DE69923255T2

DE69923255T2 - Leucinaminopeptidase Gen

Info

Publication number: DE69923255T2
Application number: DE69923255T
Authority: DE
Inventors: Genryou Umitsuki; Keietsu Abe
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1998-06-12
Filing date: 1999-06-11
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2019-06-12
Also published as: JP3727780B2; EP0967286B1; EP0967286A2; DK0967286T3; JPH11346777A; US6127161A; DE69923255D1; EP0967286A3

Description

TECHNISCHES GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Leucin-Aminopeptidase-Gen, rekombinante DNA und ein Verfahren zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Leucin-Aminopeptidase ist eine Hydrolase, die auf ein partiell hydrolysiertes Protein einwirkt, wodurch -eine Peptidbindung am N-Terminus des Proteins gespalten wird, und dieses Enzym spielt bei der Herstellung von Nahrungsmittelprodukten, wie beispielsweise Würzmitteln, eine wichtige Rolle. Im Besonderen ist von Fadenpilzen stammende Leucin-Aminopeptidase äußert wichtig, da sie eine geeignete Reaktivität zur Erzeugung von Würzmitteln an den Tag legt.
Die WO 98/51804 und die WO 98/51163 offenbaren eine Leucin-Aminopeptidase aus Aspergillus oryzae, eine für diese kodierende Nucleinsäuresequenz und ein Verfahren zur Bildung des Enzyms.
Bis heute war jedoch die Struktur des Leucin-Aminopeptidase-Gens aus Fadenpilzen zur Gänze unbekannt. Das Gen wurde bisher noch nicht isoliert.
Somit besteht das Ziel der vorliegenden Erfindung in der Isolierung eines Leucin-Aminopeptidase-Gens zum Erhalt einer mit diesem Gen hergestellten Transformante und der Bereitstellung eines Verfahrens zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase durch die Kultur der Transformante.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben nun erfolgreich ein Leucin-Aminopeptidase-Gen isoliert, unter Verwendung des Gens eine Transformante hergestellt und ein Verfahren zur effizienten Bildung der Leucin-Aminopeptidase durch die Transformante entwickelt.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung ist ein Leucin-Aminopeptidase-Gen bereitgestellt, das für ein Protein mit der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.
Einem weiteren Aspekt der Erfindung gemäß ist ein Leucin-Aminopeptidase-Gen bereitgestellt, das DNA mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.
In einem anderen Aspekt der Erfindung ist rekombinante DNA bereitgestellt, in der das oben beschriebene Leucin-Aminopeptidase-Gen in eine Vektor-DNA insertiert worden ist.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung ist eine Wirtszelle bereitgestellt, welche mit DNA, die das oben beschriebene Leucin-Aminopeptidase-Gen enthält, transformiert ist. Die Wirtszelle ist eine so genannte Transformante.
Die vorliegende Erfindung stellt zudem eine mit der obgenannten rekombinanten DNA transformierte Wirtszelle bereit.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Leucin-Aminopeptidase bereit, welches die Schritte des Kultivierens der oben beschriebenen Wirtszelle in einem Medium und des Gewinnes von Leucin-Aminopeptidase aus dem Medium umfasst.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine Abbildung der Restriktionskarten von DNA-Fragmenten, die ein Leucin-Aminopeptidase-Gen enthalten.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird hierin die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
Die Leucin-Aminopeptidase-Aktivität kann beispielsweise durch ein beliebiges der folgenden drei Verfahren bestimmt werden.
Verfahren 1: Messung unter Verwendung von Leucyl-Glycyl-Glycin (Leu-Gly-Gly) als Substrat
Dieses Verfahren ist oft ungenau, wenn eine große Menge an freien Aminosäuren in einer Enzymlösung gegenwärtig sind, die einen hohen Hintergrund erzeugen. In diesem Fall müssen die freien Aminosäuren durch Dialyse oder mithilfe einer Schleudersäule; wie beispielsweise Centricon (Amicon), aus der Enzymlösung entfernt werden.
Zunächst werden die folgenden Lösungen hergestellt.

Lösung A: eine Lösung von 1,05 mM Leu-Gly-Gly in 25 mM HEPES, pH-Wert 8,0 (Substratkonzentration nach Reaktion: 1 mM)
Lösung B: eine wässrige Lösung von 0,4 % (Gew./Vol.) Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS)
Lösung C: eine wässrige Lösung von 5 % (Gew./Vol.) Na₂B₄O₇·10H₂O
Lösung D: eine wässrige Lösung von 100 mM CuSO₄
Lösung E: ein Gemisch aus 250 μl der Lösung B, 975 μl der Lösung C und 25 μl der Lösung D pro Probe (hergestellt bei Verwendung)

Danach werden zwei Mikrozentrifugenröhrchen pro Probe mit jeweils 25 μl der Enzymlösung befüllt. Eines der beiden Röhrchen wird 5 min lang auf 100 °C erhitzt, um das Enzym für die Verwendung als Blindversuchsprobe zu inaktivieren. Jedem Mikrozentrifugenröhrchen werden (bei 30 °C) 475 μl der Lösung A zugesetzt und das Gemisch vor der Durchführung der Enzymreaktion 10 – 60 min lang bei 30 °C gerührt. Die Reaktion wird durch 5-minütiges Erhitzen auf 100 °C beendet. Dem Reaktionsgemisch werden (bei 37 °C) 625 μl der Lösung E zugesetzt und das Gemisch gerührt. Nachdem das Gemisch 25 min lang bei 37 °C gehalten wurde, wird die Extinktion bei 420 nm gemessen. Unter der Maßgabe, dass eine Einheit der Aktivität des Freisetzens von 1 μlmol an Leu pro min aus Leu-Gly-Gly entspricht, kann die Leucin-Aminopeptidase-Aktivität durch die folgende Gleichung berechnet werden: Aktivität (Einheit/ml) = (ΔOD × 0,125 × 1.000)/(25 × T),worin ΔOD durch Subtrahieren eines OD-Werts der Blindversuchsprobe von einem OD-Wert der Versuchsprobe erhalten wird und T die Reaktionszeit (in min) ist.
Verfahren 2: Messung unter Verwendung von L-Leucin-p-Nitroanilid (Leu-pNA) als Substrat
Zunächst werden die folgenden Lösungen hergestellt.

Lösung A: 100 ml einer 1-mM-Leu-pNA-Lösung, die durch Lösen von 0,1 mmol Leu-pNA in 5 ml Ethanol und darauf folgendes Zusetzen von 10 ml eines 500-mM-Tris-Puffers (pH-Wert 8,5) und 85 ml destilliertem Wasser erhalten wurde
Lösung B: 0,1 N HCl

Dann werden ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 30 μl der Enzymlösung enthält, und ein leeres Mikrozentrifugenröhrchen für den Blindversuch jeweils mit 300 μl der Lösung A befüllt und der Inhalt gerührt, bevor die Enzymreaktion 10 – 60 min lang bei 30 °C durchgeführt wird. 900 μl der Lösung B werden zugesetzt und das Gemisch gerührt, um die Enzymreaktion zu beenden. Dem Mikrozentrifugenröhrchen für den Blindversuch werden 30 μl der Enzymlösung zugesetzt und das Gemisch gerührt. Die Extinktion wird bei 400 nm ermittelt. Unter der Maßgabe, dass eine Einheit der Aktivität des Freisetzens von 1 μlmol an Leu pro min aus Leu-pNA entspricht, kann die Leucin-Aminopeptidase-Aktivität durch die folgende Gleichung berechnet werden: Aktivität (Einheit/ml)=(ΔOD × 0,69 × 1.000)/(30 × T),worin ΔOD durch Subtrahieren eines OD-Werts der Blindversuchsprobe von einem OD-Wert der Versuchsprobe erhalten wird und T die Reaktionszeit (in min) ist.
Verfahren 3: Einfacher Versuch zum Nachweis der Fähigkeiten verschiedener Stämme zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase
Die Lösungen A und B aus Verfahren 2 werden als Reagenzien eingesetzt.
10 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser oder eine wässrige Lösung von 0,01 (Gew./Vol.) Tween 20, das/die etwa 1.000 Sporen eines Fadenpilzes, z.B. Koji-Schimmelpilz Aspergillus sojae, enthält, wird auf eine dicke Papierplatte (⌀ 8mm); Toyo Roshi Co., Ltd.) aufgebracht, die auf einem Sojabohnenpulver-Agarmedium [3 % (Gew./Vol.) entfettetem Sojabohnenpulver, das durch Quellen unter Wärme und Druck erhalten wurde, 1 % (Gew./Vol.) KH₂PO₄, 1,5 % Agarpulver, pH-Wert 6,0] aufliegt. Ein Blindversuch wird auf dieselbe Weise durchgeführt, mit der Ausnahme, dass keine Sporen enthalten sind. Diese werden nun bei 30 °C kultiviert, bis die Sporenbildung einsetzt (im Fall von Koji etwa 48 Stunden lang). Jede der Papierplatten mit der Zelle wird in ein Reagenzglas (Durchmesser von 10 mm oder mehr) eingebracht, welchem bei 30 °C 600 μl der Lösung A zugesetzt werden. Das Gemisch wird daraufhin gründlich gerührt, bevor die Enzymreaktion für 7 – 30 min bei 30 °C durchgeführt wird. Danach werden dem Reaktionsgemisch 600 ml der Lösung B zugesetzt und dieses kräftig gerührt, wonach die Extinktion bei 400 nm ermittelt wird. Die willkürlich gewählte Einheit der Leucin-Aminopeptidase-Aktivität wird durch Subtrahieren der Extinktion der Blindversuchsprobe von der der Versuchsprobe ermittelt. Dieses Verfahren erzielt jedoch stark variierende Ergebnisse, und es ist wünschenswert, drei oder mehr Versuche pro Stamm nebeneinander durchzuführen. Auch sollten Stämme, die miteinander verglichen werden sollen, gleichzeitigen Versuchen unterzogen werden. Wird anstelle der Fadenpilze ein anderer Organis mus verwendet, so kann dieser durch Anpassen der Anzahl der Zellen, der Mediumzusammensetzung und der Kultivierungszeit auf ähnliche Weise getestet werden.
Der Spender des Gens der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349) oder dergleichen.
Die obgenannte Mikroorganismen können gemäß einem allgemeinen Verfahren zur Kultivierung von Fadenpilzen (das sich auf das in der JP-A 48-35094 beschriebene Verfahren bezieht) kultiviert werden, um Leucin-Aminopeptidase herzustellen und zu reinigen.
Die so erhaltene Leucin-Aminopeptidase wird unter Denaturierungsbedingungen mit einer Lysylendpeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) fragmentiert. Die Fragmente werden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie beispielsweise unter Verwendung einer vorgepackten Säule vom Typ POROS R2/H (Boehringer Mannheim) getrennt, um die Aminosäuresequenzen der getrennten Peptidfragmente beispielsweise unter Verwendung des Proteinsequenzanalysators ABI470A (Perkin-Elmer) zu sequenzieren.
Auf der Grundlage der ermittelten Aminosäuresequenzen werden PCR-Primer hergestellt, wobei die Degeneration des Codons berücksichtigt wird, und werden als Primergemische eingesetzt. Sind alle vier Basen degeneriert, so kann Inosin verwendet werden. Eine PCR wird unter Verwendung der hergestellten Primer mit chromosomaler DNA des Donors (z.B. Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349)) als Matrize durchgeführt. Die chromosomale DNA von Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349) kann gemäß einem Verfahren von Joan Tilburn et al., Gene 26, 205 – 211 (1983), erhalten werden. Die Anellierungstemperatur für die PCR wird unter Verwendung eines Robocycler Gradient (Stratagene) bestimmt. Beispielsweise kann eine Ex-Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo, Co. Ltd., Kyoto, Japan) für die PCR verwendet werden. Die amplifizierten DNA-Fragmente werden unabhängig voneinander in eine Vektor-DNA, beispielsweise ein pGEM-T Easy Plasmid (Promega), insertiert, um rekombinante Plasmide zu erhalten. Die Nucleotidsequenzen der in die Plasmide insertierten DNA werden beispielsweise unter Verwendung eines DNA-Sequenzanalysators vom Modell 4200 (Li-COR Inc.) oder dergleichen bestimmt, um DNA, die an ihren beiden Enden Nucleotidsequenzen aufweisen, welche korrekt für die Aminosäuresequenzen der für die Erstellung der PCR-Primer verwendeten Peptide kodieren, auszuwählen.
Das ausgewählte DNA-Fragment wird markiert und zur Isolierung von Klonen mit dem Gen von Interesse durch Plaque-Hybridisierung aus einer Phagenbibliothek, die chromosomale Fragmente von Aspergillus sojae enthält, verwendet. Die Phagenbibliothek kann beispielsweise unter Verwendung eines „ZAP-Express-Vector"-Sets (Stratagene) erstellt werden. Die Markierung des DNA-Fragments und der Nachweis der Hybridisierung kann beispielsweise unter Einsatz eines DIG-DNA-Markierungs/Nachweissystems (Boehringer Mannheim) durchgeführt werden.
Aus den isolierten Phagenklonen werden gemäß den dem Set beigefügten Anleitungen Plasmide hergestellt. Die verschiedenen Plasmide werden mit Restriktionsenzymen fragmentiert, um eine Restriktionskarte zu erstellen. Auf der Grundlage der Restriktionskarte werden Subklonierungsplasmide, die die jeweiligen Insertfragmente enthalten, hergestellt und deren Nucleotidsequenzen so wie oben beschrieben bestimmt. Die so bestimmten Nucleotidsequenzen werden analysiert, um zunächst die für das Polypeptid von Interesse kodierende Nucleotidsequenz (gezeigt in Seq.-ID Nr. 2) und dann die Aminosäuresequenz für dieses, d.h. die in Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Aminosäuresequenz, zu ermitteln.
Verschiedene bekannte Verfahren können zum Erhalt von Genen herangezogen werden, welche für Leucin-Aminopeptidase-Varianten mit Leucin-Aminopeptidase-Aktivität und mit einer oder mehreren, vorzugsweise mehreren, Deletionen, Substitutionen oder Additionen von Aminosäuren in der in Seq.-ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz kodieren. Für diese Zwecke einsetzbare Verfahren umfassen beispielsweise ein bekanntes Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese für die Punktmutation oder Deletionsmutation von Genen; ein Verfahren, das die selektive Spaltung von Genen, die Entfernung oder das Hinzufügen von ausgewählten Nucleotiden oder die Ligation von Genen umfasst; und eine oligonucleotidgerichtete Mutagenese.
Es ist höchst wahrscheinlich, dass die so erhaltene DNA für ein Polypeptid kodiert, das für die Leucin-Aminopeptidase-Aktivität verantwortlich ist. Unter Verwendung der DNA kann eine Transformation durchgeführt werden, und die Resultante kann für die Aktivität von Interesse gemäß so wie nachstehend beschrieben ausgewählt werden.
Gene, die im Wesentlichen mit dem Leucin-Aminopeptidase-Gen der Erfindung identisch sind, können durch Hybridisierung mit einer DNA, die die in Seq.-ID Nr. 1 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist, einem Komplementärstrang davon oder einer einen Teil der Nucleotidsequenz oder des Komplementärstrangs enthaltenden Sonde unter stringenten Bedingungen und folgender Auswahl der kodierenden Polypeptide mit Leucin-Aminopeptidase-Aktivität erhalten werden. So wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung „stringente Bedingungen" auf Bedingungen, unter denen ausschließlich ein spezifischer Hybrid gebildet und durch sein Signal nachgewiesen wird, wobei sich kein nichtspezifischer Hybrid bildet. Diese Bedingungen können je nach Typ des Organismus leicht variieren, können aber auch rasch bestimmt werden, indem die Salzkonzentrationen und Temperaturen bei der Hybridisierung und dem Waschen gemäß herkömmlicher Verfahren geprüft werden. Beispielsweise kann unter den nachstehend unter Punkt (6) in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen, wo die Hybridisierung über Nacht (etwa 8 – 16 Stunden) unter Verwendung von 5 × SSC, 1,0 % (Gew./Vol.) eines Nucleinsäurehybridisierungsblockers (Boehringer Mannheim), 0,1 % (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 0,02 % (Gew./Vol.) SDS, gefolgt von zwei jeweils 15-minütigen Waschungen unter Verwendung von × 0,1 SSC und 0,1 % (Gew./Vol.) SDS, durchgeführt wurden, ein spezifisches Signal beobachtet werden. Die Temperaturen der Hybridisierung und der Waschungen betrugen unabhängig voneinander 45 °C oder mehr, vorzugsweise 52 °C oder mehr, noch bevorzugter 57 °C oder mehr. Die Wahrscheinlichkeit, dass DNAs, die unter derartigen Bedingungen hybridisieren, für Peptide mit Leucin-Aminopeptidase-Aktivität kodieren, ist hoch. Unter diesen DNAs kann jedoch eine DNA vorliegen, die ihre Leucin-Aminopeptidase-Aktivität durch Mutation verloren hat.
In diesem Fall kann nach der Transformation jede DNA ohne Aktivität durch Bestimmen der Fähigkeit einer Transformante zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase gemäß dem obigen Verfahren 3, das von den Erfindern entwickelt wurde, auf einfache Weise entfernt werden.
Die so erhaltenen Leucin-Aminopeptidase-Gene können gemäß den in J. Sambrook et al., „Molecular Cloning", zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; E. Shiela et al., Molecular & General Genetics 218, 99 – 104 (1989), usw. beschriebenen Verfahren zur Transformation von Wirtszellen, wie beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, Insektenzellen, Pflanzenzellen oder Tierzellen, vorzugsweise Fadenpilze, beispielsweise Aspergillus sojae ATCG42251, verwendet werden. Beim Transformationsverfahren, bei dem ein Fadenpilz als Wirtszelle eingesetzt wird, wird die kultivierte Zelle mit einem Zellwände abbauenden Enzym, wie beispielsweise Novozym 234 (Novo Nordisk A/S); behandelt, um einen Protoplasten mit entfernten Zellwänden zu erhalten. Dann werden gleichzeitig eine DNA, die ein Markergen, wie beispielsweise niaD, enthält, und eine DNA, die ein Gen von Interesse enthält, in den Protoplasten unter gleichzeitiger Gegenwart von Calciumchlorid und Polyethylenglykol 4000 eingeführt. Danach wird der auf diese Weise behandelte Protoplast in einem für das verwendete Markergen geeigneten Selektionsmedium verdünnt und warm gehalten, wodurch eine Transformante, in der sowohl das Markergen als auch das Gen von Interesse im Chromosom der Wirtszelle eingebaut sind, wiedergewonnen wird. Das Leucin-Aminopeptidase-Gen ist gegebenenfalls eine in einen Vektor insertierte rekombinante DNA oder eine nicht rekombinante DNA, wie beispielsweise ein aus chromosomaler DNA durch PCR amplifiziertes DNA-Fragment. Im letzteren Fall kann die Transformation ohne Schwierigkeiten ausgeführt werden, da die nicht rekombinante DNA in das Chromosom einer Wirtszelle eingebaut werden kann. Die erhaltenen Transformanten werden gegebenenfalls auf eine erhöhte Aktivität der Bildung von Leucin-Aminopeptidase hin geprüft, indem diese beispielsweise durch das oben beschriebene Verfahren 3 gemessen wird, um eine Transformante von Interesse zu erhalten.
Die so erhaltene Transformante kann gemäß dem in der JP-A 48-35094 beschriebenen Verfahren kultiviert werden, um Leucin-Aminopeptidase herzustellen und zu reinigen, was eine effiziente Herstellung von Leucin-Aminopeptidase zur Folge hat.
BEISPIELE
Hierin wird nun die vorliegende Erfindung durch die folgenden, nicht der Einschränkung dienenden Beispiele detaillierter beschrieben.
Beispiel 1: Klonieren des Leucin-Aminopeptidase-Gens
(1) Enzymreinigung
Der Koji-Schimmelpilz Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349) wurde kultiviert, um Leucin-Aminopeptidase so wie oben beschrieben zu bilden und zu reinigen (3 mg Ausbeute).
(2) Bestimmung der partiellen Aminosäuresequenz
30 ng des gereinigten Enzyms wurden als Probe verwendet, und dessen N-terminale Aminosäuresequenz wurde unter Verwendung eines Proteinsequenzanalysators ABI470A (Perkin-Elmer) als Gly Arg Ala Leu Val Ser Pro Asp Glu Phe Pro (Seq.-ID Nr. 3) bestimmt. Da dieses Enzym ermöglicht, eine Aminosäure aus dem N-Terminus eines Peptids freizusetzen, war es jedoch nicht möglich, Verunreinigungen, denen der N-Terminus durch Autolyse teilweise fehlte, zu vermeiden, wodurch keine andere als die oben bestimmte Sequenz erhalten wurde.
Statt dessen wurde das Enzym mithilfe von Lysylendpeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) zur Bestimmung der inneren Aminosäuresequenz fragmentiert. Auch hier stellte sich aber das Problem der durch die verbleibende Enzymaktivität verursachten Freisetzung von Aminosäuren an den N-Termini der Peptidfragmente.
Durch weitere Untersuchungen haben die Erfinder herausgefunden, dass das Enzym unter Bedingungen unter Bedingungen fragmentiert wird, die das Enzym inaktivieren, die Wirkung der Lysylendpeptidase jedoch zulassen. Zunächst wurde 1 mg des gereinigten Enzyms 1,5 h lang bei 37 °C in 0,5 ml eines 50 mM Tris-Puffers (pH-Wert 9,0), der 1 % (Gew./Vol.) SDS und 5 mM EDTA enthielt, inaktiviert. Nach der Inaktivierung wurden 15 μl einer 0,1 mg/ml Lysylendpeptidase (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan) für eine 14-stündige Reaktion bei 37 °C zugesetzt. Um die Reaktion weitere 2 Stunden lang bei 37 °C fortzusetzen, wurden weitere 5 μl der Lysylendpeptidase zugesetzt. Die so erhaltene, die Peptidfragmente enthaltende Lösung wurde nun 55 μl eines 1 M Kaliumpuffers (pH-Wert 7,5) zugesetzt, 30 min lang auf Eis gelassen und zur Entfernung von SDS 20 min lang bei 15.000 × g zentrifugiert. Die festen Substanzen wurden unter Einsatz einer Column Guard HV 13 mm (Millipore) aus dieser Peptidfragmentlösung entfernt. 100 μl der hergestellten Peptidfragmentlösung wurde Trifluoressigsäure (hierin in Folge als „TFA" bezeichnet) in einer schlussendlichen Konzentration von 0,1 % zugesetzt, um unter Verwendung einer vorgepackten Säule vom Typ POROS R2/H (Boehringer Mannheim) eine Umkehrphasenchromatographie mit einem Gradienten von 0 bis 47,5 % Acetonitril in ultrareinem Wasser, das 0,1 % TFA enthielt, durchzuführen. Jeder Peptidpeak wurde fraktioniert, wobei eine Extinktion bei 220 nm als Indikation beobachtet wurde. Die an jedem Peak erhaltene Peptidlösung wurde zur Trockenen mit einem Vakuumzentrifugalkonzentrationssystem eingedampft und in 20 μl eines 20 mM Phosphatpuffers (pH-Wert 8,0) erneut gelöst. Die Aminosäuresequenzen dieser Peptide wurden mithilfe eines Proteinsequenzanalysators ABI470A (Perkin Elmer) bestimmt. Die Resultate ergaben ein Peptid bei Peak 5 aus Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Pro Ser Val Glu Gly Lys (worin Xaa eine Aminosäure ist, die aufgrund der Verunreinigung eines anderen Peptids nicht identifiziert werden konnte) (Seq.-ID Nr. 4); ein Peptid bei Peak 6 aus Gln Pro Gln Val His Leu Trp ... (Seq.-ID Nr. 5); und ein Peptid bei Peak 11 aus Asn Ala Val Arg Phe Leu Phe Trp Thr Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Asn Tyr Tyr Val Ser His Leu ... (Seq.-ID Nr. 6).
(3) Herstellung von Teilen des Leucin-Aminopeptidase-Gens durch PCR
PCR-Primer wurden basierend auf der in (2) oben bestimmten partiellen Aminosäuresequenzen hergestellt.
Auf der Grundlage von Peak 5 wurden LAP5F (5'-GA(C/T)TA(C/T)CCI(A/T)(C/G)IGA(C/T)GTIGA(A/G)GGIAAG-3'; Seq.-ID Nr. 7) und LAP5R (5'-TTICC(C/T)TCIAC(A/G)TCI(C/G)(A/T)IGG(A/G)TA(A/G)TC-3'; Seq.-ID Nr. 8) hergestellt. Auf der Grundlage von Peak 11 wurden LAP11 F (5'-TT(C/T)TGGACIGCIGA(A/G)GA(A/G)TT(C/T)GG-3'; Seq.-ID Nr. 9) und LAP11R (5'-CC(A/G)AA(C/T)TC(C/T)TCIGCIGTCCA(A/G)AA-3'; Seq.-ID Nr. 10) hergestellt. „1" bezieht sich auf „Inosin". Teile des Leucin-Aminopeptidase-Gens wurden so wie nachstehend beschrieben durch PCR unter Verwendung der obigen Primer-Sätze und der genomischen DNA aus Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349) als Matrize, die gemäß dem Verfahren von Joan Tilburn et al., Gene 26, 205 – 221 (1983), hergestellt wurde, amplifiziert. Der verwendete Thermocycler war ein RoboCycler Gradient 96 (Stratagene), während ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) als PCR-Reagens eingesetzt wurde.
33,75 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser, 5 μl von 10 × Puffer (als Komponente von ExTaq), 2 μl einer jeden der zwei Primer-DNA-Lösungen (100 pmol/μl), 3 μl von 5 μg/μl genomischer DNA-Lösung, 4 μl einer 2,5 mM dNTP-Lösung (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) und 0,25 μl ExTaq-DNA-Polymerase wurden in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen (Ina Optica, T-02) gegeben und gemischt. 20 μl eines Mineralöls (Sigma) wurden dem Gemisch zugetropft, bevor das Röhrchen in den RoboCycler Gradient 96 eingebracht wurde. Die genomische DNA war zuvor 3 min lang bei 96 °C denaturiert und danach rasch auf Eis gekühlt worden. Die Primer bestanden entweder aus einer Kombination aus LAP5F und LAP11R oder LAP5R und LAP11F. Die Reaktion wurde durchgeführt, während der RoboCycler Gradient 96 wie folgt programmiert wurde: (i) 95 °C, 30 s; 45 Zyklen von (ii) 95 °C, 30 s, (iii) 36 – 56 °C, 30 s und (iv) 72 °C, 2 min; und danach (v) 72 °C, 5 min. Schritt (iii) wurde durch Einstellen der Temperatur des Anellierungsblocks auf einen Gradienten von 36 bis 58 °C und durch Bestücken dessen mit den Röhrchen durchgeführt, worin die Temperaturen auf 36 °C, 40 °C, 44 °C, 48 °C, 52 °C und 56 °C eingestellt waren. Nach der Reaktion wurden 5 μl des Reaktionsgemischs einer Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel LO3 (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) unterzogen, um die amplifizierten Produkte zu bestätigen. In dem aus den Primern LAP5F und LAP11R erhaltenen Reaktionsgemisch wurde hauptsächlich ein Produkt mit etwa 500 bp und in dem aus den Primern LAP5R und LAP11 F erhaltenen Reaktionsgemisch wurde hauptsächlich ein Produkt mit etwa 1.200 bp amplifiziert. Die optimale Anellierungstemperatur lag bei 48 °C.
40 μl eines jeden Reaktionsgemischs (Anellierungstemperatur 48 °C) wurden einer Elektrophorese auf einem 2%igen Agarosegel unterzogen, um die beiden amplifizierten Produkte aus den Gelen zu gewinnen. DNAs wurden aus den Gelen unter Verwendung eines „QIAquick Gel Extraction Sets" (Qiagen GmbH) durch Elution aus der Schleudersäule mit 25 μl sterilisiertem, destilliertem Wasser gewonnen. Unter Einsatz von 7 μl einer jeden der zwei DNA-Fragmentlösungen wurde jedes DNA-Fragment gemäß dem Handbuch des pGEM-T Easy Vector System II (Promega) in ein pGEM-T Easy Plasmid (Promega) eingeführt. Die erhaltenen Plasmide wurden dann zur Transformation der kompetenten E-coli-JM109-Zelle (einer Komponente des Sets) verwendet.
Aus den erhaltenen Transformanten (jeweils 4 Stränge) wurden gemäß „Molecular Cloning", 2. Auflage, 1.25 – 1.28, Cold Spring Harbor Press (1989), rekombinante Plasmide hergestellt. Die Nucleotidsequenzen dieser Plasmide wurden unter Verwendung eines „Thermo Sequenase Cycle Sequencing Sets" (Amersham) mit dem DNA-Sequenzanalysator Modell 4200 (Li-COR Inc.) bestimmt. Von den vier rekombinanten Plasmiden mit dem 500-bp-Fragment wiesen zwei Plasmide an ihren Enden Nucleotidsequenzen auf, die für die zum Erstellen der Primersequenzen verwendeten Aminosäuresequenzen kodieren. Die innere Nucleotidsequenz enthielt kein Stoppcodon im Leseraster für die obige Aminosäuresequenz. Deshalb war zu erwarten, dass das Fragment Teil des Leucin-Aminopeptidase-Gens von Interesse war. Dieses Plasmid wurde als pCRLA bezeichnet.
(4) Erstellung der genomischen DNA-Bibliothek von Koji
Die genomische DNA von Koji Aspergillus sojae 1-190 (FERM BP-6349) wurde so wie unter (3) oben beschrieben hergestellt und einer Grenzspaltung mit Sau3Al unterzogen, sodass die mittlere Basenzahl der DNA-Fragmente in etwa 10 kbp betrug. Die DNAs mit etwa 10 kbp wurden durch Agaraosegelelektrophorese unter Einsatz von QIAquick gesammelt und unter Verwendung eines „ZAP Express Predigested Ligapack III Cloning Sets" (Stratagene) in einen ZAP-Express-Vektor eingeführt. Nach dem Verpacken und Amplifizieren wurde eine λ-Phagenbibliothek der genomischen DNA erhalten.
(5) Herstellung der DNA-Sonde
Aufgrund der mutmaßlichen Teilnucleotidsequenz des Leucin-Aminopeptidase-Gens, das unter (3) oben erhalten wurde, wurden zwei Primer, FOW-LAP-A 5'-AGGGCAAGGTAGCTCTCATCAAGCGTGG-3' (Seq.-ID Nr. 11) und REV-LAP-A 5'-GAGAAAGCGCACGGCATTCTTGACGGAG-3' (Seq.-ID Nr. 12) hergestellt. Ein Teil des Leucin-Aminopeptidase-Gens wurde durch eine PCR unter Verwendung von LAP5F und LAP11R als Primen und 10 ng pCRLA als Matrize unter den nachstehend angeführten Bedingungen amplifiziert:
34,75 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser, 5 μl von 10 × Puffer, 2 μl einer jeden der zwei Primer-DNA-Lösungen (100 pmol/μl), 2 μl von 5 ng/μl genomischer DNA-Lösung, 4 μl einer 2,5 mM dNTP-Lösung und 0,25 μl ExTaq-DNA-Polymerase wurden in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen gegeben und gemischt. 20 μl eines Mineralöls wurden dem Gemisch zugetropft, bevor das Röhrchen in den RoboCycler Gradient 96 eingebracht wurde. Die genomische DNA war zuvor 3 min lang bei 96 °C denaturiert und danach rasch auf Eis gekühlt worden. Die Reaktion wurde durchgeführt, während der RoboCycler Gradient 96 wie folgt programmiert wurde: (i) 95 °C, 30 s; 45 Zyklen von (ii) 95 °C, 30 s, (iii) 50 °C, 30 s und (iv) 72 °C, 40 s; und danach (v) 72 °C, 2 min. Das Reaktionsgemisch wurde einer Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel unterzogen, um unter Verwendung eines „QIAquick Gel Extraction Sets" (Qiagen) ein amplifiziertes Fragment mit etwa 500 bp zu gewinnen. Das amplifizierte Fragment wurde mit 50 μl eines TE-Puffers (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) eluiert.
Eine mit Digoxigenin (DIG) markierte DNA-Sonde wurde durch eine PCR wie folgt hergestellt, wobei FOW-LAP-A und REV-LAP-A als Primer und eine 10fache Verdünnung der oben amplifizierten Fragmentlösung als Matrize verwendet wurden: 37,75 μl sterilisiertes, destilliertes Wasser, 5 μl von 10 × Puffer, 1 μl einer jeden der zwei Primer-DNA-Lösungen (100 pmol/μl), 1 μl der Matrizen-DNA-Lösung, 4 μl eines 10 × PCR DIG-Gemischs (Boehringer Mannheim) und 0,25 μl ExTaq-DNA-Polymerase wurden in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen gegeben und gemischt. 20 μl eines Mineralöls wurden dem Gemisch zugetropft, bevor das Röhrchen in den RoboCycler Gradient 96 eingebracht wurde. Die genomische -DNA war zuvor 3 min lang bei 96 °C denaturiert und danach rasch auf Eis gekühlt worden. Die Reaktion wurde durchgeführt, während der RoboCycler Gradient 96 wie folgt programmiert wurde: (i) 95 °C, 30 s; 45 Zyklen von (ii) 95 °C, 30 s, (iii) 62 °C, 30 s und (iv) 72 °C, 40 s; und danach (v) 72 °C, 2 min. Das amplifizierte Fragment wurde dem Reaktionsgemisch mithilfe von Ethanolausfällung gewonnen und in 50 μl TE-Puffer gelöst. Dies wurde als DIG-markierte Sonde dLAP-A bezeichnet.
(6) Sreening des Leucin-Aminopeptidase-Gens durch Plaque-Hybridisierung
Die λ-Phagenbibliothek der genomischen Koji-DNA, die in (4) erstellt wurde, wurde unter Verwendung der Sonde aus (5) auf das Leucin-Aminopeptidase-Gen hin geprüft.
Gemäß den Anleitungen für das Set zur Erstellung der Bibliothek wurden etwa 5 × 10³ Plaques pro Platte auf 5 Agarmediumplatten gebildet. Die DNA wurde gemäß den der Membran beigelegten Anleitungen auf eine HyBond-N+ Nylon Transfer- Membran (Amersham) übertragen. In diesem Fall wurde die DNA getrennt auf zwei Membranen pro Platte übertragen, um nicht spezifische Signale auszuschalten.
Diese Membranen wurden in Folge unter Einsatz der mit Digoxygenin markierten DNA-Sonde, die unter (5) hergestellt wurde, und einem DIG-System (Boehringer Mannheim) gemäß dem „Users Guide for Hybridisation Using DIG System", S. 37 – 40, Boehringer Mannheim (1996), einer Hybridisierung und einem Nachweisvorgang unterzogen. Spezifisch wurde ein Standard-Prähybridisierungspuffer (5 × SSC, 1 (Gew./Vol.) eines Nucleinsäure-Hybridisierungsblockerreagens (Boehringer Mannheim), 0,1 % (Gew./Vol.) N-Lauroylsarcosin und 0,02 (Gew./Vol.) SDS) auf jede der obigen zehn Membranen, an denen die DNAs der Phagenbibliothek adsorbiert worden waren, aufgetragen, und die Membranen wurden 1 h lang bei 57 °C gehalten, während sie sanft geschüttelt wurden.
Danach wurde eine unter (5) hergestellte dLAP-A-Sonde, die 10 min lang bei 100 °C erhitzt und rasch auf Eis gekühlt worden war, auf jede Membran aufgebracht, die daraufhin 16 h lang bei 57 °C gehalten und währenddessen sanft geschüttelt wurden. Jede Membran wurde in einen neuen Behälter eingebracht und zunächst zwei Mal mit einer 2 × Waschlösung (2 × SSC, 0,1 % (Gew./Vol.) SDS) 5 min lang bei Raumtemperatur und daraufhin zwei Mal mit einer 0,1 × Waschlösung (2 × SSC, 0,1 % (Gew./Vol.) SDS) 15 min lang bei 57 °C gewaschen. Jede Membran wurde dann mit Puffer 1 (0,1 M Maleinsäure, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,5) äquilibriert und in einen neuen Behälter eingebracht, dem der Puffer 2 (Puffer 1, 1 % (Gew./Vol.) Nucleinsäure-Hybridisierungsblockerreagens) zugesetzt wurde, der in Folge 30 min lang bei Raumtemperatur sanft geschüttelt wurde. Nachdem der Puffer 2 verworfen worden war, wurde ein mit alkalischer Phosphatase markierter Anti-Digoxygenin-Antikörper, der mit dem Puffer 2 in einem Verhältnis von 1:10.000 verdünnt worden war, zugesetzt und das Ganze 30 min lang bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Nach der Verwertung der Antikörperlösung wurden die Membranen einzeln zwei Mal mit dem Puffer 1, der 0,3 % Tween 20 enthielt, in einem sauberen Behälter gewaschen. Danach wurden sie mit dem Puffer 3 (0,1 M Tris, pH-Wert 9,5, 0,1 M NaCl, 50 mM MgCl₂) 2 min lang äquilibriert. Jede Membran wurde in einen auf eine geeignete Größen zugeschnittenen Hybridisierungsbeutel eingebracht, dem 0,4 ml einer 100fach verdünnten CDP-Star-Lösung (Boehringer Mannheim) zugetropft und dadurch gleichmäßig über die Membran verteilt wurden. Nach dem Entfernen der überschüssigen Lösung wurden die Beutel mit einem Versiegler versiegelt. Diese Membranen wurden nun 10 min lang bei 37 °C gehalten und danach an Fuji-Direktfotofilme RX-U (Fuji Photo Film Co., Ltd.) 1 – 10 min lang angehaftet, woraufhin die Filme entwickelt wurden. Fünf Signale (als Signal A bis E bezeichnet) konnten an derselben Stelle der beiden Membranen, auf die die Plaques auf demselben Agarmedium übertragen worden waren, beobachtet werden. A bis E sind gegebenenfalls positive Klone. Weichagarabschnitte (5 mm Durchmesser) wurden von den den Signalen A bis E entsprechenden Stellen entfernt und in entsprechende Mikrozentrifugenröhrchen eingebracht. Nachdem 500 μl eines SM-Puffers (10 mM NaCl, 0,2 % (Gew./Vol.) MgSO₄·7H₂O, 50 mM Tris mit pH-Wert 7,5, 0,01 % Gelatine) und 20 μl Chloroform zugesetzt worden waren, wurden die Röhrchen bei 4 °C über Nacht stehen gelassen. Auf diesen Agarmedien wurden, während sie so reguliert wurden, dass 100 Phagen pro Röhrchen erzeugt werden, Plaques ausgebildet. Diese wurden, so wie zuvor beschrieben, auf entsprechende Membranen übertragen, um die Hybridisierung mit einer dLAP-A-Sonde durchzuführen. Bei der aus Signal A erhaltenen Phagenlösung wurden mehrere starke Signale beobachtet. Bei Signal B konnte kein Signal, bei den Signalen C, D und E hingegen konnten einige wenige Signale beobachtet werden. Aus den Signalen A, C, D und E wurden auf die oben beschriebene Weise Plaques entnommen, um erneut eine Plaque-Hybridisierung durchzuführen. Da sich alle Plaques der Signale A und D als positiv herausstellten, wurden einzelne Plaques aus den Signalen A und D getrennt entnommen.
Die Phagenklone der Signale A und D wurden nun gemäß den Anleitungen des Sets einer In-vitro-Exzision unterzogen, um deren Plasmide zu erhalten, die dann als pLZA bzw. pLZD bezeichnet wurden.
(7) Analyse des Leucin-Aminopeptidase-Gens
Die beiden unter (6) erhaltenen Plasmide wurden analysiert. Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung dieser Plasmide als Matrizen durchgeführt. FOW-LAP-A, REV-LAP-A und Primer für beide Seiten der Klonierungsstellen der Vektoren, d.h. F: 5'-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT-3' (Seq.-ID Nr. 12) und R: 5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3' (Seq.-ID Nr. 13), wurden in den folgenden Kombinationen eingesetzt:

(a) FOW-LAP-A und -F
(b) REV-LAP-A und -F
(c) FOW-LAP-A und -R
(d) REV-LAP-A und -R

Die Bedingungen für die PCR waren dieselben wie bei der Herstellung von dLAP-A, mit der Ausnahme, dass die Verlängerungsreaktion 8 min lang bei 72 °C durchgeführt wurde. Die PCR-Produkte wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen. Bei denen, die mit der pLZA-Matrize erhalten wurden, wurden mit den Primerkombinationen (a) und (d) etwa 2,1-kbp- bzw. etwa 4,1-kbp-Banden beobachtet. Bei denen, die mit der pLZD-Matrize erhalten wurden, wurde mit der Primerkombination (d) eine etwa 2-kpb-Bande beobachtet.
Diese Plasmide wurden einem herkömmlichen Verfahren gemäß mit Restriktionsenzymen gespalten und einer Agarosegelelektrophorese zur Erstellung einer kurzen Restriktionsenzymkarte unterzogen. Die Restriktionskarte wurde mit den Ergebnissen der PCR kombiniert, und auf der Grundlage dieser Information wurde eine mögliche Stelle des Leucin-Aminopeptidase-Gens ausgemacht (1). Somit wurde angenommen, dass pLZA und pLZD dieselben DNA-Fragmente, die das Leucin-Aminopeptidase-Gen umfassen, enthielten.
Das DNA-Fragment im pLZA wurde auf angemessene Weise subkloniert, um durch das unter (3) beschriebene Verfahren dessen Nucleotidsequenz zu bestimmen. Eine Sequenz, die mit diesem Verfahren nicht ermittelt werden konnte, wurde mithilfe des „Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Sets" (Perkin-Elmer) auf dem Sequenzanalysator Modell 373A (Perkin-Elmer) bestimmt. Die ermittelte Nucleotidsequenz ist in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt. Auf der Grundlage der Sequenzen an beiden Enden und der N-terminalen Sequenz der gereinigten Leucin-Aminopeptidase stellte sich heraus, dass es sich bei den Nucleotiden 67 – 171 der Seq.-ID Nr. 2 um ein Intron handelte. Die Aminosäuresequenz der reifen Leucin-Aminopeptidase, die in Seq.-ID Nr. 1 gezeigt ist, wurde auf Grundlage der Aminosäuresequenz eines aus der Kombination der Nucleotide 1 – 66 und 172 – 1640 der Seq.-ID Nr. 2 und der N-terminalen Sequenz der gereinigten Leucin-Aminopeptidase translatierten Polypeptids bestimmt.
Es stellte sich heraus, dass es sich bei der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 1 um die Aminosäuresequenz der reifen Leucin-Aminopeptidase handelte, da sie am N-Terminus die N-terminale Sequenz der gereinigten Leucin-Aminopeptidase und im Inneren die gesamte unter (2) ermittelte innere Sequenz von Leucin-Aminopeptidase umfasste. Es wurde der Schluss gezogen, dass pLZA eine Vektor-DNA ist, die das Leucin-Aminopeptidase-Gen enthält.
Beispiel 2: Herstellung einer Transformante mit Leucin-Aminopeptidase-Gen
Zuerst wurde als Wirt ein niaD-defekter Stamm dem von E. Shiela et al., Molecular and General Genetics 218, 99 – 104 (1989), beschriebenen Verfahren gemäß aus Aspergillus sojae ATCC 42251 hergestellt.
pLZA-Plasmid, d.h. eine Vektor-DNA, in die das Leucin-Aminopeptidase-Gen eingebaut worden war, und pSTA14-Plasmid, in das ein niaD-Gen als Marken eingebaut worden war (vgl. E. Shiela et al., oben), wurden unter Verwendung eines „QIAGEN Plasmid Maxi Sets" (QIAGEN) in großen Mengen hergestellt.
Diese Plasmide wurden zur Transformation des niaD-defekten Stamms aus Aspergillus sojae ATCC 42251 gemäß dem von E. Shiela (oben) beschriebenen Verfahren eingesetzt, wodurch 25 Kolonien der Transformanten auf einem Minimalmedium erhalten wurden.
Die Fähigkeit der erhaltenen Transformanten zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase wurde durch das oben beschriebene Verfahren 3 bestimmt. Es wurden jene ausgewählt, die die Fähigkeit zur Bildung von Leucin-Aminopeptidase im selben Maße wie, in leicht höherem Maße und in deutlich höherem Maße als der Wirtsstamm aufwiesen, und mit TFLW14, TFLW5 bzw. TFLW22 bezeichnet.
Der Aspergillus sojae (TFLW22) wurde beim National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (1 – 3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japan), versehen mit der Zugriffsnummer FERM BP-6348, hinterlegt.
Genomische DNAs des Wirtsstamms und die oben beschriebenen drei Transformantenstämme wurden so wie unter (4) in Beispiel 1 beschrieben hergestellt, mit dem Restriktionsenzym Sall gespalten und auf HyBond-N+ Nylon Transfer-Membranen (Amersham) geblottet. Die Membranen wurden durch die unter (6) in Beispiel 1 beschriebene Hybridisierung unter Verwendung von dLAP-A als Sonde auf die Kopienzahl des Leucin-Aminopeptidase-Gens hin untersucht. Die Kopienzahlen des Leucin-Aminopeptidase-Gens betrugen im Wirtsstamm, in TFLW14, TFLW5 bzw. TFLW22 1, 1, 2 -3 bzw. in etwa 10 oder mehr.
Beispiel 3: Herstellung von Leucin-Aminopeptidase unter Verwendung einer Transformante
2,78 g Weizenkleie und 2,22 ml destilliertes Wasser wurden gemischt, in einen 150-ml-Erlenmeyerkolben gefüllt, 50 min lang bei 121 °C autoklaviert und bei Raumtemperatur abkühlen gelassen. Jeweils 10⁶ Sporen des Wirtsstamms und der drei Transformantenstämme wurden in entsprechende Kolben inokuliert und 24 h lang bei 30 °C stehen gelassen. Die Kolben wurden kräftig geschüttelt, um den jeweiligen Inhalt in kleine Teilchen zu zerlegen, die dann zum Zwecke des Zwellwachstums weitere 48 h lang bei 30 °C stehen gelassen wurden. 25 ml destilliertes Wasser wurde den Kolben zugesetzt, die daraufhin kräftig geschüttelt und 3 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurden. Aus den Gemischen wurden nun Enzyme extrahiert, wodurch Enzymlösungen erhalten wurden.
Zur Bestimmung der Aminopeptidase-Aktivität der Enzymlösungen wurden freie Aminosäuren und Peptide mit niedrigem Molekulargewicht aus den Enzymlösungen entfernt. Spezifisch wurden 2 ml einer jeden Enzymlösung in ein Centricon-10 (Amicon) gegeben und bei 3.000 × g zentrifugiert. Sobald sich die Menge auf 0,5 ml belief, wurden 1,5 ml eines 25 mM HEPES-Puffers (pH-Wert 7,0) zugesetzt und das Gemisch drei Mal bei 3.000 × g zentrifugiert. Das Volumen der gesammelten Enzymlösung wurde auf 2 ml mit 25 mM HEPES-Puffer (pH-Wert 7,0) eingestellt.
Die Leucin-Aminopeptidase-Aktivitäten der so erhaltenen Enzymproben wurden unter Verwendung von Leu-Gly-Gly als Substrat ermittelt (Tabelle 1). Ist die Aktivität des Wirtsstamms als 1 definiert, so wiesen TFLW14, TFLW5 und TFLW22 eine jeweilige Aktivität von etwa 1,0, etwa 2,1 bzw. etwa 4,9 auf. Leucin-Aminopeptidase wurde somit im Vergleich zum Wirtsstamm auf effiziente Weise hergestellt, indem die Transformante TFLW22, die mit dem das Leucin-Aminopeptidase-Gen enthaltenden Vektor transformiert worden war, gezüchtet wurde.
Tabelle 1
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann Leucin-Aminopeptidase beispielsweise durch Kultivieren eines Mikroorganismus, welcher rekombinante DNA enthält, in die das Leucin-Aminopeptidase-Gen der vorliegenden Erfindung eingebaut wurde, auf effiziente Weise erhalten werden. Da das Gen der Erfindung als Probe zum Protein-Engineering eingesetzt werden kann, ist die vorliegende Erfindung für die Industrie von Nutzen.
Im Folgenden sind Informationen bezüglich der hierin beschriebenen Seq.-ID Nr. 1 und Nr. 2 angegeben: Seq.-ID Nr. 1:

Seq.-ID Nr. 2:

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Leucin-Aminopeptidase-Gen, das für ein Protein mit der in Seq.-ID Nr.1 gezeigten Aminosäuresequenz kodiert.
Leucin-Aminopeptidase-Gen, umfassend DNA mit der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Nucleotidsequenz.
Rekombinante DNA, worin ein Leucin-Aminopeptidase-Gen nach-Anspruch 1 oder 2 in eine Vektor-DNA insertiert worden ist.
Transformierte Wirtszelle, die mit DNA transformiert ist, die ein Leucin-Aminopeptidase-Gen nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
Wirtszelle, die mit rekombinanter DNA nach Anspruch 3 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung von Leucin-Aminopeptidase, umfassend die Schritte des Kultivierens einer Wirtszelle nach Anspruch 4 oder 5 in einem Medium und die Gewinnung von Leucin-Aminopeptidase aus dem Medium.