JPH09121870A - 新規チオールプロテアーゼをコードするｄｎａおよびこれを用いた該チオールプロテアーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 発芽ダイズ子葉に由来する新規チオール
プロテアーゼをコードするｃＤＮＡ、該ＤＮＡを含有す
る組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターによって
形質転換された大腸菌、酵母である形質転換体並びに該
形質転換体を用いたチオールプロテアーゼの製造方法。 【効果】 ダイズタンパク質を効率よくアミノ酸または
低分子ペプチドにまで分解し得る新規チオールプロテア
ーゼを、遺伝子組換え手法により直接的にしかも高効率
で大量に生産することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、従来のプロテアー
ゼでは分解の難しいダイズ種子貯蔵タンパク質を容易に
分解し得る新規なチオールプロテアーゼをコードするＤ
ＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、該組換
え発現ベクターにより形質転換された形質転換体並びに
該形質転換体を用いたチオールプロテアーゼの製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ダイズタンパク質のアミノ酸への分解
は、塩酸等の酸による加水分解、あるいは麹菌等の微生
物酵素をはじめとする既存のプロテアーゼによる分解な
どにより行われている。

【０００３】しかしながら、酸による加水分解を行った
場合、天然調味料になり得るようなダイズタンパク質加
水分解産物を得ようとすると、１００℃で１〜２日間の
反応が必要となり、このような高温、長時間の反応はエ
ネルギー消費量が大きいという問題がある。さらに、酸
によるタンパク質の加水分解法は簡便である一方、アミ
ノ酸の過剰分解（破壊）、中和のために高塩分となるな
どの問題もある。

【０００４】そこで上記問題を解決すべく、既存のプロ
テアーゼによる穏和な条件下でのタンパク質分解が提案
され、特に、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）によ
るダイズタンパク質のアミノ酸への分解は、生物反応を
利用する穏やかな反応条件で進行するため、化学反応を
利用する酸加水分解に代わる方法として実現が期待され
ている。

【０００５】しかしながら、一般にマメ科植物の貯蔵タ
ンパク質は、未変性の状態では既存のプロテアーゼに対
してかなりの耐性を有することが知られており（S. S.
Nielsen et al., "J. Agric. Food Chem.", 36, 896(19
88) ）、これらを酵素的に完全分解に至らしめるには厳
密な条件下での変性処理が必要とされ、そのうえ、反応
には長時間を要する。この長時間の反応は、反応基質の
完全な滅菌が困難なことと相まって、反応中の雑菌汚染
の原因となる。そのため、常に高濃度の塩や酢酸等の添
加が必要になるという問題がある。

【０００６】そのためダイズタンパク質を変性処理の有
無にかかわらず短時間で容易にアミノ酸または低分子ペ
プチドにまで分解し、また、雑菌の混入しにくい酸性や
アルカリ性域でも反応し得るような酵素の発見が望まれ
ていた。

【０００７】本発明者らは、このような期待に応え得る
プロテアーゼを発芽ダイズ子葉より見出し、単離精製を
行い、諸性質を調べ、そのＮ末端付近のアミノ酸配列を
決定し、さらに酵素活性を確認し、従前に出願を行って
いる（特願平６−２９４５４８号明細書）。すなわち、
当該プロテアーゼはプロテアーゼＤ３とも名付けられた
新規チオールプロテアーゼであり、分子量はＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで２６〜３０ｋＤａ、反応至適ｐＨ約３〜７、至
適温度３０〜５０℃で、ウシ血清アルブミンのみなら
ず、ダイズタンパク質であるグリシニン（１１Ｓグロブ
リン）、β−コングリシニン（７Ｓグロブリン）を未変
性状態でアミノ酸、あるいはオリゴペプチドまできわめ
て強力に分解し得る特異な酵素であり、その産業上での
利用が大いに期待される。

【０００８】しかしながら、この新規チオールプロテア
ーゼの発芽ダイズ子葉中での含量は微量であるため、当
該酵素を発芽ダイズ子葉抽出物より大量に調製すること
には相当な困難があった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】上述の問題点を解決す
る方法の１つとしては、該新規チオールプロテアーゼ遺
伝子をダイズ以外の系で遺伝子組換え技術を用いて大量
発現させることにより、大量のチオールプロテアーゼを
取得するという方法が挙げられる。この方法を実現する
ためには、まず、当該新規チオールプロテアーゼをコー
ドするｃＤＮＡを取得し、塩基配列を解析し、該チオー
ルプロテアーゼの全アミノ酸配列に関する情報を得るこ
とが必須である。

【００１０】次に、該新規チオールプロテアーゼをコー
ドするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、目的物
を大量に生産する形質転換体を得ることが必須である。

【００１１】さらに場合によっては、この形質転換体の
培養によって得られた該チオールプロテアーゼ遺伝子産
物を、活性体へと変換する操作技術も必要であろう。

【００１２】本発明はこのような事情に鑑みてなされた
もので、発芽ダイズ子葉に由来する新規チオールプロテ
アーゼを、天然から単離するという方法に代えて、遺伝
子組換え技術を用いて効率的な遺伝子発現並びに該チオ
ールプロテアーゼの大量生産をなし得るための技術を提
供することを課題とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、すでに本発明者らによ
り明らかにされている当該新規チオールプロテアーゼの
Ｎ末端アミノ酸配列をもとに、発芽ダイズ子葉ｍＲＮＡ
より調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、該チオールプロテアーゼをコードするｃＤＮＡを取
得した。

【００１４】本発明者らはさらに研究を進め、この得ら
れたｃＤＮＡを用いて該新規チオールプロテアーゼを生
産する形質転換体である大腸菌および酵母を得、これに
より該チオールプロテアーゼ活性を有するタンパク質を
得るに至った。

【００１５】すなわち本発明は、発芽ダイズ子葉に由来
する新規チオールプロテアーゼをコードするｃＤＮＡ、
および該ｃＤＮＡを用いた遺伝子組換え技術による該チ
オールプロテアーゼの製造方法に関する。

【００１６】

【発明の実施の形態】以下、本発明について詳述する。
上述したように、発芽ダイズ子葉に由来する新規チオー
ルプロテアーゼは、本発明者らにより単離に成功し、そ
の特性についても研究されている（特願平６−２９４５
４８号明細書）。この新規チオールプロテアーゼには２
種類のアイソザイムが存在し、いずれも分子量、反応至
適ｐＨ、至適温度、阻害剤の種類、活性化剤の種類、ダ
イズ種子貯蔵タンパク質をアミノ酸または低分子ペプチ
ドにまで分解するという作用のいずれにおいても著しい
一致をみている。したがって、本発明においてはいずれ
のアイソザイムも本発明でいう新規チオールプロテアー
ゼに含むものとする。

【００１７】なお、上記２種類のアイソザイムを区別す
るために、便宜上一方をＤ３−α、他の一方をＤ３−β
と称する。本発明者らにより既に確認されているＤ３−
αのＮ末端アミノ酸配列は、Asp-Lys-Leu-Pro-Glu-Ser-
Val-Asp-Trp-Arg-Lys-Glu-Gly-Ala-Val-Pro-Pro-Val-Ly
s-Asp-Gln-Gly-Gly-Xaa-Gly-Ser-Xaa-Trp-Ala-Phe であ
り、Ｄ３−βのＮ末端アミノ酸配列は、Asp-Lys-Leu-Pr
o-Asp-Ser-Val-Asp-Trp-Arg-Lys-Glu-Gly-Ala-Val-Pro-
Pro-Val-Lys-Asp-Gln-Gly-Gly である。Ｄ３−α中の X
aa は未同定のアミノ酸であるが、これらは Cys と推
定される。両者のアミノ酸配列は、この範囲では５番目
の残基のみが異なっていた（Ｄ３−αでは Glu、Ｄ３−
βでは Asp）。なお、これら新規プロテアーゼのアイソ
ザイムＤ３−αとＤ３−βを、Ｄ３と総称する。

【００１８】本発明のｃＤＮＡの取得方法の具体例とし
ては、例えば、Ｄ３のＮ末端のアミノ酸配列をもとにｃ
ＤＮＡプローブを作製し、発芽ダイズ子葉から抽出した
Ｄ３のｍＲＮＡを鋳型に作製したｃＤＮＡライブラリー
からハイブリダイゼーションによりＤ３のｃＤＮＡを釣
り上げるなど、従来より慣用的に行われている方法が挙
げられる。

【００１９】Ｄ３のｍＲＮＡ抽出に用いる発芽ダイズ子
葉は、そのダイズの種類を問わない。すなわち市販され
ているダイズ、搾油原料として用いられているダイズ
等、その栽培産地、品種を限定しない。また、発芽の方
法、栽培条件、発芽の有無、発芽後の期間を問わない
が、ダイズ種子を吸水させ、１０日間生長させた発芽ダ
イズ子葉を用いるのが好ましい。

【００２０】また、ｃＤＮＡプローブは、Ｄ３のＮ末端
アミノ酸配列をもとに化学合成してもよく、あるいはＰ
ＣＲ法等により作製してもよい。本実施例においてはＰ
ＣＲ法により作製したが、その詳細については後述の実
施例に詳しく記す。なお、ｃＤＮＡライブラリーの作製
方法は、常法により行うことができる。

【００２１】次に、このようにして得たｃＤＮＡを発現
ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを作製する。
用いるベクターは、特に限定されるものではないが、宿
主細胞内で自律的に複製可能であって、上記ＤＮＡすな
わちＤ３遺伝子を組み込み得る挿入部位をもち、さらに
この組み込んだＤＮＡを宿主細胞内で発現せしめること
を可能とする領域を有することが必要である。

【００２２】なお、ベクターに組み込むＤ３遺伝子とし
ては、ｃＤＮＡだけでなく、ｃＤＮＡ配列から予測され
るＤ３のアミノ酸配列をコードするよう設計して合成さ
れたＤＮＡでもよい。このようなアミノ酸配列をもとに
した遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成
したオリゴヌクレオチドをアニール後に連結すること等
により、容易に行うことができる。

【００２３】さらに、Ｄ３−αとＤ３−β間ではアミノ
酸置換がみられても酵素的性質は著しく一致しているこ
とからも明白なように、一部のアミノ酸残基が置換して
も、天然のＤ３と同じ酵素的性質が得られることが予測
される。また、末端の残基が付加または欠失したり、Ｄ
３とは関連のない配列、例えば発現プラスミド構築の際
のリンカーＤＮＡの配列などが付加したりしていても、
結果として天然のＤ３と同じ酵素的性質が得られる可能
性もある。このような遺伝子の改変は、市販の遺伝子の
部位特異変異導入キットを用いたり、合成遺伝子を挿入
することなどにより、容易に実現し得る。したがって、
このベクターに組み込むＤ３遺伝子としては、天然のＤ
３と同じ酵素的性質が維持される限り、その変異体もこ
こでいうＤ３遺伝子に含む。

【００２４】また、Ｄ３の生産方法として、異種タンパ
ク質との融合タンパク質として生産させる方法もある。
これは例えばｐＧＥＸシステム（ファルマシア社製）な
どを用いればＤ３をグルタチオン−Ｓ−トランスフェラ
ーゼとの融合タンパク質として大腸菌で生産させること
が可能である。

【００２５】そのほかのＤ３の生産方法として、枯草
菌、酵母、麹菌などのタンパク質分泌能を利用して、培
地中へ生産させる方法もある。例えば酵母を宿主とした
場合、Ｄ３自身のシグナル配列や、酵母自身の分泌タン
パク質のシグナル配列、たとえばαファクターなどのシ
グナル配列を用いれば、Ｄ３を培地中に分泌生産させる
ことも可能である。

【００２６】次いで上記組換え発現ベクターを宿主細胞
内に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの
宿主細胞内への導入方法は、従来より慣用的に用いられ
ている方法により行うことができる。コンピテントセル
法、プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレ
クトロポレーション法、マイクロインジェクション法、
リポソーム融合法等、種々のものが挙げられるが、用い
る宿主に応じてそれぞれ任意の方法を取り得る。本発明
のＤ３を産生する宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵
母、麹菌等の微生物のほか、カイコ培養細胞等の細胞を
用いてもよい。

【００２７】そして、このようにして得られた形質転換
体を培養することにより、培養物中にＤ３を産生させ
る。これを公知の方法で単離し、場合によっては精製す
ることにより、目的とする酵素が得られる。

【００２８】形質転換体を培養するための培地は公知で
あり、例えば大腸菌ではＬＢ培地などの栄養培地や、Ｍ
９培地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン類な
どを添加して用いることができ、酵母ではＹＰＤなどの
栄養培地や、ＳＤ培地などの最小培地に炭素源、窒素源
などを添加して用いることができる。形質転換体の培養
は、宿主に応じて、通常１６〜４２℃、好ましくは２５
〜３７℃で５〜１６８時間、好ましくは８〜７２時間行
う。振盪培養と静置培養のいずれも可能であるが、必要
に応じて攪拌や通気を行ってもよい。また、Ｄ３遺伝子
発現のために誘導型プロモーターを用いた場合は、培地
にプロモーター誘導剤を添加して培養を行う。

【００２９】Ｄ３の単離・精製法としては、形質転換体
の抽出物や培地より、公知の塩析、等電点沈澱法、また
は溶媒沈澱法等の沈澱法、透析、限外濾過またはゲル濾
過等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマト
グラフィー等の荷電の差を利用する方法、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方
法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー
等の疎水度の差を利用する方法等が挙げられ、これらを
組み合わせることにより単離・精製が可能である。

【００３０】大腸菌等を宿主とした場合には、不活性な
Ｄ３会合体、すなわちタンパク質封入体としてＤ３遺伝
子産物を得た後、これを適当な方法で活性化するのが好
ましい。タンパク質封入体としてＤ３遺伝子を発現させ
た場合の利点として、Ｄ３遺伝子産物を封入体として簡
便に単離できる、Ｄ３活性の宿主への影響を軽減でき
る、等の点が挙げられる。後述の実施例では、大腸菌を
宿主として、一部改変したＤ３遺伝子をタンパク質封入
体として高発現させて回収し、可溶化・巻き戻しした後
にｐＨを酸性側にシフトして活性化させて本チオールプ
ロテアーゼを得る方法について詳しく述べる。なお、タ
ンパク質封入体を可溶化・巻き戻しした後にｐＨを酸性
側にシフトして活性化させる方法は公知であり、例えば
キモシンに関しては "Biotechnology", September 198
4, pp.801-804に、カテプシン−Ｌに関しては "The Jou
rnal ofBiological Chemistry", vol.264, No.34, pp.2
0487-20495 (1989) に、それぞれ記載されている。すな
わち、キモシン、カテプシン−Ｌは、ｐＨを酸性にシフ
トさせることにより、成熟型酵素のＮ末端側にある配列
を、酸性で機能するプロテアーゼによる消化や、自己消
化により除去している。しかしながら、本チオールプロ
テアーゼＤ３に関しては、ｃＤＮＡ構造よりそのＣ末端
側にも天然型Ｄ３にはない配列の存在が示唆された。そ
のため、あらかじめこのＣ末端側の配列を除いた形でＤ
３を発現させ、その封入体について、可溶化・巻戻しを
行った後にｐＨを酸性側にシフトさせて活性化を行っ
た。

【００３１】酵母や麹菌等、タンパク質分泌能を有する
宿主を用いた場合には、Ｄ３を培地に分泌生産させる
と、Ｄ３の折り畳みが正常に行われるためＤ３活性体が
得られるため、Ｄ３活性の宿主への影響が軽減でき、さ
らに精製が簡便になる等の利点がある。後述の実施例で
は、酵母を宿主として、一部改変したＤ３遺伝子を用い
てＤ３を分泌発現させることにより、本チロールプロテ
アーゼを得る方法について詳しく述べる。

【００３２】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

【００３３】［実施例１ ＰＣＲ法によるチオールプロ
テアーゼＤ３のＮ末端アミノ酸をコードする部分ｃＤＮ
Ａ断片のクローニング］ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングのためのプローブに用いるために、プロテアー
ゼＤ３のＮ末端部分をコードする部分ｃＤＮＡ断片を下
記に示すようにＰＣＲ法により増幅後、クローニングし
た。

【００３４】まず、播種後１０日目のダイズ子葉を用い
て、常法により、ＲＮＡ エクストラクション キット
（RNA Extraction Kit；ファルマシア社製）によりＲＮ
Ａを抽出し、ｍＲＮＡ 精製キット（mRNA Purificatio
n Kit ；ファルマシア社製）を用いて、ｐｏｌｙ（Ａ）
ＲＮＡを精製した。

【００３５】このようにして得たｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ
を鋳型にして、いわゆるＲＴ−ＰＣＲ反応（reverse tr
anscript polymerase chain reaction）を行ったのであ
るが、このときに用いたＰＣＲプライマーは次のような
ものであった。すなわち、本発明者らによりすでに決定
されている上記Ｄ３−αのＮ末端配列中、１番目のＡｓ
ｐから５番目のＧｌｕまでの配列に基づいて、5'-GA(C/
T)AA(A/G)TT(A/G)CC(A/G/C/T)GA-3' なる縮重したオリ
ゴヌクレオチドを合成し、これをセンス鎖のＰＣＲプラ
イマーとした。

【００３６】また、２６番目のＳｅｒから３０番目のＰ
ｈｅまでの配列（未同定のアミノ酸は他のチオールプロ
テアーゼとの比較よりＣｙｓと推定した）に基づいて、
5'-AA(A/G/C/T)GCCCA(C/T)CA(C/T)CT-3' なる同様に縮
重したオリゴヌクレオチドを合成し、これをアンチセン
ス鎖のＰＣＲプライマーとした。

【００３７】次に、これらのｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ、Ｐ
ＣＲプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。
具体的には、ｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡ ２０ｎｇを鋳型と
して、ＲＮＡ−ＰＣＲ キット（パーキン・エルマー・
シータス社製）を用いてｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマー
により最初の１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、上記センス
鎖プライマーおよびアンチセンス鎖プライマーをそれぞ
れ１μＭ存在下、ＤＮＡ サーマル サイクラー（パー
キン・エルマー・シータス社製）を用いて以下の温度条
件でＰＣＲ反応を行った。

【００３８】すなわち、９４℃、５分間の熱変性の後、
３７℃、２分間のアニーリングを行い、続いて、１分３
０秒間の勾配を掛けて７２℃まで温度上昇させた後、さ
らに１分３０秒間の伸長反応を行った。この後、９４
℃、１分間の熱変性、３７℃、２分間のアニーリング、
１分３０秒間の勾配を掛けた７２℃までの温度上昇、７
２℃、１分３０秒間の伸長反応からなるサイクルを３５
サイクル繰り返し、その後、７２℃、７分間の伸長反応
を行って反応を停止した。

【００３９】この結果、約９０ｂｐの増幅断片が得られ
たので、これを、ＴＡ クローニング キット（インビ
トロゲン社製）によりプラスミドベクター（ＰＣＲ２）
にクローニングし、その塩基配列をＡＬＦ ＤＮＡ シ
ークエンサー（ファルマシア社製）により決定した。

【００４０】その結果、得られた塩基配列のコードする
アミノ酸配列は、決定されたチオールプロテアーゼＤ３
−αのＮ末端配列と完全に一致した。

【００４１】［実施例２ チオールプロテアーゼＤ３
ｃＤＮＡのクローニング］実施例１で得られた部分ｃＤ
ＮＡ断片をプローブにしてｃＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、チオールプロテアーゼＤ３のｃＤＮＡの
ほぼ全長を下記の方法によりクローニングした。

【００４２】すなわち、実施例１での方法と同様にして
得た発芽１０日目のダイズ子葉から抽出したｐｏｌｙ
（Ａ）ＲＮＡ ５μｇから、タイム−セーバー ｃＤＮ
Ａ クローニング キット（アマーシャム社製）を用い
て２本鎖ｃＤＮＡを合成し、これをｃＤＮＡラピッド
クローニング システム（アマーシャム社製）を用い
て、常法により、λＭＯＳＳｌｏｘベクターにクローニ
ングし、ｃＤＮＡライブラリーを得た。

【００４３】このｃＤＮＡライブラリーの５０，０００
ｐｆｕを実施例１で得た９０ｂｐの部分ｃＤＮＡ断片を
プローブにして、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベ
リング検出システム（アマーシャム社製）を用いて、プ
ラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングし
た。

【００４４】その結果、約５０個の陽性クローンを得
た。この中より２０個をランダムにピックアップし、プ
ラークを純化した後、ｃＤＮＡをλＭＯＳＳｌｏｘベク
ターのもつ自動切り出し機能を利用して、プラスミドの
形で回収した。

【００４５】これらのプラスミドを単離し、９０ｂｐ断
片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション分析
を行い、プローブとハイブリダイズするｃＤＮＡインサ
ートをもつクローンをさらにピックアップした。

【００４６】得られたクローンのｃＤＮＡインサートを
制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩにより切断
し、その切断パターンをアガロースゲル電気泳動により
分析したところ、２種類のパターンに分れ、大部分のク
ローンはこのいずれか一方のパターンのグループに属し
ていた。それぞれのグループから最大のｃＤＮＡインサ
ートをもつクローンｐＭＯＳＳ−ａ（ｃＤＮＡの長さは
約１．９ｋｂｐ）およびｐＭＯＳＳ−ｒ（ｃＤＮＡの長
さは約１．８ｋｂｐ）を選んで、その塩基配列を分析し
た結果、ｐＭＯＳＳ−ａにはチオールプロテアーゼＤ３
−βのＮ末端アミノ酸配列をコードする部分が含まれて
おり、ｐＭＯＳＳ−ｒにはチオールプロテアーゼＤ３−
αのＮ末端アミノ酸配列をコードする部分が含まれてい
ることが明らかになった。

【００４７】なお、Ｄ３−α ｃＤＮＡは、ｐＵＣ１８
プラスミドベクターに組み込まれた形で大腸菌（Escher
ichia coli）ＨＢ１０１に形質転換され、かかるプラス
ミド保持菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ
Ｊ１３０６７として、工業技術院生命工学工業技術研究
所に平成６年１２月６日に寄託されている（受託番号：
ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８８）。

【００４８】また、Ｄ３−β ｃＤＮＡは、ｐＵＣ１８
プラスミドベクターに組み込まれた形で大腸菌（Escher
ichia coli）ＨＢ１０１に形質転換され、かかるプラス
ミド保持菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ａ
Ｊ１３０６６として、工業技術院生命工学工業技術研究
所に平成６年１２月６日に寄託されている（受託番号：
ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８７）。

【００４９】これらのｃＤＮＡの全塩基配列を決定し
た。その結果、チオールプロテアーゼＤ３−αのｃＤＮ
Ａの塩基配列は配列表の配列番号１に、チオールプロテ
アーゼＤ３−βのｃＤＮＡの塩基配列は配列表の配列番
号２に記載した通りであった。

【００５０】また、決定したＮ末端アミノ酸配列を含む
フレームで上記塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配
列は、配列番号１、２に示したとおりであった。

【００５１】［実施例３ Ｄ３−βの大腸菌での生産］
実施例２で得られたＤ３−β ｃＤＮＡの一部を大腸菌
で機能する発現ベクターに組み込み、この発現プラスミ
ドを保持する形質転換体を培養し、遺伝子産物をタンパ
ク質封入体として得た。この封入体を菌体から取り出
し、in vitro で可溶化・巻き戻しを行った後、ｐＨを
酸性側にシフトさせると、初めてＤ３活性を得た。

【００５２】大腸菌で生化学的に不活性なタンパク質封
入体としてＤ３遺伝子を発現させると、Ｄ３遺伝子産物
を封入体として簡便に単離でき、またＤ３活性の宿主菌
体への影響を軽減できるなどの利点がある。

【００５３】このときベクターに組み込んだｃＤＮＡ
は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列番号４〜３５１
位をコードする部分（すなわち塩基番号１０〜１０５３
部分）である。これは、配列番号２に示されるアミノ酸
配列番号−１０７〜２４１位をコードする部分（すなわ
ち塩基番号１２３〜１１６６部分）にあたる。すなわち
これは、Ｄ３−β ｃＤＮＡの塩基配列より推定される
全一次構造から、Ｎ末端側のアミノ酸配列番号−１３２
位のＭｅｔ〜−１０８位のＳｅｒ部分、およびＣ末端側
のアミノ酸配列番号２４２位のＣｙｓ〜３３２位のＡｌ
ａ部分を除いたものである。

【００５４】Ｄ３−βのこの部分配列を発現させるよう
選択したのは、次の理由による。Ｎ末端については、プ
ロテアーゼの成熟体のＮ末端側に存在する配列、いわゆ
るプロ配列が折り畳みおよび活性制御に関与することが
知られており、Ｄ３−βではこのプロ配列は配列表の配
列番号２のアミノ酸配列番号−１０７位近傍から−１位
部分であると考えられたからである。

【００５５】また、Ｃ末端については、ペプチドマッピ
ングにより、Ｃ末端の位置にはヘテロジェニティがあ
り、配列表の配列番号２のアミノ酸配列番号２２８位の
Ｐｒｏ〜２４７位のＳｅｒであることが判明した。しか
し、他のチオールプロテアーゼにはＤ３−βのＣ末端側
のアミノ酸配列番号２４２位のＣｙｓ近傍〜３３２位の
Ａｌａ部分に相当する配列が存在しないこと、Ｄ３の分
子量は２６〜３０ｋＤａであること、他のチオールプロ
テアーゼとの比較から２４２位のＣｙｓは活性への関与
もＳ−Ｓ結合への関与もないと推測されること、２４２
位のＣｙｓコドン（ＴＧＴ）は１塩基置換により終止コ
ドンになり得ること、等から、上述のようにＣ末端の位
置を２４１位のＶａｌとした。

【００５６】また、Ｄ３−αとＤ３−βの酵素化学的性
質はほとんど一致しており、実施例２で既述したように
ｃＤＮＡ構造から両者のアミノ酸配列もほとんど一致し
ていると考えられる。したがって、Ｄ３−αも本実施例
で述べるＤ３−βの生産方法と同様な方法で生産するこ
とが可能であることが容易に推察できる。

【００５７】以下に大腸菌を用いた本実施例について、
＜１＞発現プラスミドの構築、＜２＞該発現プラスミド
を用いた大腸菌の形質転換体の作製と培養、＜３＞タン
パク質封入体の単離、可溶化・巻き戻し、＜４＞自己触
媒的活性化について分説する。

【００５８】＜１＞発現プラスミドの構築 図１に示すように、実施例２に記載のＤ３−β ｃＤＮ
Ａを組み込んだｐＭＯＳＳ−ａを制限酵素ＳｐｌＩで切
断し、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化した後、ＥｃｏＲ
Ｉで切断して約８７０ｂｐの断片を得た。この断片を、
市販の発現ベクターｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）
をＮｈｅＩで切断、Ｋｌｅｎｏｗ酵素で平滑末端化した
後にＥｃｏＲＩで切断した大断片と連結し、プラスミド
ｐＧＥＭｐβ−Ｎを作製した。

【００５９】一方、図２に示すように、ｐＭＯＳＳ−ａ
をＥｃｏＲＩ、ＰｖｕＩＩで切断して得られた１９０ｂ
ｐの断片をＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ間に
挿入し、Ｍ１３β−Ｃを構築した。そして、Ｍ１３β−
Ｃの一本鎖ＤＮＡを鋳型に、オリゴヌクレオチド 5'-CA
AATGTCTGAGACAACTACT-3' を変異プライマーとして、ス
カルプター インビトロ ミュータジェネシス システ
ム（アマーシャム社製）を用い、ＴＧＴ（配列番号２の
アミノ酸配列番号２４２位のＣｙｓコドン）をＴＧＡ
（終止コドン）に部位特異的に変異させ、Ｍ１３β−Ｃ
（Ｃ２４２Ｏｐａｌ）を作製した。次いでこれをＥｃｏ
ＲＩ、ＢａｍＨＩで切断して約１９０ｂｐの断片を得
た。

【００６０】その後、図１に示すように、ｐＧＥＭｐβ
−ＮをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩで切断して得られる大断
片と、上記Ｍ１３β−Ｃ（Ｃ２４２Ｏｐａｌ）からの約
１９０ｂｐの断片とを連結し、発現プラスミドｐＧＥＭ
ｐβを構築した。すなわちこのｐＧＥＭｐβに発現する
よう組み込んだ配列は配列表の配列番号３に記載したも
のであり、このなかで塩基番号１〜９の配列はベクター
由来の塩基配列である。

【００６１】以上の変異や構築は、ＡＬＦ ＤＮＡ シ
ークエンサー（ファルマシア社製）を用いて塩基配列を
分析することにより正しく行われていることを確認し
た。

【００６２】＜２＞発現プラスミドｐＧＥＭｐβを用い
た大腸菌の形質転換体の作製と培養 コンピテントセル法により、上記のｐＧＥＭｐβを大腸
菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（プロメガ社製）に導入し
た。得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシ
リンを含むＭ９−カザミノ酸培地で３７℃で振盪培養し
た。培地にイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ
シドを添加して生産誘導すると、目的のＤ３遺伝子産物
は、タンパク質封入体として菌体内に蓄積した。

【００６３】＜３＞タンパク質封入体の単離、可溶化・
巻き戻し 上述のようにして培養した菌体を集菌後、超音波破砕
し、遠心によってタンパク質封入体を回収した。このタ
ンパク質封入体を洗浄後、８Ｍ尿素−１０ｍＭジチオト
レイトール−５０ｍＭ塩化ナトリウム−５０ｍＭトリス
・塩酸−５ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ８）
に、タンパク質濃度が約１０ｍｇ／ｍｌになるよう溶解
した。これを可溶化ｐＤ３−β溶液と呼ぶ。

【００６４】可溶化ｐＤ３−β溶液１容に、還元型グル
タチオンおよび酸化型グルタチオンを含み、タンパク質
変性剤を含まない溶液１００容をゆっくり添加して、尿
素濃度を低下させるとともに、タンパク質濃度も低下さ
せた。この溶液の組成は１ｍＭ還元型グルタチオン−
０．１〜０．５ｍＭ酸化型グルタチオン−５０ｍＭリン
酸カリウム−５ｍＭエチレンジアミン四酢酸溶液（ｐＨ
１０．５）である。

【００６５】その後これを約５０倍に濃縮し、溶媒を２
００ｍＭ塩化ナトリウム−５ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ１０）に置換した。これを巻き戻りｐＤ３−β溶
液と呼ぶ。

【００６６】＜４＞自己触媒的活性化 巻き戻りｐＤ３−β溶液をｐＨ４前後、２００ｍＭ塩化
ナトリウムに溶液に曝し、３０℃でインキュベートさせ
た。この結果、分子量約４１ｋＤａのｐＤ３−βは自己
触媒的に分子量約３０ｋＤａのＤ３−βに変換した。こ
のＤ３−βのｃ３０分解の比活性は１５Ｕ／ｍｇで、発
芽ダイズ子葉より精製した天然型Ｄ３−βの約１／５で
あった。

【００６７】なお、このｃ３０分解活性の単位である１
Ｕとは、１μｇのｃ３０を１分間に消失させる活性であ
る。本比活性測定は、基質ｃ３０の濃度が０．５ｍｇ／
ｍｌ、反応溶液組成が５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０）、０．２Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ アジ化ナトリ
ウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールとなるよう
に酵素溶液を添加し、３０℃で１８時間反応させた反応
液の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをクマジーブリ
リアントブルーで染色し、デンシトメーターでｃ３０の
バンドの減少を定量することにより行った。基質である
ｃ３０とは、発芽過程におけるダイズ貯蔵タンパク質７
Ｓグロブリンの分子量３０ｋＤａの限定分解フラグメン
トであり、次のようにして精製した。すなわち発芽７日
目のダイズ子葉抽出物から等電点沈澱で夾雑タンパク質
を除いたものを、レクチンリガンドアフィニティー担体
ＣｏｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ファルマシア社製）に
供し、吸着画分を溶出させたものである。なお、この活
性測定法は、本発明者らにより既に出願されている特願
平６−２９４５４８号明細書に詳述されている。

【００６８】このようにして達成された生産量は、ｃ３
０分解活性に換算すると、天然型Ｄ３として約５０ｍｇ
／ｌ培地であり、これは発芽１０日目のダイズ子葉約５
０ｋｇより精製した量に匹敵する。

【００６９】なお、ｐＧＥＭｐβは大腸菌ＪＭ１０９株
に形質転換され、その保持菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＡＪ１３１２６として、工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成７年７月３日に寄託されている
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１５０２１）。

【００７０】［実施例４ Ｄ３−βの酵母での分泌生
産］実施例２で得られたＤ３−β ｃＤＮＡの一部を酵
母で機能する発現ベクターに組み込み、この発現プラス
ミドを保持する形質転換体を培養し、培地中にＤ３活性
を検出した。

【００７１】このときベクターに組み込んだＤＮＡは、
配列表の配列番号２のアミノ酸配列番号−１３２〜２４
１位をコードする部分（すなわち塩基番号４８〜１１６
６部分）に終始コドンＴＧＡ（すなわち配列番号３の塩
基番号１０５４〜１０５６部分）を連結したものであ
る。これは、Ｄ３−β ｃＤＮＡの塩基配列より推定さ
れる全一時構造から、Ｃ末端側のアミノ酸配列番号２４
２位のＣｙｓ〜３３２位のＡｌａ部分を除いたものであ
る。すなわち、Ｄ３−βのシグナルペプチドの下流に実
施例３で発現させた配列を連結したものであり、該シグ
ナルペプチドは配列表の配列番号２のアミノ酸配列番号
−１３２〜−１０８位をコードする部分（すなわち塩基
番号４８〜１２２部分）にあたる。

【００７２】酵母を用いてＤ３を培地に分泌生産させる
と、Ｄ３の折り畳みが行われるためＤ３活性体が得ら
れ、またＤ３活性の宿主への影響が軽減できる。また、
培地中には宿主由来の夾雑タンパク質が少ないため、精
製が必要な場合には、操作が簡便になる等の利点があ
る。

【００７３】以下に酵母を用いた本実施例について、＜
１＞分泌発現プラスミドの構築、＜２＞該分泌発現プラ
スミドを用いた酵母の形質転換体の作製、＜３＞形質転
換体の培養と活性測定について分説する。

【００７４】＜１＞分泌発現プラスミドの構築 図３に示すように、実施例２に記載のＤ３−β ｃＤＮ
Ａを組み込んだｐＵＣ１８−ａからｃＤＮＡ配列を制限
酵素ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩで切り出した。まず、この断
片を市販の発現ベクターｐＹＥＳ２（インビトロゲン社
製）のマルチクローニングサイトのＫｐｎＩ、ＢａｍＨ
Ｉ間に挿入し、プラスミドｐＹＥＳＤ３（ｐＡ）を構築
した。

【００７５】なお、発現ベクターｐＹＥＳ２は、マルチ
クローニングサイトの上流にガラクトースで発現誘導さ
れるＧＡＬ１プロモーターを、下流にＣＹＣ１ターミネ
ーターを有し、マーカーとしてＵＲＡ３遺伝子を有す
る。

【００７６】次に、図４に示すように、上述のｐＹＥＳ
Ｄ３（ｐＡ）からポリＡ配列を除くために、Ｄ３−β
ｃＤＮＡの３’非翻訳領域のＢｇｌＩＩより３’末端側
の配列を除去した。すなわち、ｐＹＥＳＤ３（ｐＡ）の
ＰｍａＣＩ、ＢａｍＨＩ間に、ｐＹＥＳＤ３（ｐＡ）の
ＰｍａＣＩ、ＢｇｌＩＩ断片を挿入し、ｐＹＥＳＤ３を
構築した。このｐＹＥＳＤ３は、Ｄ３−βの全長、すな
わち配列表の配列番号２記載のアミノ酸残基番号−１３
２位のＭｅｔ〜３３２位のＡｌａを発現するよう構築さ
れている。

【００７７】さらに、配列表の配列番号２記載のアミノ
酸配列番号２４２位のＣｙｓ〜３３２位のＡｌａ部分を
除いたもの、すなわち−１３２位のＭｅｔ〜２４１位の
Ｖａｌ部分を発現するようなプラスミドを構築した。す
なわち、図４に示すように、ｐＹＥＳＤ３（ｐＡ）のＰ
ｍａＣＩ、ＢａｍＨＩ間に、実施例３記載のプラスミド
ｐＧＥＭｐβのＰｍａＣＩ、ＢａｍＨＩ断片を挿入し、
プラスミドｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）を構築した。

【００７８】＜２＞発現プラスミドを用いた酵母の形質
転換体の作製 酢酸リチウム法に従った、酵母細胞形質転換キットであ
るイーストメーカー（クロンテック社製）を用いて、上
述のプラスミドを、酵母ＩＮＶＳＣ１株（インビトロゲ
ン社）に導入し、ウラシル非要求性の形質を有する形質
転換体を得た。

【００７９】＜３＞形質転換体の培養と活性測定 上記の形質転換体、すなわち、ベクターｐＹＥＳ２、ｐ
ＹＥＳＤ３、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）をそれぞれ有
する酵母ＩＮＶＳＣ１株を、カゼイン重層寒天培地にて
培養し、プロテアーゼ分泌生産の指標となるハローの形
成を調べた。

【００８０】このカゼイン重層寒天培地の組成は、下層
はロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、および糖源
を含むＳＤ寒天培地であり、上層は０．５％（ｗ／ｖ）
のカゼインを含む寒天培地である。

【００８１】糖源としてガラクトースを添加した場合
に、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）を有する酵母ＩＮＶＳ
Ｃ１株のみが、ハローを形成した。

【００８２】次に、このｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）形
質転換体のハロー形性能が、分泌されたチオールプロテ
アーゼＤ３によることの確認を行った。すなわち、上記
の形質転換体をガラクトースとカザミノ酸を含むＳＤ培
地にて培養し、その培地について、合成ペプチド基質を
用いてＤ３活性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＤ３遺伝
子産物を検出した。

【００８３】Ｄ３活性の検出は、発現プラスミドｐＹＥ
ＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）を保持する形質転換体である酵母
ＩＮＶＳＣ１株を培養した培地１２５μｌに、基質とし
てベンジルオキシカルボニル−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−４−メ
チルクマリル−７−アミド（以下、Ｚ−ＦＲ−ＭＣＡと
略す）を用い、遊離する７−アミノ−４−メチル−クマ
リン（以下、ＡＭＣと略す）の蛍光強度を測定すること
により行った。ＡＭＣの励起波長は３７０ｎｍ、蛍光波
長は４６０ｎｍである。

【００８４】このＤ３活性測定操作は、既知の方法（A.
J. Barrett & H. Kirschke, "Methods Enzymol.", 80,
535(1981)）により、以下のようにして行った。すなわ
ち、基質濃度が１０μＭ、反応溶液組成が５０ｍＭ 酢
酸ナトリウム（ｐＨ４．０）−０．２Ｍ ＮａＣｌ−２
ｍＭ アジ化ナトリウム−１０ｍＭ ２−メルカプトエ
タノールとなるように培地に添加し、３７℃で５分間反
応させた後に、阻害剤である（Ｌ−３トランス−カルボ
キシオキシラン−２−カルボニル）−Ｌ−ロイシン−ア
グマチン（以下、Ｅ−６４と略記する）を添加して反応
を停止し、ＡＭＣの蛍光強度を測定した。対照として、
上記基質に阻害剤Ｅ−６４を加えたものを用い、これと
上記飯能液を培地に添加し、同様の操作を行った。

【００８５】本チオールプロテアーゼＤ３が合成ペプチ
ド基質であるＺ−ＦＲ−ＭＣＡをよく分解してＡＭＣを
遊離させること、およびＥ−６４によって阻害を受ける
ことは、本発明者らによって確認されている（特願平６
−２９４５４８号明細書）。

【００８６】また、対照としてＤ３遺伝子をもたないベ
クターｐＹＥＳ２を保持する形質転換体についても、同
様な活性測定操作を行った。

【００８７】ＡＭＣの蛍光強度の測定結果を表１に示
す。なお、この条件において測定した１μＭ ＡＭＣの
蛍光強度は０．６４であった。

【００８８】

【表１】 表１から明らかなように、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）
形質転換体を培養した培地中には、Ｅ−６４で阻害され
る、Ｚ−ＦＲ−ＭＣＡを分解してＡＭＣを生成させる活
性が検出された。ｐＹＥＳ２形質転換体を培養した倍地
中には本活性は検出されなかった。

【００８９】また、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）形質転
換体を培養した培地を濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し
銀染色を行った。このＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を図５に示
す。同図中、レーン１は分子量マーカーであり、低分子
量からそれぞれ、１４．５ｋＤａ、２１．５ｋＤａ、３
１ｋＤａ、４５ｋＤａ、６６ｋＤａである。レーン２お
よび３は、ｐＹＥＳ２形質転換体を培養した培地であ
り、各レーンにはそれぞれ培地８μｌ、約１ｍｌ分を添
加した。レーン４および５は、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒ
ｏ）形質転換体を培養した培地のそれぞれ８μｌ、約２
ｍｌを添加した。

【００９０】図５から明らかなように、ｐＹＥＳＤ３
（ΔＴｅｒｏ）形質転換体を培養した培地から分子量約
４０ｋＤａのｐＤ３−βと考えられる幅の広いバンド、
および３０ｋＤａのＤ３−βと推定されるバンドが検出
された。一方、ｐＹＥＳ２形質転換体を培養した培地に
は、このバンドは検出されなかった。さらに、ｐＹＥＳ
Ｄ３（ΔＴｅｒｏ）形質転換体を培養した培地では、培
地中の夾雑タンパク質のバンドが消失しているのが観察
された。

【００９１】上述の分析結果から、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴ
ｅｒｏ）形質転換体のカゼイン重層寒天培地上でのハロ
ー形成は、本形質転換体がプロ型Ｄ３を分泌生産し、こ
れがＤ３活性体へと変換されることに起因するためと考
えられる。

【００９２】なお、ｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）は酵母
ＩＮＶＳＣ１株に形質転換され、その保持菌はＳａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＪ１４
７０３として、工業技術院生命工学工業技術研究所に平
成７年１１月２８日に寄託されている（受託番号：ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５３１０）。

【００９３】なお、本発明においては、発現ベクターに
組み込まれるＤ３遺伝子の配列は上記実施例３および４
に限られるものではない。すなわち、配列表の配列番号
１または２、あるいは３に示す塩基配列またはその部分
配列を表すものであって、それらがコードするアミノ酸
配列が発芽ダイズ子葉に由来する天然型チオールプロテ
アーゼの活性特性を発揮し得るチオールプロテアーゼを
コードする遺伝子であれば、本発明の範囲内に含まれ
る。したがって、配列表の配列番号１から３におけるア
ミノ酸配列またはこの配列において１若しくは複数のア
ミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミ
ノ酸配列を有し、発芽ダイズ子葉に由来する天然型チオ
ールプロテアーゼの活性特性を発揮し得るチオールプロ
テアーゼをコードする塩基配列からなる遺伝子も、本発
明範囲内に含まれる。

【００９４】また、配列表の配列番号３の塩基番号３３
１〜１０５３で表される塩基配列はＤ３−β成熟体をコ
ードする遺伝子と考えられることから、これを部分配列
として含む塩基配列であって、組み換え遺伝子手法によ
り発芽ダイズ子葉に由来する天然型チオールプロテアー
ゼと同効の酵素活性を発揮し得るものを生産し得る塩基
配列からなる遺伝子もまた、本発明範囲内に含まれる。

【００９５】さらに、これらＤ３遺伝子を発現生産させ
るための配列、すなわち高発現のための異種融合タンパ
ク質の配列や、分泌発現のためのシグナル配列が付加さ
れた配列も、本発明範囲内に含まれる。

【００９６】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明によれば、
ダイズ貯蔵タンパク質をアミノ酸または低分子ペプチド
にまで分解し得る新規チオールプロテアーゼＤ３のアミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡが得られる。これらｃＤ
ＮＡの構造情報をもとに、大腸菌や酵母などで組換え体
チオールプロテアーゼを量産できる。また、上記ｃＤＮ
Ａを用いれば、実施例に詳述した以外の宿主でも、チオ
ールプロテアーゼＤ３を生産することが可能である。

【００９７】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８０７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Glycine max 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：68..1459 特徴を決定した方法：P 配列： TCACCTTTCT CCTAAAACAT CTCCAGTGGG TTCTTCTTCT TCTATTACAA 50 CAACGTCGTC CAAGACC ATG ACC ATG GCC ATG GCC ACG ATC CTG CTC 97 Met Thr Met Ala Met Ala Thr Ile Leu Leu -130 -125 CTG TTC ACG GTC TTC GCG GTT TCA TCG GCC CTA GAC ATG TCG ATA ATC 145 Leu Phe Thr Val Phe Ala Val Ser Ser Ala Leu Asp Met Ser Ile Ile -120 -115 -110 TCG TAC GAC AAC GCC CAC GCC GCC ACG TCG CGC AGC GAC GAG GAG CTG 193 Ser Tyr Asp Asn Ala His Ala Ala Thr Ser Arg Ser Asp Glu Glu Leu -105 -100 -95 -90 ATG TCC ATG TAC GAG CAG TGG CTG GTG AAG CAC GGC AAG GTG TAC AAC 241 Met Ser Met Tyr Glu Gln Trp Leu Val Lys His Gly Lys Val Tyr Asn -85 -80 -75 GCG CTC GGG GAG AAG GAG AAG AGG TTC CAG ATC TTC AAG GAC AAC CTG 289 Ala Leu Gly Glu Lys Glu Lys Arg Phe Gln Ile Phe Lys Asp Asn Leu -70 -65 -60 CGA TTC ATC GAC GAC CAC AAC TCC CAA GAG GAC CGA ACC TAC AAG CTC 337 Arg Phe Ile Asp Asp His Asn Ser Gln Glu Asp Arg Thr Tyr Lys Leu -55 -50 -45 GGA CTG AAC CGG TTC GCG GAT CTC ACC AAC GAG GAG TAC AGG GCC AAG 385 Gly Leu Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ala Lys -40 -35 -30 TAC TTG GGA ACC AAG ATC GAT CCC AAC CGG AGG CTC GGC AAG ACC CCG 433 Tyr Leu Gly Thr Lys Ile Asp Pro Asn Arg Arg Leu Gly Lys Thr Pro -25 -20 -15 -10 AGC AAC CGA TAC GCG CCA CGT GTC GGC GAC AAA CTA CCT GAA TCG GTT 481 Ser Asn Arg Tyr Ala Pro Arg Val Gly Asp Lys Leu Pro Glu Ser Val -5 1 5 GAT TGG AGG AAG GAA GGT GCT GTT CCT CCA GTC AAA GAC CAA GGA GGC 529 Asp Trp Arg Lys Glu Gly Ala Val Pro Pro Val Lys Asp Gln Gly Gly 10 15 20 TGT GGG AGC TGT TGG GCA TTC TCA GCA ATC GGT GCA GTG GAA GGA ATA 577 Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Ile Gly Ala Val Glu Gly Ile 25 30 35 AAT AAG ATA GTG ACA GGT GAA CTG ATT TCG TTA TCA GAA CAA GAA TTG 625 Asn Lys Ile Val Thr Gly Glu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu 40 45 50 55 GTG GAT TGT GAT ACA GGA TAT AAC GAA GGA TGC AAT GGA GGA CTT ATG 673 Val Asp Cys Asp Thr Gly Tyr Asn Glu Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met 60 65 70 GAC TAT GCA TTT GAG TTC ATT ATC AAC AAT GGC GGC ATT GAT TCT GAA 721 Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Ile Ile Asn Asn Gly Gly Ile Asp Ser Glu 75 80 85 GAG GAT TAC CCT TAC CGT GGT GTT GAT GGT AGA TGT GAC ACA TAT AGG 769 Glu Asp Tyr Pro Tyr Arg Gly Val Asp Gly Arg Cys Asp Thr Tyr Arg 90 95 100 AAA AAT GCT AAG GTT GTT TCT ATT GAT GAC TAC GAA GAT GTT CCT GCC 817 Lys Asn Ala Lys Val Val Ser Ile Asp Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ala 105 110 115 TAT GAT GAG TTA GCT TTG AAA AAG GCT GTT GCA AAT CAG CCC GTC AGT 865 Tyr Asp Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala Asn Gln Pro Val Ser 120 125 130 135 GTA GCT ATT GAA GGA GGG GGC AGG GAA TTT CAA TTA TAT GTA TCT GGT 913 Val Ala Ile Glu Gly Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Val Ser Gly 140 145 150 GTA TTC ACT GGG AGA TGT GGC ACA GCA CTA GAT CAT GGT GTC GTG GCT 961 Val Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Ala Leu Asp His Gly Val Val Ala 155 160 165 GTT GGG TAT GGT ACA GCT AAT GGT CAT GAT TAT TGG ATC GTA AGG AAT 1009 Val Gly Tyr Gly Thr Ala Asn Gly His Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn 170 175 180 TCA TGG GGT CCT AGC TGG GGA GAA GAT GGC TAC ATC AGG TTA GAA AGA 1057 Ser Trp Gly Pro Ser Trp Gly Glu Asp Gly Tyr Ile Arg Leu Glu Arg 185 190 195 AAT CTT GCT AAC AGC AGA TCA GGC AAG TGT GGA ATT GCA ATT GAG CCA 1105 Asn Leu Ala Asn Ser Arg Ser Gly Lys Cys Gly Ile Ala Ile Glu Pro 200 205 210 215 TCT TAT CCC CTT AAG AAT GGT CCA AAT CCA CCT AAT CCT GGA CCA TCA 1153 Ser Tyr Pro Leu Lys Asn Gly Pro Asn Pro Pro Asn Pro Gly Pro Ser 220 225 230 CCC CCT TCA CCT GTG AAG CCA CCA AAT GTC TGT GAC AAC TAC TAC AGC 1201 Pro Pro Ser Pro Val Lys Pro Pro Asn Val Cys Asp Asn Tyr Tyr Ser 235 240 245 TGT GCT GAT AGT GCT ACT TGT TGC TGT ATT TTC GAG TTC GGA AAT GCT 1249 Cys Ala Asp Ser Ala Thr Cys Cys Cys Ile Phe Glu Phe Gly Asn Ala 250 255 260 TGC TTT GAG TGG GGT TGC TGT CCT CTT GAG GGT GCT ACC TGC TGT GAT 1297 Cys Phe Glu Trp Gly Cys Cys Pro Leu Glu Gly Ala Thr Cys Cys Asp 265 270 275 GAC CAC TAC AGT TGC TGC CCT AAC GAC TAT CCC ATC TGC AAC ACT TAT 1345 Asp His Tyr Ser Cys Cys Pro Asn Asp Tyr Pro Ile Cys Asn Thr Tyr 280 285 290 295 GCT GGA ACT TGT CTC AGG AGC AAG AAC AAC CCA TTC GGA GTG AAG GCA 1393 Ala Gly Thr Cys Leu Arg Ser Lys Asn Asn Pro Phe Gly Val Lys Ala 300 305 310 TTG AGG CGT ACT CCG GCT AAA CCC CAT TGG ACC TTT GGG CGT AAG AAC 1441 Leu Arg Arg Thr Pro Ala Lys Pro His Trp Thr Phe Gly Arg Lys Asn 315 320 325 AAG GTC AGC AGT GCT TAAGCAGATA AAGGAAATGT GAACGTGCAG GAAGGAGCCA 1496 Lys Val Ser Ser Ala 330 ATGATGAAGT AAATGAAAGA CGAAGAATTA AAACACCAGC TGATACACTT CCCCTTTACC 1556 TTCACATAAA TTTCTCTGTG CCATTTTATT ATGATACAAA TTGATACTAT TCTGTATCAA 1616 ATTTCAGTCA GATATTGGCT GTGTACATAG GGTTATATTA TTGATGCACT GTATTTGTAT 1676 TCAAATTCCA ATTCCAAATG GCGAACATAT TTGATTGCTG TTAGTTTCCC AGGTTATGTA 1736 GACTATGTGA CAATGCAGCA TTATTTGGAT TTGCCCGATA TTCTGGCTAT TTCATTTGCT 1796 TAAAAAAAAA A 1807

【００９８】配列番号：２ 配列の長さ：１８４９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Glycine max 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：48..1442 特徴を決定した方法：P 配列： TAAACATCTC AATGGGTTCT TCTTCTATTA CAACATCGCC CGCAACC 47 ATG ACC ATG GCT GCG ATC GTG CTC CTG TTC ACG GTC TTT GCC GTT TCC 95 Met Thr Met Ala Ala Ile Val Leu Leu Phe Thr Val Phe Ala Val Ser -130 -125 -120 TCC GCC CTA GAC ATG TCG ATA ATC TCG TAC GAC AGC GCC CAC GCG GAC 143 Ser Ala Leu Asp Met Ser Ile Ile Ser Tyr Asp Ser Ala His Ala Asp -115 -110 -105 AAG GCC GCC ACG TTG CGC ACC GAG GAG GAG CTG ATG TCC ATG TAC GAG 191 Lys Ala Ala Thr Leu Arg Thr Glu Glu Glu Leu Met Ser Met Tyr Glu -100 -95 -90 -85 CAG TGG CTC GTG AAG CAC GGG AAG GTG TAC AAC GCG CTC GGC GAG AAG 239 Gln Trp Leu Val Lys His Gly Lys Val Tyr Asn Ala Leu Gly Glu Lys -80 -75 -70 GAG AAG CGC TTC CAG ATC TTC AAG GAC AAC CTG CGA TTC ATC GAC GAC 287 Glu Lys Arg Phe Gln Ile Phe Lys Asp Asn Leu Arg Phe Ile Asp Asp -65 -60 -55 CAC AAC TCC GCG GAG GAC CGA ACC TAC AAG CTC GGA CTG AAC CGG TTC 335 His Asn Ser Ala Glu Asp Arg Thr Tyr Lys Leu Gly Leu Asn Arg Phe -50 -45 -40 GCT GAT CTC ACC AAC GAG GAA TAC AGG GCC AAG TAC TTG GGA ACC AAG 383 Ala Asp Leu Thr Asn Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Tyr Leu Gly Thr Lys -35 -30 -25 ATC GAT CCC AAC CGG AGG CTC GGA AAG ACC CCG AGC AAC CGC TAC GCG 431 Ile Asp Pro Asn Arg Arg Leu Gly Lys Thr Pro Ser Asn Arg Tyr Ala -20 -15 -10 -5 CCA CGT GTC GGC GAC AAA TTG CCT GAT TCC GTT GAT TGG AGG AAG GAA 479 Pro Arg Val Gly Asp Lys Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp Arg Lys Glu 1 5 10 GGT GCT GTT CCT CCT GTC AAA GAC CAA GGA GGC TGT GGG AGC TGT TGG 527 Gly Ala Val Pro Pro Val Lys Asp Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp 15 20 25 GCA TTC TCA GCA ATC GGT GCA GTA GAA GGA ATA AAT AAG ATA GTA ACA 575 Ala Phe Ser Ala Ile Gly Ala Val Glu Gly Ile Asn Lys Ile Val Thr 30 35 40 GGC GAA CTG ATT TCG TTA TCA GAA CAA GAA TTG GTG GAT TGT GAT ACT 623 Gly Glu Leu Ile Ser Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr 45 50 55 60 GGA TAT AAC CAA GGA TGC AAT GGA GGA CTT ATG GAC TAT GCA TTT GAG 671 Gly Tyr Asn Gln Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Glu 65 70 75 TTC ATA ATC AAC AAT GGC GGC ATT GAT TCT GAT GAG GAT TAC CCA TAC 719 Phe Ile Ile Asn Asn Gly Gly Ile Asp Ser Asp Glu Asp Tyr Pro Tyr 80 85 90 CGT GGT GTT GAT GGT AGA TGC GAC ACA TAT AGG AAA AAT GCT AAA GTC 767 Arg Gly Val Asp Gly Arg Cys Asp Thr Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Val 95 100 105 GTT TCT ATT GAT GAC TAC GAA GAT GTT CCT GCC TAT GAT GAG TTA GCC 815 Val Ser Ile Asp Asp Tyr Glu Asp Val Pro Ala Tyr Asp Glu Leu Ala 110 115 120 TTG AAA AAG GCC GTT GCA AAT CAG CCC GTG AGC GTT GCT ATT GAA GGA 863 Leu Lys Lys Ala Val Ala Asn Gln Pro Val Ser Val Ala Ile Glu Gly 125 130 135 140 GGG GGC AGG GAA TTT CAA TTA TAT GTA TCT GGT GTA TTC ACG GGG AGA 911 Gly Gly Arg Glu Phe Gln Leu Tyr Val Ser Gly Val Phe Thr Gly Arg 145 150 155 TGT GGC ACA GCA CTA GAT CAT GGT GTC GTG GCT GTT GGG TAT GGA ACA 959 Cys Gly Thr Ala Leu Asp His Gly Val Val Ala Val Gly Tyr Gly Thr 160 165 170 GCT AAA GGT CAT GAT TAT TGG ATC GTA AGG AAT TCA TGG GGT TCT AGC 1007 Ala Lys Gly His Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Gly Ser Ser 175 180 185 TGG GGA GAG GAT GGC TAC ATC AGA TTA GAA AGA AAT CTT GCT AAC AGC 1055 Trp Gly Glu Asp Gly Tyr Ile Arg Leu Glu Arg Asn Leu Ala Asn Ser 190 195 200 AGA TCA GGC AAG TGT GGA ATT GCA ATT GAG CCA TCT TAT CCC CTT AAG 1103 Arg Ser Gly Lys Cys Gly Ile Ala Ile Glu Pro Ser Tyr Pro Leu Lys 205 210 215 220 AAT GGT CCA AAT CCC CCT AAT CCT GGA CCA TCA CCC CCT TCA CCT GTG 1151 Asn Gly Pro Asn Pro Pro Asn Pro Gly Pro Ser Pro Pro Ser Pro Val 225 230 235 AAG CCG CCA AAT GTC TGT GAC AAC TAC TAC AGC TGT GCT GAT AGT GCT 1199 Lys Pro Pro Asn Val Cys Asp Asn Tyr Tyr Ser Cys Ala Asp Ser Ala 240 245 250 ACT TGT TGC TGT ATT TTT GAG TTC GGA AAT GCT TGC TTC GAG TGG GGT 1247 Thr Cys Cys Cys Ile Phe Glu Phe Gly Asn Ala Cys Phe Glu Trp Gly 255 260 265 TGC TGT CCT CTT GAG GGT GCT TCC TGC TGT GAT GAC CAC TAC AGT TGC 1295 Cys Cys Pro Leu Glu Gly Ala Ser Cys Cys Asp Asp His Tyr Ser Cys 270 275 280 TGC CCT GCA GAC TAT CCC ATC TGC AAC ACT TAC GCT GGA ACT TGT CTC 1343 Cys Pro Ala Asp Tyr Pro Ile Cys Asn Thr Tyr Ala Gly Thr Cys Leu 285 290 295 300 AGG AGC AAG AAC AAC CCC TTT GGA GTG AAG GCA TTA AGG CGT ACT CCA 1391 Arg Ser Lys Asn Asn Pro Phe Gly Val Lys Ala Leu Arg Arg Thr Pro 305 310 315 GCG AAA CCC CAT TGG ACC TTC GGA CGT AAG AAC AAG GTC AGC AGT GCT 1439 Ala Lys Pro His Trp Thr Phe Gly Arg Lys Asn Lys Val Ser Ser Ala 320 325 330 TAAGCAGTTT AAGGAAATGT GAACGTGCAG AAGGAGCCAA TGATGAAGTA AAAGGGAAGA 1499 CGAAGGACTA AAGCACCAGC TGGATGCACT TCCCCCTTCT TCACATAATG CTGCACGTAA 1559 CATAAAGATC TTTACCATTT TATTATGATA CAAAATAGAT AATGTTCTGT ATCAAATTTC 1619 AGTCAGACAT TGGCTCTGTA CATAGGGTTA TATTATCGAT GCACTGTATT TGTATTCAAA 1679 TTCCAAATGG CGAACATATT TGATTGCTGT TAGTTTTCAA GGTTCTGTAG ATTATGTGAC 1739 AATGCAGCAG CAATATTTGG ATTTGTCCCA TATTCACATG CTATTTTAAT TTGCTTACAA 1799 TGTGAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1849

【００９９】配列番号：３ 配列の長さ：１０５６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Glycine max 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：1..1056 特徴を決定した方法：P 特徴を表わす記号：insertion seq 存在位置：1..9 特徴を決定した方法：E 配列： ATG GCT AGG TAC GAC AGC GCC CAC GCG GAC AAG GCC GCC ACG TTG CGC 48 Met Ala Arg Tyr Asp Ser Ala His Ala Asp Lys Ala Ala Thr Leu Arg 5 10 15 ACC GAG GAG GAG CTG ATG TCC ATG TAC GAG CAG TGG CTC GTG AAG CAC 96 Thr Glu Glu Glu Leu Met Ser Met Tyr Glu Gln Trp Leu Val Lys His 20 25 30 GGG AAG GTG TAC AAC GCG CTC GGC GAG AAG GAG AAG CGC TTC CAG ATC 144 Gly Lys Val Tyr Asn Ala Leu Gly Glu Lys Glu Lys Arg Phe Gln Ile 35 40 45 TTC AAG GAC AAC CTG CGA TTC ATC GAC GAC CAC AAC TCC GCG GAG GAC 192 Phe Lys Asp Asn Leu Arg Phe Ile Asp Asp His Asn Ser Ala Glu Asp 50 55 60 CGA ACC TAC AAG CTC GGA CTG AAC CGG TTC GCT GAT CTC ACC AAC GAG 240 Arg Thr Tyr Lys Leu Gly Leu Asn Arg Phe Ala Asp Leu Thr Asn Glu 65 70 75 80 GAA TAC AGG GCC AAG TAC TTG GGA ACC AAG ATC GAT CCC AAC CGG AGG 288 Glu Tyr Arg Ala Lys Tyr Leu Gly Thr Lys Ile Asp Pro Asn Arg Arg 85 90 95 CTC GGA AAG ACC CCG AGC AAC CGC TAC GCG CCA CGT GTC GGC GAC AAA 336 Leu Gly Lys Thr Pro Ser Asn Arg Tyr Ala Pro Arg Val Gly Asp Lys 100 105 110 TTG CCT GAT TCC GTT GAT TGG AGG AAG GAA GGT GCT GTT CCT CCT GTC 384 Leu Pro Asp Ser Val Asp Trp Arg Lys Glu Gly Ala Val Pro Pro Val 115 120 125 AAA GAC CAA GGA GGC TGT GGG AGC TGT TGG GCA TTC TCA GCA ATC GGT 432 Lys Asp Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ala Ile Gly 130 135 140 GCA GTA GAA GGA ATA AAT AAG ATA GTA ACA GGC GAA CTG ATT TCG TTA 480 Ala Val Glu Gly Ile Asn Lys Ile Val Thr Gly Glu Leu Ile Ser Leu 145 150 155 160 TCA GAA CAA GAA TTG GTG GAT TGT GAT ACT GGA TAT AAC CAA GGA TGC 528 Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Gly Cys 165 170 175 AAT GGA GGA CTT ATG GAC TAT GCA TTT GAG TTC ATA ATC AAC AAT GGC 576 Asn Gly Gly Leu Met Asp Tyr Ala Phe Glu Phe Ile Ile Asn Asn Gly 180 185 190 GGC ATT GAT TCT GAT GAG GAT TAC CCA TAC CGT GGT GTT GAT GGT AGA 624 Gly Ile Asp Ser Asp Glu Asp Tyr Pro Tyr Arg Gly Val Asp Gly Arg 195 200 205 TGC GAC ACA TAT AGG AAA AAT GCT AAA GTC GTT TCT ATT GAT GAC TAC 672 Cys Asp Thr Tyr Arg Lys Asn Ala Lys Val Val Ser Ile Asp Asp Tyr 210 215 220 GAA GAT GTT CCT GCC TAT GAT GAG TTA GCC TTG AAA AAG GCC GTT GCA 720 Glu Asp Val Pro Ala Tyr Asp Glu Leu Ala Leu Lys Lys Ala Val Ala 225 230 235 240 AAT CAG CCC GTG AGC GTT GCT ATT GAA GGA GGG GGC AGG GAA TTT CAA 768 Asn Gln Pro Val Ser Val Ala Ile Glu Gly Gly Gly Arg Glu Phe Gln 245 250 255 TTA TAT GTA TCT GGT GTA TTC ACG GGG AGA TGT GGC ACA GCA CTA GAT 816 Leu Tyr Val Ser Gly Val Phe Thr Gly Arg Cys Gly Thr Ala Leu Asp 260 265 270 CAT GGT GTC GTG GCT GTT GGG TAT GGA ACA GCT AAA GGT CAT GAT TAT 864 His Gly Val Val Ala Val Gly Tyr Gly Thr Ala Lys Gly His Asp Tyr 275 280 285 TGG ATC GTA AGG AAT TCA TGG GGT TCT AGC TGG GGA GAG GAT GGC TAC 912 Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp Gly Ser Ser Trp Gly Glu Asp Gly Tyr 290 295 300 ATC AGA TTA GAA AGA AAT CTT GCT AAC AGC AGA TCA GGC AAG TGT GGA 960 Ile Arg Leu Glu Arg Asn Leu Ala Asn Ser Arg Ser Gly Lys Cys Gly 305 310 315 320 ATT GCA ATT GAG CCA TCT TAT CCC CTT AAG AAT GGT CCA AAT CCC CCT 1008 Ile Ala Ile Glu Pro Ser Tyr Pro Leu Lys Asn Gly Pro Asn Pro Pro 325 330 335 AAT CCT GGA CCA TCA CCC CCT TCA CCT GTG AAG CCG CCA AAT GTC TGA 1056 Asn Pro Gly Pro Ser Pro Pro Ser Pro Val Lys Pro Pro Asn Val 340 345 350

【図面の簡単な説明】

【図１】発現プラスミドｐＧＥＭｐβの構築過程（部
分）を示す部分図である。

【図２】発現プラスミドｐＧＥＭｐβの構築過程（部
分）を示す部分図である。

【図３】分泌発現プラスミドｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒ
ｏ）の構築過程（部分）を示す部分図である。

【図４】分泌発現プラスミドｐＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒ
ｏ）の構築過程（部分）を示す部分図である。

【図５】ベクターｐＹＥＳ２、および発現プラスミドｐ
ＹＥＳＤ３（ΔＴｅｒｏ）を保持する形質転換体である
酵母ＩＮＶＳＣ１株を培養した培地のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
像を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/50 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 三輪 哲也 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味 の素株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 柴井 博四郎 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味 の素株式会社中央研究所内 (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１番１号 味 の素株式会社中央研究所内

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１または２に示す塩基
   配列で表される、発芽ダイズ子葉に由来する新規チオー
   ルプロテアーゼをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１または２におけるア
   ミノ酸配列またはこの配列において１若しくは複数のア
   ミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置換されたアミ
   ノ酸配列を有し、発芽ダイズ子葉に由来する天然型チオ
   ールプロテアーゼの活性特性を発揮し得るチオールプロ
   テアーゼをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号３に示す塩基配列また
   はその部分配列で表されるＤＮＡであって、該配列番号
   ３におけるアミノ酸配列またはこの配列において１若し
   くは複数のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失若しくは置
   換されたアミノ酸配列を有し、発芽ダイズ子葉に由来す
   る天然型チオールプロテアーゼの活性特性を発揮し得る
   チオールプロテアーゼをコードする、上記ＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号３のアミノ酸番号４位
   （Ｔｙｒ）〜３５１位（Ｖａｌ）までのアミノ酸配列を
   コードする、請求項３に記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列表の配列番号３の塩基番号１０〜１
   ０５３の塩基配列で表される、請求項３または４に記載
   のＤＮＡ。
6. 【請求項６】 配列表の配列番号３のアミノ酸番号１１
   １位（Ａｓｐ）〜３５１位（Ｖａｌ）までのアミノ酸配
   列をコードする、請求項３に記載のＤＮＡ。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号３の塩基番号３３１〜
   １０５３の塩基配列で表される、請求項３または６に記
   載のＤＮＡ。
8. 【請求項８】 請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤ
   ＮＡを含有する、組換え発現ベクター。
9. 【請求項９】 請求項８に記載の組換え発現ベクターで
   形質転換された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
   ｌｉ）である、形質転換体。
10. 【請求項１０】 請求項９に記載の形質転換体を培養
    し、培養物中に産生されたチオールプロテアーゼを単離
    し、所望により精製することからなる、チオールプロテ
    アーゼの製造方法。
11. 【請求項１１】 前記培養物中に産生されたチオールプ
    ロテアーゼをタンパク質封入体として回収し、可溶化・
    巻き戻しした後にｐＨを酸性側にシフトして活性化する
    ことからなる、請求項１０に記載のチオールプロテアー
    ゼの製造方法。
12. 【請求項１２】 請求項４または５に記載のＤＮＡの
    ５’末端側にシグナル配列をコードするＤＮＡを付加し
    てなるＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 前記シグナル配列が、配列表の配列番
    号２の塩基番号４８〜１２２の塩基配列である、請求項
    １２に記載のＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 配列表の配列番号２のアミノ酸番号−
    １３２位（Ｍｅｔ）〜２４１位（Ｖａｌ）までのアミノ
    酸配列をコードするＤＮＡ。
15. 【請求項１５】 配列表の配列番号２の塩基番号４８〜
    １１６６の塩基配列で表されるＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 請求項１２〜１５のいずれか１項に記
    載のＤＮＡを含有する、組換え分泌発現ベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組換え分泌発現ベ
    クターで形質転換された酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃ
    ｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、形質転換体。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の形質転換体を培養
    し、培地中に産生されたチオールプロテアーゼを単離
    し、所望により精製することからなる、チオールプロテ
    アーゼの製造方法。