FI112376B - TAKA-amylaasipromoottori - Google Patents

Description

112376 TAKA-amylaasipromoottori - TAKA-amylaspromotor Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta FI-871144.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää proteiinituotteiden ilmentämiseksi Aspergillus oryzaella, yhdistelmä-DNA-vekto-reita, promoottoria Aspergillukselle ja transformoiduille sienille.

Aikojen kuluessa on kehitetty lukuisia menetelmiä polypepti-dien tai proteiinien tuottamiseksi yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla. Päämielenkiinto on keskittynyt bakteereihin ja hiivaan, esim. E. coli, Bacillus subtilis ja Saccharomyces cere-visiae, jotka ovat hyvin ominaisuuksiltaan tunnettuja lajeja, mitä tulee esimerkiksi ilmenemis- ja valintasysteemeihin.

Paitsi yllä mainitut mikro-organismit, rihmastolliset sienet, kuten Aspergillus niger, ovat houkuttelevia ehdokkaita isän-tämikro-organismeina yhdistelmä-DNA-vektoreille, niiden ol- * '* lessa hyvin ominaisuuksiltaan tunnettuja ja laajalti käytet- v : tyjä mikro-organismeja kaupalliseen entsyymien tuotantoon.

•’·· Ponnistelut on erityisesti keskitetty transformaatiosysteemi-:··: en kehittämiseen, joiden yhteydessä käytetään valintamarkke- :·· ria, joka antaa mahdollisuuden valikoida transformantteja .··*. isäntämikro-organismeista, joita ei ole transformoitu.

. Muutamana viime vuonna on kuvailtu erilaisia valintamarkke-reita Aspergillus nidulansin transformaatiota varten, ja me- • · ·;·’ netelmiä on äskettäin kehitetty rihmastollisen sienen, Asper-: gillus nidulansin integroivaa transformaatiota varten tarkoi- tuksena tutkia geneettisiä ja molekulaarisia prosesseja, jot- / . ka säätelevät sienisolun erilaistumista.

» * * 112376 2 A. nidulansin transformaatio on näytetty toteen käyttämällä plasmideja, jotka sisältävät Neurospora crassan pyr-4-geem'n (Ballance, D.J. et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112 (1983) 284-289), A. nidulansin amdS-geenin (Tilburn, J.G. et ai., Gene ££ (1983) 205-221), A. nidulansin trpC-geenin (Yelton, M.M. et ai., Proc. Natl . Acad. Sei. USA. 8£ (1984) 1470-1474) ja A. nidulansin argB-geenin (John, M.A. ja Pe-berdy J., Microb. Technol. 6 (1984) 386-389). Transformoivan DNA:n todettiin olevan yhdistynyt isäntägenomiin melko alhaisella esiintymistiheydel.lä (tyypillisesti < 1000 transfor-manttia/^ug DNA:ta)*.

Aivan äskettäin kuvailtiin Aspergillus nigerin transformaatiota A. nidulansin amdS- geenillä (Kelly, J.M. ja Hynes, M.J., EMBO Journal £ (1985), 475-479), ja amdSrn osoitettiin olevan mahdollinen vaiintamarkkeri käytettäväksi Aspergillus nigerin transformaatiossa, joka ei pysty kasvamaan voimakkaasti asetamidin ainoana typenlähteenä. Äskettäin on kuvailtu myös Aspergillus nigerin transformaatiota käyttäen Aspergillus nidulansin argB-geeniä (Buxton, F.P. et ai., Gene 37_ ( 1985 ), 207-214 ).

Toistaiseksi ei ole kehitetty mitään systeemejä vieraiden ; " proteiinien ilmentämiseksi rihmastollisissa Aspergillus ory-’"·* zaesienissä, johtuen pääasiassa riittämättömästä tietämykses-tä siitä, kuinka'geenin ilmenemistä tässä sienessä säädellään, ja johtuen sopivien valikoivien geneettisten markkereiden puuttumisesta kloonausvektoreistä.

I » » * · ,···. Esillä olevan keksinnön mukaisesti on nyt osoitettu, että edellä olevaa transformaatiotekniikkaa voidaan käyttää, jotta v : saavutettaisiin heterologiSten proteiinien suuri ilmenemisen taso, tai homologisten proteiinien lisääntynyt tuotanto Aspergillus oryzaella.

112376 3 Tässä yhteydessä käytettynä, ilniaisu "heterol ogi set proteiinit" tarkoittaa proteiineja, joita A. oryzae ei tuota, kun taas "homologiset proteiinit" tarkoittavat proteiineja, joita A. oryzae tuottaa itse.

Erityisemmin on osoitettu, että A. oryzae -kantojen valikointi, jotka on transformoitu DNA:11a, joka koodaa haluttua proteiinituotetta, on mahdollista käyttämällä merkkigeenejä, joita käytetään A. nigerin ja A. nidulansin transformaatioon.

Näiden viimeksi mainittujen sienten ja A. oryzaen välisestä fylogeneettisestä etäisyydestä johtuen (Raper, K.B. ja Fennell, D.I. (1965) The Genus Aspergillus) tämä ei ollut mitenkään aavistettavissa.

Esillä olevan keksinnön mukaisen ensimmäisen näkökohdan mukaisesti annetaan käyttöön menetelmä proteiinituotteen ilmentämiseksi Aspergillus oryzaessa, käsittäen vaiheet: (a) yhdistelmä-DNA:n kloonausvektori systeemi n tuottamisen, joka pystyy yhdistymään Aspergillus oryzae -isännän genomiin yhdessä tai useammassa kopiossa, ja joka käsittää: DNA-sek- • *· venssejä, jotka koodaavat toimintoja, jotka helpottavat gee- / nin ilmenemistä; sopivan markkerin transformanttien valikoimiseksi; ja DNA-sekvenssin, joka koodaa haluttua proteiini-;··· tuotetta, (b) Aspergillus oryzae -isännän transformoinnin, joka A. ory- . ···. zae ei sisällä toiminnallista geeniä valittua vai intamarkkeri a varten, yhdistelmä-DNA:n kloonausvektorisysteemi 11ä vaiheesta . a; ja I » · * · (c) transformoidun Aspergillus oryzae -isännän viljelemisen sopivassa kasvualustassa.

Esillä olevan keksinnön mukaisen toisen näkökohdan mukaisesti, annetaan käyttöön suuritehoinen promoottori proteiinituotteen • * ilmentämiseksi Aspergi11 uksessa, erityisesti Aspergillus oryzaessa ja Aspergillus nigerissä, jolle promoottorille on omi- 112376 4 naista se, että se on TAKA-amylaasi promoottori tai toiminnallisia osia siitä, jota valinnaisesti edeltävät aktivoivat, geenin yläpuoliset sekvenssit.

Esillä olevan keksinnön mukaisen kolmannen näkökohdan mukaisesti annetaan käyttöön menetelmä proteiinituotteen tuottamiseksi Aspergillus oryzaessa, jonka menetelmän mukaan Aspergillus oryzae -kantaa, joka transformoidaan yhdistelmä-DNA:n kloonausvektorisysteemi 11ä, kuten edellä kuvailtiin, viljellään sopivassa kasvualustassa, ja tuote otetaan talteen kasvualustasta.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan edelleen viittaamalla oheisiin piirroksiin, joissa kuvio 1 esittää TAKA-amylaasin promoottorin DNA-sekvenssiä, ja yläpuolisia promoottori aiueita, TAKA-amylaasi n rakennegee-nin esialuetta ja 5'-osaa.

kuvio 2 esittää plasmidin pTAKA17 endonukleaasirestriktio-karttaa, kuvio 3 valaisee plasmidin p285'proC konstruktiota, kuviot 4a ja 4b esittävät Rhizomucor miehein asparagiinihap-poprotei naasi n cDNA:n prepro-al ueen DNA-sek venssi ä , yhdessä päätellyn aminohapposekvenssin kanssa, joka on esitetty kol-; ’· miki rjaimisina lyhenteinä, kuvio 5 valaisee plasmidin pRMP konstrukti-ota, **: kuvio 6 esittää plasmidin pCAMG91 endonukleaasirestriktio- karttaa, kuvio 7a valaisee plasmidin pICAMG/Term konstruktiota, kuvio 7b valaisee plasmidin p686 konstruktiota, ... kuvio 8 valaisee plasmidin pRMPAMGTerm konstruktiota, ;* Kuvio 9a valaisee plasmidin pB408,3 konstruktiota, > t * : kuvio 9b valaisee plasmidin p778 konstruktiota, kuvio 10 valaisee plasmidin p719 konstruktiota, kuvio 11 valaisee plasmidin p777 konstruktiota, ! kuvio 12 esittää Rhizomucor miehein lipaasin cDNA:n prepro-alueen sekvenssiä, yhdessä päätellyn aminohapposekvenssin 112376 5

Kanssa, joka on esitetty koi mi k i r j ai rr.i si na lyhenteinä, kuvio 13a valaisee plasmidin pB544 konstruktiota, kuvio 13b valaisee plasmidin p7S7 konstruktiota, kuvio 14 esittää synteettisen kappaleen RKL 5' DNA-sekvenssiä , kuvio 15a valaisee plasmidin pT0C51 konstruktiota ja kuvio 15b valaisee plasmidin pT0C56 konstruktiota.

Transformaatiotekniikka, jota käytettiin, oli menetelmä, joka oli sovellettu A. nidulansin transformaatiomenetelmistä (Ballance et ai., Biochem.Biophys.Res.Commun.', 112 (1983), 284-289; Tilburn et ai., Gene 26 (1983), 2G5-221, Yelton et ai. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81 (1984), 1470-1474), ja joka oli samankaltainen kuin Buxtonin et ai. menetelmä (Gene 37 (1985), 207-214), A. nigerin transformoi mi seksi . Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä Aspergillus oryzae transformoidaan vektori systeemi 11ä , joka sisältää valinta-markkerin, joka pystytään liittämään isäntäkannan genomiin, mutta jota ei esiinny isäntäkannassa ennen transformaatiota. Transformantit voidaan sitten valikoida ja eristää ei-trans-formanteista liitetyn vaiintamarkkerin perusteella.

[ / Edullisia vaiintamarkkereita ovat argB- (A. nidulans tai A.

’·' niger), trpC- (A. nidulans), amdS- (A. nidulans), tai pyr4-: *·· (Neurospora erässä) geenit, tai DHFR-r( di hydrof oi aa tti reduk-taasi tai sen mutantit) geeni. Edullisempia' vai i ntamarkkerei ta :·: ovat argB- tai amdS-geenit. Villityypin A. oryzae -kannat ovat normaalisti argB (so. argB-geeni on toiminnallinen A. ory- •« · zaessa). Jos argB valitaan vaiintamarkkeriksi, on isäntäkan-tana käytettävä A. oryzaen argB-mutanttikantaa, jonka geenissä ... on virhe tämän markkerin suhteen. A. oryzaen argB-mutantteja voidaan valmistaa kuten kuvailivat F.P. Buxton et ai. (Gene : : : 1Z. (1985 ), 207-214 ). ArgB-mutantti määritellään mutantiksi, :: joka sisältää virheen ornitiinitranskarbamylaasigeenissä.

.' ; Toisaalta amdS-geeniä voidaan käyttää vai i ntamarkkeri na A.

‘ oryzaen villityypin transformaatioon, koska villityypin kannat eivät sisällä tätä geeniä.

112376 6 DNA-sekvenssit, jotka koodaavat toimintoja, jotka heipottavat geenin ilmenemistä, ovat tyypillisesti promoottoreja, transk-riptioterminaattoreja ja polyadenylaatiosignaaleja .

Promoottori, jota voisivat edeltää yläpuoliset aktivoivat sekvenssit ja tehostavat sekvenssit, kuten hyvin tiedetään alalla, voi olla mikä tahansa DNA-sekvenssi, joka voisi osoittaa voimakasta transkriptionaalista aktiivisuutta Aspergillus oryzaessa, ja se voi olla peräisin geeneistä, jotka koodaavat sekä ekstrasel1 ui aari si a että intrasel1 ui aari si a proteiineja, kuten amylaasit, gliikoamy 1 aasit, proteaasit, lipaasit, sellu* laasit ja glykolyyttiset entsyymit. Sopivat promoottorit voivat olla peräisin A. oryzaen TAKA-amylaasi n, Rhizomucor mie-hein asparagiinihappoproteinaasin, A. nigerin glukoamylaasi n, A. nigerin neutraalin ai fa-amylaasi n, A. nigerin happostabii-1i n ai fa-amylaasi n, ja Rhizomucor miehein lipaasin geeneistä. Esimerkkejä glykolyyttisiä entsyymejä koodaavien geenien promoottoreista ovat TPI, ADH ja PGK.

Edullinen promoottori esillä olevan keksinnön mukaisesti on A. oryzaen TAKA-amylaasi n promoottori . TAKA-amylaasi on hyvin tunnettu aifa-amylaasi (Toda et ai., Proc. Japan Acad. £8 Ser. B (1982) 208-212). DNA, joka koodaa promoottorialuetta, : " saatiin TAKA-amylaasi n genomisesta kloonista. Promoottorin sekvenssi ja alueet promoottori sta ylöspäin yhdessä TAKA-amylaasin rakenne'geenin pre-alueen ja 5'-pään kanssa on ku-vattuna kuviossa 1.

Kuten kuvaillaan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 2, DNA-.···. sekvenssi, joka koodaa TAKA-amylaasia, sisältäen pre-alueen '·’ ja promoottorin ja geenin yläpuoliset, aktivoivat sekvenssit, v : saatiin A. oryzaen rihmastosta ja liitettiin BamHI:llä liuo- tettuun pBR322:een, jolloin saatiin plasmidi pTAKA 17 (katso : kuvio 2). Plasmidissa pTAKA 17, A. oryzaesta saatu DNA on ’ esitetty 5,5 kb:n BamHI/Sau 3AI-BamHI/Sau 3AI -kappaleena, promoottorin ja yläpuolisten aktivoivien sekvenssien esit- 112376 7 täessä 2,1 kb kappaletta lähtien asemasta 0. Promoottorin ja yläpuolisten aktivoivien sekvenssien selvitetty DNA-sekvenssi 3g1II-paikkaan saakka on esitetty kuviossa 1. Promoottori päättyy nukleotidin-1 kohdalla, joka edeltää TAKA-amylaasin esi sekvenssin Met(1)-kodonia. Nukleotidi sekvenssi, joka koo-daa esi sekvenssiä, koostuu 63 nukleotidista, ja kehittynyt TAKA-anylaasi alkaa asemasta, joka vastaa nukleotidia 64.

Plasmidista TAKA 17 voidaan saada kokonainen promoottori sekvenssi, mukaan lukien sekvenssejä promoottorista ylöspäin, tai sen toiminnallisia osia, keinoilla, jotka ovat selviä henkilölle, joka tuntee alaa. Promoottori sekvenssi voidaan tuottaa liittäjien kanssa tarkoituksena tuottaa erityisiä katkaisu-paikkoja, jotka helpottavat promoottori sekvenssin liittämistä muuhun DNArhan, esimerkiksi geeniin, joka koodaa haluttua proteiinituotetta tai erilaisiin pre-alueisiin (signaalipeptidi t ) .

Esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä, sekvenssiä nukleotidista -1144 (katso kuvio 1) (esittäen Sali-paikan lähtöä) nukleotidiin -10, on käytetty yhtenä esimerkkinä promoottorialueen hyvin toimivasta osasta. Esillä olevan keksinnön mukaisessa toisessa suoritusmuodossa, nukleotidi sekvens-siä nukleotidista -1176 nukleotidiin ;-l edelsi vielä sekven-toimaton 1,05 kb:n kappale plasmidista pTAkA 17. Henkilölle, ·:·*: joka tuntee alaa/ on selvää, että erilaisia kappaleita voi- daan käyttää.

. Yhden keksinnön mukaisen suoritusmuodon mukaisesti sisältävät promoottori ja yläpuoliset aktivoivat sekvenssit seuraavan sekvenssin tai toiminnallisesti vastaavan nukleotidi sekvens-; sin:

.· . GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC

CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT

8 112376

TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC

ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG esittäen sekvenssiä nukleotidista -1144 nukleotidiin -10 kuviossa 1.

Lisäsuoritusmuodon mukaisesti promoottori ja yläpuoliset aktivoivat sekvenssit sisältävät seuraavan sekvenssin tai toi-:·: minnallisesti vastaavan nukleotidisekvenssin:

", AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA

» t t * i

GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG

i · *

' ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA

GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG

j 112376 i 9 j GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT'CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAGÄA6 GCATTT esittäen sekvenssiä nukleotidista -1176 nukleotidiin -1 kuviossa 1.

Esillä olevan keksinnön mukaisen 1isänäkökohdan mukaisesti jälkimmäistä sekvenssiä voi edeltää 1,05 kb:n sekventoimaton yläpuolinen alue plasmidista pTAKA 17 (asema 0-1,05 kuviossa 2).

Terminaattorit ja polyadenylaatiosekvenssit voivat olla peräisin samasta lähteestä kuin promoottorit. Tehostavia sekvenssejä voidaan myös liittää konstruktioon.

‘ Ilmenevä tuote voi kiertyä solujen sisään, mikä vaatii solu-: " jen rikkomista tuotteen eristämiseksi. Jotta vältettäisiin tämä prosessin lisävaihe ja minimoitaisiin ilmenevän tuotteen ”·: mahdollisen hajoamisen määrä soluissa, on edullista, että tuote erittyy soluista. Tätä tarkoitusta varten varustetaan halutun tuotteen geeni esialueella, joka varmistaa ilmenevän tuotteen tehokkaan ohjaamisen solun eritysreiti 11 e. Tämä .·**, esi alue (pre-alue), joka voisi olla luonnossa esiin ty v ä s i g -naali- tai esipeptidi tai sen toiminnallisia osia tai syn-v : teettinen sekvenssi, joka huolehtii erittymisestä, lohkeaa yleensä halutusta tuotteesta erittymisen aikana, jättäen ke-: hittyneen tuotteen valmiiksi eristämistä varten kasvuliemestä.

I « · » · « I · t t « · 112376

ID

Esialue voi olla peräisin minkä tahansa organismin erittyvien proteiinien geeneistä.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti esialue voi olla peräisin Aspergi11us-1ajin glukoamylaasi n tai amylaasin geenistä, Ba-cillus-lajin amylaasi geenistä, Rhizomucor miehein lipaasin tai proteinaasin geenistä, S. cerecisiaen alfa-tekijän geenistä tai vasikan prokymosiinin geenistä. Edullisemmin esialue on peräisin A. oryzaen TAKA-amylaasi n geenistä, A. nige-rin neutraalin ai fa-amylaasi n geenistä, A. nigerin happokes-toisen ai fa-amylaasin geenistä, B. licheniformiksen alfa-amylaasin geenistä, Bacilluksen NCIB 11837 maltogeenisen amy-laasin geenistä, B. stearothermophi1 uksen aifa-amylaasi n geenistä tai B. licheniformiksen subti1isiinin geenistä. Tehokkaita signaalisekvenssejä ovat A. oryzaen signaali, Rhizomucor miehein asparagiinihappoproteinaasin signaali ja Rhizomucor miehein lipaasin signaali.

TAKA-amylaasi n signaali sisältää seuraavan sekvenssin

ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCT

MetMetValAlaTrpTrpSerLeuPheLeuTyrGlyLeuGlnValAlaAlaPro GCTTTGGCT . AI aLeuAl a • t

Halutun tuotteen geeni, joka on toiminnallisesti kytkeytynyt .·*·, promoottori- ja termi naa ttori sek venssei hi n , voidaan sijoittaa vektoriin, joka sisältää vaiintamarkkerin, tai se voidaan si-. joittaa erilliseen vektoriin tai plasmidiin, jotka kykenevät yhdistymään isäntäkannan genomiin. Tässä yhteydessä käytetty- • · ··*' nä, ilmaisu "vektori systeemi" sisältää yksinkertaisen vektori’: rin tai plasmidin, tai kaksi tai useampaa vektoria tai plas-.•**; midia, jotka yhdessä sisältävät DNA:n kokonaisinformaation I I t ,· . liitettäväksi isännän genomiin. Vektorit tai plasmidit voivat olla lineaarisia tai suljetun renkaan muotoisia molekyylejä.

' Esillä olevan keksinnön mukaisen edullisen suoritusmuodon mu- 112376 11 kaisesti, A. oryzae yhtei stransf ormoi daan kahdella vektorilla, toisen sisältäessä vaiintamarkkerin ja toisen käsittäessä muun osan i säntäkantaan liitettävästä vieraasta Dh'A:sta, mukaanlukien promoottori, halutun tuotteen geeni ja transkription terminaattori ja polyadeny1aatiosekvenssit.

Tavallisesti A. oryzaen transformantit ovat pysyviä, ja niitä voidaan viljellä valintapaineiden poissa ollessa. Jos trans-formantit osoittautuvat pysymättömiksi, voidaan käyttää väli ntamarkkeri a valikointia varten kasvatuksen." aikana. Transformoituja soluja viljellään sitten valintapaineen alaisina, joka vastaa kysymyksessä olevaa markkeria.

Esillä oleva keksintö tuo käyttöön menetelmän monien erilaisten polypeptidi- tai proteiinituotteiden tuottamiseksi suurina saantoina A. oryzaessa. A. oryzaeta on vuosikausia käytetty kaupallisessa mitassa esimerkiksi TAKA-amylaasi entsyymin ja proteolyyttiSten entsyymien tuottamiseen, ja niin muodoin fermentointiteknol ogia tämän mikro-organismin kohdalla on hyvin kehittynyttä, ja mikro-organismi hyväksytään käytettäväksi elintarviketeollisuudessa. Esillä olevan keksinnön mukai-sesti tarjotaan mahdollisuus A. oryzaen käyttämiseksi pe- ‘ riaatteessa minkä tahansa polypeptidi- tai proteiinituotteen : ’·· tuottamiseksi suurina määrinä. Esimerkkejä sellaisista tuot-teista ovat kymosiini tai prokymosiini. ja muut juoksutteet, proteaasit, amyl ogl ukosi daasi t, Aspergi 11 uksen happokestoi set amylaasit, sieni 1 i paasi t tai prokari ootti set lipaasit, ja • · · 1ämpckestoiset bakteeri- ja sieniamylaasit.

... Esillä olevaa keksintöä valaistaan prokymosi i ni n , Rhizomucor miehein asparagiinihappoproteinaasin, Rhizomucor miehein TAKA-v : araylaasin ja lipaasin tuotannon avulla.

» » t | »

i » I

: Näiden entsyymien geenit saatiin cDNA-ki rjastoi sta tai geno- I ♦ * mi ki rjastoi sta, kuten kuvaillaan yksityiskohtaisemmin seuraa-vassa.

12 119776 ! ! L·. V-. ( ·-

Esi merki1

Seuraavissa esimerkeissä lähtöaineina käytettävät plasmidit ovat seuraavat: p285: (ATCC no 2G681) PCAMG91: Boel et al. EiiBO Journal 3 (1984), 1581-1585 pIC19R: Marsh et al. Gene 3£ (1984), 481-485 pSal43: Berse et al . Gene £5 (1983), 109-117 John & Pe- berdy, Enzyme Microb. Technol. 6 (1984), 386-389 p3SR2: J.M. Kelly ja M.J. Hynes, EMBO Journal 4 (1985), 475-479 PBR322: Bolivar F. et al., Gene 2 (1977), 95-113 pBR327: Covarrubias L. et al., Gene 13 (1981), 25-35 pUC9, pUC13, ja pUC19: Vieira et al ., Gene lj) (1982), 259-268 ja Messing, Meth. in Enzymology 101 (1983), 20-27.

Käytettävät kannat ovat seuraavat: A. niger: ATCC 1015, ATCC 10582 A. oryzae: ATCC 20423, IFO 4177, ATCC 1011, ATCC 9576, ATCC 14488-11491, ATCC 11601 ja ATCC 12892 E. coli: MCI000 (Casabadan, M.J. ja Cohen, S.N., J.Mol.Biol.

T: 138, 179-207) (NCIB 11956) .,.: Rhizomucor ,,,: miehei: CBS 370.65

Esimerkki 1

Plasmidin 285'proC valmistaminen, joka sisältää prokymosiini- ' ’ geenin_

Preprokymosiinigeeni eristettiin vasikan mahan cDNA:n kirjas-tosta ja sijoitettiin pBR322:n Pstl- paikkaan G-C-l i säyksen / ·. avulla (päihin lisäyksen) (Chirgwin et al ., Biochemistry 1_8 (1979), 5294 ja Truelsen et al., Nucleic Acids Res. £ ·.: (1979), 3061), jotta saataisiin pR26. pUC9 katkaistiin “· Sällillä ja täytettiin Klenow'n polymeraasi11 a ja liitettiin T4-ligaasin avulla. Muodostunut plasmidi katkaistiin BamHI- 112376 13

EccRI:llä ja 2,7 kb:n suuri kappale liitettiin 0,47 kb:n BamHl-EcoRI -kappaleen kanssa pR26:sta, joka sisältää prokymo-siinigeenin N-terminaalisen pään, pUC9':n aikaan saamiseksi. pUC9' sisältää Hindi 11-paikan M-termi naal i sesti prokymosi i ni -geenin suhteen. pUCl3 katkaistiin BamHI-Narl:11ä ja Narl-Xmal:11ä, ja suurta kappaletta vastaavat pienet kappaleet liitettiin pR26:n 0,64 kb:n Xmal-Bcll kappaleen kanssa, joka sisältää prokymosiinigeeni n C-terminaalisen pään, plasmidin pUC13' saamiseksi. pUC13' sisältää Xbal-paikan C-terminaali-sesti prokymosi i ni geeni n suhteen. pUC13':n Q,.&5 kb:n Xmal-Xbal -kappale liitettiin pSJCS':n 0,46 kb:n Hindlll-Xmal -kappaleen ja p235:n 11 kb:n Xbal-Hindlll -kappaleen kanssa plasmidin p285' proC aikaansaamiseksi, joka sisältää prokymosii-nigeenin, kuten kuvataan kuviossa 3.

Esimerkki 2 A. oryzaen TAKA-amylaasi A-geenin kloonaus Osittaisen cDKA-k1oonin eristäminen A. oryzae:sta Hw 325, jota oli kasvatettu perunatärkkelyksellä, preparoitiin rr.RNA:ta Kaplanin et ai. mukaan, Biochem. J. 163 (1979) 1S1-184. Osittainen cDNA-klooni, joka sisälsi ,· : 1050 emäsparia TAKA-amylaasi geenistä, saatiin spesifisellä mRNA:n synteesin aloituksella 14-meerisen oiigonukleotidi-;”i seoksen kanssa: ·". 5'GGATTATCATGATT 3' (NOR-168),

G G G G

t joka oli TAKA-amylaasi n sisältämiä aminohappoja 295-299 koo-daavan sekvenssin vastinsekvenssi (Toda et ai., Proc. Japan Acad. 58^, Sarja B, (1982 ) 208-212 ). Kl oonausmenettely oli Gubler & Hoffmannin mukaan, Gene 2j[, ( 1983 ) 263-269. Sek-ventointi cDNA-kloonin päistä ja keskeltä osoitti sekvenssien läsnäolon, jotka vastaavat TAKA-amylaasi n aminohapposekvenssiä.

14 112376

Genomisten kloonien eristäminen A. oryzaen Hw 325 -rihmastoa kerättiin talteen ja käsiteltiin DNA:n preparoimiseksi A. nigerillä käytetyn menetelmän mukaisesti, jota kuvailivat Boel et ai. supra. 3-10 kb:n restrik-tiokappaleet, jotka oli muodostettu osittain liuottamalla Sau3A:n kanssa, liitettiin BamHI:llä liuotetun, defosforyloi-dun pBR322:n kanssa (New England Biolabs). 50 000 rekombi-nanttia seulottiin oligonukleotidikoettimen NOR-168 kanssa (katso edellä), ja 7 todettiin sisältävän DNA:ta, joka koodaa TAXA-amylaasia. Yksi klooni valittiin promoottorialueen jatkokäyttöä varten, joka sisälsi 2,1 kb mRNA-aloituskohdan yläpuolisesta. Plasmidin pTAKA 17 restriktiokartta on hahmoteltuna kuviossa 2. pTAKA, siirrettynä E. coli -kantaan, tallennettiin kokoelmaan Deutsche Sammlung von Mikro-organismen (DSM), Griesebachstrasse 8, D-3400, Göttingen, 23. helmikuuta, 1987, ja sille annettiin viitenumero DSM 4012, DSM:n ollessa kansainvälinen talletuspaikka, joka on hyväksytty vuoden 1977 Budapestin sopimuksen alaisena, säilyttää tallenteen pysyvästi ja sallii yleisön saada sen käsiinsä edellä olevan sopimuksen sisältämien sääntöjen 9 ja 11 mukaisesti, vastaavasti .

» · · T: Esimerkki 3 ;'·.. Rhizomucor miehein cDNA-kirjaston konstruointi

Fykomykeettisieni Rhizomucor miehei (tämän, lajin morfologi-sen ja taksonomisen kuvauksen suhteen katso: Schipper, * · ... M.A.A. Suvut Rhizomucor ja Parasitella. Julkaisussa: Studies in mycology, Institute of the Royal Netherlands Academy of Sciences and Letters. No 17 (1978), 53-71) erittää hapanta ’ ‘ proteinaasia (Rhizomucor miehein proteinaasi, seuraavassa lyhennettynä RMP), jota käytetään laajalti maidon juoksutta-miseen juustotuotannossa. Jotta saataisiin tämän proteiinin .... cDNA-rekombinanttiklooneja E. colissa, kokonaista RNA:ta uu- t * tettiin homogenoidusta R. miehei -rihmastosta, kuten kuvai- > * levät Boel et ai. (EMBO J., 3: 1097-1102, 1984) ja Chirgwin et ai., (Biochemistry (Wash).), .18, 5294-5299, 1979). Po- 112376 15 ly(A):ta sisältävää RNA:ta saatiin kahdella affiniteettikroma-tcgrafiasykl i 11 ä oiigo(cT )-sei 1 uioosal1 a, kuten kuvailevat Aviv ja Leder (PUAS, USA, £S, 1408-1412, 1572). Cligo-( dT):11 ä aloitettua vastin-DHA:ta syntetisoitiin ja tehtiin kaksijuosteiseksi Gublerin ja Hoffmanin mukaisesti (Gene, 25, 263-269, 1983). Kaksijuosteisen cDKA:n päitä kasvatettiin dCT?:n ja terminaal isen deoksinukleoticyylitransferaasin kanssa, kuten kuvailevat Roychouchury et ai. (Nucleic Acids Res, 2 1Ö1-1G6, 1976). Plasmidi pBR327 tehtiin lineaariseksi Pstl:n kanssa, ja päitä kasvatettiin dGTP:'n kanssa. Oli-go(dC):llä päistä lisätty dscDNA liitettiin 1ämpökäsittele-mällä tähän oligo(dG):n kanssa päistä lisättyyn vektoriin, kuten kuvailevat Peacock et ai. (Biocnim. Biophys. Acta, 655, 243-250, 1S81) ja käytettiin transformoimaan hsdR , M -johdannainen E. ccl ista HC1000 (Casadaban ja Cohen, J,

Koi. Biol., 138, 175-207, 1SSG) rekombinanttikloonien muodostani seksi.

Ri-iP-spesifisten cDNA-rekombinanttien identifiointi 15 heptacekameeristen oiigoceoksiribonuklectidien seosta d(GCMTCCCAAAAATAATA),

,* · G G G G

. i joista yksi on RMP mRNA:n vastinsekven.ssi älueella, joka koo-daa Tyr-Tyr-Phe-Trp-Asp-Al a: aa (Bech ja Foltmann, Neth-milk ,···, Dairy J. 3_5:275-280, 1981 ), syntetisoitiin Applied Biosys-tems, Inc.:n DNA-synteesi1 aitteella ja puhdistettiin polyak-. ryy1iamioigeeli elektroforeesilla. Suunnilleen 10 000 E. Colin rekombinanttia Rhizomucor miehein cDNA-kirjastosta siir- * * ·;·' rettiin Whatman 540-suodi npaperei 11 e . Pesäkkeet liuotettiin : ja isnmobi 1 i soi ti in, kuten kuvailevat Gergen et ai. (Nucleic

Acids Res. _7, 2115-2135, 1579). Suotimet hybri di soi ti i n " 32 P-merkityn RriP-spesi f i sen neptadekameeriseoksen kanssa, kuten kuvailevat Boel et ai. (ΕΜΒ0 J. 3, 1079-1102, 1964 ).

112376 15 . o nybn di soi nti ja suotimien pesu tehtiin hv C:ssa, jota seurasi au to radi o g ra fci n ti 24 tunnin ajan vah vi s ti nva rj o s ti men kanssa. Pienimittaista plasmi di - Dii A: ta eristettiin hybridi-soivasta pesäkkeestä, pRMPiCit, standardimenettelyl 1 a (3irr.-boirn ja Doly, Nucleic Acids Res., ]_, 1513-1523, 1575), ja cDNA-1i i tännä i sen DuA-sek venssi osoitettiin naxami n ja ui 1 -bertin menetelmän avulla (Methods Enzymol. £5, 4SS-56u, 1S 8 0 ). Plasmidin p R M P1 u 16 osoitettiin sisältävän osan rr.RNA: n ei-luetusta 5'-päästä ja sitten ulottuvan kautta alueiden, jotka koodaavat 69 aminohappoa pitkää prepror'al uetta ja 300-aminohappoa, RMP-proteiinin kehittyneeksi osaksi. Koska pRMPlOlo ei sisältänyt mitään liitännäistä, joka vastaa RMP mRNA:n täydellistä 3'-päätä, cDNA-kirjasto seulottiin uudelleen kloonin pRMPlOIS P-nick -transloidun 3' spesifisen restriktiokappaleen kanssa, minkä avulla klooni pRKP2S31 eristettiin. Tämä klooni sisältää osan ei-luetusta 3'-aluees-ta ja avoimen lukukehyksen sisältäen 270 triplettiä, jotka koodaavat RMP-proteiinin karboksiterminaalista osaa. pRHP1015 ja pRHP2S31 ovat sen vuoksi laajalti toisiaan peittäviä, ja näiden kahden kloonin yhdistetty sekvenssi antaa R. miehein preproRMP cDNA:n sekvenssin. Kaikkiaan 1415 nukleotidia sek-‘ ·* ventoitiin G:C-päiden välissä, jotka muodostuivat cDNA:n i « * ,’· · kl oonausmenettelystä. Selvitetty DNA-sekvenssi esitetään kuvioissa 4a ja 4b yhdessä RMP:n prekursorin päätellyn amino-;*'· happosekvenssin kanssa. Kuvioissa 4a j.a 4b'vaakasuora viiva osoittaa cDNA-kirjaston seulontaan käytetyn synteettisen oi i — ,***, goseoksen asemaa. Nuoli osoittaa asemaa, jossa prosessointi tapahtuu natiivin RMP:n kehittymisessä. Nukleotidit on nume-. roitu lähtien ensimmäisestä emäksestä ai oitus-Met-kodonissa, tl*i» ja aminohapot on numeroitu ensimmäisestä tähteestä lähtien t · kehittyneessä RMP:ssä. Tästä cDNA-sekvenssistä voidaan pää-:T: teliä, että RMP syntetisoituu 430 aminohappoa pitkänä prekur- sorina 69 aminohappoa sisältävän propepticin kanssa. Oletettu , si gnaal i pepti daasi n prosessoi nti pai kka (von Heijne, Eur.J.- t t * ’*· Biochem. 133, 17-21, 1983) tässä prekursorissa voisi sijai-' ’ ta välillä Ai a(-48) ja Arg(-47), ja kehittynyt RMP on muodostuva autoproteolyyttisen halkaisen kautta välillä Glu-1 ja 112376 17

Ala(+i). cDNArsta päätelty RMP:n aminohapposekvenssi sopii hyvin yhteen aikaisemmin julkaistun osittaisen aminohapposekvenssin kanssa (Sech ja Foltmann, Neth-Milk Dairy J: 35275-280, 1961).

Jatkokonstruktiotyön helpottamiseksi RKP cDNA:n kanssa, Hind-111-linkkeri liitettiin BanI-paikassa juuri 3'-kohdassa TAA-terminaatiokodoniin nähden, joka identifioitiin kloonissa pRMP2931 seuraavasti: 25^ug plasmidia pRMP2S31 liuotettiin Pstl:llä, jotta saataisiin RMP cDNA-1iitännäinen. Tämä liitännäinen puhdistettiin· 1 * agaroosigeelielektroforeesin avulla, elektroeluoitiin geelistä, puhdistettiin fenoli- ja kloroformi uuttami si 1 1 a ja seostettiin NaCl:n ja etanolin kanssa. Tämä kappale, joka koodaa RKP:n 3'-puoliskoa, liuotettiin Banl:n kanssa, ja BanI kohesiiviset restriktiopaikan päät täytettiin neljän dNTP:n seoksen ja E. colin DNA-polymeraasin Klenow-kappaleen kanssa. Mäihin täytettyihin päihin lisättiin Hind-Ill-liittäjia T4-DNA-ligaasin reaktiossa. Ligaatioreaktio-seos uutettiin fenolin ja kloroformin kanssa, ja DNA seostettiin 4M MH -asetaatti/etanoli11 a. Puhdistettu DNA liuotet-4 tiin ylimäärällä Hindl11-entsyymiä, ja 380 emäsparia sisältä-\ vä kappale puhdistettiin 6 % polyakryy 1 iamidigeel i 11 ä. Tämä :·. kappale, joka sisältää RMP:n avoimen lukukehyksen 3'-pään plus TAA-terminaatiokodonin, liitettiin Hindlil:lla liuotettuun ja alkalis el 1 a fosfataasi11 a käsiteltyyn plasmidiin

: ! > I I

pIC1 9R. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan kompetentteja (vastaanottokykyisiä) E. coli-soluja, ja transformantit : valikoitiin ampi si 11 i i ni ä si sai ta vi 11 ä agarmal joi 11a. P1 asmi - di-DNA puhdistettiin transformanteista, ja oikeat rekorabi nan-·:··: tit identifioitiin restri ktioendonukl eaasi 1 iuotuksi 11 a ja . ·. agaroosigeelielektroforeesi11 a. Yhdestä sellaisesta oikeasta rekombinantista, pRMP3':sta, eristettiin 210 bp:n Bglll/Hind-‘ III-kappale 6 % polyakryyl iamidigeel iel ektroforeesi n avulla.

Tämä kappale sisältää RKP cDNA:n 3'-pään 8gl 11-paikasta amino-: happojen 297-299 kohdalla ja ulottuen TAA-terminaatiokodoni n kautta liitettyyn Hindi 11-1 i i ttä jään .

112376

IS

RHP cDf.'Arn 5'-pää eristettiin plasmidista pRHPICIS 997 bp:n Hindl11/Bgl11 -kappaleena 1 % agaroosigeelielektroforeesin avulla. Hindl11-paikka sijaitsee RKP-DNA:ssa asemassa, joka vastaa tähteitä -36, -35 prosegmentissä. Tämä 997 bp:n 5'-kappale liitettiin 210 bp:n 3'-kappaleeseen HindII:lla liuotetussa ja fosfataasi11 a käsitellyssä plasmidissa pICl9R. Tällä ligaatioseoksella saatiin rekombi nantteja E. coli sta, ja oikea plasmidi, pRKP, jossa RHP:n 5'-osa on yhdistynyt 3'-osaan, identifioitiin restrik tioentsyymianalyysin avulla. pRMP:n konstruktiota’ valaistaan kuviossa 5. pRMP ei koodaa RMP:n esialuetta eikä prosegmentin 5'-puoliskoa.

Esimerkki 4

Aspergi11uksen ilmenemisvektorin konstruointi, joka vektori on tarkoitettu saamaan aikaan aktiivisen RMP:n erittyminen Tässä esimerkissä konstruoitiin plasmidi, joka oli suunniteltu RMP:n ilmenemistä varten glukoamylaasi n promoottori-, signaali- ja termi naattori sekvenssi en säätelyn alaisena. Gluko-amylaasin promoottori- ja terminaattorisekvenssit olivat peräisin glukoamylaasi n genomisesta geenistä, joka oli kloonattu vektoriin pCAMG91. pCAMGSl:n konstruointia kuvailee Boel et ai. (EMBO Journal 3^ (1984), 1581-1585), ja plasmidin pCAMG91 endonukleaasirestriktiokartta esitetään kuviossa 6.

pCAMG91 liuotettiin restriktioendonuk1eaaseilla Sali ja Pstl. Sellaisesta liuotteesta eristettiin 698 bp:n kappale agaroo-sigeelillä. Tämä Sal I-Pstl-kappale sisältää alueen, joka ·:”· koodaa gl ukoamyl aasi n mRNA: n ei-luettua, 140 bp:n 3'-osaa plus 540 bp:a poly(A)-additiopaikasta 3' suuntaan. Tätä 3'-kappaletta käsiteltiin T4-DNA-polymeraasin kanssa katkaisu-’ ‘ paikkojen päiden "tasaamiseksi" ennen XbaI-1iittäjien lisää-’··· mistä ja liuotusta Xba I-restr i k ti oentsyymi 11 ä. Tämä glukoamy-1 aasi geeni n 3'-pää liitettiin plasmidi in pUC13, joka oli li-nearisoitu Xbal:llä plasmidin pAMG/Term aikaansaamiseksi, jo- 112376

IS

ka sisältää glukoamylaasi geeni n poly(A)-lisäämisalueen. Plas-rr.idin pAMG/Term konstruktiota valaistaan kuviossa 7a.

A. nigerin glukoamylaasi geeni n 3'-pää saatiin 700 bp:n Xbal-kappaleena plasmidista pAHG/Tero. Tämä terminaattorikappale liitettiin Xbal:llä liuotettuun ja fosfataasi11 a käsiteltyyn plasmidiin pICISR. Tämän 1igaatioseoksen kanssa saatiin re-kombinantteja E. colista, ja oikea plasmidi, pICAKG/Term, jossa terminaattorikappaleen 5'-pää on vastapäätä pIC19R-vek-torin multippelin kloonauspaikan Hindi11-paikkaa, identifioitiin restriktioentsyymianalyysin avulla. Plasmidin pICAMG/-Term konstruktiota valaistaan kuviossa 7a. Plasmidista pICAMG/Term eristettiin gl ukoamylaasin terminaattoriaiue (AKG-terminaattori) 750 bp:n Hindl11/Cl a I-restriktiokappaleena 1 * agaroosigeelielektroforeesin avulla. Plasmidista pCAMGSl eristettiin glukoamylaasi n promoottori (AMG-promoottori) yhdessä alueiden kanssa, jotka koodaavat glukoamylaasi n signaa-lipeptidiä, heksapeptidi-prosegmenttiä ja pBR322:n ampisil-1iiniresistenssigeeniä (Amp) 3,5 kb:n Cl ai/BssHII-kappaleena 1 % agaroosigeelielektroforeesin avulla. Synteettistä BssHII/Hindl11-1iittäjää valmistettiin kahdesta synteettises-' tä 31-meeri sestä oi i gonukl eoti di s ta, jotka oli syntetisoitu , Applied Biosystems Inc.:n DNA-synteesi 1 ai tteell a . Synteetti nen liittäjä sisältää seuraavan rakenteen:

’ R V S - K Q S E S K D

CGCGTAAGTAAGCAGAGCGAGAGCAAGGATA

ATTCATTCGTCTCGCTCTCGTTCCTATTCGA

:·*: Tätä 1 i i ttä jää käytettiin ligaatioreaktiossa 3,5 kB:n gluko- ‘ amylaasi promoottori n sisältävän kappaleen ja 750 bp:n gluko- amyl aasi termi naattori n sisältävän kappaleen kanssa. Ligaatio-seosta käytettiin transformoimaan E. coli, ja oikea rekombi-·;· nantti, p 6 7 3 , identifioitiin restriktioendonukleaasiliuotuk-; sen avulla. Eristetty p673 on Hindlll-kloonausvektori, johon *:·*: voidaan liittää sopiva Hindlll cDN A -kappale gl ukoamyl aasi n 20 112376 heksapeptidiprosegmentin ja glukoamylaasin transkriptioter-minaattorialueen väliin. Liitetty cDNA on oleva glukoamy-laasipromoottorin transkriptionaalisen säätelyn alainen, ja siirretyn fuusiotuotteen erittymistä ohjaavat glukoamylaasin signaalipeptidi plus glukoamylaasin heksapeptidiprosegmentti. p673 liuotettiin Hindllltlla, käsiteltiin alkalisen fosfataa-sin kanssa ja liitettiin 1,2 kb:n Hindlll-kappaleeseen, joka oli puhdistettu pRMP:n liuotteesta.

Ligaatioseosta käytettiin E. colin transformoimiseksi, ja re-kombinantti, p686, jossa RMP cDNA oli sijoittunut oikeassa asemassa RMP:n ilmenemisen saavuttamiseksi, eristettiin ja karakterisoitiin restriktioendonukleaasiliuotusten avulla. p686 koodaa RMP:n prekursoria, jolla on seuraava rakenne: glukoamylaasin signaalipeptidi, glukoamylaasin heksapropepti-di, RMP:n propeptidin aminohapot -45 - -1, kehittyneen RMP:n 361 aminohappoa. Plasmidin p868 konstruktiota valaistaan kuviossa 7b.

Esimerkki 5

Esillä olevan keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaisesti preproRMP:n avoin lukukehys tulisi liittää ekspressioplasmi-diin A. nigerin glukoamylaasigeenin promoottorin säätelyn alaisena tai A. oryzaen TAKA-amylaasigeenin promoottorin säätelyn alaisena. Tämän tekemiseksi, BamHI-restriktioendonuk-leaasipaikka liitettiin juuri preproRMP:n signaalipeptidin metioniinialoituskodonin 5'-puolelle seuraavien vaiheiden kautta. pRMPl0l6 liuotettiin Ddel:llä, joka katkaisee cDNA:ssa asemassa, joka vastaa aminohappotähteitä Ser(-66) ja Gln(-65), ja HindIII:lla, joka katkaisee cDNA:ssa asemassa, . ···, joka vastaa aminohappotähteitä Lys(-36) ja Leu(-35). Muodostunut 89 bp:n Ddel/Hindlll-kappale puhdistettiin 8 % polyak-ryyliamidigeelillä, elektroeluoitiin ja etanolisaostettiin fenoli- ja CHC13-uuttamisten jälkeen. Synteettinen DNA-kap-pale, jolla on seuraava sekvenssi, syntetisoitiin kahtena oligonukleotidina Applied Biosystems Inc.:n DNA-synteesilait-teella: 112376 ' 21

M L F S

GATCCACCATGCTGTTCTC oli go 697/6SS

GTGGTACGACAAGGAAGT

Tämä kappale sisältää BamHI-kohesiivisen pään aloitus-Met-kodonin 5' puolella ja Ddel kohesiivisen pään 3'-päässä. Kahta oiigonukleotidi a kinaasikäsi tel tiin ATP:n ja T4 polynuk-1eotidi-kinaasin kanssa, liitettiin lämmittäen toisiinsa, ja liitettiin sitten 89 bp:n Ddel/Hindlll RMP-kappaleeseen, joka oli puhdistettu pRMP1016:sta, BamHI/Hindi 11:11 a liuotetussa pUC13 vektorissa. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja oikeat rekombinantit identifioitiin pienen mittakaavan puhdistettujen plasmidien restriktioentsyymi1iuo-tuksilla. Oikeat rekombinanttiplasmidit sekventoiti in käytettyjen oiigonukleotidi en sisältämän sekvenssin varmistamiseksi.

Yksi sellainen oikea plasmidi, pRMP5' liuotettiin BamHIrllä ja HindlZI:11a, ja 110 bp:n BamHI/Hindl11-kappale, joka sisälsi ai oitus-Met-kodonin, RMP-signaalipeptidi n ja osan RMP-prosegmentistä, puhdistettiin 10 % polyakryyliamidigeeli-el ektrof oreesi n avulla. Kappale elektroeluoitiin , uutettiin fenolilla ja CHCl^rlla ja saostettiin etanolilla. Loput . RMP:n avoimesta lukukehyksestä ja AHG-termi naattori sek venssi t I » « saatiin plasmidista p686 liuotuksen jälkeen EcoRI:llä ja . osittaisella Hi ndl 11-1 i uotuksell a . Näin vap'autui 1,9 kb:n kappale, ja tämä kappale puhdistettiin agaroosigeelielektro-foreesilla, elektroeluoinnilla, fenoli- ja CHC1 -uuttami-·..· sella ennen etanoli saostusta. Tämä 1,9 kb:n kappale liitet- tiin 110 bp:n BamHI/Hindl11-kappaleeseen pRMP5':sta vektoris-·: sa pUC13, joka oli liuotettu BamHI :11ä ja EcoRIrllä. Ligaa- tioseosta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja oi-keat rekombinantit identifioitiin pienen mittakaavan puhdis-tettujen plasmidien restri kti oentsyymi 1 i uotuksi 11 a . Yksi sel-'··' lainen oikea rekombi nantti oli pRMPAMGTerm. pRMPAHGTerm: i n konstruktiota valaistaan kuviossa 8.

112376 22

Esimerkki 6

Aspergi11 uksen ekspressiovektori n konstruointi, joka vektori on tarkoitettu saamaan aikaan aktiivisen RMP:n erittyminen A. oryzaessa Aspergillus nigerin glukoamylaasipromoottori n avulla_

Glukoamylaasi n promoottori eristettiin seuraavasti. 25 ug plasmidia pCAMGSl liuotettiin restrik tioendonukleaasei(la EcoRI ja BssHII. Tämän kaksoisliuotuksen jälkeen voitiin eristää 270 bp:n DNA-kappale aga roosi geel i el ele trof oreesi n avulla. Tämä kappale peittää osan promoottorialueesta, ei-luetun 5'-alueen ja glukoamylaasi geeni n (AHG-geeni) signaali-peptidin. DNA:n elektroeluoinnin jälkeen agaroosigeelista, kappale puhdistettiin fenoli- ja CHCl -uuttamisilla ennen , 3 etanolisaostusta. 2/0 emasparia pitkä kappale liuotettiin sitten SfaNI:llä. Tämä entsyymi sisältää katkaisupaikan juuri glukoamylaasi geeni n ATG metioniiniai oituskodonin 5' puolella. Täydellisen liuottamisen jälkeen, DNA:ta käsiteltiin DNA-polymeraasi I:n suuren kappaleen (Klenow) ja kaikkien neljän dHTPrn kanssa tasaisten päiden muodostamiseksi DNA:hän. Tähän DNA:han lisättiin Bgl11-1iittäjät DNA-ligaasin kanssa, ja DNA \ liuotettiin Bgl11-restriktioentsyymiy1imäärän kanssa. DNA-;·. kappaleiden erottamisen jälkeen 10 % polyakryy 1 i ami di geel i 11 ä, voitiin eristää 175 bp:n Bgl11-kappale elektroeluoinnin avulla. Tämä kappale sisältää BglII-1iittäjän Tiitettyna asemaan, joka vastaa SfaNI-retriktiopaikkaa juuri metioniinialoitusko-’ * donin 5' puolella. Tämä DNA-palanen liitettiin BglII:11a ..· liuotettuun, alkalisella fosfataasi 11 a käsiteltyyn pIC19R-vektoriin, ja 1igaatioseosta käytettiin transformoimaan E.

, coli -soluja. Muodostuneiden transformanttien joukosta iden-ti fi oi ti in oikeat plasmidit pienimittaisten plasmidien restri kti oentsyymi 1 i uotusten avulla. Yksi sellainen oikea plasmi-' di pB404.1 liuotettiin Nsil:llä ja BglII:llä 0,16 kb: n kappa-leen vapauttamiseksi, joka sisälsi gl ukoamyl aasi geeni n ei-luetun 5'-alueen, yhdessä promoottorialueen 3'-osan suunnil-leen 100 bp:n kanssa. Tämä kappale puhdistettiin polyakryy-liamidi geeli elektroforeesi 11a, elektroeluoitiin, uutettiin 23 112376 fenolilla ja CHCl^lla ja saostettiin etanolilla. Tämän kappaleen liittämiseksi glukoamylaasin promoottorialueen muuhun osaan pCAMG91:stä, seuraavat vaiheet suoritettiin. 25 μ9 pCAMG9l:tä liuotettiin BssHII:lla, ja sitten vielä osittain liuotettiin Ndelrllä. Sen jälkeen kun kappaleen päät oli täytetty kaikkien neljän dNTP:n ja DNA-polymeraasin K1enow-kappaleen kanssa, eristettiin 1,4 kb:n DNA-kappale 1 % agaroosigeelillä. Tämä kappale sisälsi koko promoottorialueen yhdessä ei-luetun 5'-alueen ja signaalipeptidiä koodaavan alueen kanssa. Kappale elektroeluoi-tiin, uutettiin fenolilla ja CHCl3:lla ja saostettiin etanolilla DNA:n väkevöimiseksi. Liuotuksen jälkeen Nsil:llä, DNA ajettiin 1 % agaroosigeelillä, ja 1,2 kb:n Ndel-Nsil-kappale eristettiin elektroeluoinnilla. Tämän DNA:n pää oli tehty tasaiseksi Ndel-paikassa aikaisemmassa reaktiossa, ja se liitettiin nyt 0,16 kb:n Nsil-Bglll-kappaleeseen pB40l.l:st'a* NruI-BglII:llä liuotetussa pIC19R-vektorissa. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja muodostuneiden transformanttien joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja pienen mittakaavan plasmidien restriktioentsyymiliuotuksilla. Yksi sellainen oikea rekombinant-ti, pB408.3 liuotettiin HindIII:lla ja BglII:lla, ja glukoamylaa-sin (AMG) promoottori eristettiin 1,4 kb:n kappaleena 1 % agaroosigeelillä. Kappale elektroeluoitiin, uutettiin fenolilla ja CHClj:Ila ja saostettiin etanolilla. Tämä glukoamylaasin promoot-torikappale liitettiin sitten 2,0 BamHI-EcoRI-kappaleeseen plas-midista pRMPAMGTerm (katso esimerkki 5) Hindlll-EcoRIrllä liuote- :tussa pUC19-vektorissa. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan » 'E. coli -soluja, ja muodostuneiden transformanttien joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja pienen mittakaavan plasmidien restriktioentsyymiliuotuksilla. Yhtä sellaista oikeata re-kombinanttia, p778, kasvatettiin suuressa mitassa rekombinantti-*·, plasmidin eristämiseksi, ja plasmidivalmiste puhdistettiin T CsCl/etidiumbromidi-sentrifugoinnin avulla. Tämä plasmidi ohjaa * · RMP:n synteesiä glukoamylaasin promoottori- ja terminaattori-sekvenssien säätelyn alaisena. Plasimidin p408.3 konstruk- ..Ml 112376 24 tiota valaistaan kuviossa Sa, ja plasmidin p77o konstruktiota valaistaan kuviossa 9b.

Esimerkki 7

Aspergi11 uksen ekspressiovektorin konstruointi, joka vektori on tarkoitettu saamaan aikaan aktiivisen RMP:n erittyminen Aspergillus oryzaen TAKA-amylaasi n promoottorin avulla 50^ug plasmidia pTAKA17 (katso esimerkki 2), joka sisältää Aspergillus oryzaen TAKA-amylaasi n genomisen geenin, liuotettiin Sall:11ä. Tämä’entsyymi sisältää restriktiopaikan geno-misessa DNA:ssa asemassa, joka vastaa kehittyneen TAKA-amylaasin aminohappotähdettä 26. Toinen Sa11-restrik tiopaikk a sijaitsee suunnilleen 130G nukleotidia tämän aseman yläpuolella, joka on 5'-päässä promoottori alueen yläpuolella. Sal I -liuotuksen jälkeen tämä 1300 bp:n promoottorin sisältävä kappale puhdistettiin agaroosigeeli elektroforeesi n avulla, ja DNA puhdistettiin uuttamalla fenolilla ja CHC1 :11a, ja saostettiin etanolilla. DNA liuotettiin sitten eksonukleaasi 111-puskuriin ja liuotettiin eksonukleaasi 111:11a Henikoff, S. mukaan (Gene, 28^:351-359 , 1984). Reaktio lopetettiin, jotta saataisiin suunnilleen 130 bp:n deleetiot DNA:n kummas-sakin päässä. Suunnilleen 130 bp:n deleetio TAKA-amylaasigee- » * nin koodaavan alueen Sal I-paikasta antaa tällä tavalla mahdollisuuden tuoda käyttöön multippelei ta klöonauspaikkaliit-täjiä juuri metioniinial oituskodonin yläpuolella. Eksonuk-leaasi 111:11a käsiteltyä DNA:ta liuotettiin Sl-nukl eaasi 11 a Henikoff, S. mukaan (Gene, 2£: 351-359 , 1984) ja saostettiin etanolin kanssa fenoli- ja CHC1 -uuttamisten jälkeen.

···: Sl-nukl eaasi 11 a käsitellyn DNA:n korjaaminen (täydentäminen) 1 i i ttämi skel poi Sten tasaisten päiden saamiseksi, tehtiin kaikkien neljän dNTP:n ja DNA-polymeraasi I:n Klenow-kappa-*’ Teen kanssa Henikoff, S. mukaan (Gene, 28_: 351-359 , 1984 ).

3NA liuotettiin EcoRI:llä, joka katkaisee kerran 1300 bp:n . j Sali-kappaleessa, jolloin muodostuu kaksi kappaleryhmää. Toi-ien ryhmä oli noin 380 emäsparia (bp) pitkä ja edusti geenin 25 112376 yläpuolisia alueita, kun taas toinen ryhmä oli noin 620 emäs-paria pitkä ja sisälsi promoottorialueen. Nämä EcoRI-liuotus-tuotteita sisältävät ryhmät erotettiin agaroosigeelillä, ja suunnilleen 620 bp:tä pitkät DNA-kappaleet elektroeluoitiin ja liitettiin EcoRI/SmaI:llä liuotettuun pUCl9-vektoriin. Li-gaatioseosta käytettiin transformoimaan vastaanottokykyisiä E. coli -soluja, ja pienen mittakaavan plasmidi-DNA:ta eristettiin rekombinanteista. Näitä deleetiomutantteja karakterisoitiin restriktioentsyymiliuotusten avulla plasmidien iden-tifiomiseksi, joissa oli deleetion päätekohdat juuri metio-niinialoituskodonin.5' puolella. Muutama ehdokasplasmidi, joilla oli halutut ominaisuudet, sekventoitiin, ja mutantti (p9), josta puuttui 9 emäsparia ATG-metioniinissa olevan A:n 5'-puolelta, valittiin edelleenkonstruointia varten. p9 liuotettiin EcoRI:llä ja Hindlllilla, ja 645 bp:tä sisältävä TAKA- amylaasin promoottorin sisältävä kappale eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, uutettiin fenolilla ja CHCl3:Ilä ja saostettiin etanolilla. pTAKA17 liuotettiin Sällillä ja EcoRIillä, ja 510 bp:n kappale, joka sisälsi TAKA-amylaasipromoottorin yläpuoliset alueet, eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, uutettiin fenolilla ja CHCl^iIla ja saostettiin etanolilla. Nämä kaksi promoottorialuetta liitettiin toisiinsa ja pIC19R-vektoriin, jota oli : : liuotettu Sällillä ja Hindlllilla. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja oikeat, rekombinantit *: identifioitiin plasmidien restriktioentsyymiliuotuksen avul- ··· la, joita oli uutettu miniskaalassa. Yhdessä sellaisessa re-··. kombinantissa, p719, TAKA-amylaasin promoottorialue Aspergillus oryzaesta havaitaan 1,1 kbin siirrettävänä kappaleena, . joka voidaan katkaista muutaman eri restriktioentsyymituot-teen avulla. Plasmidin p719 konstruktiota valaistaan kuviossa 10.

pRMPAMGTermista eristettiin preproRMP avoin lukukehys ja glu-. koamylaasin terminaat torialue (AMGTerm) 2 kb in kappaleena 1 I » liuottamisen jälkeen BamHIillä ja EcoRIillä. Tämä kappale ! > t I · puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, uuttamalla 112376 2c fenolilla ja CHC1 :11a ja konsentroi tiin sitten etanoli - 3 , . saostuksella. A. oryzaen TAKA-amylaasi n promoottori eristettiin nyt 1,1 kb:n kappaleena, joka oli saatu plasmidin p713 liuotuksen jälkeen Sällillä ja BamHIrllä. Tämä kappale puh-Gistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla, uuttamalla fenolilla ja CHCl :11a ja saostettiin sitten etanolilla.

1,1 kb:n promoottorikappale liitettiin 2 kb:n BamHI/EcoRI-kappaleeseen pRMPAMGTerm:sta pUC19-vektorissa, joka oli liuotettu Sällillä ja EcoRIrllä. Ligaatioseosta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja muodostune!den'transformant-tien joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja mini-skaalan plasmidien restriktioentsyymi1iuotuksel1 a. Yhtä sellaista oikeata rekombinanttia, p777, kasvatettiin suuressa mitassa rekombinanttiplasmidi n eristämiseksi, ja plasmidival-miste puhdistettiin CsCl/etidiumbromidi-sentrifugoinnin avulla. p777 in konstruktiota valaistaan kuviossa 11.

Esimerkki 8

Aspergi11 uksen ekspressiovektorin konstruointi, joka vektori on tarkoitettu saamaan aikaan Rhizomucor miehein lipaasin erittyminen Aspergillus oryzaen TAKA-atayl aasi promoottori n säätelyn alaisena_

Lipaasin cDNA-kloonin konstruointi ja_identi fioi nti E. colis-sa _ • ————^— - . ——^———— -----------— - - - - ___________ • * * * Jotta saataisiin informaatiota, jonka perusteella on mahdol-lista konstruoida spesifinen oiigonukleotidikoetin, suoritet- » ·

tiin Rhizomucor miehein lipaasin osittainen sekvenssin määritys (Koskowitz, G.J. et ai., J.Agric. Food Chem., £5 (1977), *: 114-6-1150). Seuraavassa tekstissä käytetään lyhennystä RML

Rhizomucor miehein lipaasille. Rhizomucor miehein kasvul i emen supernatantti, josta liemestä oli poistettu rihmasto ja pie- » » nimolekyylipainoisiä aineita, saatettiin anioninvaihtokroma- ! « · tografiaan. Kolonnin 1 i polyy tti sestä pääjakeesta poistettiin . j suola, ja se uitrasuodatettiin ennen lyofi1isointi a. Lyofili-,soitu jauhe saatettiin sitten a f f i ni teetti k romatogra f oi n ti i n .

2 7 112376

Kolonnista yhteenkerätyistä 1 ipaasijakeista poistettiin suola, ja ne konsentroitiin uitrasuodatuksel1 a . Tämä konsentraatti saatettiin sitten hydrofobisen vuorovaikutuksen kromatogra-fointiin {HIC), ja HlC-puhdistuksesta saatua li paasi a käytettiin aminohapposekvenssimäärityk seen . Sekvenssin määrittäminen suoritettiin seka natiiveille entsyymei11 e (N-terminaali-nen sekvenssi) että valikoiduille kappaleille, joita saatiin lipaasin proteolyyttisen liuottamisen jälkeen Armillaria mel-lean proteaasi11 a. Sekvenssin määrittäminen suoritettiin Gas Phase Sequencer -laitteella (Applied Biosystefiis Model 47GA) kuten Thira, L. et aV. kuvailevat (FEBS Lett. 1987, painossa).

RKL liuotettiin Armillaria mellean proteaasin kanssa, kuten Moody et ai. kuvailevat (FEBS Lett. 1T2 (1984), 142-148) sillä ainoalla poikkeuksella, että entsyymin suhde substraattiin oli 1:40 (mooli:mooli). Saadut kappaleet erotettiin HPLC:n avulla, ja UV-absorpti ota tarkkailtiin aallonpituuksissa 260 nm ja 214 nm. Sopivien kappaleiden identifiointi-tarkoituksessa oiigonukleotidikoettimien konstruoi nti a varten, joissa suhde aallonpituuksien 2S0 nm ja 214 nm välillä oli suuri, sekventoitiin, koska nämä kappaleet sisältävät Trp:ia ja/tai Tyr:ia.

► »

Seuraava N-terminaal inen sekvenssi havaittiin käyttämällä na-: *’ tiivia RML:ä.

'“i 5 10 15 ..· Ser-Ile-Asp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-Thr-Ser-Gln-Glu-Ile-Asn- 20 25 .) 3lu-Leu-Thr-Tyr-Tyr-Thr-X-Leu-(Ser)-(Ala)-.

•

Yksi kappaleista, jotka eristettiin proteolyytti sestä liuot- ’ ' teestä, sisälsi sekvenssin: Arg-Thr-Val-I1e-Pro-Gly-Ala-Thr-* »

Trp-Asp-X-Ile-riis, ja tätä kappaletta käytettiin spesifisen . : oiigonukleotidikoettimen synteesiin.

26 112376

Rhizomucor miehein cDNA-kirja stoa esi merk i sta 3, joka oli konstruoitu tämän organismin asparagiinihappoproteinaasi ( Rr-iP) - rekombi nantti en eristämiseksi, käytettiin myös lipaa-sispesifiSten rekombinanttien identifiointiin. 01igonukleoti-dien seos syntetisoitiin Applied Biosystems Inc.:n DNA-synteesi1 aitteel1 a . Seos, jolla on oheinen rakenne: 5'ÄTCCCANGTNGCNCC 3' 430/431

G

oli vastakkainen RML* mRNA:n suhteen alueella, joka koodaa aminohappoja Gly-Ala-Thr-Trp-Asp. Tämä pentapeptidi identifioitiin aminohapposekvenssin segmenttinä, joka oli saatu puhdistetun RML-proteiinin (katso edellä) proteolyyttisistä kappaleista.

32

Rhizomucor miehein cDNA-kirjasto seulottiin P-kinaasikäsi - tellyn 1ipaasioligonukl eotidi seoksen kanssa, kuten kuvailtiin seulomista RHP-spesifisen seoksen kanssa. Suodinten hybridi- o sointi ja alkupesu tehtiin 43 C:ssa. Autoradiografoinnin o jälkeen suotimia pestiin 47 C:ssa. Pesäkkeet, joissa esi i n-, tyi voimakasta hybridi soitumista, eristettiin, ja liitetyt cDNA:t vastaavissa plasmideissa sekventoitiin RML-spesifiSten rekombi nanttien identifioimiseksi. Kahdessa sellaisessa re- kombi nanti ssa, p353.7 ja p353.16, oli noin '1,2 kb:n insertti.

‘ * Näistä kahdesta rekombinantista saatu DNA-sekvenssi alkaa si gnaal i pepti di n keskeltä (katso kuvio 12) ja jatkuu poly A -päähän. Tällä alueella voitaisiin identifioida yksi pitkä avoin lukukehys. Koska kaksi rekombinanttia eivät sisältäneet .··: sekvenssiä si gnaal i pepti di n 5'-osalle, jossa peptidissä oli sen metioniinialoituskodoni, syntetisoitiin synteettinen oli-conukleotidi (584).

> · 5' CGAGAGGGGATGAGGGGTGG 3' 584

' » I

112376 29

Tama oiigonukleotidi 584 sisältää RKL mRKA:n vastinsekvenssin alueella, joka koodaa aminohapposekvenssiä Pro-Pro-Leu-Ile-

Pro-Ser-Arg, joka todettiin propeptidi alueella (katso kuvio 12). Sen jälkeen kun oli go 5 S 4: ä ä oli käsitelty kinaasi 11a suureen spesifiseen aktiivisuuteen T4-polynuk1eotidi kinaasin 32 ja Ρ-γ-ΑΤΡ:η kanssa, sitä käytettiin alukkeen jatkereak-tiossa Rhizomucor mienein mRNA:11 a AKV-käänteiskopioijan kanssa tunnettujen menetelmien mukaisesti (Eoel, E. et ai., PNAS, USA, 80, 2866-2S6S, 1983). Alukkeen jatkereaktion tuotteet elektroforesoitiin 10 % polyakryy1iamidi/urea -geelillä, ja kaksi cDNA-tuotetta erotettiin. Nämä kaksi cDNA:ta, toinen 150 nukleotidia pitkä ja toinen 160 nukleotidia pitkä, elektroeluoitiin kumpikin ja sekventoitiin kemiallisella, DNA:n sekventointiin tarkoitetulla hajotusmenetelmäl1ä. Kummastakin cDNArsta saatiin luettava sekvenssi, joka ulottui aiukealueelta asemaan 9 nukleotidia 5' puolelle saakka metio-niiniai oituskodonista . Sekvenssi varmisti sekvenssin, joka saatiin lipaasin yhdistelmä-cDNA -plasmideista. Kahden aluke-jatkeisen cONA-tuotteen pituudet osoittavat, että lipaasin mRNA:n 5'-pää (CAP-paikka) on sijaitseva suunnilleen 5 tai 15 nukleotidia ensimmäisen A-nukleotidi n 5'-puolella, joka on , esitetty kuviossa 12. Mikroheterogeenisyys sienten mRNA:n 5'-pään sijainnissa on hyvin tavallista. Yhdistämällä sek-; venssi, joka saatiin kahdesta kloonatusta cDNA:sta, p353.7 ja p353.16, sekvenssin kanssa alukkeen jatkeanalyysistä, voidaan | « « · RML:n prekursorin-aminohapposekvenssi osoittaa. RML:n prekur-sorin LNA-sekvens si ja vastaava aminohapposekvenssi on esi- * * · tettynä kuviossa 12. Kuviossa 12 vaakasuorat viivat osoittavat synteettisten oligojen sijainnit, joita oligoja käytetään :·*: cDNA-synteesi i n ja cDNA-k i r j aston seulontaan. Nuoli osoittaa ·. paikkaa, jossa natiivin RML:n kehittymisprosessi tapahtuu.

: » ·

Nukleotidit numeroidaan lähtien ensimmäisestä emäksestä aloi- * · ‘ tus-Ket-kodonissa, ja aminohapot numeroidaan ensimmäisestä tähteestä kehittyneessä, natiivissa RML:ssä. RML: ää koodaa . : avoin lukukehys, joka ulottuu ai oitus-Met-kodonista jatkuen sitten 363 kodonin kautta ennen kuin loppukodoni saavutetaan.

112376 30 Tässä preiiursorissa ensimmäiset Z*i aminohappotähdettä tulevat muodostcr.aan tyypillisen hydrofobisen si gnaal i pepti ci n , von Heijr.en tuotannollisten ohjeiden mukaisesti (Eur. J. Biochem. 133, 17-21, 1933), signaalipeptici lohkeaisi seuraavasta propeptidistä signaalipeptididaasi1ohkaisun avulla Alaja Vai-tähteicen välistä asemissa -71 ja -70, vastaavasti.

Koska puntiistetun RHL:n K-term* naalinen aminchapposekvenssi-analyysi, jota RML:aä saatiin Rhizomucor miehein viljelmän supernatant! s ta , osoitti oikeaksi jakson Ser-IVe-Asp-Gly-Πe-Arg aktiivisen RKL-entsyymin fo-päänä, RKL:n prekursorin pro-peptidi käsitti seuraavat 70 aminohappotähdettä prekursorissa. Lähtien tästä hl-termi naal i sesta Ser-tahteestä , kehittynyt RKL jatkuu 269 tähteen kautta ennen kuin se saavuttaa lcpetusko-conin. Tässä kehittyneessä 2S500 daltenin entsyymissä lipaa-sin suostraatin siteutumispaikka sijaitsee tähteen Ser (144) lähellä, joka konservoi tuu muutamassa li paasi ssa. RML mRNA:n 3'-paässa 104 nukleotidia paikallistettiin ei-luettuna alueena TAA-1opetuskodonin ja poly(A)-pään välissä. 23 nukleotidia tämän poly(A)-paän 5'-puolella todettiin toistuva rakenne, joka käsitti 7 AT-emäsparia, vaikka mitään tyypillistä euka-rioottista polyatienylaatiosignaalia ei voitu identifioida.

* · «

Esillä olevan keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuo-: " dossa toteutettiin joukko muutoksia RKL cDh'A:ssa. Nämä muu- » i 1 » · tokset kasittivät-G:C-päiden poistamisen, jotka oli lisätty ‘ : cDNArnan kloonauksen aikana, ja restriktioendonukleaasipaik- • » * ,,,· kojen lisäämisen avoimen lukukehyksen 5'- ja 3'-puolelle.

Joukko sopivia restriktiopaikkoja sijoitettiin myös cQNA:n ··: si gnaal i pepti di - ja propepti di ai uei 11 e .

« » p353.16 liuotettiin FnuöII:llä, ja 880 bp:n DNA-kappale (RML cONA:r. 3'-pää) eristettiin agaroosi geel i el ektroforeesi n avu!- i i i * » » i · I *

« I

» I t 4 « t 112376 31 la. Kappale elektroeluoitiin, uutettiin fenolilla ja CHC1 :11a ja seostettiin etanolilla.

3 Tämä RKL cDKA:n 3'-pää liitettiin sitten pUClS-vektoriin, joka oli liuotettu Saral:11ä ja käsitelty alkalisella fosfataa-silla. Li gaatioreakti oseosta käytettiin transf ormoimaan vastaanottokyky isiä E. coli -soluja, ja muodostune!den transfor-mantti en joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja mi -niskaalan plasmidien restrik tioentsyymi1iuotuksen avulla. Yksi sellainen sopiva rekombinantti, p435,2, liuotettiin SanII:lla ja Hindllirlla, ja 0,69 kb:n kappale eristettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Kappale elektroeluoitiin, uutettiin fenolilla ja CHCl^rlla ja seostettiin etanolilla. Tämä RKL cDi-iÄ -kappale sisälsi nyt pääosan multippelista pUCIS-kloonauspaikasta liittyneenä ei-luettuun 3'-alueeseensa.

RML cDNA:n 5'-pää muotoiltiin uudelleen käyttämällä synteettisiä oligonukleotideja sopivien katkaisu paikkojen sijoittamista varten. Synteettisen kappaleen DKA-sekvenssi (RKL 5'} esitetään kuviossa 14. Yksittäin syntetisoitujen oligonukleo-tidien sijoitettujen Ratkaisupaikkojen ja yhteenliittyvien paikkojen asemaa osoitetaan vaakasuorilla nimittäin pystysuo-t ri11a/vaakasuori 11 a viivoilla. Muodostunut kappale (RML 5') - ψ puhdistettiin 150 bp:n kappaleena 2 % agaroosigeel i11 a, elektroeluoitiin, uutettiin fenolilla ja CnCl :11a ja saos- » · 1 1 · 3 tettiin etanolilla ennen 1isäligaatioreakti oi ta.

* ' I · » * t 1 p353.7 liuotettiin 3anl:llä ja BanII:lla, ja 3E7 bp:n RML- kappale puhdistettiin 10 % pclyakryyliamidigeelielektrofo- ;··: reesin avulla. Kappale el ektroel uoi ti i n , uutettiin fenolilla • '1. ja CHCl^:lla ennen etanol i saostusta, ja liitettiin sitten o !, synteettiseen RKL 5 '-kappaleeseen ja 0,65 kb:n BanlI/HindIII - t > · kappaleeseen p435.2:sta SamHI/Hino 111:11ä liuotetussa ?UCi3- t vektorissa. Ligaatioreaktioseosta käytettiin transformoimaan t , , : vastaanottokykyisiä E. coli -soluja, ja muodostune!den trans- »...: formanttien joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja 112376 j z mini skaalan pi asmi c i en restri k ci centsyymi 1 i uotuksi 11 a . Yhdessä sellaisessa oikeassa rekombinantissa, pb544, synteettinen osa sek ventoi ti i n odotetun rakenteen varmistamiseksi. pB544:n konstruktiota valaistaan kuviossa 13a. pB544:sta eristettiin prepro RKL cDNA 1,2 kb:n BamHI-kappaleena agarcosi geel iel ekt-roforeesin avulla. Ekspressiovektori, joka perustuu Aspergillus oryzaen TAKA-amyl aasi geeni n prcncottcr i i n ja Aspergillus nigerin glukoamylaasi geeni n terminaattoriin, valmistettiin seuraavasti. p71S (katso esimerkki 7) liuotettiin Sällillä ja BaniHIillä. Muodostunut 1,1 kb:n TAKA-amylaasipromoottori -kappale puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. pICAMG/Terni (katso esimerkki 4) liuotettiin BamHIillä ja EcoRIillä. Muodostunut U,75 kb:n glukoamylaasi n terminaattori-kappale puhdistettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Fenoli- ja CHC1.-uuttanisten jälkeen nämä kaksi kappaletta seostettiin etanolilla ja liitettiin Sal I/tcoRI:11ä liuotettuun pUCIS'-vektori in . L i gaati oreak ti o seos ta käytettiin transformoimaan E. coli -soluja, ja muodostuneiden transforraant-tien joukosta identifioitiin oikeita rekombinantteja miniskaa-lan plasmidien restriktioentsyymi 1 iucstusten avulla. Yksi sellainen oikea rekombinantti, p775, liuotettiin BamHIillä ja käsiteltiin alkalisella fosfataasi11 a. 1,2 kbm BamHI RKL “ prepro cDHA-kappale pB544istä liitettiin tähän p775-vektori in ·.· · ja transformoitiin E. coliin. Rekombi nantti p787, johon oli : liitettynä RKL prepro cDNA oikein si jo-i ttuneena promoottorin ·:··: ja termi naattori n - väl i ssä , identifioitiin E. colin transfor- ·;··· mänteistä uutettujen miniskaalan plasmidien restriktioentsyy-.·". mi 1 i uostusten avulla. p787 pl a smi di-DNA i ta kasvatettiin suuressa mitassa, ja plasmidi vai mlste puhdistettiin CsCl/Eti-. di umbromi di -sentri fugoi nni n avulla. p7S7in konstruktiota valaistaan kuviossa 13b.

:T: Esimerkki S

Aspergillus oryzaen transformointi (yleinen menetelmä) 1 ; 100 ml YPDitä (Sherman et ai., Methods in Yeast Genetics,

Cold Spring Harbor Laboratory, I SSI) siirrcstettiin A. cry- 112376 33 zaen, IF O 417 7 tai sen arg3-mutantti en iti cilia ja inkuboi- o mn ravistellen 37 C:ssa noin 2 päivän ajan. Rihmasto korjattiin talteen suodattamalla rr.i ra-kankaan läpi ja pestiin 200 ml :11a G,δ ί-i M g S 0 _ : a . Rihmasto suspendci ti i n 15 in 1 : a a n 4 1,2 H M g SO :a, 10 m.M M a H PG :a, pH = 5, S. Suspensio jäahdy-. . 4 2 4 tettiin jaan päällä, ja 1 ro! puskuria, joka sisälsi 12G mg Novozyns 234 :ää, erä 16S7, lisättiin. Viiden minuutin kuluttua, 1 ml 12 ing/ml BSA:ta (Sigma tyyppi H25) lisättiin, ja inkubointia jatkettiin lievästi sekoittaen 1,5-2,5 tuntia o 37 C:ssa, kunnes suuri joukko protoplasteja tuli näkyviin näytteessä, jota tarkasteltiin mikroskoopilla.

Suspensio suodatettiin mira-kankaan läpi, suodos siirrettiin steriiliin putkeen ja peitettiin 5 ml:11 a G,6 H sorbitolia, 100 mK T rls-HCl:a, pH = 7,0. Sentri fugoi nti suoritettiin 15 min. aikana 1000 g:ssa, ja protoplastit kerättiin talteen HgSO^-kerroksen pinnalta. Kaksi tilavuusosaa STC:tä (1,2 H sorbitolia, 1G mM Tris-HCl:a pH - 7,5, 1G mK C aC12) lisättiin prctoplastisuspensioon, ja seosta sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1GGG g:ssa. Protoplast!pelletti suspendoitiin uudelleen 3 ml:aan STC:ta ja pelletoitiin uudelleen sentrifu-goimalla. Tämä toistettiin. Lopuksi protoplastit suspendoi- ·.·’·· tiin jälleen 0,2-1 ml:aan STC: ta.

* * * lOO^ul protopl asti suspensiota sekoi tetti i n *5-25^ug: n ·;··· kanssa sopivaa DNA:ta 10^ul:ssa STC:tä. argB-kantojen pro- ....: toplastit sekoitettiin pSal43 DNA: n kanssa (A. nidulansin • ' + .···. argS-geenin sisältävä plasmioi) ja argB -kantojen protoplastit sekoitettiin p3S :n kanssa (A. nidulansin amdS-, geenin sisältävä plasmidi). Seos jätettiin huoneen lämpötilaan £5 minuutiksi. 0,2 ml 60 % PEG-4G00:ta (BDH 2S576 ), 10 m M CaCl :a ja 10 mM Tris-HCl:a pii = 7,5 lisättiin ja sekoitet-tiin huolellisesti (kahdesti), ja lopuksi G,85 ml samaa .···. liuosta lisättiin ja sekoitettiin huolellisesti. Seos jätet- » I · ,* tiin huoneen lämpötilaan 25 minuutin ajaksi, sentri fugoi ti i n 2500 g:ssa 15 minuuttia, ja pelletti suspenGoi ti i n uudelleen 2 • * :nl:aan 1,2 M sorbitolia. Vielä yhden sedimer.toi r.ni n jälkeen, 112376 34 protGplast.it levitettiin sopiville Kaljoille. argL-kantojen protopiastit, jotka oli transformoitu pSa!43:lla, levitettiin mi ni raaal imal joi 11 e (Cove, Bicchem. Biophys. Act a 113 (1966 ) 51-56) glukoosi ja urea hiilen ja typen lähteinä vastaavasti, ja sisältäen 1,2 l\ sorbitolia osmoottiseksi stabi1oimiseksi.

+ argB -kantojen protopiastit, jotka oli transformoitu p3SR2:lla, levitettiin sai niraaa 1 i mal joi 11 e (Cove, Biochem.

Biophys. Acta 113 (1956) 51-56), jotka sisälsivät 1,0 M

sakkaroosia, pH = 7,0, 10 mH asetamidia typen lähteenä ja 20 mK CsCl:a taustakasvun inhiboimi seksi. Inkubo'innin jälkeen o 4-7 päivää 37 C:ssa-itiot poimittiin, suspendoitiin steriiliin veteen ja 1evitettiin eri 11ispesäkkeiden saamiseksi. Tämä menettely toistettiin, ja eri11ispesäkkeen itiöt toisen eristämisen jälkeen varastoitiin määrättynä transformanttina.

Esimerkki 10 TAKA-amy1 aasi n ilmeneminen A. oryzaen villityypin kannassa ΡΪΑΚΑ17 transformoitiin A. oryzae IFO 4177:ään yhdessä p3SR2:n kanssa yhteistransformaatioi 1 a , joka p3SR2 sisältää amdS- geenin A. nidulansista, kuten on kuvailtu esimerkissä 3. Pro- toplasteja, joita oli valmistettu kuten kuvailtiin, inkuboi- ;·'·· tiin seoksen kanssa, jossa oli yhtä suuret määrät pTAKA17:äa * · · v : ja p3SR2:ta, suunnilleen 5^ug kumpaakin käytettiin. 9 : transformanttia, jotka pystyivät käyttämään asetamidia ainoa- ·;··· na typen lähteenäs eristettiin uudelleen kahdesti. Kolmen päivän kasvatuksen jälkeen YPD:llä (Sherman et ai., 19S1), ,···. viljelmien supernatant! t analysoitiin SDS-PAGE:n avulla. Geelit värjättiin coomassie-bri1janttisinisell a R. Parhaat . transformantit tuottivat 10-20 kertaa enemmän amylaasia kuin transformoimaton IFO 4177. Yksi transformantti valikoitiin lisätutkimuksia varten, ja sitä kasvatettiin 2 1 :n Kieler-fermentori ssa 4 % soi japapu jauho! 1 a, ja glukoosia syötettiin kasvatuksen aikana. Viljelmää sekoitettiin voimakkaasti fer-.· . men toi nni n aikana. Näissä olosuhteissa IFO 4177 tuotti noin 1 ’· '1 g/1 ja transf ormantti noin 12 g/1 amylaasia määritettynä entsyymi akti l vi suutena . Entsyymi akti i vi suus niitattiin kykynä ha- 112376 35 jottaa tärkkelystä (Cereal Chemistry, 1_6, (1S39), 712-733).

Käytetty tärkkelys oli Merck Amylum liukeneva erg S.o, ja ..... o määritys suoritettiin pH:ssa 4,7 ja 37 C:ssa. Yhtään ulkopuolista beeta-amylaasi a ei lisätty.

Esimerkki 11 RH?: n ilmeneminen A. ory2aessa p777 esimerkistä 7 tai p778 esimerkistä 6 transformoitiin IF0-4177:ään yhteistransformaatioi 1 a p3SR2:n kanssa menetelmällä, jota kuvailtiin esimerkissä 9. Transformantteja seulottiin ja eristettiin uudelleen kuten kuvailtiin esimerkissä 9.

Transformantteja kasvatettiin kolme päivää YPDissä, ja super-natantit analysoitiin SDS-PAGE:lla, jota seurasi Western-ölottaus ja ELISA-määritys. Transformanttien supernatantit sekä p777:stä että p778:sta sisälsivät 5C-150 mg/1 proteiinia, joka reagoi RKP:n vasta-aineen kanssa. Proteinaasi oli yli-glykolysoitunut verrattuna R. miehein tuottamaan proteinaa-siin Kahta muotoa tavattiin, joista toisen oletetaan olevan esimuoto ja toisen käsitelty kehittynyt proteinaasi. Kahta ; ·' p778-transformanttia ja kolmea p777-transformanttia kasvatet- v : tiin fermentorissa samalla tavalla kuin TAKA-amylaasi-trans- : formantteja, jota kuvailtiin edellä. Kaksi *p778-transformant- -;··· tia tuotti suunnilleen 0,2 g/1 ja 0,4 g/1 , ja kolme p777-transformantti a tuotti suunnilleen 0,5 g/1, 2,4 g/1 ja 3,3 .···. g/1 RMP: ta määritettynä maidon koagul oi tumi sakti i vi suutena

Kunitzin menetelmällä (Kunitz M., Jour. Gen. Physiol. 1_8 . (1S35), 459-466), olettamalla, että rekorabinantti-RMP:n spe- / sifinen aktiivisuus on sama kuin Rhizomucor miehein entsyymin ·*’ vastaava. (Tämä on myöhemmin vahvistettu). SDS-PAGE ja SDSPA-GE, jota seurasi Western-bl ottaus ja ELISA, osoittivat, että vain yksi muoto RMP:tä oli läsnä kasvatettaessa suuremmassa .* , mitassa. RMP oli yliglykolysoitunut myös näissä kasvuolosuh-’· · teissä. Geeleiltä tavattu protei inimäärä korreloi hyvin mäa-• * riin, jotka ennustettiinn entsyymiaktiivisuudesta.

36 1Ί2376 RKP puhdistettiin viljelmän supernatant! ste affiniteetti kro-matografian ja kokoekskl uusi ok rornatograf i an avulla.

Puhdistetun rekombinantti-RKP:n N-terminaalinen sekvenssi määritettiin käyttämällä Gas Phase Sequencer -laitetta kuten ovat kuvailleet Thim et ai. (FEES Lett, 1SS7 painossa).

Kahta rekombinantti-RMP:n muotoa todettiin, mikä osoitti, että prosessointi N-terminaalisessa päässä oi i /heterogeeni stä. Toisella muodolla o>i N-terminaalinen sekvenssi: Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-, ja toisella muodolla oli N-ter-minaalinen sekvenssi: Gly-Ser-Val-Asp-Thr-Pro-Gly-Tyr-Tyr-Asp-. Sellaista heterogeenista prosessointia N-päässä on myös kuvailtu Kucor miehein natiiville RMP:lle (Paquet, D. et ai., Neth. Milk. Dairy J., 3_5 (1981), 3S8-360). Koska rekombi-nantti-RKP:n heterogeeninen prosessointi korreloi hyvin na-tiivin RMP:n vastaavaan, A. oryzaen on esillä olevan keksinnön mukaisesti osoitettu olevan kyvykäs prosessoimaan rekom-Dinantti-RKP:ta oikealla alueella.

Esimerkki 12 ;·’·· Ekspressioyksikön konstruointi prokymosi inin tuottamista var-v ; ten A. oryzaessa__ ·;·*; Konstruktio sisältää prokymosi i ni geeni n , jota välittömästi edeltää si gnaal i pepti di sek venssi A. oryzaen TAKA-amylaasigee-.·'·. nistä, A. oryzaen TAKA-amyl aasi n promoottorin säätelyn alaisena. Konstruktio sisältää edelleen terminaattorin A. nigerin . glukoamylaasi geenistä plus E. coli -replikonin.

·;·“ Suunnilleen 430 bp:n BamHI/Xmal-kappale plasmidista p285' proC (katso esimerkki 1) ja seuraavan sekvenssin mukainen oligomeeri 112376 37

AATTCCAGCTGCCGCGGCCGAGATCACCAG

GGTCGACGGCGCCGGCTCTAGTGGTCCTAG

liitettiin EcoRI-Xma 1:11 a katkaistuun plasn;idiin pUC19, mikä tuotti plasmidin pToC50a.

pToCSOa katkaistiin EcoRI-Sac11:11 a, ja suuri kappale, joka sisälsi pUC19:n ja prokymosiinigeeni n (prokymosiini') 5'-osan, eristettiin. Tämä kappale liitettiin 0,6 kb:n EcoRI-Banl-kappaleen kanssa plasmidista pTAKA17, ja seuraavan synteettisen oligomeerin kanssa

GCACCTGCTTTGGC

GACGAAAC (KFN 280/281)

Transformaati on jälkeen plasmidi pToC51, joka sisälsi proky-mosiinigeeni n (prokymosiini') 5'-osan yhtyneenä A. oryzaen TAKA-amylaasi geeni n (preTAKA) signaalisekvenssiin, ja jota edelsi suunnilleen 500 emäsparia TAKA-amylaasi sekvenssin yläpuolella, eristettiin, pToC51:n konstruktiota valaistaan kuviossa 15a.

pR26 katkaistiin Hinfl:llä, sitä käsiteltiin DNA-polymeraasi ·' I:n suuren kappaleen (Klenow) ja neljän dNTP:n kanssa ja katkaistiin Xmal:11ä. 750 emäsparia sisäl.tävä 'kappale, joka si-·:··: saisi prokymosi i ni geeni n 3'-pään, eristettiin. Tarkoituksella liittää Hinaili tämän kappaleen 3'-päässä, pUC9 katkaistiin .···. Xmal/Hi ne 11:11 a, ja suuri kappale liitettiin 750 bp:n kappaleeseen, joka sisälsi prokymosiinigeeni n 3'-pään.

5,5 kb:n EcoRI-Clai-kappale plasmidista pTAKA 17 eristettiin ja liitettiin 2,6 kb:n Cl ai-Hind111-kappaleen kanssa samasta plasmidista plus 0,7 kb:n EcoRI-Hi ndl 11-kappal een kanssa plas-.midista pICAMG/Term (katso esimerkki 4), joka sisältää A. ni-·, gerin glukoamylaasi geeni n terminaattorin ja polyA-paikan .

’* “· Muodostunutta plasmidia kuvataan kuviossa 15b plasmidina ’ pToC52.

112376 38 pTcC52 katkaistiin HindIII:lla ja osittain EcoRIrllä, ja 6,4 kb:n kappale eristettiin. Tämä liitettiin 0,9 kb:n EcoRI-XmaI-kappaleen kanssa pToC51:sta ja G,7 kb:n Xmal-Hindl11-kappaleen kanssa plasmidista pGC'PC, joka sisälsi prokymosii-nigeeni n ('prokymosiini) 3'-osan. Muodostunutta plasmidia nimitetään pToC56:ksi, ja sitä kuvataan kuviossa 15b.

Esimerkki 13

Prokymosiinin ilmeneminen A. oryzaessa pToC56 transformoitiin A. oryzae IFO 4177:aän tai sen argB-mutanttiin yhteistransformaatioi 1 a joko p3SR2:n (amdS-geeni) tai pSal43:n (argB-geeni) kanssa. Transformantit, jotka kas-voivat selektiivisellä alustalla, eristettiin uudelleen kahdesti, kuten kuvaillaan esimerkissä 9.

Transformantteja kasvatettiin kolme päivää YPDrssä, ja proky-mosiinin määrä supernatanteista analysoitiin ELISArlla Western bloteilta SGS-PAGE:n jälkeen. Transformantit tuottivat 1-1G mg/1 prokymosiinin kokoa olevaa immunoreaktiivista proteiinia supernatanteissa. Mitään muita immunoreaktiivisi a ” proteiineja ei havaittu superna tantei ssa .

• · » : ’·· Esimerkki 14 :··: p787 esimerkistä £ transformoitiin IF0-4177:ään yhteistrans- ·;··! formaatiolla p3SR2:n kanssa menetelmällä, jota kuvailtiin .···. esimerkissä 9. Transformantteja valikoitiin ja eristettiin » · * uudelleen, kuten kuvailtiin esimerkissä 9.

» *

Transformanttien YPD-vi1jelmien supernatant!t, joita trans- » · ·;’* formantteja oli kasvatettu kolme päivää, analysoitiin SDS-PAGE:lla, jota seurasi Western blottaus ja ELISA. Paras transformantti tuotti 2 mg/1 proteiinia, joka oli kehittyneen . RHL:n kokoista. Supernatantei ssa oleva 1 i paasi akti i vi suus 112376 39 määri tetti i n kykynä katkaista tri butyri i ni a (NGYO-menetelmä AF 95, i/3-GB).

Mittaus vahvisti, että 2 m g/1 aktiivista lipaasia oli läsnä supernatantei ssa.

* · · * « t « 1 • 1 -1 • «1 1 1 > · » 1

Claims (4)

112376 Pat ent t ivaat imukset

1. Promoottori, joka on sopiva proteiinituotteen ilmentämiseksi Aspergilluksessa, tunnettu siitä, että se on Aspergillus oryzae'sta peräisin oleva TAKA-amylaasipromoottori tai sen toiminnalliset osat, jota valinnaisesti edeltävät yläpuoliset aktivoivat sekvenssit.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen promoottori ja yläpuoliset aktivoivat sekvenssit, tunnetut siitä, että ne sisältävät seuraavan sekvenssin AGATCTGCCC TTATAAATCT CCTAGTCTGA TCGTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT : AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG • GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCGTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACCCTGA TCACGGGCAG CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA ·;> AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA GAATGCAATT TAAACTCTTC ; tgcgaatcgc ttggattccc cgcccctagt cgtagagctt aaagtatgtc CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG ']'·'[ AACAATAAAC CCCACAGAAG GCATTT. * t 112376

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen promoottori ja yläpuoliset aktivoivat sekvenssit, tunnetut siitä, että yläpuolisia aktivoivia sekvenssejä edeltää 1,05 kb:n sekventoimaton yläpuolinen alue asemasta 0 asemaan 1,05 plasmidissa pTAKA 17 (DSM 4012) .

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen promoottori ja yläpuoliset aktivoivat sekvenssit, tunnetut siitä, että ne sisältävät seuraavan sekvenssin GTCGACGC ATTCCGAATA CGAGGCCTGA TTAATGATTA CATACGCCTC CGGGTAGTAG ACCGAGCAGC CGAGCCAGTT CAGCGCCTAA AACGCCTTAT ACAATTAAGC AGTTAAAGAA GTTAGAATCT ACGCTTAAAA AGCTACTTAA AAATCGATCT CGCAGTCCCG ATTCGCCTAT CAAAACCAGT TTAAATCAAC TGATTAAAGG TGCCGAACGA GCTATAAATG ATATAACAAT ATTAAAGCAT TAATTAGAGC AATATCAGGC CGCGCACGAA AGGCAACTTA AAAAGCGAAA GCGCTCTACT AAACAGATTA CTTTTGAAAA AGGCACATCA GTATTTAAAG CCCGAATCCT TATTAAGCGC CGAAATCAGG CAGATAAAGC CATACAGGCA GATAGACCTC TACCTATTAA ATCGGCTTCT AGGCGCGCTC CATCTAAATG TTCTGGCTGT GGTGTACAGG GGCATAAAAT TACGCACTAC CCGAATCGAT AGAACTACTC ATTTTTATAT AGAAGTCAGA ATTCATAGTG TTTTGATCAT TTTAAATTTT TATATGGCGG GTGGTGGGCA ACTCGCTTGC GCGGGCAACT CGCTTACCGA TTACGTTAGG GCTGATATTT ACGTGAAAAT CGTCAAGGGA TGCAAGACCA AAGTAGTAAA ACCCCGGAAG TCAACAGCAT CCAAGCCCAA * ♦ GTCCTTCACG GAGAAACCCC AGCCTCCACA TCACGAGCGA AGGACCACCT • · · » ! CTAGGCATCG GACGCACCAT CCAATTAGAA GCAGCAAAGC GAAACAGCCC Ml» AAGAAAAAGG TCGGCCCGTC GGCCTTTTCT GCAACGCTGA TCACGGGCAG > · ···1 CGATCCAACC AACACCCTCC AGAGTGACTA GGGGCGGAAA TTTAAAGGGA TTAATTTCCA CTCAACCACA AATCACAGTC GTCCCCGGTA TTGTCCTGCA ; GAATGCAATT TAAACTCTTC TGCGAATCGC TTGGATTCCC CGCCCCTAGT CGTAGAGCTT AAAGTATGTC CCTTGTCGAT GCGATGTATC ACAACATATA : !·. AATACTAGCA AGGGATGCCA TGCTTGGAGG ATAGCAACCG ACAACATCAC » · · ATCAAGCTCT CCCTTCTCTG AACAATAAAC CCCACAG. » f 42 1 12376