DE69732506T2

DE69732506T2 - Prenyl Diphosphate Synthetase Gene

Info

Publication number: DE69732506T2
Application number: DE69732506T
Authority: DE
Inventors: Masayoshi Toyota-shi Muramatsu; Ayumi Toyota-shi Koike; Kyozo Toyota-shi Ogura; Tanetoshi Toyota-shi Koyama; Naoto Toyota-shi Shimizu; Yenwin Toyota-shi Cho
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-13
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2017-06-14
Also published as: US6071733A; EP0812914B1; DE69732506D1; EP0812914A3; EP0812914A2; US6174715B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für die Herstellung eines Peptids einer Prenyldiphosphatsynthetase, ein Verfahren für die Herstellung einer aktiven Prenyldiphosphatsynthetase; einer DNS, die für die Synthetase kodiert, einem rekombinanten Vektor mit der DNS und einen mit dem Vektor transformierten Transformanten.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Eine extrem große Vielfalt an Isoprenoidverbindungen werden in natürlichen Geschöpfen von Bakterien bis höheren Eukaryoten gefunden. Zum Beispiel können Steroide, Karotenoide, Polyprenole, welche Zuckerträger sind, Chinone, mit Isopentenyladenin modifizierte tRNS, prenylierte Proteine und ähnliche aufgezählt werden. Alle diese Isoprenoide werden über Prenyldiposphat als ein Zwischenprodukt biologisch synthetisiert, welches durch eine Prenyldiphosphatsynthetase hergestellt wird (1).
Das „Prenyldiphosphatsynthetase" ist ein allgemeiner Begriff für diejenigen Enzyme, welche eine Reaktion katalysieren, die Prenyldiphosphat (ein allylischer Primer) und 3-Isopentenyldiphosphat (IPP) durch Kondensation polymerisiert, um Polyprenyldiphosphat zu erzeugen.
Prenyldiphosphatsynthetasen werden in zwei Gruppen eingeteilt. Eine Gruppe besteht aus Enzymen, die eine Kondensationsreaktion katalysieren, in welcher die durch jede Kondensation von IPP gebildete Doppelbindung vom E-Typ ist. Die andere Gruppe besteht aus Enzymen, die eine Kondensationsreaktion katalysieren, in welchem die durch jede Kondensation von IPP gebildete Doppelbindung vom Z-Typ ist. Ferner ist die maximale Länge der Isoprenkette, welche jede Prenyldiphosphatsynthetase erzeugen kann, festgelegt. Da die hydrophobe Eigenschaft eines Produkts in Abhängigkeit von der Isoprenkettenlänge des Produkts schwankt, gibt es einen großen Unterschied in den Anforderungen für die Aktivität der Enzyme. Wenn bakterielle Enzyme in Bezug auf ihre Erfordernisse verglichen werden, werden Prenyldiphosphatsynthetasen in die folgenden vier Gruppen eingeteilt.
(1) Prenyldiphosphatsynthetase I (E-Typ, Kurzketten-Prenyldiphosphatsynthetase)

(i) Geranyldiphosphat(GPP)-synthetase (Sagami, H. et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun., 85, 575) (C₅→C₁₀) Der Ausdruck „C₅→C₁₀" bedeutet, dass die angegebene Synthetase die Synthese einer Verbindung mit 5 Kohlenstoffatomen zu einer Verbindung mit 10 Kohlenstoffatomen katalysiert (hiernach hat diese Angabe eine ähnliche Bedeutung).
(ii) Farnesyldiphosphat(FPP)-synthetase (Takahashi, I. und Ogura, K., (1981) J. Biochem. 89, 1581; Fujisaki, S. et al., (1986) J. Biochem., 99, 1327) (C₅→C₁₅).
(iii) Geranylgeranyldiphosphat(GGPP)-synthetase (Takhashi, I. und Ogura, K., (1982) J. Biochem. 92, 1527; Sagami, H. und Ogura, K., (1981) J. Biochem., 89, 1573) (C₅→C₂₀).

(2) Prenyldiphosphatsynthetase II (E-Typ, Mittelketten-Prenyldiphosphatsynthetase)

(i) Hexaprenyldiphosphat(HexPP)-synthetase (Fujii, H. et al., (1982) J. Biol. Chem., 257, 14610) (C₁₅→C₃₀).
(ii) Heptaprenyldiphosphat(HepPP)-synthetase (Takahashi, I. et al., (1980) J. Biochem., 255, 4539) (C₁₅→C₃₅).

(3) Prenyldiphosphatsynthetase III (E-Typ, Langketten-Prenyldiphosphatsynthetase)

(i) Octoprenyldiphosphat(OctPP)-synthetase (Fujisaki, S. et al., (1986), J. Biochem., 99, 1327) (C₁₅→C₄₀).
(ii) Nonaprenyldiphosphat(NonPP)-synthetase (Sagami, H. et al., (1977) Biochemistry, 16, 4616) (C₁₀→C₄₅) Decaprenyldiphosphat(DecPP)-synthetase (Ishii, K. et al., (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 116, 500) (C₁₅→C₅₀)

(4) Prenyldiphosphatsynthetase IV (Z-Typ, Langketten-Prenyldiphosphatsynthetase)

(i) Z-Nonaprenyldiphosphatsynthetase (Ishii, K. et al., (1986) Biochem. J., 233, 773) (C₁₅→C₄₅)
(ii) Undecaprenyldiphosphat(UPP)-synthetase (Takahashi, I. und Ogura, K. (1982) J. Biochem., 92, 1527; Keenman, M. V. & Allen, C. M (1974) Arch. Biochem. Biophys., 161, 375) (C₁₅→C₅₅).
(iii) Dehydrodolichyldiphosphat(deDolPP)-synthetase (Sagami, H. et al., (1989) Biochem. Biophys. Acta. 1002, 218) (C₁₅→C_85-105).

Prenyldiphosphatsynthetase I kondensiert nacheinander 3-Isopentenyldiphosphat (IPP) mit Dimethylallyldiphosphat (DMAPP), erzeugt durch Isomerisierung von IPP als ein allylischer Primer, um dadurch eine kurze Kette zu synthetisieren, wobei das gesamt Prenyldiphosphat vom E-Typ 20 oder weniger Kohlenstoffatome hat. Dieses Produkt dient als ein Vorläufer für Steroide, Karotenoide oder prenylierte Proteine. Ferner dienen Geranyldiphosphate (GPP), Farnesyldiphosphat (FPP) und Geranylgeranyldiphosphat (GGPP) ebenfalls als ein allylisches Primersubstrat für eine Mittel- oder Langketten-Prenyldiphosphatsynthetase.
Hexaprenyldiphosphatsynthetase (HexPS) und Heptaprenyldiphosphatsynthetase (HepPS) gehören zur Prenyldiphosphatsynthetase II. Diese Enzyme synthetisieren Hexaprenyldiphosphat bzw. Heptaprenyldiphosphat ohne DMAPP oder GPP als einen Primer, aber unter Verwendung von FPP als ein allylischer Primer. Die Produkte sind stark hydrophob und dienen als Vorläufer für die Seitenketten von Menachinonen oder Ubichinonen in Organismen mit diesen Enzymen. Diese Prenylchinonen spielen wichtigen Rollen in der respiratorischen Kette oder dem Elektronentransportsystem in der Photosynthese.
Jedes Mitglied der Prenyldiphosphatsynthetasen II ist ein Enzym bestehend aus zwei essentiellen Proteinen, welche unabhängig voneinander keine katalytische Aktivität haben. Jedoch hat das Enzym eine Eigenschaft, dass es in der Anwesenheit von Substraten für das Enzym die zwei Proteine miteinander assoziieren und die katalytische Aktivität aufweisen (Yoshida, I. et al., (1989) Biochem. Biophys. Res. Commun., 160, 448). In diesem Punkt sind die Enzyme dieser Gruppe sehr unterschiedlich zu anderen Prenyldiphosphatsynthetasen.
Als Mikroorganismen, die Prenyldiphosphatsynthetase II produzieren sind Micrococcus luteus, Bacillus subtilils und andere bekannt (Fujii, H. et al. (1982) J. Biol. Chem., 257, 14610; Takahashi, I. et al., (1980) J. Biol. Chem., 255, 4539). Die folgenden Fakten wurden für die zwei Bestandteile (bezeichnet als „Bestandteil A" und Bestandteile B") der HexPS von Micrococcus luteus B-P 26 und für die zwei Bestandteile (bezeichnet als „Bestandteil I" und „Bestandteil II") der HepPS von Bacillus subtilis gezeigt.

a) Bestandteil A und Bestandteil I sind relativ thermostabil, während Bestandteil B und Bestandteil II eine geringe Thermostabilität wie andere aus Mesophilen stammende Enzyme haben (Fujii, H. et al., (1982) J. Biol. Chem., 257, 14610).
b) Es gibt keine Austauschbarkeit zwischen Bestandteil A und Bestandteil I. In anderen Worten, weder eine Kombination von Bestandteil A und Bestandteil II noch eine Kombination von Bestandteil I und Bestandteil B weist Enzymaktivität auf (Fujii, H. et al., (1983) FEBS Lett., 161, 257).
c) Bestandteil B und Bestandteil II werden durch SH-Reagenzien und Arginin-spezifische Reagenzien beeinträchtigt, die die Enzymaktivität deutlich senken, wobei Bestandteil A und Bestandteil I nicht durch diese Reagenzien beeinträchtigt werden (Yoshida, I. et al., (1989) Biochem. Biophys. Acta, 995, 138).

Octaprenyldiphosphatsynthetase (OctPS), Nonaprenyldiphosphatsynthetase (NonPS) und ähnliche gehören zu den Prenyldiphosphatsynthetasen III. Wie die Prenyldiphosphatsynthetasen I sind diese Enzyme homodimere Proteine bestehend aus identischen Untereinheiten. Sie weisen ihre katalytische Aktivität durch sich selbst auf. Um jedoch die Umsatzfähigkeit als ein Katalysator zu behalten, benötigen sie einen proteinhaltigen Faktor, welcher hydrophobe Produkte von ihrer aktiven Stelle entfernt (Ohnuma, S. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266, 23706). Dieser Aktivator ist austauschbar und weist Aktivierungswirkung gegenüber jedem Enzym auf, das zu den Prenyldiphosphatsynthetasen III gehört (Ohnuma, S. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266, 23706).
Enzyme, die zu den Prenyldiphosphatsynthetasen IV gehören, kondensieren IPP in der Z-Strukturform, um Polyprenyldiphosphat von gemischten E- und Z-Typ zu synthetisieren, unter Verwendung eines kurzkettigen Prenyldiphosphat (GPP, FPP) als ein Primersubstrat. Bakterielle Undecaprenyldiphosphatsynthetase (UPS) und eukaryotische Dehydrodolichyldiphosphatsynthetase (deDOlPS) sind in dieser Gruppe eingeschlossen. Eine große Anzahl dieser Enzyme sind membrangebundene Proteine, und wenn sie mit einem oberflächenaktiven Stoff oder ähnlichem gelöst werden, benötigen sie in nahezu allen Fällen die Zugabe eines oberflächenaktiven Stoffs, wie etwa Triton X-100 für die Ausprägung ihrer Aktivität (Takahashi, I und Ogura, K. (1982) J. Biochem., 92, 1527; Allen, C. M. & Muth, J. D. (1977) Biochemistry, 16, 2908). Zusätzlich ist der bei Prenyldiphosphatsynthetasen III geminsame Aktivator wirkungslos gegenüber UPS. Es wird angenommen, dass diese Tatsache so ist, da eine hydrophobe Umgebung eine Membran wesentlich für die Ausprägung der Enzymaktivität ist.
Der größte Teil der vorher beschriebenen Informationen wurde aus Untersuchungen unter Verwendung derjenigen Enzyme erhalten, die aus einer Lösung von aufgeschlossenen Zellen extrahiert und gereinigt wurden. Um einen genaueren Enzymreaktionsmechanismus klarzustellen, sollte nicht nur die primäre Struktur, sondern ebenfalls die Kristallstruktur der Enzymproteine analysiert werden. Für diesen Zweck ist die Klonierung von Genen, die für diese Enzyme kodieren, unerlässlich.
Tatsächlich wurden kürzlich Prenyldiphosphatsynthetase-Gene, wie etwa FPS und GGPS nacheinander kloniert (FPP Synthetasen: Koyama, T. et al., (1993) J. Biochem., 113, 355; Fujisaki, S. et al., (1990) J. Biochem., 108, 995; Anderson, M. A. et al., (1989) J. Biol. Chem., 264, 19176; Clarke, C. F. et al., (1987) Mol. Cell Bio., 7, 3138; Wilkin, D. J. et al., (1990) J. Biol. Chem., 265, 4607; GGPP-Synthetasen: Carattoli, A. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266, 5854; Armstrong, G. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9975; Math, S. K. et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6761; Misawa, N. et al., (1990) J. Bacteriol., 172, 6704). Mit Bezug auf die HexPP-Sythetase wurde ein Gen, das für einen der zwei Bestandteile (entsprechend dem vorher beschriebenen „Bestandteil B") durch ein Komplementaritätsexperiment in Hefe kloniert. Jedoch sind, wie vorher beschrieben, die zwei Bestandteile dieser Synthase notwendig für die Ausprägung der Aktivität. Daher kann nicht gesagt werden, dass eine perfekte Klonierung des für das Enzym vom aktiven Typ kodierenden Genes durchgeführt wurde (HexPP Synthetase: Ashby, M. M. und Edwards, P. A. (1990) J. Biol. Chem., 265, 13157).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Primärstrukturen der vorher erwähnten Enzyme auf der Grundlage der Basensequenzen ihrer Gene verglichen. Als ein Ergebnis wurde deutlich, dass Prenyldiphosphatsynthetasen 7 Bereiche haben, in welchen die Aminosäuresequenz relativ konserviert wurde jenseits dem Unterschied in der Kettenlänge oder der Organismenart (Koyama, T. et al., (1993) J. Biochem. 113, 355–363). Da diese Bereiche in einer Gruppe von Enzymen konserviert sind, welche im Wesentlichen die gleiche Reaktion katalysieren, wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle in der katalytischen Funktion haben. Andererseits ist vorhergesagt, dass nicht konservierte Bereiche einen Anteil für die Definition der Kettenlänge haben, einen Anteil, der an dem Unterschied in der Art der Ausprägung der enzymatischen Funktion usw. beteiligt ist. Jedoch ist zur Zeit die Anzahl der klonierten Gene von Prenyldiphosphatsynthetasen mit verschiedenen Kettenlängen zu gering, um die Existenz derartiger Abschnitte aus dem Vergleich von Primärstrukturen herauszufinden.
Vom Gesichtspunkt der Ausprägung der enzymatischen Funktion sind Enzyme, die zu den Prenyldiphosphatsynthetasen II gehören stark unterschiedlich von anderen Prenyldiphosphatsynthetasen, wie vorher beschrieben. Sie sind dadurch gekennzeichnet, dass sie aus zwei Proteinen bestehen (heterodimerer Typ), von denen jedes alleine keine katalytische Funktion hat, aber welche miteinander in Anwesenheit eines Substrats assoziieren, um eine katalytische Funktion aufzuweisen.
Durch diese heterodimeren Prenyldiphosphatsynthetasen synthesierte Substanzen sind Vorläufer von denjenigen Substanzen, wie etwa Vitamin K und Ubichinonen, welche universell in Organismen vorhanden sind, und daher sind sie wichtige physiologisch aktive Substanzen. Daher haben sie einen großen Nutzwert. Ferner ist ein durch eine heterodimere Prenyldiphosphatsynthetase erzeugtes Prenyldiphosphat industriell sehr nützlich, da die Kettenlänge und die strukturellen Isomere davon direkt gesteuert werden können. Folglich wird die Expression einer derartigen Synthethase in großer Menge erforderlich.
Dem gemäß ist es erwünscht, Gene zu isolieren, die für die zwei Proteine eines Enzyms kodieren, das zu dem Prenyldiphosphatsynthetasen II gehört, die Gene getrennt zu exprimieren, und dadurch die Proteine in großer Menge zu erzeugen.
Koike-Takeshita, A. et al; J. Biol. Chem., Vol. 270, No. 31, pp. 18396–18400, 1995; ist auf die molekulare Klonierung einer Heptaprenyldiphosphatsynthase (HepPP) von Bacillus stearothermophilus und die Charakterisierung des Enzymsystems gerichtet.
Yoshida, I. et al.; Biochemistry, Vol. 26, No. 21, pp. 6840–6845, 1987; offenbart, dass die Hexaprenylphosphatsynthase von M. luteus zwei Untereinheiten umfasst.
Yoshida, I. et al.; Biochem. and Biophys. Res. Com., Vol. 160, No. 2, pp. 448–452 beschreibt ebenfalls das Vorhandensein eines katalytisch aktiven Komplexes mit zwei essentiellen Bestandteilen einer Hexaprenylphosphatsynthase von M. luteus.
EP-A-0 699 761 ist auf die Heptaprenyldiphosphatsynthase von B. stearothermophilus gerichtet.
WO 95/21263 ist auf in Heterokaryons von filamentösen Pilzen erzeugte, heterologe dimere Proteine gerichtet.
AUFGABEN UND ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren für die Herstellung von Peptiden von Prenyldiphosphatsynthetasen, ein Verfahren für die Herstellung einer aktiven Prenyldiphosphatsynthetase, eine DNS, die für die Synthetase kodiert, ein rekombinanten Vektor mit der DNS und einen mit dem Vektor transformierten Transformanten zur Verfügung zu stellen.
Als ein Ergebnis von extensiven und intensiven Forschungen in Richtung auf die Lösung der vorherigen Aufgabe, waren die Erfinder der vorliegenden Erfindung bei der Klonierung des Gens einer Prenyldiphosphatsynthetase aus Micrococcus luteus erfolgreich, und waren ebenfalls bei der Herstellung einer aktiven Prenyldiphosphatsynthetase durch Mischen von Peptiden der einzelnen Untereinheiten einer Prenyldiphosphatsynthetase erfolgreich. Daher wurde die vorliegende Erfindung erzielt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine wie in Anspruch 1 definierte DNS.
Als die für das Polypeptid der Untereinheit (A) kodierende DNS kann die durch die SEQ ID NO: 3 dargestellte DNS angegeben werden. Als die für das Polypeptid der Untereinheit (B) kodierende DNS kann die durch die SEQ ID NO: 4 dargestellte DNS angegeben werden.
Solange ein Polypeptid ausgewählt aus einem Polypeptid der Untereinheit (A) oder ein Polypeptid der Untereinheit (B) die Aktivität hat, Prenyldiphosphat zu synthetisieren, kann die Aminosäuresequenz für dieses Polypeptid Variationen wie etwa Deletion, Subtitution, Insertion oder Ähnliches haben.
Dem gemäß ist zum Beispiel die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 mit einer Deletion des Methionins (Met) an Position 1 in der vorher erwähnten Aminosäuresequenz mit Variationen eingeschlossen. Ebenfalls ist nicht nur die Basensequenz, die für die in dem erfindungsgemäßen Polypeptid enthaltenden Aminosäuren kodiert, sondern ebenso ein degeneriertes Isomer der vorher erwähnten Basensequenz in der erfindungsgemäßen DNS eingeschlossen, die sich nur in degenerierten Codons unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen rekombinanten Vektor, der die vorher beschriebene DNS umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Transformante, erhalten durch Transformierung eines Wirtsorganismus durch einen vorher beschriebenen rekombinanten Vektor.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids der Untereinheit (A) und/oder eines Polypeptids der Untereinheit (B), das die Kultivierung der vorher beschriebenen Transformante in einem Medium umfasst, um dadurch das Polypeptid der Untereinheit (A) und/oder des Polypeptids der Untereinheit (B) in der Kultur zu akkumulieren und das Sammeln der Polypeptide.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Polypeptid ausgewählt aus dem Polypeptid der Untereinheit (A), im Wesentlichen dargestellt durch SEQ ID NO: 1, und das Polypeptid der Untereinheit (B), im Wesentlichen dargestellt durch SEQ ID NO: 2.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren für die Herstellung einer aktiven Prenyldiphosphatsynthetase mit Herstellen von Peptiden der einzelnen Untereinheiten einer heterodimeren Prenyldiphosphatsynthetase durch rekombinante DNS-Techniken und Mischen der resultierenden Peptide der einzelnen Untereinheiten. Als Peptide für die einzelnen Untereinheiten können das Polypeptid der Untereinheit (A) und das Polypeptid der Untereinheit (B), dargestellt zum Beispiel durch die SEQ ID NO: 1 beziehungsweise die SEQ ID NO: 2, angegeben werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die 1 ist eine graphische Darstellung, die den Biosyntheseweg von Isoprenoiden zeigt.
2 zeigt die Bestimmung von Primern auf der Grundlage von konservierten Aminosäuresequenzen.
Die 3 zeigt eine Plattentransfervorrichtung.
Die 4 stellt Autoradiogramme dar, die die Ergebnisse von Southern-Hybridisierung zeigen.
Die 5 ist ein Chromatogramm, das die Ergebnisse einer Umkehrphase-TLC zeigt.
Die 6 ist ein Diagramm, das eine Zusammenfassung der Deletionsklone zeigt.
Die 7 ist ein Diagramm, das die OLR der DNS der vorliegenden Erfindung zeigt.
Die 8 ist ein Diagramm, das eine Zusammenfassung der in der Konstruktion von Plasmiden verwendeten Klone zeigt, wobei jedes einen der OLR hat.
Die 9 ist ein Diagramm, das Plasmide mit jeweils einem der OLR zeigt.
Die 10 zeigt die Ergebnisse einer Umkehrphase-TLC (ein Chromatogramm), das die Enzymaktivität des Expressionsprodukts zeigt, wenn zwei Plasmide mit jeweils einem der OLR kombiniert werden.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben. Prenyldiphosphatsynthetasen haben 7 Bereiche, in welchen die Aminosäuresequenz relativ konserviert sind jenseits des Unterschieds in den Enzymen oder in der Organismenart. Es wird angenommen, dass diese Bereiche ebenfalls in der Hexaprenyldiphosphatsynthetase von Micrococcus luteus B-P 26 (erhalten von Dr. L. Jeffries, Walton Oaks Experimental Station Vitamins, Ltd.; hiernach bezeichnet als „M. luteus B-P 26") konserviert sind.
Dann wurde in der vorliegenden Erfindung das Prenyldiphosphatsynthetasegen von M. luteus B-P 26 unter Verwendung von rekombinanten DNS-Techniken basierend auf den konservierten Aminosäuresequenzen von bakteriellen Prenyldiphosphatsynthetasen kloniert.
Im Folgenden werden die Techniken für die DNS-Klonierung beschrieben.
Als Erstes wird genomische DNS aus einem Prenyldiphosphatsynthetase produzierenden Bakterium präpariert, zum Beispiel kultivierten Zellen von M. luteus B-P 26. Nachfolgend werden DNS-Sonden auf der Grundlage der 7 Bereiche synthetisiert, in welchen die Aminosäuresequenz jenseits des Unterschieds in der Art der Prenyldiphosphatsynthetase und der Mikroorganismenart, relativ konserviert ist, und Koloniehybrisierung oder Ähnliches wird unter Verwendung dieser Sonden durchgeführt, um dadurch ein interessierendes Gen in vollständiger Länge zu klonieren.
(1) Präparation der genomischen DNS
Die Kultivierung von M. luteus B-P 26 kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen. Zum Beispiel wird M. luteus B-P 26 in ein Medium inokuliert, das 0,5% Hefeextrakt, 1% Polypeptid und 1% Natriumchlorid enthält, und bei 30–37°C für 1–3 Tage kultiviert. Um genomische DNS aus kultivierten Zellen von M. luteus B-P 26 zu präparieren, kann jede bekannte Technik verwendet werden. Zum Beispiel werden die Zellen mit Lysozym behandelt, und dann mit einem oberflächenwirksamem Mittel wie etwa Natriumlaurylsulfat, behandelt. Danach werden Proteine aus dem Zelllysat mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Phenol, Chloroform, Ether oder Ähnliche entfernt, und dann wird das Lysat einer Ethanolpräzipitation unterzogen. Auf diese Weise kann die genomische DNS leicht durch herkömmliche Verfahren präpariert werden. (J. Mol. Biol., 3, 208, 1961).
Nachfolgend wird die erhaltene genomische DNS in Vektorplasmide ligiert, um eine genomische DNS-Bibliothek zu erzeugen. Dies kann durch herkömmliche Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel können genomische DNS-Ketten und Plasmid-DNS-Ketten mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut werden (zum Beispiel EcoRI, BamHI, HindIII, Sau3AI, MboI, PstI), und dann werden die resultierenden DNS-Fragmente mit einer DNS-Ligase (zum Beispiel T4 DNS-Ligase) oder in Abhängigkeit vom Zustand ihrer verdauten Enden, mit einer terminalen Transferase oder DNS-Polymerase behandelt. Danach werden die DNS-Fragmente unter Verwendung einer DNS-Ligase ligiert (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 269, 1982; Method in Enzymol., 68, 41, 1979). Als die Vektoren können hier ein λ-Phagenvektor (λ gt10, Charon 4A, EMBL- 3, etc.), ein Plasmidvektor (pBR322, pSC101, pUC19, pUC119, pACYC117) und Ähnliche aufgezählt werden. Die vorher beschriebenen DNS-Fragmente werden in diese Vektoren eingefügt, welche verwendet werden, um einen Wirtsorganismus, wie etwa Escherichia coli (zum Beispiel DH1, HB101, JM109, C600, MV1184, TH2) zu transformieren, um dadurch eine genomische DNS-Bibliothek zu erhalten.
(2) Herstellung von Sonden für das Screenen
Als erstes werden Sonden für das Screenen der vorher erwähnten genomischen DNS durch Hybridisierung hergestellt. Um Sonden mit höherer Selektivität herzustellen, wird es als geeignet angesehen, Oligonukleotide herzustellen, die für diejenigen Bereiche kodieren, in welchen Aminosäurereste zwischen verschiedenen Arten von Organismen stark konserviert sind. Sonden können durch herkömmliche chemische Synthese hergestellt werden. Als die Aminosäuresequenz, welche die vorher erwähnte Bedingung erfüllt, werden die folgenden konservierten Aminosäuresequenzen ausgewählt [die unterstrichenen Aminosäuren sind zu mehr als 50% in verschiedenen Arten von Organismen (siehe unten) konserviert] (2).
Die Sequenz „Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu" (SEQ ID NO: 7) in dem Bereich I
Die Sequenz „Ser Leu Ile His Asp Asp" (SEQ ID NO: 8) und die Sequenz „Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro" (SEQ ID NO: 9) in dem Bereich II
Die Sequenz „Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu" (SEQ ID NO: 10) in Bereich III
Die Sequenz „Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp" (SEQ ID NO: 11) und die Sequenz „Gly Lys Pro Val Gly Ser Asp" (SEQ ID NO: 12) in dem Bereich VI.
Die hierin verwendeten Bereiche I, II, III und VI entsprechen den Bereichen der Positionen 39–52, Positionen 73–103, Positionen 115–123 bzw. Positionen 217–250 in der Aminosäuresequenz für eine aus Bacillus stearothermophylus stammende FPS, beschrieben durch Koyama, T. et al., J. Biochem. 113, 355–363 (1993).
Die Untersuchung von konservierten Aminosäuresequenzen zwischen verschiedenen Organismenarten kann unter anderem an FPS aus Bacillus stearothermophylus, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Ratte und Mensch; GGPS von Erwinia herbicola und Erwinia uredovora; und HexPS aus Saccharomyces cerevisiae erfolgen. Der Entwurf der Sonden erfolgte auf der Grundlage der Aminosäuresequenzen der 7 Bereiche von Bacillus stearothermophylus, welcher wie M. luteus B-P 26 zu den Gram-positiven Bakterien gehört.
Auf der Grundlage dieser Aminosäurensequenzen wurden die folgenden Oligonukleotidsonden hergestellt.
P1: SEQ ID NO: 13
P2: SEQ ID NO: 14
P3: SEQ ID NO: 15
N1: SEQ ID NO: 16
N2: SEQ ID NO: 17
N3: SEQ ID NO: 18
N4: SEQ ID NO: 19
N5: SEQ ID NO: 20
Unter Verwendung der vorher beschriebenen genomischen DNS als eine Matrize und der vorher beschriebenen Oligonukleotide als Sonden, wird eine Hybridisierung durchgeführt.
(3) Screenen
Das Screenen nach einem
Hexaprenyldiphosphatsynthesasegens aus der genomischen DNS von M. luteus B-P 26 kann durch herkömmliche Verfahren erfolgen, z.B. Southern-Hybridisierung, Koloniehybridisierung und ähnliche.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein FPS-Gen von M. luteus B-P 26 durch das später in Beispiel 2 beschriebene Verfahren kloniert. Dem gemäß kann die Lokalisierung des FPS-Gens leicht durch radioaktive Markierung eines als B500 bezeichneten DNS-Fragments davon (SEQ ID NO: 28) und Durchführung von Southern-Hybridisierung identifiziert werden. Wie aus diesen Ergebnissen ersichtlich, haben die Erfinder gedacht, dass wenn dort in dem HexPS-Gen DNS-Sequenzen vorhanden sind, die für die konservierten Aminosäuresequenzen in Prenyldiphosphatsynthetasen kodieren, diejenigen DNS-Fragmente, welche mit der Sonde ein positives Signal ergeben und nicht aus dem FPS-Gen stammen, ausgewählt werden können.
Dann wurde in der vorliegenden Erfindung eine Southern-Hybridisierung der genomischen DNS von M. luteus B-P 26 unter Verwendung der wie vorher beschrieben hergestellten Sonden durchgeführt.
Kurzgefasst, wird die genomische DNS von M. luteus B-P 26 mit geeigneten Restriktionsenzymen (EcoRI, HindIII, PstI) getrennt verdaut. Die resultierenden Restriktionsfragmente werden elektrophoretisch auf Agarosegel aufgetrennt. Dann wird das Gel mit einer Base behandelt, um die DNS in einzelsträngige DNS zu denaturieren und wird auf eine Nylonmembran transferiert. Diese Nylonmembran wird mit UV bestrahlt, um die DNS auf der Membran zu fixieren. Nachfolgend wird eine Hybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde oder B500 als eine Sonde durchgeführt. Nach dem Waschen wird eine Autoradiographie mit einem Bio-Bildanalysator durchgeführt, um dadurch die Lokalisierung derjenigen DNS-Banden mit Homologie zu der Sonde zu bestimmen.
Die Sonden (P1, P2, N3, N4 und N5) wurden am Ende mit ³²P durch enzymatischen Transfer der Phosphatgruppe aus [γ-³²P] ATP an das 5' Ende markiert. Andererseits wird B500 mit ³⁵S mit einer [α-³⁵S] dCTP durch das wahllose Primermarkierungsverfahren markiert, um eine Sonde zu erhalten.
(4) Klonierung von DNS-Fragmenten, die schwach mit der Sonde B500 hybridisieren
Die Sonde B500 ist ein DNS-Fragment, die, wie vorher beschrieben, einen Bereich des FPS-Gens von M. luteus B-P 26 enthält. Daher hybridisiert diese Sonde stark mit dem FPS-Gen. Ebenfalls enthält B500 DNS-Sequenzen, die für konservierte Aminosäuresequenzen innerhalb der Prenyldiphosphatsynthetasen kodieren. Wenn das interessierende HexPS-Gen DNS-Sequenzen hat, die für die innerhalb der Prenyldiphosphatsynthetasen konservierten Aminosäuresequenzen kodieren, werden derartige DNS-Sequenzen ebenfalls mit B500 hybridisieren.
Dann wird, um ein Gen zu finden, das für das Peptid einer Phenyldiphosphatsynthetase der Erfindung kodiert, die Klonierung derjenigen DNS-Fragmente, die schwach mit B500 hybridisieren, unterschiedlich zu denjenigen DNS-Fragmenten, die aufgrund der Anwesenheit des FPS-Gens stark mit B500 hybridisieren, durchgeführt.
Mit EcoRI verdaute genomische DNS-Fragmente mit einer Größe von 4–6 kbp wurden aus dem Agarosegel extrahiert und in pUC119 eingefügt. Der E. coli Stamm JM109 wird mit dem resultierenden Plasmid transformiert, um dadurch eine diesen Bereich abdeckende DNS-Bibliothek zu erzeugen. Dann wird Koloniehybridisierung unter Verwendung jeder Sonde durchgeführt.
Die resultierenden Klone werden in einem geeigneten Medium kultiviert (z. B. LB-Flüssigmedium). Dann werden die Zellen jedes Klons geerntet und durch Ultraschall aufgeschlossen, um dadurch einen Enzymrohextrakt zu erhalten. Die HexPS-Aktivität wird unter Verwendung dieses Enzymrohextrakts bestimmt.
Derartig wurde ein Klon erhalten, der das Phenyldiphosphatsynthetasengen enthält, und dieser Klon wird für die DNS-Sequenzierung verwendet.
(5) Bestimmung der DNS-Sequenz
Der resultierende Klon wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut und auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt, um dadurch eine Restriktionskarte aus dem Auftrennungsmuster und dem Auftrennungsabstand zu erhalten.
Auf der Grundlage dieser Restriktionskarte wird die Deletion eines DNS-Fragments (d.h. Erzeugen kleinerer Fragmente) durchgeführt. Folglich wird der kleinste Klon, der Aktivität aufweist, erhalten, und die DNS-Sequenz für den kleinsten, Aktivität aufweisenden Klon wird analysiert.
Die Sequenz kann unter Verwendung von Deletionsklonen bestimmt werden, welche die eingefügte DNS mit einer Deletion von etwa 200 bp an beiden Enden in entgegengesetzten Richtungen enthält.
Der untersuchte Klon wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym (z. B. EcoRI, PstI) verdaut und in ein Plasmid wie etwa pUC119, pUC19 oder ähnliche kloniert. Dann kann die interessierende DNS-Sequenz durch herkömmliche Basensequenzanalyseverfahren, wie etwa das Dideoxyverfahren von Sanger et al. bestimmt werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)). Die Bestimmung der DNS-Sequenz kann mit einem automatischen Basensequenzanalysator unter Verwendung eines T7-Sequenzierkitts (Pharmacia) verfolgen.
Ist einmal die DNS-Sequenz derartig bestimmt, kann die interessierende DNS durch Hybridisierung eines aus einer chemischen Synthese erhaltenen DNS-Fragments oder durch PCR erhalten werden.
Die erfindungsgemäße DNS kann als ein Gen verwendet werden, um eine Prenyldiphosphatsynthetase zu exprimieren.
Als die derartig bestimmte DNS-Sequenz einer DNS, die für das Polypeptid einer Untereinheit der Prenyldiphosphatsynthetase kodiert, kann zum Beispiel die in SEQ ID NO: 21 gezeigte Basensequenz angegeben werden. Diese Basensequenz enthält 3 offene Leserahmen (OLR) bezeichnet als hex1, hex2 und hex3. Diese OLR entsprechen den Positionen 216 bis 644 (SEQ ID NO: 3), Positionen 622 bis 1359 (SEQ ID NO: 29) bzw. Positionen 1368 bis 2342 (SEQ ID NO: 4), in der in SEQ ID NO: 21 gezeigten DNS-Sequenz.
Die vorher beschriebenen OLR können durch herkömmliche rekombinante DNS-Techniken als Gesamtheit oder einzeln kloniert werden. Zum Beispiel kann die DNS, die für das Polypeptid einer Untereinheit der Prenyldiphosphatsynthetase kodiert, mit einem geeigneten Restriktionsenzym verdaut werden, um dadurch 3 Fragmente zu enthalten, die jeweils hex1, hex2 oder hex3 enthalten, welche individuell in einen mit dem gleichen Restriktionsenzym verdauten Plasmidvektor ligiert werden. Derartig können einzelne OLR kloniert werden.
(6) Identifizierung der Prenyldiphosphatsynthetasegene
Um zu untersuchen, ob die durch die vorher beschriebene Expression der drei Gene erhaltenen drei Polypeptide eine Aktivität haben oder nicht, werden Plasmide hergestellt, die jeweils ein der OLR enthalten, und eine Wirtszelle wird mit jedem der Plasmide transformiert. Die resultierende Transformante wird kultiviert, um dadurch einen Enzymrohextrakt herzustellen. Dann wird die Enzymaktivität an Prenyldiphosphatsynthetase unter Verwendung dieses Enzymrohextrakts untersucht.
Die Transformation einer Wirtszelle mit einem rekombinanten Vektor kann zum Beispiel durch Zugabe eines rekombinanten Vektors zu kompetenten Zellen, hergestellt mit CaCl₂, MgCl₂ oder RbCl, durchgeführt werden (wenn die Wirtszelle E. coli ist).
Um Zellen nachzuweisen, die das interessierende Gen enthalten, kann das Kolonie- oder Plaquehybridisierungsverfahren (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press) unter Verwendung von chemisch synthetisierten Oligonukleotidsonden auf der Grundlage der Aminosäuresequenz für das Protein, oder ähnliche, verwendet werden.
Die Fragmente, die die derartig klonierten DNS enthalten, die für Polypeptide der Prenyldiphosphatsynthetase kodieren, können einzeln in einem geeigneten Vektor (z. B. pMalc2, pTrc99A) wieder eingefügt werden, um dadurch die Gene stark in E. coli-Zellen zu exprimieren. Ferner ist es durch die Wiedereinfügung des Fragments in einen geeigneten Vektor möglich, andere prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen mit dem Vektor zu transformieren. Ferner kann, durch Einbringen in einen derartigen Vektor mit einem geeigneten Promotor und mit an der phänotypischen Expression beteiligten Sequenzen, das Gen in jeder Wirtszelle exprimiert werden.
Als eine Wirtszelle können aus Säugetieren stammenden Zellen, wie etwa COS-Zellen, chinesische Hamsterovarzellen (CHO), HELA-Zellen (humane Zervixkarzinomzellen), Sertolizellen von der Maus; aus Insekten stammende Zellen; und aus Hefezellen, wie etwa Pichia pastolis und Saccharomyces cerevisiae aufgezählt werden. Als ein Vektor, um diese Zellen zu transformieren, können BacPAK6, pSVL, SV40 und ähnliche aufgezählt werden. Diese Vektoren enthalten einen Replikationsursprung, einen selektierbaren Marker, einen Promotor, ein Polyadenylierungssignal und ähnliche.
Als ein Promotor für die Genexpression kann ein Promotor eines Retrovirus, eines Polyomavirus oder ähnliches verwendet werden.
Als ein Replikationsursprung kann einer aus SV40, Polyomavirus, Adenovirus, VSV usw. verwendet werden. Als ein selektierbarer Marker kann ein Thymidinkinase-Gen, ein Dihydrofolatreduktas-Gen, oder ähnliches, verwendet werden.
(7) Expression der Polypeptide
Um die Polypeptide der Untereinheit (A) und/oder die Polypeptide der Untereinheit (B) einer Prenyldiphosphatsynthethase in einer Kultur unter Verwendung des vorher erwähnten Wirts-Vektorsystems zu akkumulieren und die Polypeptide zu sammeln, wird die Wirtszelle mit einer rekombinanten DNS transformiert, die durch Einfügen des interessierenden Gens in eine geeignete Stelle in dem Vektor erhalten wird, und dann wird die resultierende Transformante kultiviert. Ferner, um die Peptide von den Zellen oder aus der Kulturlösung abzutrennen und zu reinigen, können bekannte Techniken verwendet werden. Zum Beispiel Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie, Umkehrphasechromatographie und ähnliche, können für die Reinigung unabhängig voneinander oder in Kombination verwendet werden. Ob das gereinigte Polypeptid das interessierende Polypeptid ist, oder nicht, kann durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, Western-Blot, oder ähnliches, bestätigt werden.
(8) Herstellung einer heterodimeren, aktiven Prenyldiphosphatsynthetase
Erfindungsgemäß kann eine aktive Prenyldiphosphatsynthetase durch Herstellen der Peptide der einzelnen Untereinheiten einer heterodimeren Prenyldiphosphatsynthetase durch rekombinante DNS-Techniken und Mischen der resultierenden Peptide der einzelnen Untereinheiten hergestellt werden.
Zum Beispiel kann als eine Untereinheit (A) der Prenyldiphosphatsynthetase das Expressionsprodukt von hex1 angegeben werden, und als Untereinheit (B) das Expressionsprodukt von hex3. Durch Mischen des Expressionsprodukts von hex1 und des Expressionsprodukts von hex3 kann eine aktive Prenyldiphosphatsynthetase mit hoher Enzymaktivität erhalten werden.
Es ist anzumerken, dass weder eine Mischung des Expressionsprodukts von hex1 (Untereinheit (A)) und des Expressionsprodukts von hex2 noch eine Mischung des Expressionsprodukts von hex3 (Untereinheit (B)) und des Expressionsprodukts von hex2 eine Enzymaktivität von Prenyldiphosphatsynthetase hat.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSBEISPIELE DER ERFINDUNG
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlicher mit Bezug auf das folgende Beispiel beschrieben, welches nicht angesehen werden sollte, den technischen Umfang der Erfindung zu beschränken.
BEISPIEL 1
Präparation von genomischer DNS aus Micrococcus luteus
M. luteus B-P 26 wurde in 6 Liter L-Medium (mit 10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 5 g NaCl und 1 g Glukose pro Liter) bei 30°C für 24 Stunden kultiviert. Die Kulturlösung wurde bei 7000 U/min bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in Saline-EDTA (0,15 M NaCl, 0,1 M EDTA, pH 8,0) suspendiert und gewaschen und dann bei 7.000 U/min bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert.
Die derartig erhaltenen Zellen (etwa 17 g Feuchtgewicht) wurden in 17 ml Saline-EDTA suspendiert. Dann wurde 1 g Lysozym zu der Zellsuspension gegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert.
Nachfolgend wurden 36 ml sterilisiertes Wasser, 36 ml 1 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), 12 ml 5 M NaCl und 12 ml 10% SDS zu der Zellsuspension gegeben und gut suspendiert. Dann wurde die resultierende Suspension unter Verwendung von flüssigem Stickstoff eingefroren. Danach wurde die gefrorene Suspension bei 60°C aufgetaut und 1,0 g Lysozym wurde bei Raumtemperatur dazugegeben. Dann wurde die Suspension bei –70°C wieder eingefroren und bei 60°C wieder aufgetaut. Dieses Einfrieren und Auftauen wurde abermals wiederholt. Die Suspension wurde bei 37°C für 1 Stunde inkubiert und dann wurden 400 mg Lysozym und 3,1 mg Proteinase K dazugegeben und bei 55°C für 30 Minuten inkubiert. Ein gleiches Volumen (etwa 150 ml) Phenol wurde dazugegeben und für 20 Minuten unter Eiskühlung langsam geschüttelt. Die resultierende Suspension wurde bei 3000 U/min bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde gesammelt. Dieser Überstand wurde weiter bei 3000 U/min bei 4°C für 30 Minuten zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde in 15 ml Portionen in 50 ml konische Röhrchen (Falcon) verteilt. Zwei Volumina Ehtanol wurden vorsichtig zu jedem Röhrchen gegeben und vorsichtig gemischt. Das weiße Präzipitat von fadenartiger DNS wurde um einen Glasstab herumgewunden und in 36 ml verdünntem Saline-Citrat (0,015 M NaCl, 0,0015 M Trinatriumcitrat) gelöst, zu welchem 4 ml konzentriertes Saline-Citrat (1,5 M NaCl, 0,15 M Trinatriumcitrat) zugegeben wurde. Aus der Messung der Extinktion (A260) wurde eine Rohausbeute von etwa 44 mg gefunden. Um die RNS zu entfernen, wurden die folgenden Arbeitsschritte durchgeführt. Zu der DNS-Lösung wurden 40 ml verdünntes Saline-Citrat zugegeben, um eine Nukleinsäurekonzentration von etwa 0,5 mg/ml zu ergeben. Dann wurde RNaseTI und RNaseA in Endkonzentrationen von 3,6 μg/ml bzw. 50 μg/ml zugegeben und bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Ein gleiches Volumen an Phenol wurde dazugegeben und langsam durch Umdrehen des Röhrchens für 10 Minuten geschüttelt, während das Röhrchen mit Eis gekühlt wurde. Die resultierende Phenolmischung wurde bei 3000 U/min bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert und die wässrige Schicht wurde mit einer gemischten Lösung aus Phenol und Chloroform (1:1) gemischt.
Die resultierende Lösung wurde bei 3000 U/min bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert und die wässrige Schicht wurde gesammelt. Zwei Volumina Ethanol wurden zu der wässrigen Schicht zugegeben, um die DNS zu präzipitieren. Nach Zentrifugation bei 15000 U/min bei 4°C für 20 Minuten wurde das Präzipitat mit 70%, 80% und 90% Ethanol in dieser Reihenfolge gewaschen und schließlich in 50 ml TE (10 ml Tris-HCl), 1 mM EDTA, pH 7,4) suspendiert.
Aus der Messung der Extinktion wurde eine Ausbeute von 4,95 mg gefunden.
BEISPIEL 2
Amplifikation des FPP Synthetasegenfragments (B500) durch PCR und Klonierung des FPP-Synthetasegens.
Die im Folgenden beschriebenen Primer wurden auf der Grundlage der Aminosequenzen von „Gly Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu" (SEQ ID NO: 7) in dem konservierten Bereich I, „Ser Leu Ile His Asp Asp" (SEQ ID NO: 8) und „Asp Leu Arg Arg Gly Arg Pro" (SEQ ID NO: 9) im konservierten Bereich II, „Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu" (SEQ ID NO: 10) im konservierten Bereich III, „Phe Gln Ile Arg Asp Asp Ile Leu Asp" (SEQ ID NO: 11) und „Gly Lys Pro Val Gly Ser Asp" (SEQ ID NO: 12) im konservierten Bereich VI synthetisiert, gefunden innerhalb der Prenydiphosphatsynthetasen jenseits der Unterschiede in den Organismenarten.
Sinnprimer (Sense primers):

P1: SEQ ID NO: 13
P2: SEQ ID NO: 14
P3: SEQ ID NO: 15

Gegensinnprimer (Antisense primer):

N1: SEQ ID NO: 16
N2: SEQ ID NO: 17
N3: SEQ ID NO: 18
N4: SEQ ID NO: 19
N5: SEQ ID NO: 20

Eine PCR wurde unter Verwendung der vorher beschriebenen genomischen DNS als eine Matrize und den vorher erwähnten Oligonukleotiden als Primern durchgeführt.

Die PCR wurde in einer PCR-Lösung mit der im Folgenden beschriebenen Zusammensetzung mit 5 Zyklen durchgeführt, wobei 1 Zyklus bei 97°C für 90 Sekunden, bei 40°C für 90 Sekunden und bei 72°C für 120 Sekunden gefolgt von 20 Zyklen, 1 Zyklus mit 96°C für 90 Sekunden, 55°C für 90 Sekunden und 72°C für 120 Sekunden ist. Zusammensetzung der PCR-Lösung:

Genomische DNS	1 μg
Tris-HCl (pH 8,3)	10 mM
KCl	50 mM
MgCl₂	1,5 mM
Gelatine	0,001% (w/v)
dNTP-Mischung	je 200 μM
Primer	je 0,1 nmol
Ampli Taq DNS Polymerase	2,5 u
(Gesamtvolumen	100 μl)

Eine Bande mit etwa 500 bp (B500), welche spezifisch mit einer Kombination von P1 und N3 amplifiziert wird, wurde erhalten. Dieses DNS-Fragment wurde in einen pT7Blue T-Vektor (Novagen) ligiert, um dadurch pB500 zu erhalten. Als ein Ergebnis der Bestimmung seiner DNS-Sequenz durch das Dideoxyverfahren, wurde gefunden, dass die durch B500 kodierte Aminosäuresequenz in 145 Aminosäuren 60,7 Homologie zu der Aminosäuresequenz der FPS von Bacillus stearothermophilus hat. Die genomische DNS von M. luteus B-P 26 wurde teilweise mit Sau3AI verdaut. Die resultierenden DNS-Fragmente von 4–8 kbp wurden in pUC119/BamHI eingefügt, und der E.coli Stamm JM109 wurde mit diesen Plasmiden transformiert, um dadurch eine genomische Bibliothek zu erzeugen. pB500 wurde mit PstI und BamHI verdaut und dann auf einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um DNS-Fragmente abzutrennen und zu gewinnen. Die erhaltenen B500-Fragmente wurden unter Verwendung des Random Primer Labeling Kit (Takara Shuzo) gemäß dem beigefügten Protokoll markiert. Eine Bibliothek von etwa 6000 Kolonien wurde durch Koloniehybridisierung mit markierten 8500-Fragmenten als Sonden gescreent, um dadurch mit B500 hybridisierende Klone zu erhalten. Die Prenyldiphosphatsynthetaseaktivität dieser Klone wurde gemessen und ihre Produkte wurden analysiert. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass ein Produkt eine FPP-Synthetase ist.
BEISPIEL 3
Southern-Hybridisierung der genomischen DNS aus M. luteus B-P 26.
(1) Blot der genomischen DNS auf eine Nylonmembran
Die in Beispiel 1 hergestellte genomische DNS aus M. luteus B-P 26 wurde einem Southern-Blot unterzogen.

Genomische DNS 100 μl (10 μg)

10 × Puffer 30 μl

Sterilisiertes Wasser 162 μl

Enzym 8 μl
In der vorher erwähnten Zusammensetzung reagierte 10 μg der genomischen DNS aus M. luteus B-P 26 mit einem der Restriktionsenzyme EcoRI (10 E/μl), PstI (100 E/μl) und HindIII (12 E/μl) bei 37°C für 40 Stunden, um einen vollständigen Verdau zu ermöglichen. Die Reaktionslösung wurde mit Phenol-Chloroform und dann mit Chloroform behandelt. Danach wurde die Lösung mit Ethanol präzipitiert. Die resultierende DNS wurde unter reduziertem Druck getrocknet und dann in 100 μl TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) zu einer Konzentration von 350 ng/μl gelöst. Drei DNS-Lösungen (10 μl jeweils) wurden auf 0,8% Agarosegel elektrophoretisch getrennt. Für den Southern-Blot wurde eine Plattentransfervorrichtung, NA-1512 (Nippon Eido K. K.) verwendet. Die verwendeten Restriktionsenzyme waren kommerzielle Enzyme (erhältlich von Takara Shuzo, NEB oder Boehringer Mannheim).
Nach der Elektrophorese der DNS wurde das Agarosegel in eine Lösung mit 1,5 M NaCl und 0,5 M NaOH getaucht und langsam für 30 Minuten geschüttelt, um dadurch die DNS zu denaturieren. Eine Nylonmembran und ein Filterpapier wurden in die gleiche Größe wie das Gel geschnitten und in eine Lösung mit 0,25 M NaOH und 1,5 M NaCl eingetaucht. Das Agarosegel und die Nylonmembran wurden in der Plattentransfervorrichtung, wie in der 3 gezeigt, geschichtet. Dann wurde ein elektrischer Strom (konstant) von 150 mA an die Vorrichtung für 60 Minuten angelegt, um dadurch die DNS auf die Nylonmembran zu transferieren. Diese Membran wurde mit 5 × SSC (0,5 M NaCl, 0,075 M Natriumcitrat) gewaschen, auf einem Filterpapier luftgetrocknet und dann mit UV-Strahlen (120 mJ/cm²) bestrahlt, um dadurch die DNS auf der Membran zu fixieren.
Die derartige gehaltene Nylonmembran wurde in der Southern-Hybridisierung verwendet.
(2) Herstellung von Sonden für die Southern-Hybridisierung

B500, welches ein DNS-Fragment des FPS-Gens ist, wurde unter Verwendung von Zufalls-Primern (9er-mere) und [α-³⁵S] dCTP (Amersham) markiert. Die synthetischen als Sonden verwendeten, Oligonukleotide wurden durch enzymatischen Transfer der Phosphatgruppe an der γ Position von [γ-³²P] ATP (Amersham) mittels der T4-Polynukleotidkinase enthalten in der folgenden Zusammensetzung an ihr 5'-Ende markiert.

5'-OH Oligonukleotide (P1, P2, N3, N4, N5)	10 pmol
10 × Kinasepuffer	1 μl
[γ-³²P] ATP (3000 Ci/mmol, 10 μ Ci/μl)	3 μl
T4 Polynukleotidkinase (10 U/μl)	1 μl
Sterilisiertes Wasser	auf 10 μl

10 × Kinasepuffer: 0,5 M Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 M MgCl₂ 50 mM DTT Lösung

Die vorherige Zusammensetzung reagierte bei 37°C für 30 Stunden, und wurde dann bei 95°C für drei Stunden wärmebehandelt, um die T4-Polynukleotidkinase zu inaktivieren. Die derartig gehaltenen endmarkierten Oligonukleotide wurden als Sondern für die Southern-Hybridisierung verwendet.
Nachfolgend wurde die Hybridisierung mit den markierten Sonden und Waschen durchgeführt. Dann wurde eine Autoradiographie unter Verwendung eines Bio-Bildanalysators, hergestellt durch Fuji Film, durchgeführt.
Drei identische Nylonmembran wurden vorbereitet und als Nr. 1, Nr. 2 und Nr. 3 bezeichnet, als Erstes wurde Nr. 1 mit der Sonde B500 hybridisiert, Nr. 2 mit der Sonde N4 und Nr. 3 mit der Sonde N5. Dann wurde eine Autoradiographie durchgeführt. Danach wurden die Filter gewaschen, um die hybridisierenden Sonden vollständig zu entfernen. Danach wurden sie wieder mit Sonden P1, P2 bzw. N3 rehybridisiert und dann autoradiographiert.
Die Ergebnisse sind in der 4 gezeigt. Von diesen Autoradiogrammen, scheinen mit Blick auf ihre starke Bindung an die Sonde B500 die mit einer Markierung „
" bezeichneten, Fragmente des FPS-Gens zu sein. Ferner, mit Bezug auf die mit EcoRI verdaute, genomische DNS, wurde eine schwache Bande (mit der Markierung „Δ" bezeichnet; etwa 4,2 kbp) unter der FPS-Bande bestätigt. Es ist zu sehen, dass diese Bande von etwa 4,2 kbp ebenfalls relativ stark an die Sonde N4 bindet.
Da das FPS-Gen keine EcoRI-Restriktionsschnittstelle in seinem Inneren hat, wird das FPS-Gen nie durch EcoRI verdaut und weist zwei Banden auf. Dem gemäß gibt es eine Möglichkeit, dass diese schwach bindende etwa 4,2 kbp-Bande ein Gen einer anderen Prenyldiphosphatsynthetase enthält.
Daher wurde dieses DNS-Fragment von etwa 4,2 kbp kloniert.
(3) Klonierung des DNS-Fragments, das schwach mit der Sonde B500 hybridisiert
Die 4–6 kbp-Fraktionen der mit EcoRI verdauten genomischen DNS wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNS-Fragmente wurden unter Verwendung des GENECLEAN II Kit (BIO 101) gereinigt.
Diese DNS-Fragmente wurden in pUC119 eingefügt und dann wurde der E. coli-Stamm JM109 mit dem Plasmid transformiert. Nachfolgend wurde Koloniehybridisierung durchgeführt.
Als ein Ergebnis wurden drei Kolonien, die mit jeder Sonde hybridisieren, aus etwa 1.200 Kolonien erhalten. Diese Klone wurden in LB-Medium kultiviert. Die Zellen wurden geerntet und durch Ultraschall aufgeschlossen, um dadurch einen Enzymrohextrakt zu erhalten. Die Messung der Prenyldiphosphatsynthetaseaktivität wurde an dieser Enzymrohlösung durchgeführt.
Die Messung der Aktivität wurde wie folgt durchgeführt.
Kurzgefasst wurden positive Kolonien in 50 ml L-Medium über Nacht kultiviert. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation bei 3000 U/min bei 4°C für 20 Minuten geerntet und in 3 ml TE suspendiert. Diese Suspension wurde mit Ultraschall behandelt, um die Zellen auszuschließen. Dann wurde die Suspension bei 3000 U/min bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde weiterhin bei 15000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um dadurch einen Überstand als einen Enzymrohextrakt zu erhalten. Die Ultraschallbehandlung wurde bei einer Ausgabeleistung von 40 W mit 30% Impulse über 5 Minuten durchgeführt.

Rohhomogenat 20 μg

Tris-HCl (pH 7,5) 100 mM

MgCl₂ 5 mM

FPP 5 μM

[1-¹⁴C]IPP (54 Ci/mol) 0,46 μM

H₂O auf 1 ml
Die vorherige Zusammensetzung reagierte bei 37°C für 3 Stunden. Zu der Reaktionslösung wurden 3 ml Butanol zugegeben und geschüttelt. Die Mischung wurde stehen gelassen oder zentrifugiert, um sich dadurch in zwei Schichten zu trennen. Die Butanolschicht wurde wiedergewonnen. Unter Verwendung von 500 μl dieser Schicht wurde der Grad an Radioaktivität in dem Produkt mit einem Flüssigkeitszintillationszähler gemessen. Ebenfalls wurden 2 ml der gewonnenen Butanolschicht mit saurer Phosphatase behandelt und einer Umkehrphase Dünnschichtchromatographie (TLC) unterzogen, um dadurch das Produkt zu analysieren.

BuOH-Extrakt 2 ml

Acetatpuffer (pH 5,6) 1 ml

5% Triton X-100 100 μl

MeOH 1 ml

Saure Phosphatase (1 g/28 ml) 500 μl
Die vorherige Zusammensetzung reagierte bei 37°C für 14 Stunden. Zu der Reaktionslösung wurden 4 ml Pentan zugegeben und geschüttelt. Die Mischung wurde stehen gelassen oder zentrifugiert, damit sie sich dadurch in zwei Schichten auftrennt. Dann wurde die Pentanschicht wiedergewonnen. Das Lösungsmittel wurde mit Stickstoffgas entfernt, und das verbleibende Material wurde in 100 μl Pentan gelöst und auf einer LKC18 Umkehrphase Dünnschichtchromatographie (Whatman; Entwicklungslösungsmittel: Aceton/Wasser = 19/1) aufgebracht.
Die Ergebnisse sind in der 5 gezeigt.
Aus diesen Ergebnissen wurde gefunden, dass das Produkt eine HexPP ist.
Folglich wurde ein Klon erhalten, der ein HexPP-Gen enthält und als pHX00 bezeichnet. Danach wurde dieser Klon bei der Analyse der DNS-Sequenzen verwendet.
BEISPIEL 4
Analyse einer Restriktionskarte und von DNS-Sequenzen
(1) Herstellung von Deletionsklonen aus pHX00
Eine Restriktionskarte von pHX00 wurde erstellt und Deletionsklone wurden auf der Grundlage dieser Karte hergestellt. Folglich wurden DNS-Fragmente verschiedener Länge erhalten (6). Wie in der 6 gezeigt, wurden die Fragmente pHX01–pHX05 und pEcoRV-L wie folgt hergestellt. Zuerst wurde pHX00 mit XbaI verdaut und der Verdau wurde an der für jedes Fragment angegebenen Stelle geschnitten (z.B. die MluI-Stelle für pHX02 und die NruI-Stelle für pHX05). Der resultierende Verdau wurde elektrophoretisch auf einem Agarosegel getrennt und ein DNS-Fragment mit der vorhergesagten Länge wurde unter Verwendung des GENECLEAN II Kit (BIO 101) gewonnen. Nachfolgend wurden die Enden der DNS-Fragmente mit T4-DNS-Polymerase glatt gemacht. Dann wurde ein interessierender Deletionsklon durch Selbst-Ligation hergestellt.
Die Fragmente pSacI-L und pSacI-s in der 6 stellten die zwei Fragmente dar, die durch Schneiden von pHX00 mit SacI erzeugt wurden. Das längere Fragment (das pUC119 enthält) wurde selbstligiert, um pSacI-s zu erhalten, und das kürzere, mit SacI verdaute Fragment wurde in einen weiteren pUC119 ligiert, um pSacI-L zu erhalten.
Die Fragmente pPstI-L und pPstI-s in der 6 wurden in einer ähnlichen Art und Weise aus pHX01 erhalten. Mit anderen Worten wurde pHX01 mit PstI verdaut. Das längere der resultierenden zwei Fragmente wurde selbstligiert, um pPstI-s zu erhalten, und das kürzere wurde in die PstI-Stelle eines anderen pUC119 ligiert, um pPstI-L zu erhalten (6).
Mit pSacI-L und pPstI-L wurden zwei Plasmide mit jeweils entgegengesetzten Insertionsrichtungen erhalten.
Diese Plasmide mit entgegengestzten Richtungen wurden als pSacI-L-1 und -2 bzw. pPstI-L-1 und -2 bezeichnet.
Für jede der vorher beschriebenen Deletionsklone wurde die Prenyldiphosphatsynthetaseaktivität gemessen. Als ein Ergebnis wurde ein Klon mit minimaler Länge, der Aktivität aufwies, pHX05, erhalten (6).
Ferner wurden Deletionsklone mit seriellen Deletionen in der rechten und der entgegengesetzten Richtung des Gens aus pPstI-L-1 und pPstI-L-2 unter Verwendung des Deletionsreagenziensatz für Kilo-Sequenzen (Takara Shuzo) gemäß dem an den Reagenziensatz angehefteten Protokoll hergestellt. Unter Verwendung der derartig hergestellten Deletionsklone wurden die Basensequenzen analysiert.
(2) Bestimmung der DNS-Sequenz
Die durch das Alkali-SDS-Verfahren hergestellten Deletionsklone wurden wie im Folgenden beschrieben basisch denaturiert, um eine Matrizen-DNS (Template) herzustellen.

Matrize 32 μl (1,5–2 μg DNS)

2 M NaOH 8 μl

Gesamtvolumen 40 μl
Die vorherige Lösung wurde hergestellt, leicht geschüttelt und bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert. Zu der resultierenden Lösung wurden 7 μl 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und 4 μl destilliertes Wasser hinzugegeben.
Dann wurde weiterhin 120 μl Ethanol zugegeben und gemischt. Danach wurde die Lösung in Trockeneis für 15 Minuten gestellt. Die Lösung wurde bei 15.000 U/min bei 4°C 15 Minuten zentrifugiert, um die DNS zu präzipitieren, welche mit 70% Ethanol gewaschen und bei 15.000 U/min bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde verworfen. Dann wurde die DNS unter reduziertem Druck getrocknet und in 10 μl destilliertem Wasser gelöst.
Unter Verwendung der derartig hergestellten DNS als eine Matrizen-DNS erfolgte die Analyse der Basensequenz durch das Dideoxyverfahren mit dem T7-Sequencing Kit (Pharmacia) und [α-³⁵S]dCTP (Amersham).
Die analysierte DNS-Sequenz wird in der SEQ ID NO: 21 gezeigt.
Als ein Ergebnis wird deutlich, dass pHX05 3 offene Leserahmen enthält, die für Proteine kodieren. Sie werden in Richtung stromabwärts als hex1, hex2 und hex3 bezeichnet (7).
hex1 kodiert für ein aus 143 Aminosäuren bestehendes Protein, gezeigt in der SEQ ID NO: 1. Das vermutete Molekulargewicht dieses Proteins war 17 kDa. hex2 kodiert für ein Protein bestehend aus 246 Aminosäuren, gezeigt in der SEQ ID NO: 29. Das vermutete Molekulargewicht dieses Proteins war 28 kDa. Die ersten 23 Basen enthalten das Initiationskodon, das mit einem Stromabwärtsbereich von hex1 überlappt. hex3 kodiert für ein Protein bestehend aus 325 Aminosäuren, gezeigt in der SEQ ID NO: 2. Das vermutete Molekulargewicht von diesem Protein war 37 kDa.
Die Aminosäuresequenzen (Hex1, Hex2 und Hex3) der durch diese 3 offenen Leserahmen (OLR) kodierten Proteine wurden mit den Aminosäuresequenzen (Hep1 und Hep2) der durch die HepPS-Gene kodierten Proteine (hep1, hep2) von Bacillus stearothermophilus verglichen. Als ein Ergebnis weist Hex3 36,4 Homologie zu Hep2 auf und enthält die wie vorher beschrieben 7 konservierten Bereiche, die in Prenyldiphosphatsynthetasen üblich sind.
Andererseits weist Hex1 nur 8,4% Homologie zu Hep1 auf und besteht aus einer sehr kleinen Anzahl (d. h. 143) Aminosäuren, während Hep1 aus 220 Aminosäuren besteht.
Die Strukturgene von Bacillus stearothermophilus HepPS sind hep1 und hep2. Von der Homologie dieser Gene wurde erwartet, dass hex3 das Strukturgen des HexPS von M. luteus B-P 26 ist. Jedoch konnten hex1 und hex2 nicht so bewertet werden, weil sie keine hohe Homologie mit hep1 aufweisen. Dann entschieden die Erfinder zu bestimmen, welcher OLR das Strukturgen der HexPS ist.
BEISPIEL 5
Messung der Aktivität von heterodimeren Prenyldiphosphatsynthetasen (1)
(i) Identifikation des HexPP-Synthetasegens
Um ein Plasmid herzustellen, das hex1 allein enthält, wurde pdel 2–5 mit HincII und NruI verdaut und die resultierenden Fragmente wurden selbstligiert (8 und 9). Folglich wurde pREG1 erhalten. Auf ähnliche Weise wurde, um das Plasmid herzustellen, das hex2 allein enthält, das SacI-SacI-Fragment aus pdel 1-1 ausgeschnitten und in die SacI-Stelle von pUC199 eingefügt, um dadurch pREG2 zu erhalten (8 und 9).
Ein Plasmid, das hex3 allein enthält, wurde wie folgt hergestellt. pdel1-13 wurde mit EcoRI verdaut. Nachdem die Fragmente mit glatten Enden versehen wurden, wurden sie ferner mit PstI verdaut. Ferner wurde pPstI-S mit HindIII verdaut. Nachdem die Fragmente mit glatten Enden versehen wurden, wurden sie mit PstI verdaut. Diese Fragmente wurden ligiert, um pREG3 zu erhalten. Da pREG3 stromabwärts etwa 400 bp von hep3 enthält, wurde pREG3 mit EcoRI und EcoT14I verdaut und nachdem die Enden der Fragmente geglättet waren, wurden die Fragmente ligiert, um pREG3S zu erhalten (8 und 9). „pdel 2-5", „pdel 1-1" und „pdel 1-13", wie hierin verwendet, sind Deletionsklone vom vorher beschriebenen pPstI-L, welche mit dem Deletionsreagenziensatz für Kilo-Sequenz hergestellt wurden.
Folglich wurden Plasmide, die jeweils einen der in der eingefügten DNS von pHX05 gefundenen drei Bereiche (hex1, hex2 und hex3) enthalten, hergestellt (9).
Da pHX05, das hex1, hex2 und hex3 enthält, stromabwärts etwa 400 bp von hex3 einschließt, wurde pHX00 mit NruI und EcoT14I verdaut und dann in einen mit HincII-verdauten pUC119 ligiert. Von den resultierenden zwei Klonen, wurde der eine mit der gleichen Richtung des Gens wie die von pHX05 ausgewählt und als pHX06 bezeichnet (9).
Der E. coli-Stamm JM109 wurde mit den vorher erwähnten Plasmiden transformiert und die Enzymaktivität wurde wie vorher beschrieben gemessen.
Transformanten, die die Plasmide pREG1, pREG2 und pREG3 tragen, die hex1, hex2 bzw. hex3 Gene enthalten, wurden beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, wie folgt hinterlegt:

pREG1/JM109 FERM BP-5910

pREG2/JM109 FERM BP-5911

pREG3S/JM109 FERM BP-5912
(ii) Messung der Enzymaktivität
Ein Enzymrohextrakt wurde aus jedem der erhaltenen Klone hergestellt. Die Enzymaktivität der in Tabelle 1 gezeigten Kombinationen wurde untersucht.
Das Ergebnis wird in der Tabelle 1 und der 10 gezeigt.
Die Spuren 1–9 in der 10 entsprechen den Spuren 1–9 in Tabelle 1.
Aus der Tabelle 1 und der 10 wurde gefunden, dass die HexPS-Aktivität aufgewiesen wird, wenn die durch hex1 und hex2 kodierten Polypeptide zur gleichen Zeit vorhanden sind (Tabelle 1, Spalten 1 und 2 und 9: 10, Spuren 1 und 9). In anderen Worten wird die Enzymaktivität durch Mischen des Polypeptids hex1 [d. h. Polypeptid der Untereinheit (A)] mit dem Polypeptid Hex3 [d. h. Polypeptid der Untereinheit (B)] ausgebildet. Durch die vorherigen Ergebnisse wird ebenfalls gezeigt, dass hex1 und hex3 die Strukturgene von HexPS sind.
WIRKUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren für die Herstellung von Peptiden von Prenyldiphosphatsynthetasen, ein Verfahren für die Herstellung einer aktiven Prenyldiphosphatsynthetase, eine für die Synthetase kodierende DNS, ein die DNS umfassender, rekombinanter Vektor und ein Transformant mit dem Vektor zur Verfügung gestellt.
Durch die erfindungsgemäße
Prenyldiphosphatsynthetase synthetisierte Substanzen sind Vorläufer von denjenigen Substanzen, wie etwa Vitamin K und Ubichinonen, welche universell in Organismen vorhanden sind, und folglich sind sie wichtige, physiologisch aktive Substanzen. Daher haben sie einen hohen Nutzwert. Ferner ist das durch eine heterodimere Prenyldiphosphatsynthetase hergestellte Prenyldiphosphat sehr nützlich, da die Kettenlänge und die strukturellen Isomere davon streng kontrolliert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNS, die für ein Polypeptid ausgewählt aus einem Polypeptid einer Untereinheit (A) einer Prenyldiphosphatsynthetase oder einem Polypeptid einer Untereinheit (B) davon kodiert, wobei das Polypeptid der Untereinheit (A) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 und das Polypeptid der Untereinheit (B) die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 hat.
DNS nach Anspruch 1, wobei die für das Polypeptid der Untereinheit (A) kodierende DNS die SEQ ID NO: 3 hat.
DNS nach Anspruch 1, wobei die für das Polypeptid der Untereinheit (B) kodierende DNS die SEQ ID NO: 4 hat.
Rekombinanter Vektor mit der DNS nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
Transformant, erhältlich durch Transformieren eines Wirtsorganismus' mit dem rekombinanten Vektor des Anspruchs 4.
Verfahren für die Herstellung eines Polypeptids der Untereinheit (A) und/oder eines Polypeptids der Untereinheit (B) einer Prenyldiphosphatsynthetase, mit Kultivieren des Transformanten des Anspruchs 5 in einen Medium, um dadurch das Polypeptid der Untereinheit (A) und/oder das Polypeptid der Untereinheit (B) in der Kultur anzureichern, und Sammeln des/der Polypeptids/e.
Polypeptid, ausgewählt aus einem Polypeptid der Untereinheit (A) einer Prenyldiphosphatsynthetase, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 hat, und eines Polypeptids der Untereinheit (B) einer Prenyldiphosphatsynthetase, welche die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 hat.
Verfahren für die Herstellung einer Prenyldiphosphatsynthetase vom aktiven Typ, mit Herstellen der Peptide der einzelnen Untereinheiten einer heterodimeren Prenyldiphosphatsynthetase durch rekombinante DNS-Techniken und Mischen der resultierenden Peptide der einzelnen Untereinheiten, wobei die Peptide der einzelnen Untereinheiten das Polypeptid der Untereinheit (A) bzw. das Polypeptid der Untereinheit (B) des Anspruchs 1 sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Peptide der zwei Untereinheiten das Polypeptid mit der SEQ ID NO: 1 bzw. das Polypeptid mit der SEQ ID NO: 2 sind.