JP2949352B2 - プラスミド▲下p▼NI20及びそれをベクターとして用いた遺伝子組換え法 - Google Patents

プラスミド▲下p▼NI20及びそれをベクターとして用いた遺伝子組換え法

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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はシュードモナス属菌を宿主とする遺伝子組換
え用のベクターとして有用な新規なプラスミド及びそれ
をベクターとして用いた遺伝子組換え法に関するもので
あり、より詳しくは、分子量が約2.9Kbであり、第1図
に示される制限酵素開裂地図により特徴づけられる新規
なプラスミドpNI20及びそれをベクターとして用いた遺
伝子組換え法に関するものである。
本発明のプラスミドpNI20の任意の制限酵素部位に、
目的とする蛋白質をコードする遺伝子DNAを連結し、こ
れをシュードモナス属細菌,大腸菌等のグラム陰性細菌
内に導入することによりこれら細菌の菌体内もしくは菌
体外に目的とするペプチドホルモンや種々の酵素等の蛋
白質を量産することができる。
〔従来技術〕
従来、遺伝子組換え実験は主として大腸菌を宿主とす
る系で広く研究が行われ、インシュリン,インターフェ
ロン,ヒト成長ホルモン,種々の酵素等が大腸菌で量産
されるなど大きな成果を挙げている。また大腸菌以外に
も酵母,桔草菌,放線菌などで宿主・ベクター系が開発
され応用への道が検討されている。
シュードモナス属の細菌はその生息範囲が広く、また
単一炭素源としていろいろな有機化合物の利用が可能で
あること、さらに化学合成された化合物を資化できるこ
とからシュードモナス属細菌での宿主−ベクター系の開
発は産業上有用な微生物を育種するためにより有効な手
段となっている。
〔解決すべき問題点〕
シュードモナス属細菌からは、これまでいくつかのプ
ラスミドの存在が報告されているが、これらはすべてそ
の分子量が30Kb以上であり、操作上様々な困難を伴うこ
とから、各種制限酵素によるミニプラスミド作成が試み
られているが、未だ満足すべきものが得られていない。
また、シュードモナス属細菌の遺伝子組換え実験に
は、RSF1010などのようにグラム陰性菌の中で多コピー
プラスミドとして使用できる広宿主域プラスミドを使用
する例が知られているが、本プラスミドも8.9Kbと比較
的大きく、また、トランスフォーメーションの効率もあ
まり高くない。
そこで、任意の長さの外来遺伝子を挿入でき、しかも
シュードモナス属細菌を高い効率で形質転換することが
でき、かつ又その検出が容易な小型のベクターの開発が
切望されてきた。
〔問題点を解決するための方法〕
本発明者らはこのような背景において、シュードモナ
ス属細菌に適した宿主,ベクターを開発すべく鋭意検討
し、ついにシュードモナス属の新菌シュードモナス・フ
ラビダ(Pseudomonas flavida)IF−4株より、ベクタ
ーとして用いるのに適したプラスミドpNI20を見い出
し、本発明を完成したのである。
本発明のプラスミドpNI20はシュードモナス・プチダ
を宿主として複製することが可能である。
またpNI20は第1図よりも明らかなように、Pst I,Kpn
I,Bal II,Xho I,Sma Iなどの制限酵素による開裂部位
を特定のしかも限られた位置に有している。このことは
pNI20をベクターとして利用する際に、挿入すべき目的
の遺伝子の導入部位を有意に選択できるという点で有利
である。
プラスミドDNAがベクターたり得るためには、そのプ
ラスミドが宿主内での自立増殖能及び選択マーカー(そ
のプラスミドが宿主内に存在していることを示すマーカ
ー)を有していることが必須である。一般にシュードモ
ナス属細菌は、カナマイシン(以下Kmと省略する。)及
びストレプトマイシン(以下Smと省略する。)に対し感
受性である場合が多く、こうした薬剤耐性を付与すれば
ベクタープラスミドの存在を容易に識別することができ
る。本発明者らは、pNI20の制限酵素開裂部位にpUC−4K
〔Vieria,J.and Messing,J.Gene,19巻,259頁(1982)〕
由来のKm耐性遺伝子及びRSF1010〔Scherzinger,E.ら,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,81巻,654頁(1984)〕由来のSm
耐性遺伝子を導入し、選択マーカーを有するpNI20系プ
ラスミドベクターを完成した。
本発明のプラスミドpNI20は、細胞内でのコピー数が
多く、従って外来遺伝子を組換えた時に多量の遺伝子増
幅が期待できる。また、20Kb以上の外来遺伝子も挿入す
ることが可能である。
更に又、本発明のプラスミドpNI20をベクターとして
用いることにより、多数の化合物を資化する有用なシュ
ードモナス属細菌の育種を著しく向上させうる。
プラスミドpNI20は本発明者らが土壌中より新たに分
離した菌株IF−4から得られる。本菌株の菌学的性質は
下記の通りである。
I.細胞 形態:1〜2本の極鞭毛を有する短桿菌0.7〜1.1×1.0
〜2.5μm 運動性 :有り グラム染色:陰性 胞子形成 :無し II.各培地における生育状態 (1)標準寒天平板培養 コロニーは円形、周辺は全縁、表面は平滑で透明、輝
光あり。
(2)標準寒天斜面培養 直線状で表面は平滑、バター質、玉虫色、生育中程
度。
(3)標準液体培養 かすかに粉状沈殿を有す。皮膜形成はなし。
(4)標準ゼラチン穿刺培養 液化する。
(5)リトマスミルク アルカリ性 III.生理的性質 カタラーゼ:陽性 チトクロームオキシダーゼ:陰性 GC含量 :63% 色素生成 :黄色(トリプトソイ寒天培地,非水溶
性色素), 黄色(KingB培地,蛍光の水溶性色素) O−F試験:酸化型 酸産生:ブドウ糖 + キシロース + マンニット − 乳 糖 − 白 糖 − 麦芽糖 − サリシン − 果 糖 + 発 育: 5℃ + 41℃ − Mac Conkey + SS + Nac + C.V.T. + 6%NaCl + DL−α−HB − ポリベータヒドロキシ酪酸蓄積 + 硝酸塩還元 − 亜硝酸塩からのガス − 卵黄反応 − アルギニンジヒドロラーゼ + リジンデカルボキシラーゼ − オルニチンカルボキシラーゼ − アシルアミダーゼ − Tween80 分解 − ゼラチン分解 + カゼイン分解 − 澱粉分解 − DNA 分解 − エスクリン分解 − 尿素分解 − セルロース分解 − キチンの分解 − 寒天分解 − グルコン酸からの2−ケトグル + コン酸の生成 VP.MR 反応 − インドール,硫化水素反応 − ジオキシアセトンの生成 − クエン酸の利用 + T.S.I. −/− O.N.P.G. − ムコイドの生成 − リトマスミルク アルカリ化 フェニルアラニン反応 − 発育温度(℃) 5〜37 発育pH 5.0〜9.2 以上の菌学的性質からバージェ・マニュアル(Berge
y's Manual of Determinative Bacteriology)第8版,
コーワン・ステールマニュアル(S.T.Cowan et al.:197
4 Manual for the Identification of Medical Bacteri
a),CDCマニュアル(R.E.Weaver and D.G.Hollis:1983
Gran−Negative Organisms:An approach to Identifica
tion Centers for Disease Control)により検索したと
ころ、本菌株はシュードモナス(Pseudomonas)と認め
られた。
しかし、種については、各マニュアルに記載のない新
菌であること、また新規なプラスミドpNI20を保有する
ことから、従来のどの種でもないと判断された。本菌株
は特に光沢のある黄色菌であることから、シュードモナ
ス・フラビダ(pseudomonas flavida)IF−4株と命名
した。本菌株は微工研菌寄第10865号(FERM P−10865)
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。
実施例1 (1)シュードモナス・フラビダIF−4(FERM P−1086
5)の培養細胞よりpNI20 DNAの単離 PY培地(ペプトン5g,酵母エキス5g,水1,pH7.0)に
シュードモナス・フラビダIF−4(FERM P−10865)株
を接種し、一夜,30℃で振盪培養する。本培養液1mlを新
鮮同培地100mlに接種し、30℃で16時間培養した。
この培養液を冷却遠心して集菌し、SET緩衝液(20%
シュクロース,50mM EDTA,50mMトリス塩酸(pH8.0)〕20
mlに懸濁する。この溶液にリゾチーム(10mg/ml,ベーリ
ンガーマンハイム社製品)2.25ml,プロナーゼ(10mg/m
l,科研化学社製品)250μ,RNase(5mg/ml,ベーリンガ
ーマンハイム社製品)250μを添加し、軽く撹拌し、
氷上に5分間静置する。次に45mlのアルカリSDS溶液
(1%SDS,0.2N NaOH)を添加し、遠心管内で上下して
撹拌する。氷上で10分間冷却後、32mlの3M酢酸ナトリウ
ム溶液(pH4.8)を添加、混合し、1時間氷水中で静置
する。19000rpmで15分間の冷却遠心後、上清を分離し
た。さらに、該上清と同体積のイソプロパノールを加
え、氷上で2時間冷却後、8000rpmで10分間遠心した。
遠心後、沈殿物を70%エタノール溶液で洗浄した。沈殿
物をデシケータ内で真空ポンプにより減圧乾燥させた
後、8mlのTE緩衝液(10mMトリス塩酸,1mM EDTA pH8.0)
に溶解し、DNA粗標品とした。これに10mg/mlのエチジウ
ムブロミド0.56mlと8.48gの塩化セシウムを加え、50000
rpmで17時間,16℃で超遠心してプラスミドDNAを分離し
た。分離したプラスミドDNAを飽和塩化セシウム水で飽
和したイソプロパノールを用いて処理し、エチジウムブ
ロミドを除去した後、TE緩衝液で透析してプラスミドDN
Aを得た。次に当該DNAを0.7%アガロースゲル,TBE緩衝
液(59mMトリス−ホウ酸,2mM EDTA,pH8.0)を用いて電
気泳動を行った。DNA分子量マーカーとしてλファージD
NAのHind III分解物を用いた場合、pNI20の環状プラス
ミドの移動度は約1.6Kbの直鎖状DNAの断片と同じ移動度
を示した。この部分をアガロースゲルより切出し、8M過
塩素酸ナトリウム溶液でゲルを溶解し、この溶液をワッ
トマン10FCフィルターで吸引ろ過することによりプラス
ミドDNAをフィルター上に吸着させる。6M過塩素酸溶液,
100%エタノールでフィルターを洗浄後、フィルターをT
E緩衝液に浸し、プラスミドDNAを回収した。上記操作に
より、高純度のpNI20プラスミドを調製した。
(2)pNI20プラスミドの分子量の測定 pNI20の分子量の測定は、pNI20を制限酵素Pst Iで切
断した断片を0.7%アガロースゲル電気泳動により決定
した。この際の分子量マーカーとしてはλファージDNA
のHind III分解物及びBstE II分解物を使用した。これ
より、pNI20の分子量は2.9Kbと算出された。
(3)pNI20の制限酵素地図の作成 純化したpNI20プラスミドDNAを各種の制限酵素で切断
した。切断後は(2)項と同様の方法で本プラスミドDN
Aの制限酵素切断断片の分子量を1%アガロースゲル電
気泳動法により決定した。第1表に各種制限酵素に対す
る切断数を示す。
第2表の制限酵素切断パターンから第1図に示すよう
な制限酵素切断地図を作成した。
(4)pNI20のコピー数の測定 シュードモナス・フラビダIF−4(FERM P−10865)
株を前述(2)項の方法で培養し、菌体を得た。本菌体
より斉藤,三浦の公知の方法〔バイオキミカ・バイオフ
ィジカ・アクタ(Biochimica et Biophysica Acta),72
巻,619〜629頁(1963)〕によりその全DNAを抽出・精製
した。次に当該DNA約10μgを制限酵素EcoR Iで完全分
解し、その一部を前述(2)項の方法でアガロースゲル
電気泳動にかけた。アガロースゲル電気泳動での分離パ
ターンを写真撮影し、pNI20由来のバンドのピークと他
のDNA部分のピークの比をデンシトメーターにより測定
した。シュードモナス属細菌の細胞1個当りの全DNA量
を4×109ダルトンとすると、pNI20の細胞1個当りのコ
ピー数は50〜60/cellと算出された。
(5)プラスミドpNI20A,pNI20B,pNI20Cの構築 a)プラスミドpNI20の制限酵素Sma I切断部位に、公知
のプラスミドpUC−4K〔Vieria,J.and Messing,J.,Gene,
19巻,259頁(1982)〕を制限酵素Hinc II処理すること
により生じる約1250bpのKmr遺伝子を含むDNA断片をT4DN
Aリガーゼを用いて連結し、シュードモナス・フラビダI
F−4(FERM−P 10865)の環状プラスミドをすべて脱落
させて得たシュードモナス・フラビダIF−42株を次項記
載の方法で形質転換後、Kmを25μg/ml含有するPY培地で
Kmr形質転換株を選択した。この形質転換株より、Kmr
ーカーを有するプラスミドpNI20Aを得た。
b)a)項と同様の方法により、pNI20の制限酵素Pst I
切断部位に、pUC−4Kを制限酵素Pst I処理することによ
り生じる約1250bpのKmr遺伝子を含むDNA断片を連結し、
シュードモナス・フラビダIF−42株を形質転換し、これ
よりKmr選択マーカーを有するプラスミドpNI20Bを得
た。
c)pNI20Aを制限酵素Cla Iで完全分解した後、DNAポリ
メラーゼを用いて平滑末端としたものとRSF1010からHin
c II−Pvu IIで切り出されるSm耐性遺伝子を含む約1.9K
bのDNA断片をT4 DNAリガーゼを用いて連結した。得られ
たプラスミドDNAを用いてシュードモナス・プチダ(Pse
udomonas putida)IF3株を形質転換し、Sm耐性を示す形
質転換株を得た。Sm耐性形質転換株からは、予想された
構造を示すプラスミドが分離され、得られたSm耐性遺伝
子を含むプラスミドをpNI20Cとした。第2図に各ベクタ
ーの概略を示した。
(6)シュードモナス属細菌ならびに他のグラム陰性菌
の形質転換 シュードモナス属細菌の形質転換は公知の方法〔M.Ba
gdasarian et al.,Gene,16巻,237頁(1981)〕を一部改
良して行った。
PY培地にシュードモナス属細菌の保存種菌を接種し、
30℃で15時間振盪培養した。この培養液1mlを集菌し、
次にあらかじめ氷冷した2.5mlの形質転換用緩衝液I(1
0mM MOPS,10mM RbCl,100mM MgCl2,pH7.0)を添加し、菌
を懸濁した。0℃で30分間静置後、遠心して集菌し、こ
れに0.3mlの同緩衝液Iを加え再懸濁し、コンピテント
細胞とした。コンピテント細胞液にDNAサンプルを25μ
添加し、0℃で45分間静置した。次に40℃で5分間熱
処理した後、PY培地1.7mlを添加し、30℃で3時間振盪
培養後、任意の選択培地の表面に培養液0.15mlを塗布し
目的とする形質転換株を選択した。
(7)形質転換の効率 (6)の方法に従って、いくつかのシュードモナス属
細菌の形質転換の効率を測定した。形質転換の効率は1
μgのpNI20BプラスミドDNA当り何個の形質転換株(Km
耐性株)が得られたかを基準として表した。第2表にそ
の結果を示す。
また、pNI20A,pNI20C(Sm耐性)の各ベクターを使用
した場合も、ほぼ第2表と同様の結果が得られた。
(8)pNI20Aの宿主菌の検索 プラスミドpNI20Aがどのような細菌を宿主として複製
し発現するか否かを調べた。形質転換の方法は、大腸菌
については公知の方法〔Kushner,S.R.,Genetic Enginee
ring 17頁,Elsevier(1978)〕に従ってコンピテント細
胞を調製した。
その結果、本ベクターはシュードモナス属細菌で特異
的に発現し、大腸菌では発現しないことが明らかとなっ
た。
またpNI20B,pNI20C各ベクターもpNI20Aと同様の結果
が得られた。
以上のように、pNI20系プラスミドはシュードモナス
属細菌のベクターとして有用である。
(9)挿入し得るDNAの長さ pNI20Aにどれほどの大きさの外来DNAが挿入し得るか
について以下の方法で実験を行った。
まず外来DNAの調製は、シュードモナス・プチダより
前項(4)の方法に従って行った。次に当該DNAを制限
酵素Kpn Iで部分分解し、外来DNA標品とした。
他方pNI20AをKpn Iで切断し、このベクターDNAと上記
外来DNAをT4リガーゼで連結し、前項の(6)の方法で
シュードモナス・プチダIF3株を形質転換した。Km耐性
株を任意に50株選択し、得られた形質転換株からプラス
ミドDNAを単離した。それぞれの株より得られたプラス
ミドDNAを制限酵素Kpn Iで切断し、挿入された外来DNA
を切り出した。このDNAの長さを、前項(2)の方法に
従い、アガロースゲル電気泳動法によって決定した。そ
の結果、本ベクター上に各長さのDNAが挿入されるこ
と、また最大のDNAは20Kb以上のものが挿入されている
ことが明らかとなった。
〔発明の効果〕
上記のように本発明によって得られるプラスミドpNI2
0は小型のベクターであり、その任意の制限酵素部位
に、目的とする蛋白質をコードする遺伝子DNAを連結で
きる。それ故これを各種細菌内に導入することにより、
これら細菌の菌体内もしくは菌体外に目的とするペプチ
ドホルモンや種々の酵素等の蛋白質を量産することがで
きる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明のプラスミドpNI20の制限酵素地図を
示す。第2図は本発明のプラスミドpNI20由来の各プラ
スミドの制限酵素地図を示すものであり、図中a)はプ
ラスミドpNI20A、b)はプラスミドpNI20B、c)はプラ
スミドpNI20Cの制限酵素地図をそれぞれ示す。なお又、
図中 はpNI20由来, はpUC−4K由来, はRSF1010由来のDNAを示す。

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】分子量が約2.9Kbであって、下記に示す酵
    素切断地図を有し、かつ制限酵素BamH I,SaC I,Cla I及
    びSal Iにより開裂されないシュードモナス・フラビダ
    由来のプラスミドpNI20。
  2. 【請求項2】請求項1記載のプラスミドpNI20にカナマ
    イシン耐性もしくはストレプトマイシン耐性の選択マー
    カーを付与したプラスミド。
  3. 【請求項3】請求項1記載のpNI20又はpNI20由来のプラ
    スミドをベクターとして用いた遺伝子組換え法。
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