチジュウムで染色することによりプラスミドの存在を
確認した。 プラスミドの分子量測定法 上記のように調製したプラスミドの一部を０．７％アガ
ロースゲル電気泳動に供した。この際、サイズマーカー
として大腸菌プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐ
ＢＲ３２２（各々２．６９ｋｂ、３．１６ｋｂ、４．３
６ｋｂ）を同時に泳動した。Rhodococcus rhodochrous
ATCC 4001 から得られたプラスミドはｐＲＣ０１０と命
名され、アガロースゲル電気泳動から求められた大きさ
は約７．０ｋｂであった。 各種制限酵素による切断特異性 上記のように調製したプラスミドの一部を各種制限酵素
と反応させ、反応終了後、反応液を０．７％アガロース
ゲル電気泳動および５％アクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。サイズマーカーとしてはラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物およびＰｓｔＩ消化物を
用い、プラスミドの各制限酵素断片のサイズを算出し
た。ｐＲＣ０１０は表２のような制限酵素切断特性を示
した。
【０００９】
【表２】
【００１０】
【発明の効果】本発明の環状プラスミドは工業的に有用
な宿主−ベクター系におけるベクターとして有用であ
る。
な宿主−ベクター系におけるベクターとして有用であ
る。
【図１】本発明のプラスミドpRC010の制限酵素切断地
図。
図。
Claims (2)
- 【請求項１】 その大きさが約7.0kbであり、制限酵素
切断部位数がSphI:1,KpnI:2,BglII:2,SacI:3であること
を特徴とするRhodococcus属に属する微生物由来の環状
プラスミド。 - 【請求項２】 微生物がRhodococcus rhodochrous ATCC
4001 である請求項１記載の環状プラスミド。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3754691A JP3107402B2 (ja) | 1991-03-04 | 1991-03-04 | 環状プラスミド |
| US07/773,055 US5246857A (en) | 1990-10-11 | 1991-10-08 | Circular plasmids derived from the genus rhodococcus |
| DE69110402T DE69110402T2 (de) | 1990-10-11 | 1991-10-09 | Neue zirkuläre Plasmide aus der Gattung Rhodococcus. |
| EP91117212A EP0482426B1 (en) | 1990-10-11 | 1991-10-09 | Novel circular plasmids derived from the genus rhodococcus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3754691A JP3107402B2 (ja) | 1991-03-04 | 1991-03-04 | 環状プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04330287A JPH04330287A (ja) | 1992-11-18 |
| JP3107402B2 true JP3107402B2 (ja) | 2000-11-06 |
Family
ID=12500527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3754691A Expired - Lifetime JP3107402B2 (ja) | 1990-10-11 | 1991-03-04 | 環状プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3107402B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1688491B1 (en) | 2003-10-31 | 2010-09-15 | Daiichi Fine Chemical Co., Ltd. | Novel plasmids and utilization thereof |
-
1991
- 1991-03-04 JP JP3754691A patent/JP3107402B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04330287A (ja) | 1992-11-18 |
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