JPH11346777A

JPH11346777A - ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子、組み換え体ｄｎａ及びロイシンアミノペプチダーゼの製造法

Info

Publication number: JPH11346777A
Application number: JP10164611A
Authority: JP
Inventors: Genryu Umitsuke; 玄龍海附; Takayoshi Abe; 敬悦阿部
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1998-06-12
Publication date: 1999-12-21
Anticipated expiration: 2018-06-12
Also published as: US6127161A; JP3727780B2; DK0967286T3; EP0967286A3; EP0967286B1; EP0967286A2; DE69923255T2; DE69923255D1

Abstract

(57)【要約】【解決手段】特定のアミノ酸配列を有するロイシンア
ミノペプチダーゼをコードする遺伝子、該遺伝子をベク
ターＤＮＡに挿入してなる組み換え体ＤＮＡ、前記組み
換え体ＤＮＡを含む形質転換体及び前記形質転換体を用
いるロイシンアミノペプチダーゼの製造法。【効果】本発明によれば、ロイシンアミノペプチダー
ゼ遺伝子を提供し、該遺伝子を用いてロイシンアミノペ
プチダーゼを効率良く得ることができる。また、上記遺
伝子は、蛋白質工学用試料として用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ロイシンアミノペ
プチダーゼ遺伝子、組み換え体ＤＮＡ及びロイシンアミ
ノペプチダーゼの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ロイシンアミノペプチダーゼは、タンパ
ク質の部分加水分解物に作用して、アミノ末端のペプタ
イド結合を分解する加水分解酵素であって、調味料等の
食品の製造において重要な役割を果たしている。中で
も、糸状菌由来のものは調味料生産に適した反応性を示
すことから、その重要性は大きい。しかしながら、従
来、糸状菌由来のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の
構造については全く未知であり、また、該遺伝子の単離
すらされていないのが実状である。このロイシンアミノ
ペプチダーゼは、調味料等の食品の製造等に用いること
ができる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ロイシンア
ミノペプチダーゼ遺伝子を単離し、該遺伝子による形質
転換体を取得するとともに、該形質転換体を培養するこ
とによるロイシンアミノペプチダーゼの製造法を提供す
ることを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、ロ
イシンアミノペプチダーゼ遺伝子を単離することに成功
し、更に、該遺伝子による形質転換体を作成し、形質転
換体によりロイシンアミノペプチダーゼを効率良く製造
する方法を確立し、本発明を完成した。即ち、本発明
は、以下の(ａ)または(ｂ)のタンパク質をコードするロ
イシンアミノペプチダーゼ遺伝子である。 (ａ)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質。 (ｂ)アミノ酸配列(ａ)において1もしくは複数のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するタン
パク質。

【０００５】更に、本発明は、以下の(ａ)または(ｂ)の
ＤＮＡからなるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子。 (ａ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。 (ｂ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつロイシ
ンアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡである。更に本発明は、前記のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入してなることを特徴とする組
み換え体ＤＮＡである。更に、本発明は、前記のロイシ
ンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡにより形質転
換された形質転換体である。更に、本発明は、前記の組
み換え体ＤＮＡにより形質転換された形質転換体であ
る。更に、本発明は、前記の形質転換体を培地に培養
し、培養物からロイシンアミノペプチダーゼを採取する
ことを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼの製造法
である。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
ロイシンアミノペプチダーゼ活性の測定は、例えば、以
下の3種の方法で行なうことができる。［測定法１］ロイシル−グリシル−グリシン（Leu-Gly-
Gly）を基質として用いる測定法この方法は、酵素液中に遊離のアミノ酸が多量に存在す
るとバックグラウンド値が高くなり、不正確になるの
で、その場合には透析や、セントリコン(アミコン社製)
等のスピンカラムによりアミノ酸を除去した酵素液を使
用する必要がある。

【０００７】先ず、以下の各溶液を調製する。 A液：1.05mM Leu-Gly-Gly溶液(25mM HEPES, pH8.0)…反
応時の基質濃度1mM B液：0.4%(W/V) トリニトロベンゼンスルホン酸（TNB
S）水溶液 C液：5%(W/V) Na2B4O7・10H2O水溶液 D液：100mM CuSO4水溶液 E液：1検体当たり250 μlのB液、975 μlのC液と25μl
のD液を混合する

【０００８】（用時調製）次いで、1検体あたり2本の微
量遠沈管に夫々25μl の酵素溶液を入れる。一方の遠沈
管を盲検用として、100℃で5分間煮沸し、酵素を失活さ
せる。夫々の遠沈管に30℃のA液を475 μl加え、撹拌し
た後30℃で10〜60分間酵素反応を行なう。100℃で5分間
煮沸して反応を止め、37℃のE液を625 μl加えて撹拌
し、37℃で25分間保温後、420nmの吸光度を測定する。1
分間に1μmolのLeu-Gly-Glyを遊離する活性を１単位と
すると、活性は、次の式で表される。活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.125×1000)÷(25×T) ［ただし、ΔODは、試料のODから盲検のOD値を引いたも
の、Tは、反応時間（分）］

【０００９】［測定法２］L-ロイシン-p-ニトロアニリ
ド(Leu-pNA)を基質として用いる測定法先ず、以下の各溶液を調製する。 A液：0.1mmolのLeu-pNAを5mlのエタノールに溶解させ
る。ここに、10mlの500mMトリスバッファー(pH8.5)と85
mlの蒸留水を加え、100mlの1mM Leu-pNA溶液とする。 B液：0.1規定塩酸次いで、30μl の酵素溶液を入れた微量遠沈管及び盲検
用の空の微量遠沈管に300 μlのA液を加え、撹拌した
後、30℃で10〜60分間酵素反応を行なう。900 μl のB
液を加え、撹拌し、酵素反応を停止させる。盲検用の遠
沈管に30μl の酵素溶液を加え、撹拌する。400nmの吸
光度を測定する。1分間に1μmolのLeu-pNAを遊離する活
性を１単位とすると、活性は、次の式で表される。活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.69×1000)÷(30×Ｔ）［ただし、ΔＯＤは、試料のODから盲検のOD値を引いた
もの、Tは、反応時間（分）］

【００１０】［測定法３］多数の菌株のロイシンアミノ
ペプチダーゼ産生能を検定するための簡便な活性測定法試薬は、［測定法２］のA液及びB液を使用する。糸状
菌、例えば、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子約1000
個を含む滅菌蒸留水または0.01%(W/V)Tween-20水溶液10
μl を(盲検として、胞子を含まないものについても同
時に行なう)、大豆粉寒天培地［3%(W/V)加熱・加圧膨化
処理した脱脂大豆粉末、1%(W/V) KH2PO4、1.5%寒天末、
pH6.0］上に置いた厚手・8mmφのペーパーディスク(東
洋濾紙社製)に滴下し、30℃で胞子を形成し出すまで
（麹菌の場合48時間程度）培養する。菌体の付着したペ
ーパーディスクを直径10mm以上の試験管に移し、30℃の
A液600 μlを加え、激しく撹拌した後30℃で7〜30分間
程度酵素反応を行なう。B液を600 μl加え、激しく撹拌
し、400nmにおける吸光度を測定する。盲検値の吸光度
を引いたものを任意単位の活性とした。ただし、この方
法は、結果のばらつきが大きいので、1つの菌株につき3
試験以上を並行して行なうことが望ましい。また、比較
したいもの同士は同時に測定する必要がある。糸状菌以
外の生物を用いる場合には、細胞数・培地組成・培養時
間を適宜変更することにより同様にして測定することが
できる。

【００１１】本発明の遺伝子のドナーとしては、例え
ば、アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)等が
挙げられる。次いで、上記微生物を通常の糸状菌の培養
方法( 以下、特開昭48-35094号公報記載の方法と言う)
で培養し、ロイシンアミノペプチダーゼを精製すること
により、ロイシンアミノペプチダーゼを得ることができ
る。得られたロイシンアミノペプチダーゼを、変性条件
下でリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業社製)処
理し、断片化する。上記断片を、例えば、POROS R2/Hプ
レパックドカラム（ベーリンガー・マンハイム社製）等
を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分取
し、数種の断片ペプタイドについてアミノ酸配列を、例
えば、ABI470Aプロテインシーケンサー（パーキンエル
マー社製）を用いて決定する。

【００１２】上記アミノ酸配列をもとに、PCRプライマ
ーを作成する。この際、コドンの縮重を考慮した混合プ
ライマーを用いる。また、4種の塩基全てが縮重してい
る個所については、イノシンを使用することができる。
作成されたプライマーを用いて、遺伝子のドナー、例え
ば、アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM BP-6349)の染
色体DNAを鋳型としたPCRを行なう。アスペルギルス・ソ
ーヤ1-190(FERM BP-6349)の染色体DNAは、例えば、ジョ
アン・ティルバーン(Joan Tilburn)等：ジーン(Gene)、
26、205-221(1983)の方法で得ることができる。PCRは、
例えば、Robocycler Gradient(ストラタ・ジーン社製)
を用いてアニーリング温度を検討する。PCRには、例え
ば、Ex Taq DNAポリメラーゼ（宝酒造社製)を用いる。
増幅されたDNA断片を、ベクターDNA、例えば、pGEM-T E
asyプラスミド(プロメガ社製)等に組み込み、組み換え
体プラスミドを得る。該プラスミド中の挿入DNAの塩基
配列を、例えば、Model4200 DNAシーケンサー(LI-COR社
製) 等を用いて決定し、PCRのプライマー設計に用いた
ペプタイドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列
を両端に有するものを選択する。

【００１３】上記DNA断片を標識し、プラーク・ハイブ
リダイゼーションによりアスペルギルス・ソーヤの染色
体断片を含むファージ・ライブラリーから、目的遺伝子
を含むクローンを単離する。ファージ・ライブラリーの
作成は、例えば、STRATA GENE社のZAP Express Vector
Kitを用いて行なうことができる。DNA断片の標識と、ハ
イブリダイゼーションの検出は、例えば、DIG DNA標識
・検出システム（ベーリンガー・マンハイム社製）等を
用いて行なうことができる。

【００１４】単離されたファージ・クローンから、キッ
トに記載の方法でプラスミドを調製する。プラスミド数
種について、各種制限酵素により断片化し、制限酵素地
図を作成する。制限酵素地図をもとに、挿入断片の一部
ずつを持つサブクローンプラスミドを調製する。サブク
ローンプラスミドについて、前述の方法で塩基配列を決
定する。得られた塩基配列を解析し、配列番号２で示さ
れる塩基配列を決定し、次いでこの遺伝子によってコー
ドされるポリペプタイドのアミノ酸配列、即ち、配列番
号１で示されるアミノ酸配列を決定することができる。

【００１５】そして、配列番号１に示されるアミノ酸配
列において、1もしくは複数、好ましくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されており、かつロイシン
アミノペプチダーゼ活性を有するアミノ酸配列をコード
するロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を得るには、公
知の多くの方法を用いることができる。例えば、遺伝子
に点変異又は欠失変異を生じさせるための周知技術であ
る部位特定変異誘導法；遺伝子を選択的に開裂し、次い
で、選択されたヌクレオチドを除去または付加し、遺伝
子を連結する方法；オリゴヌクレオチド変異誘導法等が
挙げられる。これらのDNAは、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ活性をもたらすポリペプタイドをコードしている蓋
然性が高く、下記のように形質転換し活性を持つものを
選択することができる。

【００１６】本発明のロイシンアミノペプチダーゼ遺伝
子と実質的に同一な遺伝子を取得するためには、配列番
号２の塩基配列を持つDNA又はその相補鎖、又はそれら
の一部を含むプローブによりストリンジェントな条件で
ハイブリダイゼーションし、ロイシンアミノペプチダー
ゼ活性を持つポリペプタイドをコードするものを選択す
ることができる。ここでいう、ストリンジェントな条件
とは、特異的なハイブリッドのみが選択的に形成され、
シグナルが検出されるが、非特異的なハイブリッドは形
成されない条件である。この様な条件は、個々の生物種
により若干異なるが、常法によりハイブリダイゼーショ
ンと洗いの際の塩濃度又は温度をいくつか検討するのみ
で容易に決定することができる。このような条件として
は、例えば、後記実施例１の項目６において特異的なシ
グナルが観察できることから、ハイブリダイゼーション
は、5 ×SSC 、1.0 %(W/V)核酸ハイブリダイゼーション
用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、
0.1 %(W/V) N-ラウロイルサルコシン、0.02 %(W/V)SDS
を用い一晩（８〜１６時間程度）で行ない、洗いは、0.
1×SSC 、0.1%(W/V)SDSを用い、15分間、2 回行なう。
ハイブリダイゼーションと洗いの温度は、45℃以上、好
ましくは52℃以上、更に好ましくは57℃以上である。こ
のような条件でハイブリダイズするようなＤＮＡはロイ
シンアミノペプチダーゼ活性を持つペプタイドをコード
している蓋然性が高いが、ロイシンアミノペプチダーゼ
活性を失うような変異を持つものも含まれる。しかし、
それらについては、形質転換を行なった後に、本発明者
等が開発し前述した測定法３により形質転換体のロイシ
ンアミノペプチダーゼ産生能を測定することにより容易
に取り除くことが可能である。

【００１７】得られたロイシンアミノペプチダーゼ遺伝
子を用いて、公知の方法、例えばイー・シエラ(E. Shie
la)等：モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィクス、218、99-104(1989)記載の方法で、例えば、ア
スペルギルス・ソーヤATCC42251を形質転換する。この
方法では、まず、液体培養した菌体を、例えば Novozym
234( ノボ・ノルディスク社) 等の細胞壁分解酵素で処
理することにより細胞壁を除去したプロトプラストを得
る。続いて、塩化カルシウム及びポリエチレングリコー
ル 4000存在下で、例えばniaD等のマーカー遺伝子を含
むDNAと、目的遺伝子を含むDNAを同時に細胞内に導入す
る。その後、使用したマーカー遺伝子に適した選択培地
に希釈して保温することによりプロトプラストの再生を
行なうと、マーカー遺伝子及び目的遺伝子が夫々宿主細
胞の染色体上に組み込まれた形質転換体を得ることがで
きる。従って、用いるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝
子は、ベクター上に挿入された組み換え体ＤＮＡであっ
てもよいが、染色体ＤＮＡからＰＣＲにより増幅したＤ
ＮＡ断片等の非組み換え体ＤＮＡであっても宿主細胞の
染色体への組み込みが起こるため支障なく形質転換を行
なうことができる。更に、得られた形質転換体につい
て、例えば、［測定法３］を用いてロイシンアミノペプ
チダーゼ生産能の向上したものをスクリーニングするこ
とにより、目的の形質転換体を得ることができる。この
ようにして得られた形質転換体を、例えば、特開昭48-3
5094号公報の方法で培養し、ロイシンアミノペプチダー
ゼを精製することにより、ロイシンアミノペプチダーゼ
を効率良く製造することができる。

【００１８】

【実施例】以下、実施例を挙げて更に詳細に説明する。（実施例１）ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子のクロ
ーニング１．酵素の精製前記方法により麹菌アスペルギルス・ソーヤ1-190(FERM
BP-6349)の培養、ロイシンアミノペプチダーゼの精製
を行ない精製酵素３mgを得た。２．部分アミノ酸配列の決定 ABI470Aプロテインシーケンサー（パーキンエルマー社
製）を用いて精製酵素30ngを試料としてN末端のアミノ
酸配列としてGly Arg Ala Leu Val Ser Pro AspGlu Phe
Proを得た。しかしながら、本酵素は、ペプタイド結合
をN末端から遊離させる活性を有するため、自己消化に
よりN末端が一部削られたものが混入することを避けが
たく、これ以上の配列は得られなかった。

【００１９】そこで、リシルエンドペプチダーゼにより
本酵素を断片化し、内部アミノ酸配列を決定することと
した。この際にも、断片ペプタイドのN末端が残存する
本酵素の活性により削り込まれる問題が生じた。そこ
で、下記のような、本酵素を失活させ、かつ、リシルエ
ンドペプチダーゼが働きうる条件を見い出し、断片化を
行なった。先ず、精製酵素1mgを1%(W/V) SDS、5mM EDTA
を含む50mMトリス緩衝液(pH9.0)0.5ml中で37℃、1.5時
間処理することにより失活させた。ここに0.1mg/mlのリ
シルエンドペプチダーゼ(和光純薬工業社製)を15μl 添
加し、37℃で14時間反応させ、更に、上記リシルエンド
ペプチダーゼ5 μlを添加して37℃で2時間反応させた。
このようにして得られた断片ペプタイドを含む溶液に1M
リン酸カリ緩衝液(pH7.5)55 μlを加え、氷上に30分間
放置したのち、15,000×g 20分間の遠心分離することに
よりSDSを除去した。断片ペプタイド溶液から、カラム
ガードHV13mm（ミリポア社製）を用いて固形分を除去し
た。このようにして調製した断片ペプタイド溶液100 μ
lに終濃度0.1%のトリフルオロ酢酸（以下、TFAと略称す
る。）を加え、POROS R2/Hプレパックドカラム（ベーリ
ンガー・マンハイム社製）により0.1% TFAを含む超純水
〜47.5%アセトニトリル水溶液の勾配で逆相クロマトグ
ラフィー分離した。この際、220nmにおける吸光度を指
標に、ペプタイドのピークを夫々分取した。分取した各
ピークのペプタイド溶液を真空遠心濃縮器により蒸発乾
固し、20μl の20mMリン酸緩衝液(pH8.0)に再溶解し
た。これらのペプタイド数種についてABI470Aプロテイ
ンシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いてアミ
ノ酸配列の決定を行なった。その結果、ピーク5がXaa X
aa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Pro Ser Val Glu Gly
Lys(Xaaは、別のペプタイドの混入により決定できなか
った配列）、ピーク6がGln Pro Gln Val His Leu Trp
…、ピーク11がAsn Ala Val Arg Phe Leu Phe Trp Thr
Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Asn Tyr Tyr Va
l Ser His Leu…となった。

【００２０】３．PCRによるロイシンアミノペプチダー
ゼ遺伝子の一部の取得前項で明らかになった部分アミノ酸配列を用いてPCRプ
ライマーの設計を行なった。ピーク5より、LAP5F: 5’-
GA(C/T)TA(C/T)CCI(A/T)(C/G)IGA(C/T)GTIGA(AG)GGIAA
G-3’、LAP5R: 5’-TTICC(C/T)TCIAC(A/G)TCI(C/G)(A/
T)IGG(A/G)TA(A/G)TC-3’の2種を、ピーク11より、LAP1
1F: 5’-TT(C/T)TGGACIGCIGA(A/G)GA(A/G)TT(C/T)GG-
3’、LAP11R: 5’-CC(A/G)AA(C/T)TC(C/T)TCIGCIGTCCA
(A/G)AA-3’の計4種を作成した。なお、Iは、イノシン
を表す。ジョアン・ティルバーン(Joan Tilburn)等：ジ
ーン(Gene)、26、205-221(1983)の方法により調製した
アスペルギルス・ソーヤ 1-190 FERM BP-6349 のゲノム
DNAをテンプレートとして、上記プライマーを組み合わ
せて、下記のようにPCRを行ない、ロイシンアミノペプ
チダーゼ遺伝子の一部を増幅した。サーモサイクラーと
しては、RoboCycler Gradient96(ストラタ・ジーン社
製)を、PCR試薬は、ExTaq(宝酒造社製)を用いた。

【００２１】0.2ml容量のPCR用チューブ(イナ・オプテ
ィカ、T-02)に滅菌蒸留水33.75 μl、10×バッファー(E
xTaqに付属のもの)5μl 、プライマーDNAの100pmol/μl
溶液2 μl×2種、ゲノムDNAの0.5ug/μl 溶液3 μl、
2.5mM dNTP溶液(宝酒造社製)4μl 及びExTaq DNAポリメ
ラーゼ0.25μl を入れ、混和した後、ミネラルオイル
(シグマ社製)20 μlを滴下しRoboCycler Gradient 96に
セットした。なお、ゲノムDNAは、予め96℃で3分間変性
させた後、氷上で急冷したものを用いた。プライマー
は、LAP5F・LAP11R、LAP5R・LAP11Fの2通りで行なっ
た。RoboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、2)95℃30
秒、3)36〜56℃30秒、4)72℃2分、2)〜4)を45サイク
ル、5)72℃5分のプログラムをセットし、反応を実施し
た。なお、3)については、アニーリングブロックに36〜
58℃のグラジエントをかけて、36、40、44、48、52、56
℃の各温度の位置にチューブを置いた。反応後、5 μl
を0.7%アガロースLO3(宝酒造社製)ゲルで電気泳動し、
増幅産物を確認したところ、LAP5F・LAP11Rのプライマ
ーを用いた反応液では約500bpの産物が、LAP5R・LAP11F
のプライマーを用いた反応液では約1200bpの産物が夫々
主要なものであった。また、最適なアニーリング温度
は、48℃であった。

【００２２】そこで、これらのアニーリング温度48℃の
反応液40μl を2%アガロースゲルで電気泳動し、上記の
2つの増幅産物をゲルから回収した。ゲルからのDNAの回
収にはQIAquick Gel Extraction kit(キアゲン社製)を
用い、25μl の滅菌蒸留水でスピンカラムから溶出させ
た。これらの2種のDNA断片溶液を7 μlずつ用いて、pGE
M-T Easy Vector System II(プロメガ社製)のマニュア
ルに従って、夫々、pGEM-T Easyプラスミド(プロメガ社
製)に組み込み、大腸菌JM109コンピテントセル(キット
に添付のもの)を形質転換した。

【００２３】これらの形質転換体夫々4株から「モレキ
ュラークローニング第２版」(Molecμlar Cloning Seco
nd edition)1.25-1.28 頁、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(1989)の方法に従って組み換え体
プラスミドを調製した。これらのプラスミドについて、
Thermo Sequenaseサイクルシークエンシングキット(ア
マシャム社製)・Model4200 DNAシーケンサー(LI-COR社
製)を用いて塩基配列の決定を行なった。この結果、500
bpの断片を有する組み換え体プラスミド4種のうち、2種
の末端の塩基配列がプライマー設計に用いたアミノ酸配
列をコードするものであり、また、内部の塩基配列は、
上記のアミノ酸配列をもたらす読み枠には終止コドンを
含まないものであった。従って、この断片が目的とする
ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部であることが
推測され、このプラスミドをpCRLAと命名した。

【００２４】４．麹菌ゲノムDNAライブラリーの作成麹菌アスペルギルス・ソーヤ 1-190FERM BP-6349のゲノ
ムDNAを項目３．と同様の方法により調製し、平均塩基
数約10kbpになるようにSau3AIにより限定分解し、10kbp
前後のDNAをアガロースゲル電気泳動、QIAquickによっ
て回収し、ZAPExpress Predigested Gigapack III Clon
ing Kit(ストラタ・ジーン社製)を用いてZAP Expressベ
クターに組み込み、パッケージング、増幅を行ない、ゲ
ノムDNAのλファージライブラリーを作成した。

【００２５】５．DNAプローブの作成先に項目３．で推測されたロイシンアミノペプチダーゼ
遺伝子の部分塩基配列を元に、プライマー2種（FOW-LAP
-A: 5’-AGGGCAAGGTAGCTCTCATCAAGCGTGG-3’、REV-LAP-
A: 5’-GAGAAAGCGCACGGCATTCTTGACGGAG-3’）を作成し
た。LAP5F及びLAP11Rをプライマーとして用い、10ngのp
CRLAをテンプレートとして下記のような条件でPCRを行
ない、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の一部を増幅
した。0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水34.75 μ
l、10×バッファー5 μl、プライマーDNAの100pmol/μl
溶液2 μl×2種、ゲノムDNAの5ng/μl 溶液2 μl、2.5
mMdNTP溶液4 μl及びExTaq DNAポリメラーゼ0.25μl を
入れ、混和した後、ミネラルオイル20μl を滴下しRobo
Cycler Gradient 96にセットした。なお、ゲノムDNA
は、予め96℃で3分間変性させた後、氷上で急冷したも
のを用いた。RoboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、
2)95℃30秒、3)50℃30秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイ
クル、5)72℃2分のプログラムをセットし、反応を実施
した。反応液を1%アガロースゲルで電気泳動し、約500b
pの増幅断片をQIAquick Gel Extractionkit(キアゲン社
製)を用いて回収し、50μl のTEバッファー［10mMトリ
ス、1mM EDTA、pH8.0］で溶出した。次に、プライマー
としてFOW-LAP-A及びREV-LAP-Aを用い、上記増幅断片溶
液の10倍希釈液をテンプレートとして下記のようにPCR
によりジゴキシゲニン(DIG)ラベルされたDNAプローブを
作成した。0.2ml容量のPCR用チューブに滅菌蒸留水37.7
5 μl、10×バッファー5 μl、プライマーDNAの100pmol
/μl 溶液1 μl×2種、テンプレートDNA溶液1 μl、PCR
DIGミックス10倍濃度(ベーリンガー・マンハイム社製)
4μl 及びExTaq DNAポリメラーゼ0.25μl を入れ、混和
した後、ミネラルオイル20μl を滴下しRoboCycler Gra
dient 96にセットした。なお、ゲノムDNAは、予め96℃
で3分間変性させた後、氷上で急冷したものを用いた。R
oboCycler Gradient 96に、1)95℃30秒、2)95℃30秒、
3)62℃30秒、4)72℃40秒、2)〜4)を45サイクル、5)72℃
2分のプログラムをセットし、反応を実施した。反応液
よりエタノール沈殿によって増幅断片を回収し、50μl
のTEバッファーに溶解してDIGラベルプローブdLAP-Aと
した。

【００２６】６．プラーク・ハイブリダイゼーションに
よるロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の検索項目４．で調製した麹菌ゲノムDNAのλファージライブ
ラリーから項目５．のプローブを用いてプラーク・ハイ
ブリダイゼーションによってロイシンアミノペプチダー
ゼ遺伝子を検索した。ライブラリー作成に用いたキット
のマニュアルに従い、5枚の寒天培地に１枚あたり約5×
10³個のプラークを形成させた。これらの寒天培地上の
プラークからHyBond-N+ナイロントランスファーメンブ
レン(アマシャム社製)に、メンブレンの説明書に従って
DNAをトランスファーした。なお、この際、非特異のシ
グナルを排除するために、1枚の寒天培地につき2枚のメ
ンブレンにトランスファーを行なった。

【００２７】上記メンブレンについて、項目５．で作成
したジゴキシゲニンラベルDNAプローブ、DIGシステム
(ベーリンガー・マンハイム社製)を用いて「DIGシステ
ムを用いてハイブリダイゼーションを行なうためのユー
ザーガイド」37-40頁、ベーリンガー・マンハイム社(19
96)に従ってハイブリダイゼーション・検出を行なっ
た。具体的には、ファージライブラリーのDNAが吸着し
た上記メンブレン10枚に標準プレハイブリダイゼーショ
ンバッファー[5×SSC, 1%(W/V)核酸ハイブリダイゼーシ
ョン用ブロッキング試薬(ベーリンガー・マンハイム社
製), 0.1%(W/V) N-ラウロイルサルコシン, 0.02%(W/V)
SDSを加え、穏やかに振盪しながら57℃で1時間放置し
た。

【００２８】ここに、項目５．で作成したdLAP-Aプロー
ブを100℃で10分間煮沸した後、氷水で急冷したものを
加え、穏やかに振盪しながら57℃で16時間放置して、ハ
イブリダイズさせた。メンブレンを新しい容器に移し、
2×洗浄液[2×SSC, 0.1%(W/V) SDS]で室温で5分ずつ2回
洗浄した。続いて、0.1×洗浄液[2×SSC, 0.1%(W/V)SD
S]で57℃で15分ずつ2回洗浄した。次いで、メンブレン
をバッファー1[0.1Mマレイン酸, 0.15M NaCl, pH7.5]と
1分間平衡化し、新しい容器に移してから、バッファー2
[バッファー1、1%(W/V) 核酸ハイブリダイゼーション用
ブロッキング試薬]を加え、室温で30分間穏やかに振盪
した。バッファー2を捨て、バッファー2で1万倍に希釈
したアルカリフォスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗
体を加え、室温で30分間穏やかに振盪した。抗体溶液を
捨て、清潔な容器中でバッファー1＋0.3%ツイーン20で1
5分ずつ2回洗浄した。次いで、メンブレンをバッファー
3[0.1Mトリス pH9.5, 0.1M NaCl, 50mM MgCl2]と2分間
平衡化した。次いで、適当な大きさに切ったハイブリダ
イゼーションバッグ中にメンブレンを1枚ずつ置き、100
倍希釈したCDP-Star溶液(ベーリンガー・マンハイム社
製)を0.4mlずつ滴下し、全体に均一に行き渡らせた後、
余分な溶液を除去し、シーラーで密閉した。これらのメ
ンブレンを37℃で10分間放置した後、富士直接撮影用フ
ィルムRX-U(富士写真フィルム社製)に1〜10分間密着し
た後、フィルムを現像した。同一の寒天培地上のプラー
クからトランスファーした2枚のメンブレンで同じ位置
に認められたシグナルが5個所あり、これらをA〜Eの陽
性クローンとした。寒天培地上のこれらのシグナルに対
応する位置から、軟寒天部分直径5mmを微量遠沈管に取
り、500 μlのSMバッファー[10mM NaCl, 0.2%(W/V) MgS
O4・7H20, 50mMトリスpH7.5, 0.01%ゼラチン]、クロロホ
ルム20μl を加え、4℃で1晩放置した。寒天培地上で、
これらのファージを1枚あたり約100個になるように調節
してプラークを形成させた。これらのプラークを上記の
方法でメンブレンにトランスファーし、dLAP-Aプローブ
でハイブリダイゼーションを行なった。Aのシグナルの
位置から得たファージ液を用いたものでは、多数の強い
シグナルが観察された。Bではシグナルは観察されず、
C, D, Eでは数個のシグナルが観察された。そこで、A,
C, D, Eの４つのシグナルについて、上記のようにプラ
ークを回収し、再度プラーク・ハイブリダイゼーション
を行なったところ、A, Dは全てのプラークが陽性であっ
たので、夫々単一のプラークを回収した。これらのファ
ージクローンについて、キットの説明書に従い、in vit
ro excisionを行い、夫々プラスミドpLZA及びpLZDとし
て回収した。

【００２９】７．ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子の
解析前項で得られた２つのプラスミドについて解析を行なっ
た。先ず、これらのプラスミドをテンプレートとして、
PCRを行なった。プライマーとして、FOW-LAP-A, REV-LA
P-A, ベクター上のクローニングサイトの両側のプライ
マー、F: 5’-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3’, R: 5’-
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’を次のような組み合わせ
で用いた。 a) FOW-LAP-A, F b) REV-LAP-A, F c) FOW-LAP-A, R d) REV-LAP-A, R

【００３０】PCRの条件は、72℃での伸長反応を8分間に
した以外はdLAP-Aを調製したときと同様である。PCR産
物をアガロースゲル電気泳動したところ、pLZAをテンプ
レートとしたものではa)で約2.1kbpのバンドが、d)で約
4.1kbpのバンドが観察され、pLZDをテンプレートとした
ものではd)で約2kbpのバンドが観察された。次いで、常
法によりこれらのプラスミドを各種制限酵素で切断し、
アガロースゲル電気泳動し、大まかな制限酵素地図を作
成し、PCRの結果と合わせて、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ遺伝子のおおよその位置を推定した(図１)。その結
果、pLZA及びpLZDは、ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝
子を含む同一のDNA 断片を含むことが推測された。

【００３１】そこで、pLZA上のDNA断片を適宜サブクロ
ーニングし、項目３．と同様の方法で塩基配列の決定を
行なった。また、この方法で決定できなかった配列につ
いては、Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready R
eaction Kit(パーキンエルマー社製)、Moel373Aシーク
エンサー(パーキンエルマー社製)を用いて決定した。塩
基配列は、配列番号2の通りであった。この塩基配列に
おいて、塩基番号67-171については、その両端の配列
と、精製ロイシンアミノペプチダーゼのN末端配列か
ら、イントロンであることが判った。配列番号2の塩基
番号1-66, 172-1640を結合した配列から翻訳されるポリ
ペプタイドのアミノ酸配列と、精製ロイシンアミノペプ
チダーゼのＮ末端配列からマチュアーなロイシンアミノ
ペプチダーゼのアミノ酸配列を決定し、配列番号１とし
た。配列番号１のアミノ酸配列は、N末端に、精製した
ロイシアミノペプチダーゼのN末端配列を、内部に項目
２．で決定したロイシンアミノペプチダーゼの内部配列
全てを含むことからマチュアーなロイシンアミノペプチ
ダーゼのアミノ酸配列であり、pLZAはロイシンアミノペ
プチダーゼ遺伝子が組み込まれたベクターDNAであると
結論できる。

【００３２】（実施例２）ロイシンアミノペプチダーゼ
遺伝子による形質転換体の取得先ず、イー・シエラ(E. Shiela)等：モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティクス、218、99-104(198
9)記載の方法で、宿主として使用するアスペルギルス・
ソーヤATCC42251から、niaD欠損株を取得した。ロイシ
ンアミノペプチダーゼ遺伝子が組み込まれたベクターDN
AであるpLZAプラスミド、マーカーとして使用するniaD
遺伝子が組み込まれたpSTA14プラスミド(イー・シエラ
等、前出)をQIAGEN Plasmid Maxi Kit(キアゲン社製)を
用いて大量調製した。

【００３３】これらのプラスミドを用いて、先に得たア
スペルギルス・ソーヤATCC42251 のniaD欠損変異株をイ
ー・シエラ等(前出)記載の方法で形質転換し、最少培地
上に25個の形質転換体コロニーを得た。得られた形質転
換体について、前述の［測定法３］によりロイシンアミ
ノペプチダーゼ産生能の検定を行なった。その結果、ロ
イシンアミノペプチダーゼ産生能が宿主株と同程度、少
し向上したもの、大きく向上したものを選択し、夫々、
TFLW14、TFLW5及び、TFLW22と命名した。なお、得られ
たアスペルギルス・ソーヤ(TFLW22)は、工業技術院生命
工学工業技術研究所にFERM BP-6348として寄託されてい
る。

【００３４】宿主株及び上記形質転換体3株について、
ゲノムDNAを項目４．で述べた方法で調製し、制限酵素S
alIで切断し、常法によりHyBond-N+ナイロントランスフ
ァーメンブレン(アマシャム社製)にブロッティングし
た。このメンブレンをdLAP-Aをプローブとして、実施例
１の項目６．に記載の方法でハイブリダイゼーション
し、検出した。その結果、これらの株におけるロイシン
アミノペプチダーゼ遺伝子のコピー数は、宿主株で1、T
FLW14で1、TFLW5で2-3、TFLW22でおよそ10以上であるこ
とが判った。

【００３５】（実施例３）形質転換体によるロイシンア
ミノペプチダーゼの製造小麦ふすま2.78g及び蒸留水2.22mlを混合し、150ml容量
の三角フラスコに入れ、121℃で50分間オートクレーブ
処理し、室温まで放冷後、宿主株及び前項の3種の形質
転換体の胞子10⁶個を夫々接種した。30℃で24時間放置
した後、三角フラスコを激しく振盪して内容物を小さい
粒子に砕き、30℃で更に48時間放置して菌体を生育させ
た。そこへ、蒸留水25mlを加えて、激しく撹拌し、室温
で3時間放置して酵素を抽出することにより酵素液を得
た。

【００３６】アミノペプチダーゼの活性を測定するため
にこの酵素液から遊離アミノ酸及び低分子ペプタイドを
除去した。具体的には、セントリコン-10(アミコン社
製) に酵素液2mlを入れ、3000×gで遠心分離し、液量が
0.5mlになったら1.5mlの25mM HEPES緩衝液pH7.0を加
え、更に、3000×gで遠心分離することを3回繰り返し
た。回収した酵素液を25mM HEPES緩衝液(pH7.0)で2mlに
容量を調整した。こうして得られた酵素液試料につい
て、Leu-Gly-Glyを基質としたロイシンアミノペプチダ
ーゼ活性測定を行なった(表１)。Leu-Gly-Gly活性は、
宿主株の活性を1とすると、TFLW14が約1.0、TFLW5が約
2.1、TFLW22が約4.9であった。つまり、ロイシンアミノ
ペプチダーゼ遺伝子を含むベクターによって形質転換さ
れた形質転換体であるTFLW22を生育させることにより、
宿主株に比べて効率良くロイシンアミノペプチダーゼを
製造することが出来た。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、本発明ロイシンアミノ
ペプチダーゼ遺伝子の組み込まれた組み換え体DNAを含
む、例えば、微生物を培地に培養することにより、ロイ
シンアミノペプチダーゼを効率良く得ることができる。
また、上記遺伝子は、蛋白質工学用試料として用いるこ
とができ、本発明は、産業上極めて有用なものである。

【００３９】

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：481 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：蛋白質配列： Gly Arg Ala Leu Val Ser Pro Asp Glu Phe Pro Glu Asp Ile Gln Leu 1 5 10 15 Glu Asp Leu Leu Glu Gly Ser Gln Gln Leu Glu Asp Phe Ala Tyr Ala 20 25 30 Tyr Pro Glu Arg Asn Arg Val Phe Gly Gly Lys Ala His Asp Asp Thr 35 40 45 Val Asn Tyr Leu Tyr Lys Glu Leu Lys Lys Thr Gly Tyr Tyr Asp Val 50 55 60 Tyr Lys Gln Pro Gln Val His Leu Trp Ser Asn Ala Asp Gln Thr Leu 65 70 75 80 Lys Val Gly Asp Glu Glu Ile Glu Ala Lys Thr Met Thr Tyr Ser Pro 85 90 95 Ser Val Glu Val Thr Ala Asp Val Ala Val Val Lys Asn Leu Gly Cys 100 105 110 Ser Glu Ala Asp Tyr Pro Ser Asp Val Glu Gly Lys Val Ala Leu Ile 115 120 125 Lys Arg Gly Glu Cys Ala Phe Gly Asp Lys Ser Val Leu Ala Ala Lys 130 135 140 Ala Lys Ala Ala Ala Ser Ile Val Tyr Asn Asn Val Ala Gly Ser Met 145 150 155 160 Ala Gly Thr Leu Gly Ala Ala Gln Ser Asp Lys Gly Pro Tyr Ser Ala 165 170 175 Ile Val Gly Ile Ser Leu Glu Asp Gly Gln Lys Leu Ile Lys Leu Ala 180 185 190 Glu Ala Gly Ser Val Ser Val Asp Leu Trp Val Asp Ser Lys Gln Glu 195 200 205 Asn Arg Thr Thr Tyr Asn Val Ile Ala Gln Thr Lys Gly Gly Asp Pro 210 215 220 Asn Asn Val Val Ala Leu Gly Gly His Thr Asp Ser Val Glu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Gly Ile Asn Asp Asp Gly Ser Gly Ile Ile Ser Asn Leu Val Val 245 250 255 Ala Lys Ala Leu Thr Gln Tyr Ser Val Lys Asn Ala Val Arg Phe Leu 260 265 270 Phe Trp Thr Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Asn Tyr Tyr Val 275 280 285 Ser His Leu Asn Ala Thr Glu Leu Asn Lys Ile Arg Leu Tyr Leu Asn 290 295 300 Phe Asp Met Ile Ala Ser Pro Asn Tyr Ala Leu Met Ile Tyr Asp Gly 305 310 315 320 Asp Gly Ser Ala Phe Asn Gln Ser Gly Pro Ala Gly Ser Ala Gln Ile 325 330 335 Glu Lys Leu Phe Glu Asp Tyr Tyr Asp Ser Ile Asp Leu Pro His Ile 340 345 350 Pro Thr Gln Phe Asp Gly Arg Ser Asp Tyr Glu Ala Phe Ile Leu Asn 355 360 365 Gly Ile Pro Ala Gly Gly Leu Phe Thr Gly Ala Glu Gly Ile Met Ser 370 375 380 Glu Glu Asn Ala Ser Arg Trp Gly Gly Gln Ala Gly Val Ala Tyr Asp 385 390 395 400 Ala Asn Tyr His Ala Val Gly Asp Asn Met Thr Asn Leu Asn His Glu 405 410 415 Ala Phe Leu Ile Asn Ser Lys Ala Thr Ala Phe Ala Val Ala Thr Tyr 420 425 430 Ala Asn Asp Leu Ser Ser Ile Pro Lys Arg Asn Thr Thr Ser Ser Leu 435 440 445 His Arg Arg Ala Arg Thr Met Arg Pro Phe Gly Lys Arg Ala Pro Lys 450 455 460 Thr His Ala His Val Ser Gly Ser Gly Cys Trp His Ser Gln Val Glu 465 470 475 480 Ala 481

【００４０】配列番号：２配列の長さ：１６４０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：アスペルギルス・ソーヤ(Aspergillus sojae)１-190 株名：FERM BP-6349 配列： ATGAGGTCGC TTTTATGGGC TTCGTTGCTT TCGGGGGCGT TGGCTGGGAG GGCGCTTGTT 60 TCGCCGGTTC GTTTTTTTCT TCTTTTCTTT GCGATTCTGG TCTTTTTTGA TTGCTTTTCT 120 TGAGCTTGGG TGTTAAGTGT TGAGTGTTGA CTGAGCTAAT GTTATGTCTA GGATGAGTTC 180 CCAGAGGATA TCCAGTTGGA AGATCTGCTG GAAGGATCCC AACAGCTCGA GGACTTTGCC 240 TATGCCTACC CCGAGCGCAA TCGCGTCTTT GGTGGTAAAG CCCACGACGA CACGGTCAAC 300 TACCTCTACA AGGAGCTGAA GAAGACTGGC TACTACGATG TCTACAAGCA GCCCCAGGTC 360 CACCTGTGGA GCAATGCCGA CCAGACGCTC AAGGTGGGCG ACGAGGAAAT CGAGGCGAAG 420 ACCATGACCT ATAGTCCCAG CGTCGAAGTA ACTGCCGATG TAGCCGTCGT CAAGAACCTG 480 GGATGCAGTG AGGCGGATTA TCCATCCGAT GTCGAGGGCA AGGTAGCTCT CATCAAGCGT 540 GGAGAATGTG CGTTCGGCGA CAAGTCGGTT CTCGCTGCCA AAGCCAAGGC CGCGGCTTCG 600 ATTGTCTATA ACAATGTGGC AGGATCCATG GCAGGCACCC TTGGCGCGGC GCAGAGTGAC 660 AAGGGACCGT ATTCGGCCAT TGTCGGTATC AGCTTGGAGG ATGGCCAGAA GCTGATCAAG 720 CTTGCTGAGG CTGGATCGGT ATCTGTGGAT CTGTGGGTGG ATAGCAAGCA GGAGAACCGT 780 ACGACGTATA ACGTTATCGC GCAGACGAAG GGCGGCGATC CGAACAATGT CGTCGCGCTG 840 GGTGGCCACA CTGACTCGGT CGAGGCGGGC CCTGGTATCA ATGACGATGG CTCGGGCATT 900 ATTAGCAACC TGGTCGTTGC CAAAGCGCTG ACGCAGTACT CCGTCAAGAA TGCCGTGCGC 960 TTTCTCTTCT GGACGGCCGA GGAGTTCGGT CTCCTGGGCA GCAACTACTA CGTCTCCCAT 1020 CTGAATGCCA CCGAGCTGAA CAAGATCAGA CTGTACCTGA ACTTCGACAT GATCGCCTCG 1080 CCCAACTACG CCCTCATGAT CTATGACGGT GACGGATCGG CGTTCAACCA GAGCGGACCG 1140 GCCGGATCCG CCCAGATCGA GAAACTGTTC GAGGACTACT ACGACTCCAT CGACTTGCCT 1200 CATATCCCGA CCCAGTTCGA CGGACGTTCC GATTACGAGG CCTTTATCCT GAACGGCATT 1260 CCGGCCGGTG GACTCTTCAC GGGCGCCGAG GGCATCATGT CCGAAGAGAA CGCAAGCCGT 1320 TGGGGAGGTC AAGCCGGCGT GGCCTACGAC GCCAACTACC ACGCCGTGGG AGACAACATG 1380 ACCAACCTCA ACCATGAAGC CTTCCTGATC AACTCCAAAG CCACAGCCTT CGCCGTCGCC 1440 ACCTACGCCA ACGACCTATC CTCGATCCCC AAACGGAATA CCACATCCTC TCTGCACCGA 1500 CGAGCCCGCA CCATGCGACC ATTCGGGAAA AGAGCTCCGA AGACGCACGC TCACGTATCA 1560 GGATCCGGAT GCTGGCATTC TCAAGTTGAG GCATAGATCG ATAGGTAAAG ACCGACTCTT 1620 ACATAGTAAG GCCTGTAGGA 1640

【図面の簡単な説明】

【図１】ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA
断片の制限酵素地図を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｒ 1:66）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の(ａ)または(ｂ)のタンパク質をコ
ードするロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子。 (ａ)配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質。 (ｂ)アミノ酸配列(ａ)において1もしくは複数のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつロイシンアミノペプチダーゼ活性を有するタン
パク質。
【請求項２】以下の(ａ)または(ｂ)のＤＮＡからなる
ロイシンアミノペプチダーゼ遺伝子。 (ａ)配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ。 (ｂ)(ａ)の塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつロイシ
ンアミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質をコード
するＤＮＡ。
【請求項３】請求項１または２記載のロイシンアミノ
ペプチダーゼ遺伝子をベクターＤＮＡに挿入してなるこ
とを特徴とする組み換え体ＤＮＡ。
【請求項４】請求項１または２記載のロイシンアミノ
ペプチダーゼ遺伝子を含むＤＮＡにより形質転換された
形質転換体。
【請求項５】請求項３記載の組み換え体ＤＮＡにより
形質転換された形質転換体。
【請求項６】請求項４または５記載の形質転換体を培
地に培養し、培養物からロイシンアミノペプチダーゼを
採取することを特徴とするロイシンアミノペプチダーゼ
の製造法。